專利名稱：一株鐮刀霉菌及其用于制備人參皂苷Rh2的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鐮刀霉菌及其用途，具體地說，涉及一株產(chǎn)特異性β-葡萄糖苷水解酶的鐮刀霉菌及其在制備人參皂苷Rh2中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
人參是我國(guó)珍貴的傳統(tǒng)中藥，具有滋補(bǔ)、強(qiáng)壯、抗疲勞、抗腫瘤等多方面的藥理和生物活性。研究表明，人參皂苷是其主要活性成分，目前已分離鑒定的人參皂苷達(dá)40多種。各種人參皂苷都有其獨(dú)特的藥物療效，其中人參皂苷Rh2對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，是很有發(fā)展?jié)摿Φ目拱┧幬?。但人參皂苷Rh2在人參中的含量極少，所以直接提取十分困難。相對(duì)而言，人參皂苷Rg3的提取制備要容易得多，而人參皂苷Rg3與人參皂苷Rh2的區(qū)別僅在于前者在C3位上多連有一個(gè)糖基，因此選用合適的方法去掉Rg3分子中C3位上側(cè)鏈O-Glc-Glc末端的β-葡萄糖基，使其轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh2，是制備Rh2的一條有效途徑。多年來許多學(xué)者對(duì)此都頗感興趣，已有一些文獻(xiàn)和專利涉及了這方面的技術(shù)，較為典型的有(1)中國(guó)專利CN 1293198A于2001年公開了一種化學(xué)法改變?cè)碥战Y(jié)構(gòu)的方法。此方法將幾種人參皂苷單體或其混合物溶于堿金屬氫氧化物和高沸點(diǎn)脂肪醇類有機(jī)物組成的溶液中，在常壓下加熱進(jìn)行水解，來制備稀有的人參皂苷?；瘜W(xué)法的主要缺點(diǎn)是專一性差，轉(zhuǎn)化率低。
(2)文獻(xiàn)Biological & Pharmaceutical Bulletin，2002，25(1)，58-63報(bào)道了利用腸道菌將人參皂苷Rg3代謝生成人參皂苷Rh2和原人參二醇。該方法的主要缺點(diǎn)是腸道菌厭氧培養(yǎng)條件苛刻、效率很低，且需要專用設(shè)備，用于稀有皂苷制備很不經(jīng)濟(jì)。
(3)韓國(guó)專利2000年公開了用酶制備人參皂苷Rh2的方法。此方法利用β-半乳糖苷酶水解人參皂苷Rg3生成人參皂苷Rh2。使用商品酶制劑存在供應(yīng)受限、成本較高等問題。
(4)文獻(xiàn)大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，19(3)，195-198報(bào)道了利用一株黑曲霉制備人參皂苷Rh2的方法，此黑曲霉所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以特異性地水解人參皂苷Rg3生成Rh2。該方法的不足之處是反應(yīng)的底物濃度較低，產(chǎn)品得率也不夠高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一株鐮刀霉菌及其用于制備人參皂苷Rh2的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
用于制備人參皂苷Rh2的是一種屬于鐮刀霉菌屬的菌種(Fusariumproliferatum)ECU2042，其具有制備人參皂苷Rh2的能力，該菌種篩選自土壤，并于2005年10月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1495。
所述菌種具有以下性質(zhì)在平板上25℃培養(yǎng)五天后，其菌落直徑為55mm，氣生菌絲透明，呈氈狀，老化后帶有淡紫色，但瓊脂無色。小分生孢子以鏈狀或假頭狀著生于氣生菌絲中散生或聚生的孢子梗上，孢子梗長(zhǎng)約25μm，分生孢子呈棒狀，大小為6～15μm×3～4μm，底部扁平。沒有觀察到大型分生孢子，也無厚垣孢子，可在溫度10～60℃，pH3.0～8.0和NaCl濃度0～7％(w/v)的環(huán)境中生存。
經(jīng)德國(guó)DSMZ公司鑒定，此菌種為鐮刀霉菌屬(Fusarium proliferatumnirenberg)。它與其它真菌(例如黑曲霉)的主要不同點(diǎn)在于，此菌種氣生菌絲發(fā)達(dá)，透明，呈氈狀，老化后帶有淡紫色；而黑曲霉菌落生長(zhǎng)稍局限，菌絲初為白色，逐漸變?yōu)楹谏窠q狀。黑曲霉還具有由頂囊、小梗以及分生孢子鏈構(gòu)成的頭狀結(jié)構(gòu)，稱分生孢子頭，幼為球形，后為放射狀，呈褐黑色。
已有專利的菌種(黑曲霉)與本發(fā)明菌種顯著不同。
采用上述菌種制備人參皂苷Rh2的方法，包括如下步驟(1)斜面培養(yǎng)所使用的斜面培養(yǎng)基為察氏瓊脂培養(yǎng)基，將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，20～40℃恒溫培養(yǎng)1～5天后，4℃保存?zhèn)溆茫?2)搖瓶培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到裝有4ml液體培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基蔗糖30g/l，NaNO33g/l，K2HPO41g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/l)的φ10×100mm的搖管中，在20～50℃，最好25～35℃和60～300轉(zhuǎn)/分鐘的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)12～20h后，接種于裝有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的1L大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)1～5天，搖瓶的裝液量10～30％(v/v)，接種量2～10％(v/v)；(3)酶促水解反應(yīng)培養(yǎng)后的霉菌發(fā)酵液經(jīng)抽濾獲得菌絲體，用生理鹽水洗滌，經(jīng)研磨破碎細(xì)胞后，在4℃以15000r/min離心，取上清液作為酶源，以人參皂苷Rg3為底物，其加入量為0.5～20g/L(反應(yīng)物總體積)，酶的加入量為10～100U/g底物，在pH3.0～8.0，最好是pH5.0～6.0的緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20～60℃，最好為35～50℃，反應(yīng)時(shí)間為3～30小時(shí)，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集人參皂苷Rh2；所說的緩沖液優(yōu)選為NaAc/HAc體系；本發(fā)明為在溫和條件下催化水解相對(duì)易得的人參皂苷制備極具應(yīng)用潛力的稀有皂苷提供了一株制備方便、價(jià)格相對(duì)低廉的鐮刀菌株，用該菌株制備人參皂苷Rh2，成本相對(duì)較低，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60％以上，所得皂苷純度≥95％。
具體實(shí)施例方式
下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述，其目的是為更好理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1斜面培養(yǎng)采用察氏瓊脂培養(yǎng)基。將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)大約3天。
產(chǎn)酶培養(yǎng)采用察氏液體培養(yǎng)基，100ml搖瓶裝液量20ml，滅菌后接入預(yù)先已在搖管中培養(yǎng)了18小時(shí)的培養(yǎng)液作為種子，接種量10％(v/v)，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，在上述條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3天，產(chǎn)酶量可達(dá)到48.8U/L發(fā)酵液。
酶活單位(U)的定義為在40℃、pH5.0條件下，每小時(shí)生成1μmol Rh2所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。
實(shí)施例2斜面培養(yǎng)與實(shí)施例1相同。將在30℃、160r/min條件下預(yù)培養(yǎng)了18小時(shí)的培養(yǎng)液作為種子，按10％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)入裝有20ml察氏培養(yǎng)基的100-ml搖瓶中，在培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，加入0.5mg/ml的人參總皂苷進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，酶產(chǎn)量提高了一倍。
實(shí)施例3種子培養(yǎng)與實(shí)施例2相同。在若干個(gè)1L大搖瓶中各裝入200ml察氏液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，分別接入8ml預(yù)培養(yǎng)18小時(shí)的種子液，在培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min的條件下培養(yǎng)3天后，酶產(chǎn)量達(dá)30.9U/L發(fā)酵液。
實(shí)施例4取實(shí)施例3中的發(fā)酵液1000ml，經(jīng)抽濾獲得細(xì)胞，用生理鹽水(0.85％NaCl)洗滌，將所得細(xì)胞研磨破碎，離心，以所得上清液作為酶液，加入NaAc/HAc緩沖液(50mM，pH5.0)，使反應(yīng)體系為10ml，再加入10mg人參皂苷Rg3，在40℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min的條件下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)24小時(shí)后，進(jìn)行HPLC分析(UV 203nm，流動(dòng)相甲醇/水＝85/15，v/v)，轉(zhuǎn)化率接近100％。
實(shí)施例5粗酶液制備方法同實(shí)施例4，將所得粗酶液制成凍干粉末。在250ml磨口三角瓶中依次加入12mg粗酶，50mg人參皂苷Rg3，再加入50ml緩沖液(NaAc/HAc，100mM，pH5.0)，塞緊磨口塞，用生料帶封口，50℃、160r/min旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后分別加入正丁醇25ml萃取四次，收集正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，經(jīng)過硅膠快速柱層析(氯仿/甲醇＝9/1)分離純化，再經(jīng)甲醇-水(70/30，v/v)重結(jié)晶，得到11mg人參皂苷Rh2，轉(zhuǎn)化率為60.3％，最終摩爾產(chǎn)率為29％，制備所得人參皂苷Rh2的純度≥95％。
權(quán)利要求
1.一株鐮刀霉菌(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495。
2.采用權(quán)利要求1所述的菌種制備人參皂苷Rh2的方法，其特征在于，包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)鐮刀霉菌(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCCNo.1495；培養(yǎng)后的霉菌發(fā)酵液經(jīng)抽濾獲得菌絲體，洗滌，破碎細(xì)胞，離心取上清液作為酶源，以人參皂苷Rg3為底物，其加入量為0.5～20g/L(反應(yīng)物總體積)，酶的加入量為10～100U/g底物，在pH 3.0～8.0的緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20～60℃，反應(yīng)時(shí)間為3～30小時(shí)，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集人參皂苷Rh2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，水解反應(yīng)的pH是5.0～6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)溫度為35～50℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的緩沖液為NaAc/HAc體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)鐮刀霉菌(Fusariumproliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495包括下列步驟(1)斜面培養(yǎng)將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，20～40℃恒溫培養(yǎng)1～5天；(2)搖瓶培養(yǎng)搖瓶裝液量10～30％(v/v)，接種量2～10％(v/v)，培養(yǎng)溫度20～50℃，搖床轉(zhuǎn)速60～300r/min，搖瓶培養(yǎng)1～5天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鐮刀霉菌及其用于制備人參皂苷Rh2的方法。用于制備人參皂苷Rh2的是一種屬于鐮刀霉菌屬的菌種(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495。本發(fā)明為在溫和條件下催化水解相對(duì)易得的人參皂苷制備極具應(yīng)用潛力的稀有皂苷提供了一株制備方便、價(jià)格相對(duì)低廉的鐮刀菌株，用該菌株制備人參皂苷Rh2，成本相對(duì)較低，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60％以上，所得皂苷純度≥95％。
文檔編號(hào)C12P1/02GK1793320SQ200510111138
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者許建和, 蘇金環(huán) 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)