專利名稱：在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是一種在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
利用基因工程進(jìn)行農(nóng)藝性狀的改良和利用植物作為生物反器生產(chǎn)某些藥用蛋白和藥用成份分子，已經(jīng)成了植物基因工程的研究熱點(diǎn)。迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物中，但有些優(yōu)良性狀是由多基因控制的，同時(shí)某些分子的合成代謝途徑也是有多基因參與的。常規(guī)的多基因的轉(zhuǎn)化方法是分別將單個(gè)基因裝入表達(dá)載體中，然后分別轉(zhuǎn)入受體植物中進(jìn)行后代雜交篩選獲得多基因的轉(zhuǎn)化體，或者對獲得的轉(zhuǎn)化體再進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，或者進(jìn)行多個(gè)載體共轉(zhuǎn)化，但是這些這種方法繁瑣，費(fèi)時(shí)，同時(shí)由于多次的基因操作帶來了隨后的抗生素篩選的困難，另外多個(gè)載體共轉(zhuǎn)化的方法效率比較低，并且隨著載體數(shù)的增多，獲得的所需多基因轉(zhuǎn)化體的頻率大幅度下降，所以目前急需要一種可以一次同時(shí)進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建方法。
葉綠體是地球上獨(dú)特的將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的細(xì)胞器，隨著人們逐步研究清楚了葉綠體的遺傳和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，利用葉綠體遺傳工程改良植物性狀和表達(dá)有價(jià)值的蛋白及其他代謝物質(zhì)越來越受到科學(xué)家的重視。葉綠體遺傳工程除了具有葉綠體基因組的多拷貝導(dǎo)致的高表達(dá)量、母性遺傳帶來的沒有基因污染、定點(diǎn)整合消除了基因沉默的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有原核特性，即某些基因是以多順反子的形式形成一個(gè)operon進(jìn)行表達(dá)的，這一特點(diǎn)為利用葉綠體遺傳工程同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因奠定了理論基礎(chǔ)。新生仔豬腹瀉(又稱仔豬黃痢)，是一種發(fā)病迅速，發(fā)病率和死亡率均很高的傳染病，是養(yǎng)豬場，特別是集約化養(yǎng)豬場的常見傳染病。仔豬的發(fā)病率往往在90％以上，對于仔豬的成活、發(fā)育和增重等有嚴(yán)重影響，同時(shí)還降低飼料報(bào)酬等，估計(jì)全國每年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)十億元。新生仔豬腹瀉是由毒素源性大腸桿菌引起的，病菌感染仔豬以后，藉鞭毛的作用附著在仔豬的腸上皮細(xì)胞上，在那里大量繁殖，并產(chǎn)生大量毒素，受感染仔豬劇烈腹瀉，排出黃色或黃白色水樣糞便，并迅速脫水而死亡。目前預(yù)防新生仔豬腹瀉主要是采取基因工程的菌株來免疫接種妊娠后期的母豬，激發(fā)免疫反應(yīng)，給哺乳仔豬腸道提供被動(dòng)免疫保護(hù)。
毒素源性大腸桿菌表面的鞭毛抗原和菌體分泌的腸毒素是兩個(gè)重要的致病因子，根據(jù)菌株的不同，此類產(chǎn)腸毒素大腸桿菌攜帶有不同的鞭毛抗原類型，如K88、K99、P、Type 1、S、987P、CFA/I等。在這些菌株中以K88鞭毛抗原型的ETEC流行性最廣，K88鞭毛由大量的主要結(jié)構(gòu)蛋白亞基FaeG和少量的小亞基(FaeC，F(xiàn)aeD，F(xiàn)aeE，F(xiàn)aeF，F(xiàn)aeG，F(xiàn)aeH，F(xiàn)aeI，F(xiàn)aeJ)組成，這些鞭毛亞基穿越細(xì)胞質(zhì)膜到周質(zhì)后按一定的機(jī)制組裝成鞭毛。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon inchloroplast leads to formation of insecticidal crystals(在葉綠體中過量表達(dá)Bt cry2Aa2操縱子后形成抗蟲劑晶體).De Cosa et al(2001)首次報(bào)道了在葉綠體中表達(dá)多基因，他們證明了煙草的葉綠體能夠表達(dá)蘇云金芽孢桿菌cry2Aa2操縱子的三個(gè)基因，cry2Aa2本身是該操縱子中的第三個(gè)基因，前兩個(gè)基因編碼輔助蛋白，其中一個(gè)作為分子伴侶促進(jìn)毒素蛋白折疊成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并且形成晶體。這種方法得到的重組cry2Aa2蛋白表達(dá)量達(dá)到了45％/TSP，這些為利用葉綠體遺傳工程同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因鋪平了道路，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題密切聯(lián)系的文獻(xiàn)與專利的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac鞭毛蛋白基因簇中從faeC到faeI的七個(gè)基因的煙草葉綠體表達(dá)載體，通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法對煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)七個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。提供一種在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，使其首次在植物葉綠體中進(jìn)行7個(gè)外源基因的表達(dá)，同時(shí)為生產(chǎn)誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明構(gòu)建了一種葉綠體表達(dá)載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質(zhì)粒，以野生菌C83907的質(zhì)粒為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長基因faeCD的擴(kuò)增產(chǎn)物，為3011bp，且核苷酸序列與SEQ IDNO.5相同；將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTCD，用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長基因faeEI的擴(kuò)增產(chǎn)物，為4186bp，且核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。
所述的外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組中，是指(1)構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段(Targeting fragment)。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。
(2)同時(shí)要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rps12rps7，psbA/trnK，rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。
(3)所構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體選擇rbcL/accD，作為同源重組片段。
在外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組中，植物的葉綠體中轉(zhuǎn)錄目的基因中包含第一代和第二代轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生；所述的K88ac鞭毛蛋白是毒素源性大腸桿菌的鞭毛蛋白；所述的K88ac鞭毛蛋白，葉綠體的基因組中整合有K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因；所述的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因序列，蛋白表達(dá)在獲得的轉(zhuǎn)基因植物中。
所述的外源基因，其表達(dá)框以16S rRNA啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，1，5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因3’端非翻譯區(qū)(ribulose-1，5-biphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit gene 3’UTR)作為外源基因表達(dá)框的終止子。為了確保外源基因在煙草葉綠體中的表達(dá)，分別在基因faeC和faeE的起始密碼子前添加核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)GGAGG。
大腸桿菌克隆pTCD用SalI和BamH I雙切，回收3kb的條帶，pBSK用同樣的酶切，回收載體，連接轉(zhuǎn)化后獲得中間載體pBSKCD；pBSKCD用BamH I和Sac I酶切回收載體，大腸桿菌克隆pTEI用同樣的酶切回收4186bp的條帶，連接轉(zhuǎn)化，獲得中間載體pBSKCDEI。pBSKCDEI用Sac I和Sal I酶切，回收7kb的條帶，葉綠體表達(dá)載體pCAB用同樣的酶切，回收載體，連接轉(zhuǎn)化，獲得最后的全長基因的葉綠體表達(dá)載體pAB88。葉綠體表達(dá)載體pAB88，含有與SEQ ID NO5和SEQ ID NO6相同的核苷酸序列。通過基因槍轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)載體pAB88導(dǎo)入到煙草的葉綠體中，通過同源重組的方法將外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組中，并通過ELISA的方法檢測外源基因的表達(dá)。
選擇光系統(tǒng)IIDl蛋白基因(photosystem II Dl protein(psbA)gene)啟動(dòng)子(PpsbA)作為抗性篩選基因aadA的啟動(dòng)子。同時(shí)以該基因的3’端非翻譯區(qū)作為aadA的終止子。氨基糖苷3’-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(Streptothricinacetyltransferases and aminoglycoside adenyltransferase)基因aadA作為抗性篩選基因，提供壯觀酶素/鏈霉素抗性，來篩選葉綠體轉(zhuǎn)化植物。
由于高等植物每個(gè)細(xì)胞中含有數(shù)目眾多的葉綠體和葉綠體基因組，因此轉(zhuǎn)化后經(jīng)過抗性篩選的到的轉(zhuǎn)基因植物一般是異質(zhì)的(heteroplasmic)，即轉(zhuǎn)化葉綠體和未被轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植物中，經(jīng)過篩選后所有的葉綠體基因組都被轉(zhuǎn)化的狀態(tài)稱為同質(zhì)化(homoplasmic)。
本發(fā)明獲得的七個(gè)基因的葉綠體同時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQID NO.5和SEQ ID NO.6相同，利用該載體對煙草進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，獲得了七個(gè)基因的葉綠體表達(dá)植物，并且在轉(zhuǎn)基因植物中檢測到有FaeC、FaeD、FaeE、FaeF、FaeG、FaeH、FaeI蛋白的表達(dá)，對克服傳統(tǒng)的植物遺傳改良的多基因操作技術(shù)的關(guān)鍵缺陷，具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為生產(chǎn)誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。


圖1K88基因簇在煙草葉綠體中表達(dá)的載體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2FaeC等基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方案1.實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌菌株DH5α、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；K88野生菌株C83907購自中國獸藥監(jiān)察所(China Institute of Veterinary Drug Control)；大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a(+)購自Novagen公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。
1.2主要生化試劑Taq DNA聚合酶，dNTPs，限制性內(nèi)切酶，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)等均購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；pfu DNA聚合酶、IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽)、NBT(氯化氮藍(lán)四唑)等均購自Promega公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermantas GmbH和NEB公司。
1.3煙草煙草(Nicotiana tabacum cv Kexin No.1)由本實(shí)驗(yàn)室保存。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1C83907野生菌質(zhì)粒的提取從培養(yǎng)基平板上挑取含目的質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18h以上(37℃，85rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，3000rpm，2min)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾干管壁上的殘余液滴。加入100μl預(yù)冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關(guān)閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉(zhuǎn)離心管；加入150μl溶液III，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，-20℃放置30min。離心(4℃，13000rpm，10min)，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃放置10min以上，離心(4℃，13000rpm，10min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數(shù)分鐘，待管壁上的殘余乙醇液滴完全揮發(fā)，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保溫30min，DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.2PCR擴(kuò)增在無菌PCR管中加入5μl 10×Pfu PCR緩沖液，5μl 2mM dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，5 U Pfu DNA聚合酶，加水至50μl總體積，最后加適量礦物油以防止蒸發(fā)。反應(yīng)條件如下94℃，5min；94℃ 30sec，56℃ 30Sec，72℃ 2min(退火溫度及延伸時(shí)間根據(jù)引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長度不同作相應(yīng)改變)，35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10min。
反應(yīng)結(jié)束后，在PCR體系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃ 45min。
2.3DNA片段的回收PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的Agrose凝膠電泳，切取含有目的DNA條帶的膠塊進(jìn)行回收，方法參照杭州維特潔公司的膠回收試劑盒說明。
2.4DNA連接反應(yīng)在無菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR產(chǎn)物，0.25μl pMD18-T載體，1μl T4 DNA連接酶，總體積為10μl。將各組分混勻，4℃中連接16h。當(dāng)PCR產(chǎn)物與載體DNA片段通過酶切形成的互補(bǔ)粘端相連時(shí)，兩者之間的質(zhì)量比為5∶1。
2.5制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞在LB平板上劃線接種大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。用接種環(huán)挑取10-12個(gè)單菌落(2-3mm直徑)，接種于250mL的SOB培養(yǎng)液中。振蕩培養(yǎng)(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細(xì)胞。用80ml預(yù)冷的TB溶液重懸細(xì)胞，冰浴10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細(xì)胞。用20ml預(yù)冷的TB輕輕地重懸細(xì)胞，加入DMSO至終濃度7％，輕輕混勻，置于冰上。10min后，按每管500μl分裝細(xì)胞懸液于無菌的eppendorf管中。用液氮快速冷凍，儲存于-70℃。
2.6DNA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受態(tài)細(xì)胞與10μl的DNA連接產(chǎn)物，手指輕彈管壁，混勻混合物。冰浴30min。42℃，溫育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培養(yǎng)液，37℃，劇烈振蕩混合液1h。將混合液涂布在選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。
2.7DNA序列分析采用ABI377型測序儀(購自美國ABI公司)測定DNA序列，用PCGENE軟件分析序列，由上海博亞生物公司完成。
2.8小量制備質(zhì)粒DNA從培養(yǎng)基平板上挑取含目的質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，3000rpm，1min)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾干管壁上的殘余液滴。加入100μl預(yù)冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關(guān)閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉(zhuǎn)離心管；加入150μl溶液III，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，-20℃放置30min。離心(4℃，13000rpm，10min)，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃放置10min以上，離心(4℃，13000rpm，10min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數(shù)分鐘，待管壁上的殘余乙醇液滴完全揮發(fā)，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保溫30min，DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.9限制性內(nèi)切酶酶切DNA酶切反應(yīng)參照限制性內(nèi)切酶試劑盒(購自TAKARA公司)說明書中的具體操作進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，回收操作與PCR產(chǎn)物回收相同。
2.10煙草葉綠體轉(zhuǎn)化---基因槍法通過基因槍法實(shí)行葉綠體的轉(zhuǎn)化，方法參照(Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917)。
用包裹有pAB88質(zhì)粒DNA的直徑為1.0um的金粉，采用基因槍Bio-Rad PDS1000/He進(jìn)行轟擊放置在ROMP培養(yǎng)基(MS鹽，加上0.2M/L山梨醇和0.2M/L的甘露醇，30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)野生型煙草葉片，轟擊壓力1，100psi；轟擊距離9cm.轟擊后的葉片移至到MS培養(yǎng)基上(MS鹽，30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)光培養(yǎng)4天后，將葉片剪成5mm見方的小塊放置到上選培養(yǎng)基(MS鹽，1.5mg/L 6BA，0.15mg/L IAA，500mg/L壯觀霉素30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)上進(jìn)行分化培養(yǎng)，每2周根換一次分化培養(yǎng)基；待長出綠色小苗時(shí)，移栽至生根培養(yǎng)基(MS鹽，500mg/L壯觀霉素30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
2.11外源蛋白的ELISA檢測取100mg轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，加液氮研磨，加入適量的蛋白抽提buffer(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
用大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的純化的FaeC，F(xiàn)aeD，F(xiàn)aeE，F(xiàn)aeF，F(xiàn)aeH，F(xiàn)aeI蛋白經(jīng)PBS稀釋后，加50μl到96孔酶標(biāo)板中，作為陽性對照，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因煙草的總可溶性蛋白作為陰性對照，總蛋白量保持相同，25℃包被過夜。用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉緩沖液(0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12M NaCl，pH8.5)，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉緩沖液稀釋(1∶300)的小鼠血清，4℃孵育2h。用重蒸水沖洗三次后，加入封閉緩沖液封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉緩沖液稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液[稱取5mg NPP，溶于50μl ddH2O中，取10μl用NPP緩沖液(0.1MGlycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH10.4)稀釋到1ml]。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件和具體技術(shù)進(jìn)一步結(jié)合具體實(shí)施闡述本發(fā)明。這些實(shí)施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
如圖1、2所示，實(shí)施例1-6中K88基因簇在煙草葉綠體中表達(dá)的載體結(jié)構(gòu)和FaeC等基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果。
實(shí)施例1——轉(zhuǎn)基因植物中FaeC蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeC蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeC在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的，如圖2(1)。
實(shí)施例2——轉(zhuǎn)基因植物中FaeD蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeD蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeD在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的，如圖2(2)。
實(shí)施例3——轉(zhuǎn)基因植物中FaeE蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeE蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μ1封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeE在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的，如圖2(3)。
實(shí)施例4——轉(zhuǎn)基因植物中FaeF蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeF蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeF在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的，如圖2(4)。
實(shí)施例5——轉(zhuǎn)基因植物中FaeG蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeG蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeG在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的(結(jié)果未列出)。
實(shí)施例6——轉(zhuǎn)基因植物中FaeH蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑
(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeH蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeH在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的(結(jié)果未列出)。
實(shí)施例7——轉(zhuǎn)基因植物中FaeI蛋白的表達(dá)1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調(diào)節(jié)pH到9.6；(2)封閉buffer
0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標(biāo)板中，同時(shí)加等量的大腸桿菌表達(dá)的FaeI蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應(yīng)。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結(jié)果表明，外源蛋白FaeI在轉(zhuǎn)基因煙草中是有所表達(dá)的(結(jié)果未列出)。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度33bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1aaaaaagcttatgaaaaaagcattcttattagc(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2aaaaaggatccttattactcacacgtaatctcctgtagtttc(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度27bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3ggatccagttgtagggagggatttatg(4)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征(A)長度32bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4gagctcttattactggtactcaatacttaccg(5)SEQ ID NO.5-6的信息<110>上海交通大學(xué)<120>一種在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>5<211>3011<212>DNA<213>Escherichia coli<400>5aagcttatga aaaaagcatt cttattagca tgtgtttttt ttctcactgg gggcggggtt 60tctcacgctg cggttcagaa aaccatattc agtgctgacg tggtggcctc ggtctgtcat120gtggtggtgg atgcggacag caccggcaac agtggccggc tgacgttcgg gacttaccgt180aagtccacgg gggcatctgt accgccgcgt gacttcacgg tgcgtctgta tgagtccggc240gccacggttc agggttgctc tgcgtttctt gccgggcagg tcgccaccct ggattttggt300aacccgggac aactggacgc tgccggcgtg gtcacccgcg gtgccggtga tggtattcgc360gtggatgtac gggctgttga tgcacaggct gattatcgcg gacgtctgac gcaggataac420cattccgtga aatatccggt ggattttgcc gctaagggcc agtttcgttt tcgtgcgcag480ccggtgtttc cggctgatgt gaaggcggga gagtattccg gggcgctgac ttttgttgtc540
acttatcagt agtagggatg ccaatgaaaa aatatgtgac aacaaaatca gtgcagccag600tggcgtttcg tctgacaacc ctgagtctgg ttatgtcggc ggtactgggc agcgcatcgg660ttattgccgg tgaaaaactg gatatgtcct ttatccaggg ggggggcggg gttaatccgg720aagtctgggc agccctgaac ggcagctatg cgccggggcg ttatctggtt gacctgtccc780tgaacgggaa ggaggccggg aaacagatac tggatgtgac accacaggac agtaatgaac840tgtgtctgac agaggcatgg ctgacgaagg ctggggttta cgtcagtgca gattactttc900gtgagggata tgacgccaca cgacagtgct atgtgctgac aaaagccccg tcagtgaagg960tggattttga tgtttccacc cagagtctgg cgctgtccat tccccagaag gggctggtga 1020agatgccgga gaatgtggac tgggattacg ggaccagtgc atttcgcgtg aactataacg 1080cgaacgccaa caccggccgt aataacacct cggcctttgg ctcagcggac ctgaaagcca 1140atatcgggca ctgggtggtg agttcttctg ccacggccag cggcggtgac agcggggata 1200actccaccac gataaatatg tttacggcca cccgggccat ccgcgcactg agtgcggacc 1260tggcggtcgg gaaaacatcc accggggaca gtctgctggg cagtacggga acgtacggcg 1320tgtcgctgag ccggaacaac agcatgaagc cgggcaatct ggggtatacc ccggtgttca 1380gcggcattgc gaacgggccg tcgagggtga cactgacaca gaacgggcgg ttgctgcatt 1440cggagatggt gccggcgggt ccgttctcca tcacggatgt gccgctgtac accagtggtg 1500atgtgaccat gaaaatcacc ggtgaagacg ggcgcgacga ggtacagaac ttcccgttgt 1560cggtgatggc cgggcagtta agtccggggc agcacgagtt cagtgtggca gccggtttgc 1620ctgacgatga cagtgacctg aaaggcggtg tgtttgcggc gtcatacggt tacggtctgg 1680acggactgac gctgcgagcc ggtggggtgt tcaaccagga ctggcagggg gccagtgccg 1740gtgtggttgc cgggctgggt tacctggggg cggtatctgc tgacggggct tatgccacgg 1800cgaaataccg tgacggcagc cacagcggga ataaggtgca gctgtcctgg agtaaacaac 1860tggagacgac gaacaccggg ctgcgggtaa gctggtcacg gcagagtgag gaatatgagg 1920gcatgtcctc ctttgacccg acagagctgt ggtcgcagtc aaatcatggg cgccggacga 1980aggatgaatg gaatgccggt atcagtcagc cggtgggcgg gttgttcagt ctgtcggtgt 2040ccggctggca gcggagttat taccctgcat ccatgaccgg aagttaccgg tacagcgatg 2100acaacggaaa agaaaccggt attaccggca gtctgagtac ccagataaag ggtgtcagtc 2160tgaacctggg ctggtccggc tcccggaact cccgggggga gaataactgg tcggcgtctg 2220cttcggtgtc ggtaccgttc acactgtttg accgtcgcta cagcagcagt gcgtcggtga 2280
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1.一種在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建了一種葉綠體表達(dá)載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質(zhì)粒，以野生菌C83907的質(zhì)粒為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長基因faeCD的擴(kuò)增產(chǎn)物，為3011bp，且核苷酸序與SEQ ID NO.5相同；將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTCD，用核苷酸序列與SEQ IDNO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長基因faeEI的擴(kuò)增產(chǎn)物，為4186bp，且核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，所述的外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組中，是指(1)構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)；(2)同時(shí)要求同源重組發(fā)生以后，都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)；(3)所構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體選擇rbcL/accD，作為同源重組片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，在外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組中，植物的葉綠體中轉(zhuǎn)錄目的基因中包含第一代和第二代轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，所述的K88ac鞭毛蛋白是毒素源性大腸桿菌的鞭毛蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，所述的K88ac鞭毛蛋白，葉綠體的基因組中整合有K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，所述的外源基因，其表達(dá)框以16S rRNA啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，1，5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因3’端非翻譯區(qū)(ribulose-1，5-biphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit gene 3’UTR)作為外源基因表達(dá)框的終止子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者3所述的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法，其特征是，所述的外源基因，外源基因在煙草葉綠體中的表達(dá)中，分別在基因faeC和faeE的起始密碼子前添加核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)GGAGG。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的在葉綠體中同時(shí)表達(dá)7個(gè)外源基因的載體構(gòu)建方法。構(gòu)建了一種葉綠體表達(dá)載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個(gè)基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質(zhì)粒，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核苷酸序列3018bp與SEQ ID NO.5相同；用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。對克服傳統(tǒng)的植物遺傳改良的多基因操作技術(shù)的關(guān)鍵缺陷，同時(shí)為生產(chǎn)誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。
文檔編號C12N15/09GK1793377SQ200510111228
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者張大兵, 申慧峰, 梁婉琪, 錢炳俊, 袁政 申請人:上海交通大學(xué)