專利名稱：犬類精液稀釋液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬類精液稀釋液，用于犬類精液稀釋后常溫或低溫體外保存以及飼養(yǎng)犬類的人工授精，屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬是人類的朋友，尤其是寵物犬——風(fēng)姿倬約、體態(tài)玲瓏，所以寵物犬成為大自然美的精靈，為人類所崇尚，為人類所喜愛(ài)。我國(guó)城鄉(xiāng)居民隨著經(jīng)濟(jì)條件的改善，飼養(yǎng)寵物的人越來(lái)越多，人們已經(jīng)意識(shí)到飼養(yǎng)寵物犬所帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)效益，已把人工飼養(yǎng)寵物犬作為一種新興飼養(yǎng)業(yè)來(lái)發(fā)展，寵物犬除了進(jìn)入人類的物質(zhì)生活外，逐漸進(jìn)入人類的精神生活。目前國(guó)內(nèi)各地區(qū)已經(jīng)廣泛開(kāi)展了犬類的人工養(yǎng)殖，現(xiàn)有寵物犬上億只。我國(guó)犬的品種不僅以特有的使用和觀賞價(jià)值著稱于世界，而且對(duì)世界著名品種的形成產(chǎn)生過(guò)重要的影響，如西藏的馬士迪夫(獒)、西施犬、北京犬、西藏拉薩犬(埃普索犬)等，作為珍貴犬的品種資源，已經(jīng)成為世界人民的共同財(cái)富。然而在犬類長(zhǎng)期養(yǎng)殖過(guò)程中，由于飼養(yǎng)及人工繁殖的條件限制，特別是雜交育種技術(shù)的條件限制直接導(dǎo)致我國(guó)人工飼養(yǎng)的犬類品種質(zhì)量退化，在國(guó)際寵物犬市場(chǎng)上逐漸失去競(jìng)爭(zhēng)力，給養(yǎng)犬者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙我國(guó)犬類飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展。
在世界寵物犬市場(chǎng)中可以發(fā)現(xiàn)，名貴犬種正以其獨(dú)特的身價(jià)、良好的開(kāi)發(fā)前景逐漸被人們所接受，優(yōu)質(zhì)寵物犬將以它高品質(zhì)受到更多人的青睞。隨著人類飼養(yǎng)技術(shù)、繁殖水平的提高，寵物飼養(yǎng)種類越來(lái)越多。同我國(guó)飼養(yǎng)的犬類相比，國(guó)外犬類品種繁多、質(zhì)量較高，尤其是新型品種價(jià)格昂貴。其主要原因是人工繁殖技術(shù)的應(yīng)用，通過(guò)人工授精技術(shù)雜交改良原有自繁犬類品種，既能克服不同品種間自然交配難題，又能通過(guò)雜交優(yōu)勢(shì)培育出新型品系，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何進(jìn)一步保存、利用、開(kāi)發(fā)我國(guó)的犬種資源，是一項(xiàng)非常重要的研究課題，深入開(kāi)展此方面的研究工作，必將對(duì)我國(guó)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生活產(chǎn)生難以估量的積極作用。
人工授精繁殖技術(shù)包括利用稀釋后的鮮精液和解凍后的凍精輸精兩種方式。當(dāng)前國(guó)內(nèi)犬類養(yǎng)殖中普遍采用鮮精進(jìn)行人工授精繁殖，繁殖過(guò)程中多半是直接利用鮮精進(jìn)行人工授精，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)稀釋液的稀釋，這種方法只是克服不同品系之間交配困難的弊端，而沒(méi)有達(dá)到充分利用種公犬的目的，同時(shí)在繁殖效果方面亦不是很理想，嚴(yán)重影響犬類雜交育種的進(jìn)程。目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有關(guān)犬類精液液稀釋的研究報(bào)導(dǎo)，而國(guó)外也只限于犬類精液冷凍稀釋液的研究報(bào)導(dǎo)配方一葡萄糖(0.033M)、果糖(0.033M)、氨基乙酸(0.0625M)、檸檬酸(0.0385M)、磺胺(0.1M)青霉素(1000IU/ml)蒸餾水(定容為100ml)。用此配方稀釋犬類鮮精液并進(jìn)行超低溫冷凍保存，精子復(fù)蘇后凍融精子活力為0.52，質(zhì)膜完整率和頂體完整率均能達(dá)到58％。(Yu et al，Cryobiology.2002，44(1)62-78.)。
配方二三羥甲基胺基甲烷(240mM)、檸檬酸(63mM)、果糖(70mM)、蒸餾水(定容為100mL)、青霉素(1000IU/ml)。用此配方稀釋犬類鮮精液并進(jìn)行超低溫冷凍保存，精子復(fù)蘇后凍融精子活力為0.5，質(zhì)膜完整率和頂體完整率均能達(dá)到55％。(Yildiz et al，Theriogenology.2000，54(4)579-85.)。
N-乙?；?D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是幾丁質(zhì)的主要成分，存在于昆蟲和甲殼動(dòng)物的外骨骼中，屬于多糖同聚物，在細(xì)胞外表層、細(xì)胞間隙及結(jié)締組織形成時(shí)提供主要的結(jié)構(gòu)成分，使動(dòng)植物組織有彈性和韌性。Breborowicz等報(bào)道N-乙?；?D-葡萄糖胺通過(guò)人體腹膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞能有效激活體內(nèi)葡萄胺聚糖的合成(Breborowicz等，1998，Adv.Perit.Dial.14，31-35.)。另?yè)?jù)報(bào)道，N-乙酰基-D-葡萄糖胺已成功應(yīng)用于豬精液冷凍稀釋液中(Yi等，2002，Animal Reproduction Science.74，187-194.)，但關(guān)于N-乙?；?D-葡萄糖胺在犬類精液稀釋液方面的研究目前還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種犬類精液稀釋液，使之能有效延長(zhǎng)常溫或低溫條件下犬類精子的存活時(shí)間，有利于維持犬類精子的質(zhì)膜完整性及頂體完整性，提高犬類人工授精的受孕率。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明的犬類精液稀釋液采用了細(xì)胞培養(yǎng)液成分N-乙?；?D-葡萄糖胺，同時(shí)添加果糖、葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、檸檬酸、乙二胺四乙酸等各種成分，用蒸餾水配制而成。
本發(fā)明配制的犬類精液稀釋液具體包含如下成分N-乙?；?D-葡萄糖胺 0.01～0.10克果糖和/或葡萄糖 0.55～3.85克檸檬酸 0.85～2.50克三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克乙二胺四乙酸0.05～1.00克殺菌劑 1000UI/毫升蒸餾水加至100毫升。
稀釋液pH值為6.15～6.95，滲透壓為310～350mOsmo/L。
本發(fā)明所述殺菌劑可選擇青霉素或慶大霉素，也可以為其他具有殺菌作用的抗生素。
優(yōu)選的稀釋液(1)含有如下成分N-乙酰基-D-葡萄糖胺 0.08克果糖1.35克檸檬酸 1.80克三羥甲基胺基甲烷3.38克乙二胺四乙酸0.16克青霉素或慶大霉素1000UI/毫升加蒸餾水至100毫升。
稀釋液pH值為6.65，滲透壓為325mOsmo/L。
優(yōu)選的稀釋液(2)含有如下成分N-乙?；?D-葡萄糖胺 0.06克葡萄糖 2.85克檸檬酸 1.45克三羥甲基胺基甲烷 2.48克乙二胺四乙酸 0.23克青霉素或慶大霉素 1000UI/毫升加蒸餾水至100毫升。
稀釋液pH值為6.85，滲透壓為320mOsmo/L。
優(yōu)選的稀釋液(3)含有如下成分N-乙?；?D-葡萄糖胺0.05克果糖 1.08克葡萄糖 0.75克檸檬酸 1.03克三羥甲基胺基甲烷 2.10克乙二胺四乙酸 0.15克青霉素或慶大霉素 1000UI/毫升加蒸餾水至100毫升。
稀釋液pH值為6.60，滲透壓為335mOsmo/L。
本發(fā)明的稀釋液可按本領(lǐng)域的常規(guī)方法配制，按所述含量分別加入上述成分，再加蒸餾水，配成100毫升溶液即可。配制成的稀釋液pH值為6.15～6.95，滲透壓為310～350mOsmo/L，可為犬類精子體外存活提供最佳基質(zhì)條件。
本發(fā)明的犬類精液稀釋液中的果糖、葡萄糖成分為精子在體外代謝的能量來(lái)源，三羥甲基胺基甲烷、檸檬酸及乙二胺四乙酸可維持稀釋液環(huán)境與精子內(nèi)環(huán)境的滲透壓平衡。此外，在本發(fā)明的稀釋液中還加入青霉素或慶大霉素(1000UI/毫升)等殺菌劑，提高稀釋液的常溫及低溫保存效果。
本發(fā)明使用由N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多種成分組成的稀釋液，犬類鮮精液稀釋后在5℃、22℃條件下體外保存，并用稀釋后的鮮精液進(jìn)行人工授精，研究該稀釋液對(duì)犬類精子存活時(shí)間精子質(zhì)量及生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果表明由N-乙?；?D-葡萄糖胺等多種成分組成的稀釋液，稀釋犬類鮮精液體外保存時(shí)，能有效延長(zhǎng)犬類精子的存活時(shí)間、保護(hù)精子質(zhì)膜和頂體結(jié)構(gòu)的完整性，表現(xiàn)出良好的精子保護(hù)作用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的稀釋液具有如下優(yōu)點(diǎn)1、能夠有效延長(zhǎng)常溫(22℃)條件下犬類精子的存活時(shí)間，提高犬類精子體外保存的質(zhì)量，提高人工授精的受孕率；2、能夠有效延長(zhǎng)低溫(5℃)條件下保存犬類精子的存活時(shí)間，延長(zhǎng)稀釋后精子的壽命，提高精子質(zhì)膜完整率及頂體完整率；3、配制簡(jiǎn)單，取材容易，成本價(jià)格低廉，易于推廣。
本發(fā)明的犬類精液稀釋液既適用于鮮精稀釋后人工輸精繁殖，也適用于犬類精液稀釋后的短期保存和短途運(yùn)輸后輸精，顯著提高犬類精子的生存指數(shù)，保持其授精活力。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例的作用應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明的詮釋而非對(duì)本發(fā)明的任何方式的限制。
實(shí)施例1(稀釋液1)先稱取0.08g N-乙?；?D-葡萄糖胺，溶于10ml蒸餾水中，使其完全溶解。稱取1.35g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.80g三羥甲基胺基甲烷、3.38g檸檬酸、0.16g乙二胺四乙酸，按上述順序逐一加入，添加時(shí)待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后把兩種制劑相混合，然后加入10萬(wàn)單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.65，滲透壓為325mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。該配方對(duì)犬類精液稀釋后體外常溫保存效果極佳。使用時(shí)按1∶3比例與犬類精液相混合，同時(shí)要保持稀釋液的溫度與待稀釋精液溫度相同。
實(shí)施例2(稀釋液2)稱取0.06g N-乙?；?D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸餾水中，待完全溶解后放入5℃冰箱保存。稱取2.85g葡萄糖溶于20ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入2.48g三羥甲基胺基甲烷、1.45g檸檬酸、0.23g乙二胺四乙酸，按上述順序逐一加入，添加時(shí)待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后混合均勻并放入5℃冰箱保存。使用時(shí)取出并把兩種制劑相混合，然后加入10萬(wàn)單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.85，滲透壓為320mOsmo/L。所有制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。使用時(shí)按1∶3的比例與犬類精液相混合，同時(shí)要保持稀釋液的溫度與待稀釋的精液溫度相同。
使用按實(shí)施例1、2方法制備的稀釋液按1∶3比例稀釋犬類精液，檢測(cè)5℃、22℃精子存活時(shí)間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測(cè)精子活力)、精子頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯(lián)合染色法檢測(cè)精子頂體完整率)、鮮精稀釋后受孕率。結(jié)果表明在5℃、22℃條件下犬類精子分別存活125小時(shí)、87小時(shí)；利用該稀釋液進(jìn)行鮮精液稀釋保存4小時(shí)后人工輸精，母犬受孕率為95.8％、96.5％，與使用鮮精液立即輸精的母犬受孕率(97.2％)無(wú)顯著差異。
實(shí)施例3(稀釋液3)先稱取1.08g果糖、0.75g葡萄糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.03g檸檬酸、2.10g三羥甲基胺基甲烷、0.15g乙二胺四乙酸，按上述順序逐一加入，添加時(shí)待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后混合均勻并放入5℃冰箱保存。使用時(shí)取出并調(diào)整至所要保存精液的溫度或者人工輸精的溫度，然后稱取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于調(diào)整好溫度的稀釋液中。最后加入10萬(wàn)單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.60，滲透壓為335mOsmo/L。所有制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。該配方對(duì)犬類鮮精液稀釋后體外低溫保存效果極佳。使用時(shí)按1∶3的比例與犬類精液相混合，同時(shí)要保持稀釋液的溫度與待稀釋的精液溫度相同。
利用該稀釋液進(jìn)行鮮精液稀釋后，在5℃、22℃條件下體外保存，精子的存活時(shí)間分別為115小時(shí)、84小時(shí)；利用該稀釋液進(jìn)行鮮精液稀釋保存4小時(shí)后人工輸精，雌犬的受孕率達(dá)到96％，接近于自然交配繁殖的受孕率(98％)。
實(shí)施例4(稀釋液4)先稱取0.03g N-乙?；?D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸餾水中，使其完全溶解。稱取0.70g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入3.08g三羥甲基胺基甲烷、0.95g檸檬酸、0.21g乙二胺四乙酸，按上述順序逐一加入，添加時(shí)待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后把兩種制劑相混合，然后加入10萬(wàn)單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.80，滲透壓為310mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。該配方對(duì)犬類精液稀釋后體外低溫保存效果極佳。使用時(shí)按1∶3比例與犬類精液相混合，同時(shí)要保持稀釋液的溫度與待稀釋精液溫度相同。
實(shí)施例5(稀釋液5)稱取0.07g N-乙?；?D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸餾水中，待完全溶解后放入5℃冰箱保存。稱取2.55g葡萄糖溶于20ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.58g三羥甲基胺基甲烷、2.25g檸檬酸、0.53g乙二胺四乙酸，按上述順序逐一加入，添加時(shí)待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后混合均勻并放入5℃冰箱保存。使用時(shí)取出并把兩種制劑相混合，然后加入10萬(wàn)單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.55，滲透壓為320mOsmo/L。所有制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。該配方對(duì)犬類精液稀釋后體外常溫保存效果極佳。使用時(shí)按1∶3的比例與犬類精液相混合，同時(shí)要保持稀釋液的溫度與待稀釋的精液溫度相同。
使用按實(shí)施例3、4方法制備的稀釋液按1∶3比例稀釋犬類精液，檢測(cè)5℃、22℃精子存活時(shí)間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測(cè)精子活力)、精子頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯(lián)合染色法檢測(cè)精子頂體完整率)、鮮精稀釋后受孕率。結(jié)果表明在5℃、22℃條件下犬類精子分別存活120小時(shí)、85小時(shí)；利用該稀釋液進(jìn)行鮮精液稀釋保存4小時(shí)后人工輸精，母犬受孕率為94.5％、96.1％，與使用鮮精液立即輸精的母犬受孕率(97.2％)無(wú)顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種犬類精液稀釋液，其特征在于由N-乙?；?D-葡萄糖胺0.01～0.10克，果糖和/或葡萄糖0.55～3.85克，檸檬酸0.85～2.50克，三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克，乙二胺四乙酸0.05～1.00克，殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，稀釋液pH值為6.15～6.95，滲透壓為310～350mOsmo/L。
2.如權(quán)利要求1的犬類精液稀釋液，其特征在于由N-乙?；?D-葡萄糖胺0.08克，果糖1.35克，檸檬酸1.80克，三羥甲基胺基甲烷3.38克，乙二胺四乙酸0.16克，殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，稀釋液pH值為6.65，滲透壓為325mOsmo/L。
3.如權(quán)利要求1的犬類精液稀釋液，其特征在于由N-乙?；?D-葡萄糖胺0.06克，葡萄糖2.85克，檸檬酸1.45克，三羥甲基胺基甲烷2.48克，乙二胺四乙酸0.23克，殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，稀釋液pH值為6.85，滲透壓為320mOsmo/L。
4.如權(quán)利要求1的犬類精液稀釋液，其特征在于由N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克，果糖1.08克，葡萄糖0.75克，檸檬酸1.03克，三羥甲基胺基甲烷2.10克，乙二胺四乙酸0.15克，殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，稀釋液pH值為6.60，滲透壓為335mOsmo/L。
5.如權(quán)利要求1或2或3或4的犬類精液稀釋液，其特征在于所述的殺菌劑為青霉素或者慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種犬類精液稀釋液，屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。由N－乙?；璂－葡萄糖胺0.01～0.10克、果糖和/或葡萄糖0.55～3.85克、檸檬酸0.85～2.50克、三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克、乙二胺四乙酸0.05～1.00克、殺菌劑 1000 UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，稀釋液pH值為6.15～6.95，滲透壓為310～350mOsmo/L。本發(fā)明的稀釋液能夠有效延長(zhǎng)低溫或常溫條件下犬類精子的存活時(shí)間，有利于維持犬類精子的質(zhì)膜完整性及頂體完整性，提高犬類人工授精的受孕率。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1800369SQ200510111519
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者李新紅, 華修國(guó) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)