專利名稱：重組人纖溶酶原Kringle 5(hk5)生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種重組人纖溶酶原h(huán)K5(HumanPlasminogen Kringle 5)的生產(chǎn)方法，以及用于該方法的表達(dá)載體和宿主菌株。
背景技術(shù)：
腫瘤是一類常見病和多發(fā)病，對(duì)人類的生命和健康威脅很大。全世界每年約有500萬人死于腫瘤。在有些國家，腫瘤已占據(jù)死亡原因的第二位，甚至第一位。
惡性腫瘤細(xì)胞，包括癌和肉瘤的細(xì)胞，通稱為癌細(xì)胞。癌細(xì)胞是從相應(yīng)正常組織的細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，它既不同于正常細(xì)胞，又不同程度地保持著來源組織細(xì)胞的某些固有特征。對(duì)大多數(shù)惡性腫瘤，很容易錯(cuò)過早期發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)，可以作出臨床診斷時(shí)，癌細(xì)胞往往已經(jīng)經(jīng)歷了10-30次倍增，細(xì)胞數(shù)達(dá)到百億甚至千億，重10-100g，直徑22-47mm。當(dāng)?shù)竭_(dá)40次倍增時(shí)，已發(fā)展到萬億個(gè)癌細(xì)胞，重約1kg，直徑100mm；而正常成年人大約有50萬億個(gè)細(xì)胞(5×1013)，此時(shí)的癌足以使宿主致死。
五十多年來，在腫瘤治療領(lǐng)域占主導(dǎo)地位的是直接策略，即所選擇的靶目標(biāo)是腫瘤細(xì)胞本身。體外能夠殺死腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒藥物被用作體內(nèi)化療侯選藥物。直到現(xiàn)在，癌癥病人仍主要依賴手術(shù)或放療來切除腫瘤或使原發(fā)瘤消退，再緊接著進(jìn)行放化療，以消除體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞。然而，正常細(xì)胞也對(duì)化療藥物敏感，而且癌細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定，經(jīng)常暴露于化療下最終導(dǎo)致抗藥性。腫瘤治療的另一方法是間接策略，即抗血管生成治療，它不直接破壞腫瘤，而是通過限制腫瘤的血液供給，使腫瘤阻止腫瘤生長或使其消退。應(yīng)用這一策略，腫瘤學(xué)家的注意力就不僅僅局限于單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞本身，而是總體腫瘤組織，尤其是血管生成過程?；谶@種概念，人們采用新方法來尋找新型抗癌藥物。
70年代Folkman提出腫瘤是一個(gè)涉及腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞交叉旁相互作用的生態(tài)系統(tǒng)，血管生成對(duì)腫瘤從小的細(xì)胞簇轉(zhuǎn)化為大的惡性腫瘤，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移都很關(guān)鍵。通過抑制新生血管形成，腫瘤可能會(huì)由此產(chǎn)生“饑餓”而導(dǎo)致死亡。在1989年，第一次開始抗血管生成藥物的臨床試驗(yàn)—將IFN-α用于治療嬰幼兒血管瘤。目前已發(fā)現(xiàn)Angiostatin、K5、endostatin、vasostatin、VEGF單克隆抗體等都能抑制或完全阻斷小鼠腫瘤的生長。許多抗血管生成試劑，如Marimastat、Primostat、Neovastat、Bay-12-9566m、IFN-α、SU101、retinoids、IM862都已進(jìn)入或正進(jìn)行III期臨床試驗(yàn)，而MMPs抑制劑、VEGF/R抑制劑、Endostatin、somatostatin結(jié)構(gòu)類似物、COX-2抑制劑等也在臨床或基礎(chǔ)研究中取得令人振奮的結(jié)果。
纖溶酶原含有5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，其蛋白水解片段顯示具有抗血管增生的活性。纖溶酶原Kringle5(K5)能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，且其活性比血管抑素即(Kringle1～4，angiostatin更強(qiáng))。而且，K5也抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。而內(nèi)皮細(xì)胞遷移在血管生成過程中是一個(gè)很重要的過程。近期發(fā)現(xiàn)，K5能抑制視網(wǎng)膜血管增生，可能具有潛在的治療糖尿病性視網(wǎng)膜病(早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)性黃斑變性等疾病的價(jià)值。K5通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯而發(fā)揮作用，具有高效、高細(xì)胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點(diǎn)，因此具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
與傳統(tǒng)的抗腫瘤化療藥物比較，K5屬于抗血管生成療法，不產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)BCE細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(ED50)約為50-60nM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于angiostatin的140nM。因此，K5似乎比angiostatin更能抑制bFGF刺激的BCE細(xì)胞生長。用大腸桿菌表達(dá)正確折疊的重組鼠K5，抑制活性與水解片段得到的人K5相似。在內(nèi)皮細(xì)胞遷移方面，重組K5蛋白同樣具有抑制作用，其IC50約為500nM。K5的發(fā)現(xiàn)，可更好地了解Pgn的聯(lián)環(huán)區(qū)在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生方面的作用?；钚詼y(cè)定表明，hK5可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成。更加令人振奮的是，酵母表達(dá)的重組hK5在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性。
目前國內(nèi)外多采用大腸桿菌表達(dá)hK5，表達(dá)產(chǎn)物或是沒有活性，需要復(fù)雜的變復(fù)性工藝才能獲得純品；或是表達(dá)量低，不適合產(chǎn)業(yè)化。而本發(fā)明通過在體外構(gòu)建攜帶多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒(該重組質(zhì)粒含有一種甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子)，篩選多基因位點(diǎn)整合多拷貝表達(dá)盒的工程菌，并通過發(fā)酵工藝的改進(jìn)，同時(shí)簡(jiǎn)便純化工藝，獲得高表達(dá)、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的一種hK5生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡(jiǎn)便/安全的生產(chǎn)hK5的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于該方法的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和相關(guān)序列。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的纖溶酶原Kringle 5編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上(更佳地98％以上)以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列(包括DNA)選自下組(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信號(hào)肽編碼序列構(gòu)成的核苷酸。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，本發(fā)明上述的編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPIC9K/8α-K5。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體攜帶2-8個(gè)表達(dá)人纖溶酶原Kringle 5的表達(dá)盒，且在所述載體的BamHI/BglII位點(diǎn)插入了人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，它是通過上述的表達(dá)載體或本發(fā)明上述的序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后同源重組而得的，且染色體中整合有人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母細(xì)胞的染色體中整合有2-40個(gè)拷貝的人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列，并且在在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)人纖溶酶原h(huán)K5。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母的hrK5的表達(dá)水平大于或等于500mg/L發(fā)酵液，較佳地大于或等于800mg/L發(fā)酵液，更佳地大于或等于1000mg/L發(fā)酵液。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)人纖溶酶原Kringle 5的方法，它包括以下步驟(a)在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述的工程細(xì)胞，從而分泌表達(dá)人纖溶酶原Kringle 5，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母；(b)分離純化出表達(dá)的人纖溶酶原Kringle 5。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母細(xì)胞的基因組中整合有2-40拷貝的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母工程細(xì)胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到OD600為40-200，誘導(dǎo)期時(shí)間為24-120hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在28-30℃，微量元素PTM1量為1-20ml/L，誘導(dǎo)期的pH值為3-9，誘導(dǎo)期甲醇濃度控制在0.5-5％。
在另一優(yōu)選例中，在培養(yǎng)時(shí)還添加添加0.1-5wt％(更佳地1-3％)蛋白胨作為保護(hù)劑。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的分離條件包括(i)對(duì)發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾去除菌體，獲得發(fā)酵上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行濃縮，獲得濃縮液；(iii)對(duì)濃縮液進(jìn)行層析純化，所述的層析純化選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合，從而獲得純度達(dá)到95-99.9％的純品。
在另一優(yōu)選例中，提供了一種生產(chǎn)重組人纖溶酶原h(huán)K5的方法，該方法包括步驟(i)在胞外構(gòu)建攜帶多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒；(ii)在適合的條件下，轉(zhuǎn)染畢赤酵母，使畢赤酵母細(xì)胞的基因整合多拷貝人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列，且在更適合的條件下，工程菌的多個(gè)基因位點(diǎn)內(nèi)均整合多拷貝人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列；(iii)在適合的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)畢赤酵母工程細(xì)胞，該工程細(xì)胞的基因整合有多拷貝的纖溶酶原h(huán)K5編碼序列，添加誘導(dǎo)劑甲醇后，能大量表達(dá)出人纖溶酶原h(huán)K5；(iv)分離純化出步驟(c)中表達(dá)的hK5。


圖1是本發(fā)明α-K5融合基因的獲得示意圖。圖中用PCR的方法分別獲得釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列與K5基因，同時(shí)引入特定的酶切位點(diǎn)(XhoI與EcoRI)，用XhoI消化分別消化，連接，以連接液為模板用一對(duì)引物PCR擴(kuò)增，從而獲得α-K5融合基因。
圖2是單拷貝重組質(zhì)粒pPIC9K/α-K5的構(gòu)建示意圖。圖中采用EcoRI消化pPIC9K質(zhì)粒與α-K5融合基因，連接，構(gòu)建插入方向正確的重組質(zhì)粒pPIC9K/α-K5。
圖3是斑點(diǎn)雜交檢測(cè)高抗性工程菌的hK5基因拷貝數(shù)。以K5基因作探針進(jìn)行點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，圖中1為高抗性篩選獲得的工程菌基因組DNA的雜交結(jié)果，2為低抗性工程菌基因組DNA的雜交結(jié)果，3為畢赤酵母宿主細(xì)胞GS115基因組DNA的雜交結(jié)果，4為pPIC9K/8α-K5質(zhì)粒DNA的雜交結(jié)果。結(jié)果表明，高抗性篩選得到的陽性克隆具有較高的K5基因拷貝數(shù)，而畢赤酵母宿主細(xì)胞畢赤酵母宿主細(xì)胞GS115(陰性對(duì)照)則未檢測(cè)到K5基因。
圖4是hK5的生物活性檢測(cè)結(jié)果，即對(duì)Ecv304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制結(jié)果(×100)。其中A用PBS處理的對(duì)照細(xì)胞；B用0.2μg/孔的hK5處理的細(xì)胞；C用5μg/孔的hK5處理的細(xì)胞；D用20μg/孔的hK5處理的細(xì)胞。
圖5是hK5對(duì)Vero、OB、KMB17細(xì)胞的作用結(jié)果，其中A.用PBS處理的Vero細(xì)胞；B.用20μg/孔的hK5處理的Vero細(xì)胞；C.用OB處理的OB細(xì)胞；D.用20μg/孔的hK5處理的OB細(xì)胞；
E.用PBS處理的KMB17細(xì)胞；F.用20μg/孔的hK5處理的KMB17細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)中人纖溶酶原Kringle 5的表達(dá)量低的主要原因之一是基因序列未經(jīng)優(yōu)化。本發(fā)明人通過基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)，將優(yōu)化后的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列(SEQ ID NO1)轉(zhuǎn)入甲醇利用型畢赤酵母(P.pastoris)，從而實(shí)現(xiàn)了rhK5的高水平分泌表達(dá)rhK5，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人還在胞外構(gòu)建了攜帶多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，該表達(dá)載體有助于進(jìn)一步提高h(yuǎn)K5表達(dá)產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，還通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，不僅提高了hK5表達(dá)量，而且簡(jiǎn)化了分離純化工藝，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的，特別適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)的人rhK5編碼序列。該序列是根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性等原則而設(shè)計(jì)出的。設(shè)計(jì)出的rhK5的編碼序列用常規(guī)方法進(jìn)行全基因合成，或在通過PCR方法獲得的cDNA上進(jìn)行點(diǎn)突變。
在優(yōu)化基因的5′端與3′端分別引進(jìn)特異性酶切位點(diǎn)，用分子克隆的常規(guī)方法，將優(yōu)化基因克隆入表達(dá)載體(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，轉(zhuǎn)化、整合入P.pastoris宿主細(xì)胞染色體，利用常規(guī)方法(如G418抗性或Southern印跡法)選出高拷貝轉(zhuǎn)化株，搖瓶表達(dá)選出高表達(dá)工程細(xì)胞。工程細(xì)胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
整合入畢赤酵母染色體(或基因組)中的rhK5編碼序列的拷貝數(shù)沒有特別限制，可以為1-50個(gè)或更高，通常為2-40個(gè)，較佳地為3-30。
在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。凡適合于畢赤酵母生長、表達(dá)的培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明。
hK5氨基酸序列是已知的，如SEQ ID NO2所示，編碼一個(gè)全長98個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的hK5的編碼序列，是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的hK5cDNA序列，依據(jù)酵母遺傳密碼偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行全基因合成。
適用于本發(fā)明的載體為表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/8α-K5。
適用于本發(fā)明的宿主菌是P.pastoris。
通常，在hK5編碼序列的5’端與3’端引入特異性酶切位點(diǎn)，與釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列以正確的框架進(jìn)行融合，然后克隆入質(zhì)粒pPIC9K，構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌如P.pastoris GS115，加壓篩選，以獲得多基因位點(diǎn)插入多拷貝表達(dá)盒。通常篩選出的陽性菌株使之生長在加壓因子濃度遞增的培養(yǎng)平板上。挑選抗性最強(qiáng)的菌株，確定為工程菌。本發(fā)明的工程菌屬于甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)菌株。
在發(fā)酵表達(dá)hK5后，對(duì)表達(dá)的hK5進(jìn)行分離。
表達(dá)的rhK5存在于培液上清，表達(dá)水平占發(fā)酵液上清總蛋白50％以上，使純化復(fù)雜度大大下降。通常，發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式獲得發(fā)酵液上清，去除菌體。發(fā)酵液上清可通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
(a)凝膠過濾層析樣品超濾濃縮后，可以用凝膠過濾層析去鹽及純化。
(b)離子交換層析(陽離子交換層析、陰離子交換層析)樣品的緩沖系統(tǒng)以稀釋、超濾、沉淀后復(fù)溶、透稀或凝膠過濾層析等手段進(jìn)行更換，直至與對(duì)應(yīng)的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，且電導(dǎo)水平與緩沖液的電導(dǎo)水平接近，直接上樣，鹽濃度梯度或pH梯度梯度洗脫。
(c)親和層析選擇肝素親和凝膠介質(zhì)，鹽梯度或肝素梯度洗脫。
經(jīng)過2-3步純化，可得到hK5純品，純化得率30％以上，純度95％以上，純品得率約1.5g/L發(fā)酵上清液。
純化后的hGH可用常規(guī)方法制成各種劑型，如凍干粉針劑。選擇一定的穩(wěn)定劑，同時(shí)還可添加表面活性劑、抗氧化劑等保護(hù)劑，及適當(dāng)緩沖液進(jìn)行冷凍干燥。得到的制品具有活性損失小、水分含量低、穩(wěn)定性好、易于長期保存等特點(diǎn)。
rhK5還可做成水針劑、噴霧劑、微球緩釋劑，以及經(jīng)PEG修飾制成長效制劑等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，在體外構(gòu)建了攜帶多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建高效、穩(wěn)定表達(dá)的hK5工程菌(畢赤酵母)。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)，hK5以可溶形式分泌到發(fā)酵液上清；表達(dá)水平高，占總蛋白70％左右，表達(dá)量達(dá)5g/L發(fā)酵上清液。由于表達(dá)水平較高，hK5又具有天然活性，避免了復(fù)雜的復(fù)性過程，通過簡(jiǎn)便、快速的二步純化方法，即獲得高質(zhì)量的hK5純品，每升發(fā)酵液可得hK5純品1.5g，產(chǎn)品純度95％以上。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，用上述攜帶多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒構(gòu)建的高效、穩(wěn)定表達(dá)的hK5工程菌(畢赤酵母)，與含天然K5序列的重組質(zhì)粒構(gòu)建的構(gòu)建的高效、穩(wěn)定表達(dá)的hK5工程菌(畢赤酵母)表達(dá)量進(jìn)行比較，通過比較，表明在相同表達(dá)條件下，優(yōu)化序列有助于K5表達(dá)量的顯著提高。
純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成hK5的注射用粉針劑。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，周期短，成本低，每升發(fā)酵上清液可獲得hK5純品1.5g，采用300升(或者3個(gè)100升)發(fā)酵罐，每批可生產(chǎn)300g。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)表達(dá)工藝簡(jiǎn)單，表達(dá)載體含有甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，被甲醇誘導(dǎo)后能高效分泌表達(dá)人纖溶酶原h(huán)K5，有利于規(guī)?；a(chǎn)。
(2)表達(dá)量高。
a.根據(jù)酵母遺傳密碼偏愛性對(duì)K5序列進(jìn)行了優(yōu)化，提高了K5在酵母中的表達(dá)量。
b.通過胞外構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，一次同源重組事件可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)表達(dá)盒在多個(gè)染色體位點(diǎn)上定位整合，結(jié)合加壓因子抗性篩選高拷貝的轉(zhuǎn)化子，從而獲得具有多基因位點(diǎn)高拷貝的外源基因表達(dá)盒重組的畢赤酵母工程菌株。
c.同時(shí)控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)使表達(dá)產(chǎn)量大大高于目前報(bào)道的采用畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)量。
(3)純化工藝簡(jiǎn)便，回收率高。由于是分泌可溶蛋白，不是以包涵體形式表達(dá)，因此簡(jiǎn)化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)hK5成為可能。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；Jan-Christer Janson等人，Proteinpurification(John Wiley & Sonss，Inc.，1998)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hK5分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建1.α-K5融合基因的獲得根據(jù)天然人纖溶酶原Kringle 5的氨基酸序列，按畢赤酵母密碼子偏愛性等原則，設(shè)計(jì)目的基因并全基因合成，其序列如SEQ ID NO1所示的DNA片段。插入pThioHisA(購自Invitrogen公司)的EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建得到含有hK5編碼序列的質(zhì)粒pThioHisA-hK5。以質(zhì)粒pThioHisA-hK5為模板，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer2a5’-CCGCTCGAGAAAAGAGTTTTGTTGCCAGACGTTG-3’(SEQ ID NO4)Primer2b5’-CGGAATTCCTGCAGTTAGAAAGAAGGAGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO5)從而得到與釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列以正確的框架進(jìn)行融合的K5基因。
同時(shí)，以含有釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽編碼序列的質(zhì)粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板，PCR擴(kuò)增得到α-因子前導(dǎo)肽序列。所用的引物是Primer2c5’-CGGAATTCATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO6)Primer2d5’-CCGCTCGAGAGATACCCCTTCTTC-3’(SEQ ID NO7)把純化后的上述兩種PCR產(chǎn)物分別用限制酶XhoI進(jìn)行消化，對(duì)兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到可用于分泌表達(dá)的融合基因α-K5。
2.多拷貝表達(dá)盒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將α-K5融合基因經(jīng)EcoRI單酶切，克隆入同樣酶切的質(zhì)粒pPIC9K(見圖2)，酶切鑒定，測(cè)序。用BamHI+BglII雙酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-α-K5，回收小片段(1851bp，對(duì)應(yīng)α-K5表達(dá)盒)，插入BamHI單酶切的pPIC9K-α-K5重組質(zhì)粒，酶切鑒定，選出正向重組子，得到攜帶同向排列的2拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pPIC9K-2α-K5。以此類推，從pPIC9K-2α-K5出發(fā)構(gòu)建攜帶4拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pPIC9K-4α-K5，再從pPIC9K-4α-K5出發(fā)構(gòu)建攜帶8拷貝表達(dá)盒的質(zhì)粒pPIC9K-8α-K5。
酶切鑒定表明，分別獲得了插入方向正確且具有單拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pPIC9K-α-K5，攜帶同向排列的2拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒、pPIC9K-2α-K5，攜帶同向排列的4拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pPIC9K-4α-K5，攜帶8拷貝表達(dá)盒的質(zhì)粒pPIC9K-8α-K5。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5、pPIC9K-8α-K5分別用SalI酶切線性化，轉(zhuǎn)化感受態(tài)常規(guī)的畢赤酵母GS115(購自Invitrogen公司)細(xì)胞涂布MD平板后72小時(shí)，取最大的菌落接種到含0.25mg/ml的G418的YPD平板上，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，然后將在平板上長出的菌落用2.0mg/mlG418的YPD平板篩選獲得高抗性工程菌。得到一批高抗性工程株，在試管中表達(dá)篩選獲得多個(gè)高效表達(dá)株。
試驗(yàn)結(jié)果pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三個(gè)轉(zhuǎn)化組分別獲得了能在0.25mg/mlG418的YPD平板上生長的數(shù)個(gè)克隆，pPIC9K-8α-K5轉(zhuǎn)化組獲得了能在2mg/mlG418的YPD平板上生長的數(shù)個(gè)克隆。
對(duì)獲得的工程菌中進(jìn)行鑒定，表明這些畢赤酵母工程菌中含有2-30個(gè)拷貝的rhK5。
實(shí)施例3高表達(dá)工程菌的獲得分別抽提實(shí)施例2中不同抗性工程菌的基因組DNA，并制備hK5基因探針，斑點(diǎn)雜交(Dot Blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hK5的整合拷貝數(shù)，篩選高拷貝數(shù)的陽性克隆。
試驗(yàn)結(jié)果pPIC9K-8α-K5轉(zhuǎn)化組的高抗性工程菌具有較高外源基因拷貝數(shù)(30拷貝以上)，從而獲得了具有高拷貝hK5基因的工程菌，而pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三個(gè)轉(zhuǎn)化組的克隆拷貝數(shù)相對(duì)較低。
不同抗性工程菌做小搖表達(dá)檢測(cè)接種單克隆工程菌入YPD培養(yǎng)基中，甲醇誘導(dǎo)48小時(shí)后取上清檢測(cè)，比較不同抗性工程菌的基因表達(dá)水平。
試驗(yàn)結(jié)果pPIC9K-8α-K5轉(zhuǎn)化組獲得的具有高拷貝hK5基因的工程菌表達(dá)量最高，分泌至培養(yǎng)基中的hK5蛋白濃度超過500mg/L發(fā)酵上清液，與其它三組低拷貝的工程菌相比，表達(dá)量高出5倍以上。這說明本發(fā)明所采用的高拷貝構(gòu)建策略是成功的和必要的，通過提高拷貝數(shù)可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)hK5的高表達(dá)。
實(shí)施例4優(yōu)化序列對(duì)K5表達(dá)的影響重復(fù)實(shí)施例1的步驟，不同點(diǎn)僅在于使用天然的人K5核苷酸編碼序列替換實(shí)施例1中密碼子經(jīng)過優(yōu)化的K5編碼序列，從而構(gòu)建了pPIC9K/8α-K5-N，該表達(dá)載體含有天然的人K5序列。
分別接種pPIC9K-8α-K5和pPIC9K-8α-K5-N的單克隆進(jìn)行小搖表達(dá)實(shí)驗(yàn)，分別加甲醇誘導(dǎo)后，兩種樣品每隔12hr取100ml發(fā)酵液離心，-20℃凍存，誘導(dǎo)48hr結(jié)束。樣品檢測(cè)SDS-PAGE(并掃描)、蛋白含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見下表)表明在相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，pPIC9K-8α-K5菌株的表達(dá)明顯高于pPIC9K-8α-K5-N菌株。因此，通過本次實(shí)驗(yàn)，決定采用pPIC9K-8α-K5菌株。

實(shí)施例5不同啟動(dòng)子對(duì)K5表達(dá)的影響用類似的方法構(gòu)建了pGAPA/8α-K5，該表達(dá)載體含有組成型表達(dá)啟動(dòng)子(pGAP啟動(dòng)子為GAP)。分別接種pPIC9K-8α-K5和pGAPA/8α-K5的單克隆進(jìn)行小搖表達(dá)實(shí)驗(yàn)，在pPIC9K-8α-K5的菌液中加甲醇誘導(dǎo)后，兩種樣品每隔12hr取100ml發(fā)酵液離心，-20℃凍存，誘導(dǎo)48hr結(jié)束。樣品檢測(cè)SDS-PAGE(并掃描)、蛋白含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見下表)表明在相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，pPIC9K-8α-K5菌株的表達(dá)明顯高于pGAPA/8α-K5菌株。因此，通過本次實(shí)驗(yàn)，決定采用pPIC9K-8α-K5菌株。

實(shí)施例6發(fā)酵階段添加不同蛋白保護(hù)劑對(duì)表達(dá)水平的影響準(zhǔn)備3個(gè)發(fā)酵罐。取單克隆，接種到BMGY一級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級(jí)接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4～8hr左右，接種上罐進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 5.0、溫度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇誘導(dǎo)。再將濃度為10％的CA、蛋白胨和Tryptone各300ml流加入罐(5L發(fā)酵罐，發(fā)酵上清3L)，維持溶氧在35％～70％之間。誘導(dǎo)36小時(shí)后結(jié)束，收集發(fā)酵上清。樣品檢測(cè)SDS-PAGE和蛋白含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例7發(fā)酵階段不同蛋白胨量對(duì)表達(dá)水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級(jí)接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4～8hr左右，接種上罐進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 5.0、溫度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇誘導(dǎo)。同時(shí)取不同體積10％的蛋白胨流加入5L發(fā)酵罐(發(fā)酵上清3L)，維持溶氧在35％～70％之間。誘導(dǎo)36小時(shí)后結(jié)束，收集發(fā)酵上清。樣品檢測(cè)SDS-PAGE和蛋白含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白胨的最佳濃度為1％-3％。
實(shí)施例8
hK5的純化1.對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，將發(fā)酵液的緩沖體系替換為磷酸鹽溶液PB。
2.超濾濃縮及更換緩沖液使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為1KD，超濾時(shí)留取濃縮液(作用是去除小分子雜質(zhì)和鹽類)。發(fā)酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入PB，繼續(xù)超濾；反復(fù)此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平和PB緩沖液的電導(dǎo)水平接近。
3.層析1(陰離子交換層析)層析介質(zhì)DEAE Sepharose FF緩沖液溶液APB溶液BPB+1M NaCl上樣將超濾濃縮的hK5溶液上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集hK5樣品峰。
4.層析2(疏水層析)層析介質(zhì)phenyl Sepharose FF緩沖液溶液APB+1M NaCl溶液BPB上樣將層析1的樣品峰上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集hK5樣品峰。
5.層析3(分子篩層析)層析介質(zhì)Sephadex 75緩沖液PB上樣層析1收集的樣品主分。
樣品經(jīng)過此三步純化，即超濾、陰離子交換層析、分子篩層析以后，純度提高至95％以上。
實(shí)施例9hK5的生物活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長期的常規(guī)的Ecv304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以1.6×105細(xì)胞/ml接種100μl于96孔板中，培養(yǎng)條件為M199培養(yǎng)基加10％新生牛血清，37℃，5％CO2。約24h后，用含5％新生牛血清的M199培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的重組EhK5或YhK5，37℃5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，加20ulMTT(5mg/ml)，反應(yīng)4小時(shí)，加150ulDMSO裂解，570nm比色。結(jié)果表明重組蛋白hK5能明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ecv304的增殖，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落、細(xì)胞膜溶解、細(xì)胞死亡(見附圖5)，抑制效果呈典型的劑量依賴性。對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞，如KMB17(人胚肺二倍體細(xì)胞株)、Vero(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞)、OB(新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞)，兩種系統(tǒng)表達(dá)的重組hK5均未表現(xiàn)任何抑制活性(見附圖6)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>重組人纖溶酶原Kringle 5(hK5)生產(chǎn)方法<130>054416<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>297<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>hK5的編碼序列<400>1gttttgttgc cagacgttga aactccatct gaagaagatt gtatgttcgg taatggtaag 60ggttatagag gtaagagagc tactactgtt actggtactc cttgtcaaga ctgggctgct120caagaaccac acagacactc tatcttcact cctgaaacta acccacgtgc tggtttagaa180aagaactact gtcgtaaccc tgacggtgac gttggtggtc catggtgtta cactactaac240cctagaaagt tgtacgacta ctgtgacgtt ccacaatgtg ctgctccttc tttctaa 297<210>2<211>98<212>PRT<213>智人<400>2Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe1 5 10 15Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly20 25 30Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile35 40 45Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys
50 55 60Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn65 70 75 80Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro85 90 95Ser Phe<210>3<211>300<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>α信號(hào)肽的編碼序列<400>3atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcc ctagggcggc cgcgaattaa300<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ccgctcgaga aaagagtttt gttgccagac gttg34<210>5<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5cggaattcct gcagttagaa agaaggagca gcacat 36<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cggaattcat ccaaacgatg agatttc27<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ccgctcgaga gatacccctt cttc 2權(quán)利要求
1.一種編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的纖溶酶原Kringle 5編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其特征在于，選自下組(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信號(hào)肽編碼序列構(gòu)成的核苷酸。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它是通過權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求1所述的序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后同源重組而得的，且染色體中整合有人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是畢赤酵母(PichiaPastoris)。
6.一種生產(chǎn)人纖溶酶原Kringle 5的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，從而分泌表達(dá)人纖溶酶原Kringle 5，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母；(b)分離純化出表達(dá)的人纖溶酶原Kringle 5。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母細(xì)胞的基因組中整合有2-40拷貝的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母工程細(xì)胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到OD600為40-200，誘導(dǎo)期時(shí)間為24-120hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在28-30℃，微量元素PTM1量為1-20ml/L，誘導(dǎo)期的pH值為3-9，誘導(dǎo)期甲醇濃度控制在0.5-5％。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)的分離條件包括(i)對(duì)發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾去除菌體，獲得發(fā)酵上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行濃縮，獲得濃縮液；(iii)對(duì)濃縮液進(jìn)行層析純化，所述的層析純化選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合，從而獲得純度達(dá)到95-99.9％的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種優(yōu)化的適合酵母表達(dá)的重組人纖溶酶原Kringle 5片段(hK5)的編碼序列，高效生產(chǎn)rhK5的方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、rhK5的表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的纖溶酶原Kringle 5基因非常適合酵母表達(dá)(尤其是多拷貝表達(dá))，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本地獲得rhK5純品。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1990871SQ200510112489
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者王軍志, 袁力勇, 饒春明, 史新昌, 黃陽濱, 孫九如, 蔣劍, 祁暉 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司, 中國藥品生物制品檢定所