專利名稱：脂肪酶、其基因、產(chǎn)生該酶的亞羅解脂酵母及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備一種脂肪酶、編碼該脂肪酶的基因、產(chǎn)生該脂肪酶的亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)以及利用該脂肪酶合成酯類的方法。
背景技術(shù)：
酯類物質(zhì)是食品、飲料、醫(yī)藥、生物能源等許多工業(yè)領(lǐng)域常用的化學(xué)物質(zhì)，但長(zhǎng)期以來，工業(yè)上脂肪酸酯均是通過化學(xué)法來生產(chǎn)。即用無機(jī)催化劑如濃硫酸、苯磺酸等在高溫高壓下催化酸醇的酯化反應(yīng)來完成。雖然產(chǎn)率較高，但也存在許多難以克服的缺點(diǎn)。如高溫高壓反應(yīng)能耗高、副反應(yīng)多，產(chǎn)物色澤深、分離和精制困難等，而且酸對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，不利于生產(chǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，特別是酶工程的研究，為生物催化劑合成脂肪酸酯提供了新的方法。與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，酶法合成具有反應(yīng)條件溫和，特異性強(qiáng)，副反應(yīng)少，產(chǎn)物品質(zhì)高等特點(diǎn)。特別是非水相中脂肪酶促反應(yīng)，拓寬了酶的應(yīng)用范圍和領(lǐng)域，成為近年來酶學(xué)研究的熱點(diǎn)。
“微生物脂肪酶催化酯的合成”CN 1223300A(1999)報(bào)道了以脂肪醇、一元脂肪酸為底物，游離的脂肪酶為催化劑，在15℃～40℃條件下，于有機(jī)溶劑中催化脂肪酸酯的合成。該方法所用脂肪酶是用華根霉生產(chǎn)，反應(yīng)為分批操作，在攪拌罐中進(jìn)行。10～36hr底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)95％。反應(yīng)結(jié)束后，過濾分離脂肪酶和反應(yīng)液，減壓蒸餾得到產(chǎn)物酯。該方法采用游離脂肪酶，因此反應(yīng)批次不高，不利于產(chǎn)物的分離純化。
Leite等人(1998)研究了固定化米黑毛霉脂肪酶催化的酯化反應(yīng)。以異辛烷為溶劑通過滲透蒸發(fā)膜移走反應(yīng)中生成的水。Bufeiend等人(1999)中空纖維膜反應(yīng)器，以辛烷為溶劑，通過將底物循環(huán)反應(yīng)合成長(zhǎng)鏈脂肪酸酯。膜反應(yīng)器催化效率高，能選擇性移走反應(yīng)中生成的水，但膜反應(yīng)器也存在造價(jià)高，操作復(fù)雜、膜易堵塞等問題。
亞羅解脂酵母(Y.lipolytica)屬于非常規(guī)酵母，F(xiàn)DA認(rèn)證為安全級(jí)酵母(GRAS)，該菌株被大規(guī)模用于生產(chǎn)檸檬酸、單細(xì)胞蛋白，工業(yè)生產(chǎn)中積累了大量的經(jīng)驗(yàn)。亞羅解脂酵母分泌幾種胞外蛋白包括酸性和堿性蛋白酶、RNA酶、酯酶、幾種脂肪酶等(Barth and Gaillardin，1997)。1976年，Ota等人報(bào)道Y.lipolytica生產(chǎn)一個(gè)胞外脂肪酶及兩個(gè)與細(xì)胞結(jié)合(Cell-bound)的脂肪酶。1996年，Ota等人純化出39kDa的胞外脂肪酶并測(cè)定了N-端氨基酸序列。1997年，Destain等人報(bào)道Y.lipolytica在500L發(fā)酵罐中大規(guī)模生產(chǎn)脂肪酶，最高酶活達(dá)到1000U/ml發(fā)酵液，該方法雖然進(jìn)行了大規(guī)模生產(chǎn)但是單位體積發(fā)酵液的酶活不高。2000年，F(xiàn)ignede等人采用基因工程的方法來提高胞外脂肪酶Lip2的生產(chǎn)，在15L發(fā)酵罐中，優(yōu)化條件下，發(fā)酵酶活達(dá)到了10000U/ml發(fā)酵液。該方法雖然單位發(fā)酵液的酶活比較高，但是生產(chǎn)規(guī)模小，只在15L的發(fā)酵罐中進(jìn)行，而且發(fā)酵的控制條件比較嚴(yán)格，難于進(jìn)行放大。目前，關(guān)于Y.lipolytica胞外脂肪酶的應(yīng)用報(bào)道很少，Sandoval等人報(bào)道用Y.lipolytica脂肪酶拆分手性酸，得到的產(chǎn)物的光學(xué)純度大大提高。關(guān)于Y.lipolytica脂肪酶的其它應(yīng)用未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種新型的脂肪酶、編碼該脂肪酶的基因、高產(chǎn)該脂肪酶的菌株和使用該脂肪酶合成酯的方法。
在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO1或其保守突變序列。SEQ ID NO1由301個(gè)氨基酸殘基組成，其中164-168氨基酸(GHSLG)為脂肪酶的保守五肽序列。與Lip2基因(AJ012632)編碼的氨基酸序列相比，其中第179位氨基酸由甘氨酸(G)突變成天冬氨酸(D)。本文中所述的術(shù)語“保守突變”指由另一生物學(xué)相似殘基替代氨基酸殘基。保守突變的例子包括將親水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代為另一種，將極性殘基替代為另一種，例如將精氨酸替代為賴氨酸、將谷氨酸替代為天冬氨酸或谷氨酰胺替代為天冬酰胺等。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種編碼上述脂肪酶的基因，更具體地提供了核苷酸序列為SEQ ID NO2的編碼所述脂肪酶的基因。該基因由906個(gè)堿基組成。與Lip2基因的核苷酸序列相比，其中第536位核苷酸由g突變?yōu)閍。
可以理解的是，由于氨基酸密碼子的兼并性，本發(fā)明中編碼脂肪酶的基因除了SEQ ID2所示的序列外，還包括編碼上述脂肪酶氨基酸序列的其他核酸分子。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生上述脂肪酶的亞羅解脂酵母(Yarrowialipolytica)，其已于2005年9月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080)提交生物保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.1470。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種利用上述脂肪酶合成酯的方法，其包括(a)獲得權(quán)利要求1所述的脂肪酶；(b)使用步驟(a)中所得脂肪酶合成酯。
本發(fā)明技術(shù)人員通過閱讀本說明書，可以從上述的亞羅解脂酵母提取得到所述的脂肪酶，也可以通過本領(lǐng)域中公知的基因重組技術(shù)在本領(lǐng)域中公知的合適基因表達(dá)系統(tǒng)中容易地獲得，還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的肽合成方法進(jìn)行化學(xué)合成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)中通過固定化脂肪酶合成酯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述的固定化脂肪酶包含上述脂肪酶、載體和共固定劑。固定化載體先用一定組成和配比的共固定劑活化。將固定化載體和共固定劑按1∶1～1∶3(W∶V)比例混合，干燥。脂肪酶用去離子水溶解，按1000-30000單位/克載體的比例與活化后的固定化載體混合，晾干待用。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包括固體顆粒，如硅膠、硅藻土；和膜狀紡織品，包括天然纖維織物如棉布和化學(xué)纖維織物如滌綸，尤其是膜狀紡織品固定化酶，其具有表面積大、吸附性強(qiáng)、價(jià)格便宜、穩(wěn)定性好以及以重復(fù)利用的特點(diǎn)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共固定劑選自(包括)高分子化合物、表面活性劑、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽中的至少一種。
在一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述共固定劑選自PEG6000、椰子油、吐溫80、明膠、卵磷脂和硫酸鎂中的至少一種，共固定劑的總濃度為0.5％-2％，各組分的質(zhì)量比為明膠∶卵磷脂∶PEG6000∶吐溫80∶硫酸鎂∶椰子油＝5∶1∶1∶2∶1∶1。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，酯的合成通過脂肪酸和醇的酯化反應(yīng)進(jìn)行，優(yōu)選將脂肪酸和醇以3∶1～1∶5的摩爾比和脂肪酶混合，于20-50℃反應(yīng)9-50小時(shí)。具體而言，將底物脂肪酸和醇按摩爾比3∶1～1∶5的比例加入含有有機(jī)溶劑的酶反應(yīng)器中。加入固定化酶開始反應(yīng)。在20-50℃的條件下，攪拌反應(yīng)9-50小時(shí)，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到56-97％，在反應(yīng)過程中加入分子篩或變色硅膠除去反應(yīng)中生成的水，可增加反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)結(jié)束后，固定化酶可以直接分離，用少量的有機(jī)溶劑洗滌后可再次使用。反應(yīng)液過濾后在真空度0.05-0.08MPa條件下減壓蒸餾，蒸發(fā)出反應(yīng)媒體有機(jī)溶劑，得到產(chǎn)物酯。蒸發(fā)出的溶劑經(jīng)過冷凝后可回收重復(fù)使用。
本發(fā)明在有機(jī)溶劑中完成的酯化反應(yīng)方程式為 酶活的定義為40℃條件下，pH8.0的磷酸緩沖溶液中水解橄欖油，每分鐘釋放出1μmol脂肪酸的酶量為一個(gè)酶活單位。
其中所述的脂肪酸選自C8～C18一元脂肪酸和二元酸的至少一種，優(yōu)選為辛酸、癸酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、己二酸、壬二酸、癸二酸中的至少一種；醇選自C1～C18的伯醇、C3～C5的仲醇以及甘油、維生素C中至少一種，優(yōu)選為甲醇、丙醇、丁醇、己醇、異辛醇、癸醇、十二醇、十八醇、異丙醇、異丁醇、甘油和維生素C中的至少一種。
反應(yīng)所用的有機(jī)溶劑為丙酮、正己烷、環(huán)己烷、石油醚、正庚烷或正辛烷等，對(duì)于某些底物可直接采用無溶劑體系。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中步驟(b)中酯的合成通過底物醇或者酸和酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行，優(yōu)選將底物醇或者底物酸和底物酯以摩爾比3∶1～1∶7與有機(jī)溶劑和固定化脂肪酶混合，于20-50℃反應(yīng)9-50小時(shí)。具體而言，將底物酸或者醇和酯按摩爾比3∶1～1∶7的比例加入含有有機(jī)溶劑的酶反應(yīng)器中。加入固定化酶開始反應(yīng)。在20-50℃的條件下，攪拌反應(yīng)9-50小時(shí)，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到80-93％。反應(yīng)結(jié)束后，固定化酶可以直接分離，用少量的有機(jī)溶劑洗滌后可再次使用。反應(yīng)液通過分離純化得到產(chǎn)物酯。蒸發(fā)出的溶劑經(jīng)過冷凝后可回收重復(fù)使用。
本發(fā)明在有機(jī)溶劑中完成的酯化反應(yīng)方程式為 其中所述底物酸選自棕櫚酸、油酸中的至少一種；底物醇選自甲醇、乙醇中的至少一種；底物酯選自維生素A醋酸酯、豆油、紅花油、亞麻油、玉米油、棕櫚油、色拉油中的至少一種。
反應(yīng)所用的有機(jī)溶劑選自丙酮、正己烷、環(huán)己烷、石油醚、正庚烷中的至少一種，對(duì)于某些底物可直接采用無溶劑體系。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通過一系列的誘變方法得到一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株，該菌株于500L發(fā)酵罐中，優(yōu)化的條件下，發(fā)酵脂肪酶活力可達(dá)到8000U/ml發(fā)酵液，為生產(chǎn)提供了廉價(jià)的酶催化劑。發(fā)酵液經(jīng)過離子交換和疏水層析純化后，脂肪酶比酶活可達(dá)到18600U/mg。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明生產(chǎn)的脂肪酶有廣泛的底物適應(yīng)性，作用的底物包括一元、二元脂肪酸，一元的伯醇，甘油，維生素A、C等。將酶固定在載體上，提高了酶的穩(wěn)定性和使用批次，并且有利于連續(xù)化生產(chǎn)，大大簡(jiǎn)化了后續(xù)的分離純化步驟，由于該發(fā)明采用生物催化劑，反應(yīng)中使用的溶劑可以回收重復(fù)利用，因此不會(huì)環(huán)境造成污染，為酯類的工業(yè)化生產(chǎn)提供了非常有前景的綠色工藝路線。


圖1說明復(fù)合誘變系譜I，其中UV為紫外線，n為快中子，γ為γ射線，ME為磁場(chǎng)；圖2說明復(fù)合誘變系譜II，其中n為快中子，γ為γ射線，ME為磁場(chǎng)；圖3說明不同的氮源a、b(a為脫脂豆粕、b為全脂豆粕)(4％)對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響；圖4說明溫度對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響；圖5說明pH對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響；圖6說明500L發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)酶產(chǎn)量隨時(shí)間的變化。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體的實(shí)施方案描述本發(fā)明的亞羅解脂酵母菌的獲得以及利用該菌株中的脂肪酶合成酯的方法。除非特別指明，本發(fā)明中所用的實(shí)驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。此外，實(shí)施例應(yīng)理解為說明性的，而不是要限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的菌種誘變條件、分離純化條件、底物類型、反應(yīng)條件進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1亞羅解脂酵母菌種的獲得本菌種是經(jīng)過進(jìn)行紫外線、亞硝基胍誘變后再進(jìn)行快中子、γ射線和磁場(chǎng)復(fù)合處理相結(jié)合得到的脂肪酶高產(chǎn)育種。簡(jiǎn)言之，紫外誘變時(shí)間分別為1分鐘、1.5分鐘、2分鐘，快中子誘變劑量分別為5千拉特、10千拉特、15千拉特，γ射線誘變劑量分別為5萬倫琴、10萬倫琴、15萬倫琴，如圖1和2所示。圖1說明復(fù)合誘變系譜I，其中UV為紫外線，n為快中子，γ為γ射線，ME為磁場(chǎng)；圖2說明復(fù)合誘變系譜II，其中n為快中子，γ為γ射線，ME為磁場(chǎng)。經(jīng)過上述一系列誘變過程，最終得到了酶活為2246U/mL的高產(chǎn)脂肪酶菌株。
麥芽汁斜面培養(yǎng)基(麥芽汁0.3％，酵母粉0.3％，牛肉蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，瓊脂2％)上、26℃下培養(yǎng)48hr后出現(xiàn)白色菌落，72hr后菌落長(zhǎng)大，呈淡黃色，較肥厚，邊緣整齊，略帶油脂光澤，96hr后菌落匍匐展開，變得單薄，并且表面出現(xiàn)皺褶。
實(shí)施例2發(fā)酵條件的優(yōu)化比較了不同的氮源a、b(a為脫脂豆粕、b為全脂豆粕)(4％)對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。從圖3的曲線可以看出，以b作為氮源的培養(yǎng)基脂肪酶產(chǎn)量很低，遠(yuǎn)小于以a作為氮源。
選擇有利于產(chǎn)脂肪酶的油脂c、d、e(c為豆油、d為菜籽油、e為橄欖油)作為碳源(2.5％)進(jìn)行研究，結(jié)果比較見下表1表1

從表中可見，在比較的三種碳源中，c的脂肪酶產(chǎn)量最高。
在恒溫?fù)u床中，不同溫度下培養(yǎng)96小時(shí)，結(jié)果見圖4。從圖4可知，產(chǎn)脂肪酶的溫度較窄，以28℃～30℃最適，超過30℃，脂肪酶產(chǎn)量明顯減少，34℃基本不產(chǎn)脂肪酶。
培養(yǎng)基在接種前用1N NaOH和1N HCl將pH調(diào)節(jié)到一定值，28℃振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，結(jié)果見下表2。從表2可見，發(fā)酵初始pH6～7最利于生產(chǎn)脂肪酶，而發(fā)酵液的自然pH在5.7左右。

在獲得較好的培養(yǎng)基配方(4％脫脂豆粕、2.5％豆油、0.1％K2HPO4、0.1％司盤(SPAN)60)后，我們?cè)?0L發(fā)酵罐中進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)以研究其發(fā)酵過程(發(fā)酵溫度為26℃，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，pH5.7，通氣量為0.5vvm)的變化規(guī)律和脂肪酶的產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，兩批有代表性的發(fā)酵的脂肪酶活力增長(zhǎng)和pH變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵40小時(shí)左右開始產(chǎn)酶，80小時(shí)左右進(jìn)入產(chǎn)酶旺盛期，130小時(shí)左右脂肪酶活力達(dá)到最高峰，之后開始下降；發(fā)酵過程中pH保持在4～5之間，波動(dòng)不大，在酶活達(dá)到最高峰后回升到5.4。綜上所述，發(fā)酵時(shí)間應(yīng)當(dāng)為130小時(shí)左右，脂肪酶產(chǎn)量可達(dá)5300U/mL。
實(shí)施例3發(fā)酵和脂肪酶的提取隨后在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行了中試放大實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組分為4％豆粕、2.5％豆油、0.1％K2HPO4、0.1％司盤(SPAN)60、03％泡敵；發(fā)酵溫度為26℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，pH5.7，通氣量為0.35vvm。發(fā)酵酶活達(dá)到了8000U/mL，結(jié)果如圖6。
脂肪酶的提取通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將發(fā)酵液4000rpm離心10min，取上清液，加入4％聚乙二醇6000絮凝濃縮，自然沉降分層，取下層液。向下層液中加入3倍體積的丙酮，得到沉淀，干燥后得到粗酶產(chǎn)品。經(jīng)上述操作后得到的粗酶產(chǎn)品酶活為5×104u/g，收率為65％，外觀為灰黃色粉末。
實(shí)施例4酯化脂肪酶基因的克隆亞羅解脂酵母發(fā)酵液經(jīng)過離心分離得到上清，上清液用3倍體積的冷丙酮沉淀，得到的沉淀物冷丙酮洗滌3次，室溫干燥得到粗酶粉。此酶粉用25mM的磷酸緩沖液(pH7.5)溶解，離心得到上清液。此上清液經(jīng)過Q-sepharose FF層析柱后收集脂肪酶組分，該組分加入硫酸銨至終濃度為0.8M，然后經(jīng)過Butyl sepharose FF層析柱，收集脂肪酶組分，得到純化的脂肪酶。此脂肪酶組分在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上得到單一條帶，此條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)N端測(cè)序，得到氨基酸序列為VYTSTETSHIDQESY。
此序列同亞羅解脂酵母基因組的蛋白序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此序列與Lip2基因(AJ012632)編碼的氨基酸序列匹配。分析發(fā)現(xiàn)此序列含有保守的五肽序列GHSLG(第194-198氨基酸)，N-端1-30氨基酸為該脂肪酶的信號(hào)肽序列。根據(jù)lip2脂肪酶的基因序列(SEQ NO.1)設(shè)計(jì)如下引物引物15’-ACGAGAATTCGTGTACACCTCTACCGAGACC-3’引物25’-AATAAAGCTTGATACCACAGACACCCTCGGT-3’根據(jù)該引物，以亞羅解脂酵母基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到DNA序列，經(jīng)過測(cè)序得到SEQ ID NO2的基因序列，該序列與Lip2基因同源，編碼該脂肪酶的成熟肽，只是第536位核苷酸由g突變?yōu)閍，導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列中第179位氨基酸由甘氨酸(G)突變成天冬氨酸(D)。
實(shí)施例5脂肪酶的固定化將棉布和共固定劑按質(zhì)量體積比為1∶1的比例混合，室溫晾干得到活化載體。共固定劑為PEG6000、椰子油、吐溫80、明膠、卵磷脂和硫酸鎂混合物，其質(zhì)量比為明膠∶卵磷脂∶PEG6000∶吐溫80∶硫酸鎂∶椰子油＝5∶1∶1∶2∶1∶1。亞羅解脂酵母脂肪酶水溶液按8000U/克活化載體的比例與活化載體混合，浸泡，室溫晾干得到固定化脂肪酶。
實(shí)施例6將硅藻土和共固定劑按質(zhì)量體積比為1∶1.5的比例混合，室溫晾干得到活化載體。共固定劑為PEG6000、椰子油、吐溫80、明膠、卵磷脂和硫酸鎂混合物，其質(zhì)量比為明膠∶卵磷脂∶PEG6000∶吐溫80∶硫酸鎂∶椰子油＝5∶1∶1∶2∶1∶1。亞羅解脂酵母脂肪酶水溶液按8000IU/克活化載體的比例與活化載體混合，浸泡，室溫晾干得到固定化脂肪酶。
實(shí)施例7將滌綸和共固定劑按質(zhì)量體積比為1∶3的比例混合，室溫晾干得到活化載體。共固定劑為PEG6000、椰子油、吐溫80、明膠、卵磷脂和硫酸鎂混合物，其質(zhì)量比為明膠∶卵磷脂∶PEG6000∶吐溫80∶硫酸鎂∶椰子油＝5∶1∶1∶2∶1∶1。亞羅解脂酵母脂肪酶水溶液按8000IU/克活化載體的比例與活化載體混合，浸泡，室溫晾干得到固定化脂肪酶。
實(shí)施例80.085g實(shí)施例5中制備的固定化脂肪酶(16000u/g，)加入含有0.85mol/L濃度油酸和甲醇的5ml正己烷中，40℃條件下，反應(yīng)16hr后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)95％。經(jīng)過在-0.05Mpa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物油酸甲酯。
實(shí)施例90.12g實(shí)施例5中制備的固定化酶(9000U/g)加入到含1g棕櫚酸(0.54mol/L)和0.67g 2-乙基己醇(0.7mol/L)的5mL石油醚中。40℃條件下，振蕩反應(yīng)(190r/min)，22hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)96.7％。半衰期達(dá)150hr。
實(shí)施例100.05g實(shí)施例5中制備的脂肪酶(16000u/g)加入含有0.7mol/L濃度硬脂酸和丁醇的5ml的環(huán)己烷中，40℃條件下，反應(yīng)24hr后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)97％.經(jīng)過在-0.05Mpa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物硬脂酸丁酯。
實(shí)施例110.12g實(shí)施例5中制備的固定化酶(9000U/g)加入到含1g硬脂酸和0.62g 2-乙基己醇(0.65mol/L)的5mL正庚烷中。45℃條件下，振蕩反應(yīng)(190r/min)，50hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)95％。
實(shí)施例1220g實(shí)施例5中制備的固定化酶(9000U/g)加入含138g棕櫚酸(0.54mol)和92g異辛醇(0.706mol)的690mL的石油醚中，40℃條件下攪拌反應(yīng)。固定化酶固定在不銹鋼絲網(wǎng)上置于反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)24hr轉(zhuǎn)化率可達(dá)95％。反應(yīng)液經(jīng)堿液洗滌、過濾后在0.05～0.08的Mpa真空度下蒸發(fā)出有機(jī)溶劑，得到產(chǎn)品棕櫚酸異辛脂。產(chǎn)品色澤淺，酸值為0.205mgKOH/g。
實(shí)施例130.2g實(shí)施例5中制備的固定化酶(9000U/g)加入含0.2g癸酸和0.147g異丁醇的20ml正己烷中，50℃條件下，振蕩反應(yīng)(190r/min)，24hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)91％。
實(shí)施例140.2g實(shí)施例6中制備的固定化酶(9000U/g)加入含0.2g辛酸和0.135g異丙醇的20ml正己烷中，35℃條件下，振蕩反應(yīng)(190r/min)，20hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)93％。
實(shí)施例150.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.2g癸二酸和0.147g異丁醇的10ml正己烷中，40℃條件下，振蕩反應(yīng)，9hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)91％。
實(shí)施例160.12g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.2g癸二酸和0.535g十八醇的20ml石油醚中，30℃條件下，振蕩反應(yīng)，12hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)89％。
實(shí)施例170.3g實(shí)施例7中制備的固定化酶加入含0.2g癸二酸和0.2575g辛醇的10ml正己烷中，50℃條件下，振蕩反應(yīng)，18hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)88％。
實(shí)施例180.25g實(shí)施例6中制備的固定化酶加入含0.2g己二酸和0.3886g十二醇的20ml正辛烷中，20℃條件下，振蕩反應(yīng)，48hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)89％。
實(shí)施例190.3g固定化酶加入含0.2g己二酸和0.203g庚醇的20ml正己烷中，37℃條件下，振蕩反應(yīng)，24hr反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)92％。
實(shí)施例200.2g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入0.2g癸二酸和2g己醇，無溶劑條件下，40℃下反應(yīng)20h，轉(zhuǎn)化率達(dá)94％。
實(shí)施例210.16g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入0.2g己二酸和2g辛醇，無溶劑條件下，35℃下反應(yīng)50h，轉(zhuǎn)化率達(dá)90％。
實(shí)施例220.50g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入0.0956g維生素C和1.051g棕櫚酸的10mL丙酮溶劑，40℃，反應(yīng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率為65.3％。
實(shí)施例230.60g實(shí)施例7中制備的固定化酶加入0.0956g維生素C和0.956g月桂酸的10mL丙酮溶劑，37℃，反應(yīng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率為56.5％。
實(shí)施例240.40g固定化酶加入0.0956g維生素C和1.203g豆蔻酸的10mL丙酮溶劑，40℃，反應(yīng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率為58.2％。
實(shí)施例250.50g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入0.0956g維生素C和1.000g亞油酸的10mL丙酮溶劑，35℃，反應(yīng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率為61.6％。
實(shí)施例26
0.65g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入0.0956g維生素C和1.203g亞麻酸的10mL丙酮溶劑，40℃，反應(yīng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率為63.6％。
實(shí)施例270.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.100g(0.3mmol)維生素A醋酸酯和0.234g(0.9mmol)棕櫚酸的10ml正己烷中，35℃下反應(yīng)24h轉(zhuǎn)化率達(dá)84％。
實(shí)施例280.4g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.100g(0.3mmol)維生素A醋酸酯和0.254g(0.9mmol)油酸的20ml正己烷中，40℃下反應(yīng)24h轉(zhuǎn)化率達(dá)80％。
實(shí)施例290.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g色拉油和0.25g甲醇的10ml石油醚中，40℃下反應(yīng)30h轉(zhuǎn)化率達(dá)93％。
實(shí)施例300.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g豆油和0.27g甲醇的10ml正庚烷中，35℃下反應(yīng)40h轉(zhuǎn)化率達(dá)92％。
實(shí)施例310.4g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g紅花油和0.30g甲醇的10ml石油醚中，40℃下反應(yīng)50h轉(zhuǎn)化率達(dá)93％。
實(shí)施例320.35g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g亞麻油和0.28g甲醇的10ml正己烷中，30℃下反應(yīng)50h轉(zhuǎn)化率達(dá)90％。
實(shí)施例330.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g玉米油和0.26g甲醇的10ml石油醚中，40℃下反應(yīng)30h轉(zhuǎn)化率達(dá)92％。
實(shí)施例340.3g實(shí)施例6中制備的固定化酶加入含2.00g棕櫚油和0.29g甲醇的10ml環(huán)己烷中，30℃下反應(yīng)40h轉(zhuǎn)化率達(dá)89％。
實(shí)施例350.3g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含2.00g色拉油和0.36g乙醇的10ml石油醚中，40℃下反應(yīng)30h轉(zhuǎn)化率達(dá)91％。
實(shí)施例360.4g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.110g甘油和0.190g癸酸的20ml正己烷中，37℃下反應(yīng)24h轉(zhuǎn)化率達(dá)到96％。
實(shí)施例370.4g實(shí)施例5中制備的固定化酶加入含0.110g甘油和0.178g辛酸的20ml正己烷中，40℃下反應(yīng)24h轉(zhuǎn)化率達(dá)到92％。
<110>北京化工大學(xué)<120>脂肪酶、其基因、產(chǎn)生該酶的亞羅解脂酵母及其應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>301<212>PRT<213>亞羅解脂酵母<220>
<221>misc_特征<222>(179)<223>突變位點(diǎn)<400>1Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn1 5 10 15Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly20 25 30Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala35 40 45His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg Leu50 55 60Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln65 70 75 80Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr85 90 95Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala100 105 110Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly115 120 125Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly145 150 155 160His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys165 170 175Val Asn Asp His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val180 185 190Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln195 200 205Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg210 215 220Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly225 230 235 240Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His245 250 255Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln260 265 270Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn275 280 285His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile290 295 300<210>2<211>903<212>DNA<213>亞羅解脂酵母<220>
<221>misc_特征<222>(536)<223>突變位點(diǎn)<400>2gtgtacacct ctaccgagac ctctcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag60tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag240atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc300atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt360gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc420ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt480cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacgaccac540gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg600gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct ccaaggtgtc caaagaccga660aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt720taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc780aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc840cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt900atc 90權(quán)利要求
1.一種脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO1或其保守突變序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO2。
4.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述脂肪酶的亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1470。
5.一種利用權(quán)利要求1所述的脂肪酶合成酯的方法，其包括(a)獲得權(quán)利要求1所述的脂肪酶；(b)使用步驟(a)中所得脂肪酶合成酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的脂肪酶從權(quán)利要求4所述的亞羅解脂酵母提取得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的脂肪酶是重組和化學(xué)合成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)中通過固定化脂肪酶合成酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的固定化脂肪酶包含權(quán)利要求1所述的脂肪酶、載體和共固定劑，其中，載體與共固定劑的質(zhì)量體積比為1∶1～1∶3(W∶V)，脂肪酶與載體的比例為1000-30000單位/克載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述載體包括固體顆粒，如硅膠、硅藻土；和膜狀紡織品，包括天然纖維織物如棉布和化學(xué)纖維織物如滌綸。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述共固定劑選自高分子化合物、表面活性劑、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述共固定劑選自PEG6000、椰子油、吐溫80、明膠、卵磷脂和硫酸鎂中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)中所述酯的合成通過脂肪酸和醇的酯化反應(yīng)進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中脂肪酸和醇以3∶1～1∶5的摩爾比和脂肪酶混合，于20-50℃反應(yīng)9-50小時(shí)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的脂肪酸選自C8～C18一元脂肪酸和二元酸的至少一種，醇選自C1～C18的伯醇、C3～C5的仲醇以及甘油、維生素C中的至少一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的脂肪酸選自辛酸、癸酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、己二酸、壬二酸、癸二酸中的至少一種；所述醇選自甲醇、丙醇、丁醇、己醇、異辛醇、異丙醇、異丁醇、癸醇、十二醇、十八醇、甘油、維生素C中的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)中酯的合成通過底物醇或者酸和酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于底物醇或者底物酸和底物酯以摩爾比3∶1～1∶7與固定化脂肪酶混合，于20-50℃反應(yīng)9-50小時(shí)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述底物酸選自棕櫚酸、油酸中的至少一種；底物醇選自甲醇、乙醇中的至少一種；底物酯選自維生素A醋酸酯、豆油、紅花油、亞麻油、玉米油、棕櫚油、色拉油中的至少一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求13～19中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)使用有機(jī)溶劑或不用溶劑，所述有機(jī)溶劑選自丙酮、正己烷、環(huán)己烷、石油醚、正庚烷或正辛烷中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備一種脂肪酶，具體是氨基酸序列為SEQ ID NO1或其保守突變序列的脂肪酶，還涉及編碼該脂肪酶的基因、產(chǎn)生該脂肪酶的亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)以及利用該脂肪酶合成酯的方法。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1948470SQ200510112638
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者譚天偉, 于明銳, 陳必強(qiáng), 王芳, 鄧列, 聶開立, 何耀強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)