專利名稱：T1r味覺(jué)受體及其編碼基因的制作方法
涉及申請(qǐng)本專利申請(qǐng)涉及以下臨時(shí)申請(qǐng)U.S.Ser.No.60/187,546，2000年3月7日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“新型味覺(jué)受體及其編碼基因，”授予Zozulya和Adler；U.S.Ser.No.60/195,536，2000年4月7日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“哺乳動(dòng)物味覺(jué)受體和人類直向進(jìn)化同源物(ortholog)，”授予Adler；U.S.Ser.No.60/209,840，2000年6月6日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“新型味覺(jué)受體及其編碼基因，”授予Zozulya和Adler；U.S.Ser.No.60/214,213，2000年6月23日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“新型味覺(jué)受體及其編碼基因，”授予Zozulya和Adler；U.S.Ser.No.60/226,448，2000年8月17日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“新型味覺(jué)受體及其編碼基因，”授予Zozulya和Adler；U.S.Ser.No.60/259,227，2001年1月3日提出申請(qǐng)，標(biāo)題為“T1R味覺(jué)受體及其編碼基因，”授予Adler、Li、Staszewski和O’Connell，這些專利申請(qǐng)此處全文引用作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及最近鑒定的哺乳動(dòng)物化學(xué)感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體家族和編碼這些受體的基因和cDNA。本發(fā)明尤其涉及最近鑒定的哺乳動(dòng)物在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活躍的化學(xué)感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體家族、編碼這些受體的基因和cDNA和涉及在分析、發(fā)現(xiàn)味覺(jué)調(diào)節(jié)子時(shí)這些受體、基因和cDNA的使用方法。
背景技術(shù)：
味覺(jué)系統(tǒng)提供了關(guān)于外界化學(xué)組分的感受信息。味覺(jué)轉(zhuǎn)換是哺乳動(dòng)物化學(xué)觸發(fā)的感受中最復(fù)雜的形式之一。至今人們對(duì)于味覺(jué)感受由何種途徑引發(fā)仍缺乏了解。例如參見，Margolskee，生物試驗(yàn)(Bioassays)，15645-50(1993)；Avenet等，膜生物學(xué)雜志(J.Membrane Biol.)，1121-8(1989)。整個(gè)動(dòng)物界，從簡(jiǎn)單的后生動(dòng)物(metazoans)到最復(fù)雜的脊椎動(dòng)物都普遍存在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生現(xiàn)象。通常認(rèn)為味覺(jué)感受包括截然不同的信號(hào)發(fā)生途徑。這些途徑被認(rèn)為是由受體介導(dǎo)，即代謝趨向性(metabotropic)受體和變力(inotropic)受體。表達(dá)這些味覺(jué)受體的細(xì)胞在暴露在特定化學(xué)刺激下，通過(guò)去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位從而引發(fā)味覺(jué)感受，其被認(rèn)為是觸發(fā)感受。通常認(rèn)為這個(gè)事件在嘗覺(jué)傳入神經(jīng)元突觸處觸發(fā)了神經(jīng)傳遞素的釋放，從而啟動(dòng)了神經(jīng)途徑上的信號(hào)發(fā)生，由此介導(dǎo)味覺(jué)感知。例如參見，Roper，神經(jīng)科學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Neurosci.)，12329-53(1989)。
同樣，味覺(jué)受體特異性地識(shí)別能夠引發(fā)特異味覺(jué)感受的分子。這些分子在此處也被稱作“味覺(jué)元(tastant)”。許多味覺(jué)受體屬于7-跨膜受體超家族(Hoon等，細(xì)胞(Cell)96451(1999)；Adler等，細(xì)胞100693(2000))，同樣也被認(rèn)為是G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)。其它味覺(jué)被認(rèn)為由通道蛋白質(zhì)介導(dǎo)。G蛋白耦聯(lián)受體控制許多生理功能，如內(nèi)分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用、糖代謝和跨膜信號(hào)發(fā)生。許多這類受體的生物化學(xué)分析和分子克隆已經(jīng)揭示了關(guān)于這些受體功能的許多基本原理。
例如，美國(guó)專利號(hào)5,691,188描述了如何在配體(ligand)與GPCR結(jié)合后，這個(gè)受體可能發(fā)生構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致G蛋白活化。G蛋白包含三個(gè)亞基一個(gè)脒基核苷酸結(jié)合α亞基，一個(gè)β亞基和一個(gè)γ亞基。G蛋白在兩種形式中循環(huán)，取決于是GDP還是GTP結(jié)合到α亞基上。GDP結(jié)合上之后，G蛋白以異三體(heterotrimer)形式存在即Gαβγ復(fù)合物。當(dāng)GTP結(jié)合后，α亞基從異三體上解離，剩下Gβγ復(fù)合物。當(dāng)Gαβγ復(fù)合物與細(xì)胞膜上的活化G蛋白耦聯(lián)受體功能性結(jié)合時(shí)，GTP交換成結(jié)合GDP的速度加快，結(jié)合的Gα亞基從Gαβγ復(fù)合物中解離的速度亦隨之加快。自由Gα亞基和Gβγ復(fù)合物因此能夠傳遞一個(gè)信號(hào)到多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游環(huán)節(jié)。這些事件形成不同細(xì)胞信號(hào)現(xiàn)象多樣性的基礎(chǔ)，包括例如味覺(jué)和/或嗅覺(jué)等被認(rèn)為是神經(jīng)學(xué)感受感知的信號(hào)現(xiàn)象。
通常認(rèn)為哺乳動(dòng)物有五種基本味覺(jué)形式甜、苦、酸、咸和鮮(umami，谷氨酸鈉的味道)。例如參見，Kawamura等，鮮味入門一種基本味道(Introduction to UmamiA Basic Taste)(1987)；Kinnamon等，生理學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Physiol.)，54715-31(1992)；Lindemann，生理學(xué)綜述(Physiol.Rev.)，76718-66(1996)；Stewart等，美國(guó)生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)，2721-26(1997).大量動(dòng)物生理學(xué)研究表明味覺(jué)受體細(xì)胞可能對(duì)不同化學(xué)刺激進(jìn)行選擇性的反應(yīng)。例如參見，Akabas等，科學(xué)(Science)，2421047-50(1988)；Gilbertson等，遺傳生理學(xué)雜志(J.Gen.Physiol.)，100803-24(1992)；Bernhardt等，生理學(xué)雜志(J.Physiol.)，490325-36(1996)；Cummings等，神經(jīng)生理學(xué)雜志(J.Neurophysiol.)，751256-63(1996)。
在哺乳動(dòng)物中，味覺(jué)受體細(xì)胞被組裝進(jìn)味蕾，這些味蕾?gòu)V泛分布在舌上皮細(xì)胞的乳狀乳頭中。輪廓乳頭位于舌的最后部，包含成百上千個(gè)味蕾。與此相對(duì)照的是，位于舌后側(cè)面的葉狀乳頭含有幾十到幾百個(gè)味蕾。此外，位于舌前部的菌狀乳頭，僅有一個(gè)或幾個(gè)味蕾。
根據(jù)不同種類，每個(gè)味蕾含有50-150個(gè)細(xì)胞，包括前體細(xì)胞、支持細(xì)胞和味覺(jué)受體細(xì)胞。例如參見，Lindemann，生理學(xué)綜述(Physiol.Rev.)，76718-66(1996)。受體細(xì)胞在其基部受傳入神經(jīng)末梢支配，通過(guò)腦干和丘腦的突觸，這些神經(jīng)末梢將信息傳遞給大腦皮層的味覺(jué)中樞。闡明味覺(jué)細(xì)胞信號(hào)發(fā)生和信息處理的機(jī)制對(duì)于理解味覺(jué)的功能、調(diào)節(jié)和感知是非常重要的。
盡管人們對(duì)于味覺(jué)細(xì)胞功能的精神物理學(xué)和生理學(xué)了解很多，但對(duì)于介導(dǎo)感受信號(hào)反應(yīng)的分子和途徑缺乏了解。新型味覺(jué)受體和味覺(jué)信號(hào)發(fā)生分子的鑒定和分離能夠產(chǎn)生化學(xué)和遺傳調(diào)節(jié)味覺(jué)傳導(dǎo)途徑的新方法。例如，利用受體和通道蛋白，能夠篩選味覺(jué)活性的高親和力激動(dòng)劑、拮抗劑、反向激動(dòng)劑和調(diào)節(jié)劑。這些味覺(jué)調(diào)節(jié)化合物在藥品和食品工業(yè)十分有益，它們可以改進(jìn)多種消費(fèi)品的味道，或阻斷一些令人不快的味道，如藥劑的味道。
眾多的人類和其它真核生物化學(xué)感受受體全部或部分序列現(xiàn)在都已清楚。例如參見，Pilpel，Y和Lancet，D，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)，8969-977(1999)；Mombaerts，P.，神經(jīng)科學(xué)年度綜述，22487-50(1999)。同樣參見，EP0867508A2，US 5874243，WO 92/17585，WO 95/18140，WO 97/17444，WO 99/67282。由于配體-受體作用的復(fù)雜性，以及尤其是味覺(jué)元-受體作用的復(fù)雜性，配體-受體識(shí)別信息十分缺乏。本發(fā)明部分強(qiáng)調(diào)更好地了解化學(xué)感受受體和化學(xué)刺激之間作用的必要性。除此之外，本發(fā)明也提供新型化學(xué)感受受體、使用這些受體的方法、編碼這些受體的基因和cDNA來(lái)鑒定用于調(diào)節(jié)化學(xué)感受例如味覺(jué)感受傳導(dǎo)的分子。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種G蛋白耦聯(lián)受體新家族，和編碼這些受體的基因和cDNA。這些受體被認(rèn)為主要參與甜味味覺(jué)傳導(dǎo)，但也可能參與從其它味覺(jué)形式的信號(hào)轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物包括人類中味覺(jué)感知的描述方法和/或預(yù)知味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用這些受體和使用編碼此處所述受體的基因來(lái)完成。
為此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體新家族，在此稱為T1R，T1R在味覺(jué)感知中具有活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠保留味覺(jué)元結(jié)合活性的這些T1R的片段和變體(variants)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼這種T1R及其片段或變體的核酸序列和分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供表達(dá)載體，其中包含編碼這種T1R及其片段或變體的核酸序列，這些序列可操作性地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或參與正向或負(fù)向基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的其它序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供正常表達(dá)至少一種這種T1R或其片段或變體的人類或非人類細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供T1R融合蛋白質(zhì)或多肽，其包含至少一種這種T1R中的至少一個(gè)片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離的編碼T1R多肽的核酸分子，該分子包含一個(gè)核酸序列，其與選自下列的核酸序列至少50％，優(yōu)選75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同SEQ ID NO1，2，3，9，11，13，15，16，20及其保守性修飾的變體序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供分離的核酸分子，該分子包含一個(gè)核酸序列，其編碼一條多肽，其氨基酸序列與選自下列的氨基酸序列至少35％到50％，和優(yōu)選60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同SEQ ID NO4，10，12，14，17和其保守性修飾的變體序列，其中該片段長(zhǎng)度至少是20，優(yōu)選40，60，80，100，150，200或250個(gè)氨基酸。任選地，片段可以是能結(jié)合抗-T1R抗體的抗原性片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離的多肽，其包含所述片段的變體，其中最多在10，優(yōu)選5，4，3，2或1個(gè)氨基酸殘基處存在變異。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這些T1R的激動(dòng)劑和拮抗劑，或其片段或變體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物包括人類中味覺(jué)感知的展示方法和/或預(yù)知味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用此處所述的T1R，或其片段或變體，和編碼該T1R的基因，或其片段或變體來(lái)完成。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)預(yù)定味覺(jué)感知的新型分子或分子組合。這些分子或組合物可以由以下方法得到對(duì)于已知分子或分子組合確定其在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；對(duì)于一種或多種未知分子或分子組合確定其在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；比較一種或多種未知組合物和一種或多種已知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；選擇能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物特定味覺(jué)感知的分子或分子組合；和合并兩種或多種分子或分子組合形成分子或分子組合，其能夠引發(fā)一種特定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知。合并步驟產(chǎn)生單獨(dú)分子或分子組合，其能夠引發(fā)特定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供篩選一種或多種化合物以鑒定是否存在哺乳動(dòng)物可察覺(jué)的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物與至少一種公開的T1R、其片段或變體接觸的步驟，其中優(yōu)選地哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激味覺(jué)的方法，包括以下步驟對(duì)于此處所述多數(shù)T1R中的每一個(gè)，或其變體的片段，優(yōu)選地人類T1R來(lái)說(shuō)，確定T1R與味覺(jué)元相互作用程度；合并多個(gè)化合物，其中每個(gè)化合物都有與一種或多種T1R預(yù)先確定的相互作用，以達(dá)到一起提供受體-刺激模式的程度，這種程度可以模仿味覺(jué)模式。通過(guò)在此描述的任何一個(gè)結(jié)合或報(bào)告試驗(yàn)可以確定味覺(jué)元與T1R的相互作用。多數(shù)化合物然后可以結(jié)合形成混合物。需要的話，多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價(jià)結(jié)合。結(jié)合后的化合物基本上刺激至少50％、60％、70％、75％、80％或90％或全部可以實(shí)質(zhì)上由味覺(jué)元刺激的受體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種方法，其中針對(duì)多數(shù)T1R、或其片段或變體，對(duì)多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行測(cè)試，以確定每一個(gè)T1R和每一標(biāo)準(zhǔn)化合物的相互作用程度，由此產(chǎn)生每一標(biāo)準(zhǔn)化合物的受體刺激模式。這些受體刺激模式可以存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中。本方法還可以包括提供一個(gè)味覺(jué)的所希望的受體刺激模式；將所希望的受體刺激模式與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)比較；并確定能夠與所希望的受體刺激模式最密切相匹配的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物組合。本方法還進(jìn)一步包括將標(biāo)準(zhǔn)化合物組合成一種或多種已經(jīng)確定的組合物來(lái)刺激味覺(jué)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供展示哺乳動(dòng)物感知特定味覺(jué)元的方法，包括以下步驟提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T1R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于2；從該值中產(chǎn)生味覺(jué)感知的定量表示法。T1R可能是在此公開的味覺(jué)受體，或其片段或變體，表示法可能包含一個(gè)點(diǎn)或n維空間的體積，可能包含一個(gè)圖或一個(gè)譜，還可能包含一個(gè)定量表示法矩陣。同樣，提供的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的T1R、或其片段或變體與試驗(yàn)組合物接觸，并定量測(cè)量該組合物與該受體的作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的方法(該感知是由一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的未知的味覺(jué)感知)，包括以下步驟提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T1R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于2；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知；并針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，從該值中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T1R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于2；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知；針對(duì)一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知，從該值中產(chǎn)生一個(gè)哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法，通過(guò)比較哺乳動(dòng)物對(duì)一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的定量表示法和哺乳動(dòng)物對(duì)一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的定量表示法，預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物的味覺(jué)感知(該味覺(jué)感知是由一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生的未知味覺(jué)感知)。本方法使用的T1R可能包括在此公開的味覺(jué)受體、或其片段或變體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是一個(gè)冷凍小鼠舌的冰凍切片，通過(guò)原位雜交顯示在小鼠輪廓乳頭味蕾有T1R3基因表達(dá)。箭頭所示為選擇T1R3表達(dá)味覺(jué)受體細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明因此提供分離的編碼味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體(“GPCR”)的核酸分子，和它們編碼的多肽。這些核酸分子和它們編碼的多肽是味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR T1R家族成員。味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR T1R家族成員由Hoon等，Cell，96541-551(1999)，WO 00/06592和WO00/06593鑒定，在此全文引用以供參考。
本發(fā)明尤其提供編碼味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR新家族的核酸。這些核酸和編碼受體在此處被稱為味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR“T1R”家族成員。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，T1R家族成員包括rT1R3、mT1R3、hT1R3和hT1R1。不局限于具體理論，通常認(rèn)為味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR是味覺(jué)傳導(dǎo)途徑的組分，可能參與甜味物質(zhì)和/或其它味覺(jué)形式的味覺(jué)檢測(cè)。
此外，通常認(rèn)為T1R家族成員可能與其它T1R家族成員、其它味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR，或其組名結(jié)合發(fā)揮作用，由此產(chǎn)生化學(xué)感覺(jué)的味覺(jué)傳導(dǎo)。例如，一般認(rèn)為T1R1和T1R3在相同味覺(jué)受體細(xì)胞型中可能共同表達(dá)，兩種受體可能物理上相互作用，形成一個(gè)異二聚體味覺(jué)受體?；蛘撸琓1R1和T1R3可能都單獨(dú)與同一類型配體結(jié)合，而它們的共同結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致一種特異感知的味覺(jué)。
因?yàn)檫@些核酸是在味覺(jué)細(xì)胞中特異表達(dá)的，這些核酸為鑒定味覺(jué)細(xì)胞提供了有價(jià)值的探針。例如，T1R多肽和蛋白質(zhì)的探針可用于鑒定存在于葉狀、輪廓和菌狀乳頭的味覺(jué)細(xì)胞，以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃腸道上皮和會(huì)厭的味覺(jué)細(xì)胞。它們同樣可以作為制作味覺(jué)拓?fù)鋱D的工具，用來(lái)闡明舌味覺(jué)細(xì)胞和味覺(jué)感受神經(jīng)元(通向腦味覺(jué)中樞)之間的關(guān)系。特別是檢測(cè)T1R的方法可用于鑒定對(duì)甜味或其它特定味覺(jué)形式味覺(jué)元敏感的味覺(jué)細(xì)胞。而且，該核酸和其編碼的蛋白質(zhì)可以作為研究味覺(jué)誘導(dǎo)的行為的探針。同樣，編碼人類T1R的基因在染色體上的定位可用于由T1R家族成員引起的和與之關(guān)聯(lián)的疾病、突變和性狀的鑒定。
本發(fā)明的編碼T1R蛋白質(zhì)和多肽的核酸可以依據(jù)WO 00/035374公開的方法，從多種來(lái)源經(jīng)遺傳工程、擴(kuò)增、合成、和/或重組表達(dá)方法分離。該專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊米鳛閰⒖肌?br> 本發(fā)明也提供篩選這些新型味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR調(diào)節(jié)子(如活化子(activator)、抑制子(inhibitor)、刺激子(stimulator)、增強(qiáng)子、激動(dòng)劑和拮抗劑等)的方法。這些味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子對(duì)于味覺(jué)信號(hào)發(fā)生途徑的藥理、化學(xué)、和遺傳調(diào)節(jié)等十分有用。這些篩選方法可用于鑒定味覺(jué)細(xì)胞活性的高親和力激動(dòng)劑和拮抗劑。這些調(diào)節(jié)化合物然后能用于食品和藥物工業(yè)來(lái)定制味道，例如調(diào)節(jié)食品和藥品的甜味。
因此，本發(fā)明提供檢測(cè)和鑒定味道調(diào)節(jié)的驗(yàn)定法，其中T1R家族成員作為調(diào)節(jié)子對(duì)味覺(jué)傳導(dǎo)影響的直接或間接報(bào)告分子。例如GPCR可用于例如在體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)測(cè)量配體結(jié)合、離子濃度、膜電位、電流、離子流量、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛鹊茸兓脑囼?yàn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，T1R家族成員可以通過(guò)與第二報(bào)告分子如綠色熒光蛋白質(zhì)結(jié)合而作為間接報(bào)告子(reporter)(例如參見，Mistili&Spector，Nature Biotechnology，15961-964(1997))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，T1R家族成員可以在細(xì)胞中重組表達(dá)，并且通過(guò)GPCR活性對(duì)味覺(jué)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，可以通過(guò)測(cè)量鈣離子水平和其它細(xì)胞內(nèi)信息如cAMP、cGMP或IP3的變化來(lái)進(jìn)行分析。
在某些實(shí)施方案中，T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)胞外、跨膜或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，與異源多肽融合，從而形成嵌合多肽，例如具有GPCR活性的嵌合多肽。該嵌合多肽十分有用，例如可用于鑒定T1R多肽的配體、激動(dòng)劑、拮抗劑或其它調(diào)節(jié)子的試驗(yàn)中。另外，該嵌合多肽還可用于產(chǎn)生具有新的配體結(jié)合專一性、調(diào)節(jié)模式、信號(hào)傳導(dǎo)途徑或其它此類性質(zhì)的新型味覺(jué)受體，或用于產(chǎn)生具有新的配體結(jié)合專一性、調(diào)節(jié)模式、信號(hào)傳導(dǎo)途徑等的組合特性的新型味覺(jué)受體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，T1R多肽在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，與促進(jìn)質(zhì)膜運(yùn)輸、或成熟并定向通過(guò)分泌途徑異源、伴侶序列一起表達(dá)為一個(gè)嵌合受體。任選的異源序列可以是一個(gè)視紫紅質(zhì)序列，例如視紫紅質(zhì)N末端片段。這種嵌合T1R受體可以在任何真核細(xì)胞如HEK-293細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，這些細(xì)胞包含G蛋白，例如Gα15或Gα16或其它形式的混棲G蛋白，這些蛋白能夠使廣泛的化學(xué)感受GPCR與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生途徑配對(duì)或與信號(hào)蛋白如磷脂酶C配對(duì)。可以用任何標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)這些細(xì)胞中的嵌合受體的活化，例如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中FURA-2依賴的熒光來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。如果優(yōu)選的宿主細(xì)胞不表達(dá)合適的G蛋白，它們可以用編碼混棲G蛋白的基因(例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S 60/243,770中所描述的)轉(zhuǎn)染。該專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊米鳛閰⒖肌?br> 分析味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子的方法包括體外配體結(jié)合試驗(yàn)，其中使用T1R多肽，其部分，即細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合、或包含一種或多種T1R家族成員結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白；表達(dá)T1R多肽、片段或融合蛋白質(zhì)的卵母細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞；T1R家族成員的磷酸化和去磷酸化；結(jié)合到GPCR上的G蛋白；配體結(jié)合試驗(yàn)；電壓、膜電位和電阻變化；離子流量試驗(yàn)；細(xì)胞內(nèi)第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇的變化；細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
此外，本發(fā)明提供檢測(cè)T1R核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，用來(lái)進(jìn)行味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)和味覺(jué)受體細(xì)胞的特異性鑒定的研究。T1R家族成員也提供親子和法醫(yī)鑒定有用的核酸探針。T1R基因也可作為用以鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞，如葉狀、菌狀、輪廓、geschmackstreifen和會(huì)厭味覺(jué)受體細(xì)胞的有用的核酸探針。T1R受體也可用于制備鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞的單克隆和多克隆抗體?？梢允褂萌缦录夹g(shù)如mRNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增、總RNA或多聚A+RNA的提取、Nothern印跡、點(diǎn)印跡、原位雜交、RNA酶保護(hù)、S1消化、探明DNA微芯片陣列、Western印跡等技術(shù)鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞。
從功能上講，T1R多肽包含一個(gè)涉及7種跨膜G蛋白耦聯(lián)受體的家族，其被認(rèn)為參與味覺(jué)傳導(dǎo)，可能與G蛋白相互作用以介導(dǎo)味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)(例如參見，F(xiàn)ong，Cell Signal，8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.CellBiol.，6180(1994))。從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，T1R家族成員核苷酸序列可能編碼相關(guān)多肽，其包含一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、7個(gè)跨膜域和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。來(lái)自其它物種的相關(guān)T1R家族基因與SEQ ID NO1，2，3，9，11，13，15，16，20，或其保守性修飾的變體中至少有50核苷酸長(zhǎng)度，可選地100、200、500或更多核苷酸長(zhǎng)度的區(qū)域，至少有50％，可選地60％、70％、80％或90％核苷酸序列相同，或編碼多肽與SEQ ID NO4，10，12，14，17，或其保守性修飾的變體中的至少約25個(gè)氨基酸，任選地50到100氨基酸的區(qū)域，至少大約35到50％，可選地60％、70％、80％或90％氨基酸序列相同。
已經(jīng)鑒定了T1R家族成員特征性的幾個(gè)共有氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域。例如，T1R家族成員通常包括與T1R共有序列1和2(分別為SEQ ID NO 18和19)至少有50％，可選地55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高的一致性的序列。通過(guò)同一性、特異雜交或擴(kuò)增、或與針對(duì)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體的特異結(jié)合，這些保守的結(jié)構(gòu)域因而可用于鑒定T1R家族的成員。這些T1R共有序列具有下列氨基酸序列T1R家族共有序列1(SEQ ID NO18)(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E
T1R家族共有序列2(SEQ ID NO19)(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)這些共有序列包含此處所述的T1R多肽中發(fā)現(xiàn)的序列，但是其它生物體T1R家族成員可能期望包含與在此特別描述的共有序列75％或更高一致性的共有序列。
T1R核苷酸和氨基酸序列的特異區(qū)可能用于鑒定多態(tài)變體、種間同源體和T1R家族成員等位基因。這些鑒定可以體外進(jìn)行，例如在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件或PCR(例如，使用編碼T1R的上述共有序列的引物)，或通過(guò)在一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中使用這些序列信息用以和其它核苷酸序列進(jìn)行比較。單一物種群內(nèi)T1R基因的不同等位基因也可用于確定等位基因序列差異是否與種群不同成員之間味覺(jué)感知差異相關(guān)。典型PCR形式的擴(kuò)增和克隆技術(shù)對(duì)于分離直向進(jìn)化同源物(ortholog)十分有益，例如簡(jiǎn)并引物能有效地檢測(cè)跨物種的相關(guān)基因，但是通常比同一個(gè)物種內(nèi)T1R家族的共生同源成員具有更高水平的相關(guān)一致性。
例如，簡(jiǎn)并引物SAP077(SEQ ID NO5)和SAP0079(SEQ ID NO6)可以用于從不同哺乳動(dòng)物基因組中擴(kuò)增和克隆T1R3基因。相反，單一物種內(nèi)與T1R3相關(guān)的基因最好使用序列模式識(shí)別軟件來(lái)尋找相關(guān)序列。通常，可以通過(guò)比較一個(gè)大約25個(gè)氨基酸或更多，如50-100個(gè)氨基酸的氨基酸序列來(lái)實(shí)施T1R家族成員多態(tài)變體和等位基因的鑒定。氨基酸相同性大約至少35-50％，和可選地60％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高通常表明蛋白質(zhì)是T1R家族成員的多態(tài)變體、種間同源體或等位基因。序列比較可以由下述任何一種序列比較算法實(shí)現(xiàn)。特異性結(jié)合T1R多肽或其保守區(qū)的抗體也可用于鑒定等位基因、種間同源體和多態(tài)變體。
T1R基因的多態(tài)變體、種間同源體和等位基因可通過(guò)檢驗(yàn)推定T1R多肽的味覺(jué)細(xì)胞特異性表達(dá)來(lái)確認(rèn)。通常，擁有在此公開的氨基酸序列的T1R多肽可作為與推定的T1R多肽比較的陽(yáng)性對(duì)照，以證明T1R家族成員的多態(tài)變體或等位基因的鑒定。多態(tài)變體、等位基因和種間同源體預(yù)計(jì)保留有G蛋白耦聯(lián)受體的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。更詳細(xì)內(nèi)容參見WO 00/06592，其中公開了相關(guān)的T1R家族成員，GPCR-B3，該專利申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖?。GPCR-B3受體在此處稱為rT1R1和mT1R1。另外參見WO 00/06593，其中也公開了相關(guān)的T1R家族成員GPCR-B4，該專利申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖?。GPCR-B4受體在此處稱為rT1R2和mT1R2。
T1R家族成員的核苷酸和氨基酸序列信息還可以用來(lái)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中構(gòu)建味覺(jué)細(xì)胞特異性多肽模型。這些模型然后可用于鑒定可激活或抑制T1R受體蛋白質(zhì)的化合物。然后這些調(diào)節(jié)T1R家族成員活性的化合物可用于研究T1R基因和受體在味覺(jué)傳導(dǎo)中的作用。
本發(fā)明同樣提供分析方法，特別是高通量分析方法，用來(lái)鑒定與T1R多肽相互作用和/或調(diào)節(jié)T1R多肽的分子。在眾多方法中，使用了獨(dú)特的T1R家族成員的結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)胞外、跨膜、或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或區(qū)。在眾多的實(shí)施方案中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合可以結(jié)合固體基質(zhì)，并用來(lái)例如分離配體、激動(dòng)劑、拮抗劑、或其它能夠結(jié)合T1R多肽和/或調(diào)節(jié)T1R多肽活性的分子。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供新的定義為hT1R3的人類T1R家族GPCR基因。該hT1R3基因從包括GenBank的HTGS部的人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出來(lái)。hT1R3的核苷酸序列和概念性翻譯的氨基酸序列見SEQ IDNO1-4。由于它與候選大鼠味覺(jué)受體rT1R1(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AL127389)序列相似，因而將hT1R3受體從部分測(cè)序的BAC基因組克隆RP5-89003(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AL139287)中確定出來(lái)。作為參考，預(yù)測(cè)的hT1R3和rT1R1蛋白序列配對(duì)相同性大約為34％。與GPCR C家族(包括鈣敏感性受體、推定的V2R信息素受體、GABA-B受體、魚味覺(jué)受體和代謝趨向性谷氨酸受體)的另外成員序列比較顯示，hT1R3很可能屬于T1R1和另一大鼠候選味覺(jué)受體(rT1R2，登錄號(hào)AF127390)定義的C家族亞組。
本發(fā)明也提供稱為rT1R1的大鼠味覺(jué)受體的稱為hT1R1的人類直向進(jìn)化同源物。rT1R1和hT1R1的基因產(chǎn)物大約有74％的一致性。小鼠基因mT1R1已經(jīng)有報(bào)道，參加Hoon等，Cell，96541-551(2000)，并且繪制在與含有hT1R1的間隔區(qū)同源的染色體間隔上。hT1R1核苷酸和概念性翻譯的序列在此分別被描述為SEQ.ID NOS 15和16。
不局限于任何理論，因?yàn)閙T1R3與Sac位點(diǎn)(位于4號(hào)染色體遠(yuǎn)端能夠影響甜味味覺(jué))的連鎖，預(yù)計(jì)受體T1R家族參與了甜味味覺(jué)傳導(dǎo)。也有報(bào)道認(rèn)為人T1R3定位于1p36.2-1p36.33，這個(gè)區(qū)表現(xiàn)出與小鼠含有Sac和T1R1的間隔區(qū)有保守同線性(conserved synteny)。但是，T1R類型受體可能介導(dǎo)其它味覺(jué)形式，如苦、鮮、酸和咸等。
預(yù)想到的各種保守性突變和替換都在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，利用已知的包括PCR、基因克隆、cDNA定點(diǎn)突變、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體外轉(zhuǎn)錄的重組基因技術(shù)方法進(jìn)行氨基酸替換都將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。由此可以篩選到具有味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR功能活性的變體。
A.T1R多肽的鑒定和特性表征本發(fā)明T1R蛋白和多肽的氨基酸序列可以通過(guò)編碼核酸序列的推定翻譯得到鑒定。這些多種多樣的氨基酸序列和編碼核酸序列可以按照許多方法互相比較或與其它序列比較。
例如在序列比較中，通常一條序列作為參考序列，與另外的試驗(yàn)序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將試驗(yàn)和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。可以使用默認(rèn)程序參數(shù)，如下面就BLASTN和BLASTP程序所述，或指定替代參數(shù)。序列比較算法然后根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算試驗(yàn)序列相對(duì)于參考序列的百分序列相同性。
此處所用的“比較窗口”包括參考任何毗鄰位置數(shù)的區(qū)段，(選自20到600，通常大約50到大約200，更經(jīng)常是大約100到大約150)，其中經(jīng)過(guò)兩個(gè)序列優(yōu)化比對(duì)后，可以將序列與相同號(hào)碼的鄰近位置的參考序列比較。
計(jì)算序列的排列方法在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知。可以例如通過(guò)Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源算法，通過(guò)Needleman&Wunsch，J Mol.Biol.48443(1970)的同源比對(duì)算法，通過(guò)Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)相似搜尋方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方案(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science，Dr.，Madison，WI)，或通過(guò)手工比對(duì)和肉眼觀察(例如參見，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.1995增刊))的方法進(jìn)行比較序列的優(yōu)化比對(duì)。
適于確定序列同源性和序列相似性百分比的算法優(yōu)選的實(shí)施例是BLAST和BLAST2.0算法，其分別由Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J Mol.Biol.，215403-410(1990)描述。執(zhí)行BLAST分析的軟件已經(jīng)可以從國(guó)家生物工程信息中心(NatinalCenter for Biotechnology Information)公開(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。該算法包括首先通過(guò)確定查詢序列W長(zhǎng)度中的短字來(lái)確定高分序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)序列的相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，其或是匹配或是符合一些陽(yáng)性值閾值分?jǐn)?shù)T。T是指鄰近字分?jǐn)?shù)閾值(Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和ltschul等，JMol.Biol.，215403-410(1990))。這些初始的鄰近字值(word hit)作為種子，以啟動(dòng)搜索去尋找包含它們的更長(zhǎng)的HSPs。沿著序列向兩邊延伸該字值，直到累積比對(duì)分?jǐn)?shù)能被增加。對(duì)于核苷酸序列，用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；總是＞0)和N(錯(cuò)配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是＜0)來(lái)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，使用計(jì)分矩陣來(lái)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。字值向每個(gè)方向的延伸當(dāng)出現(xiàn)下列情形即停止累積比對(duì)分?jǐn)?shù)X量從其最大獲得值下降；由于一種或多種負(fù)分?jǐn)?shù)殘基比對(duì)結(jié)果導(dǎo)致累積分?jǐn)?shù)變?yōu)?或以下；或到達(dá)了序列任一末端。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)(W)為11，預(yù)期值(E)為10，M＝5，N＝-4以兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)為3，預(yù)期值(E)為10，而BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad Sci.USA 8910915(1989))比對(duì)(B)為50，預(yù)期值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較。
另一個(gè)有益的算法實(shí)施例是PILEUP。PILEUP從一組相關(guān)序列中產(chǎn)生多重序列比對(duì)結(jié)果，它使用漸進(jìn)的、配對(duì)比對(duì)方式來(lái)顯示關(guān)系和序列同源性百分比。它也能畫出一個(gè)所謂的“樹”或“樹狀圖”來(lái)顯示聚類關(guān)系用以產(chǎn)生比對(duì)(例如參見圖2)。PILEUP使用一個(gè)簡(jiǎn)化了的Feng&Doolittle的漸進(jìn)式比對(duì)方法(J Mol.Evol.35351-360(1987))。該方法與Higgins&Sharp，CABIOS 5151-153(1989)描述的方法相似。該程序可以比對(duì)多達(dá)300條序列，每條的最大允許長(zhǎng)度為5000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重比對(duì)程序由兩條最相似序列的配對(duì)比對(duì)開始，產(chǎn)生兩條比對(duì)序列的簇(cluster)。該簇然后與下一個(gè)最相關(guān)序列或比對(duì)序列的簇比對(duì)。通過(guò)兩條單獨(dú)序列配對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單延伸，兩個(gè)簇序列就被比對(duì)了。通過(guò)一系列漸進(jìn)式、配對(duì)比對(duì)，完成最后的比對(duì)。通過(guò)指定序列比較區(qū)的特異序列和它們的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)以及程序參數(shù)后，運(yùn)行程序。使用PILEUP，將參考序列與其它試驗(yàn)序列比較，使用如下參數(shù)來(lái)確定百分序列同一關(guān)系，默認(rèn)缺口加權(quán)(3.00)，默認(rèn)缺口長(zhǎng)度加權(quán)(0.10)和末端缺口加權(quán)。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包中獲得，例如版本7.0(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12387-395(1984))。編碼基因的蛋白質(zhì)序列可以由相應(yīng)的開放閱讀框架概念性地翻譯而得到。使用BLASTP算法將這些蛋白質(zhì)序列與公開數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已知的蛋白質(zhì)比較，顯示它們與T1R家族成員有很高的同源性，每一個(gè)T1R家族與至少一種已知的家族成員有至少大約35到50％，優(yōu)選地至少55％、至少60％、至少65％和最優(yōu)選70％的氨基酸同源性。
B.定義除非另有所指，此處使用的下列術(shù)語(yǔ)各自具有描述給它們的意義。
“味覺(jué)細(xì)胞”包括神經(jīng)上皮細(xì)胞，其成組后形成舌的味蕾，例如葉狀、菌狀和輪廓細(xì)胞(例如參見，Roper等，Ann.Rev.Neurosci.12329-353(1989))。味覺(jué)細(xì)胞同樣也見于顎和其它組織，如食管和胃。
“T1R”指G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一種或多種成員，這些受體在諸如葉狀、菌狀和輪廓細(xì)胞，以及上顎和食管的細(xì)胞中表達(dá)(例如參見，Hoon等，Cell，96541-551(1999)，在此全文引用以作參考)。該家族成員在WO 00/06592中也稱為GPCR-B3和TR1，在WO 00/06593中也稱為GPCR-B4和TR2。GPCR-B3在此同樣稱為rT1R1，GPCR-B4也被稱作rT1R2。味覺(jué)受體細(xì)胞也可以通過(guò)形態(tài)學(xué)(例如參見，Roper，Supra)來(lái)鑒定，或通過(guò)味覺(jué)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白的表達(dá)來(lái)鑒定。T1R家族成員可能具有作為甜味味覺(jué)傳導(dǎo)受體的能力，或辨別其它不同味覺(jué)形式的能力。
“T1R”核酸編碼擁有7個(gè)跨膜區(qū)的GPCR家族，其具有G蛋白耦聯(lián)受體活性，例如在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶(關(guān)于GPCR結(jié)構(gòu)和功能的描述，參見例如，F(xiàn)ong，Supra，和Baldwin，Supra)的刺激下，它們可以響應(yīng)外界刺激而與G蛋白結(jié)合并促進(jìn)產(chǎn)生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和鈣離子。一個(gè)單獨(dú)的味覺(jué)細(xì)胞可能包括多種截然不同的T1R多肽。
術(shù)語(yǔ)“T1R”家族因此是指具有以下特征的多態(tài)變體、等位基因、突變體和種間同源體(1)與SEQ ID NO4，10，12，14或17在一個(gè)大約25個(gè)氨基酸，可選地50-100個(gè)氨基酸的窗口上相比，具有至少大約35到50％氨基酸同一性，可選地大約60，75，80，85，90，95，96，97，98，或99％的氨基酸同一性；(2)特異性地結(jié)合針對(duì)某個(gè)免疫原(包含選自下列的氨基酸序列，SEQ ID NO4，10，12，14，17和其保守性修飾的變體)產(chǎn)生的抗體；(3)由一條核酸分子編碼，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下該分子可以特異性地與選自SEQ ID NO1，2，3，9，11，13，15，16，20和其保守性修飾變體的序列雜交(大小至少大約100，可選地至少大約500-1000個(gè)核苷酸)；(4)包括與選自SEQ ID NO4，10，12，14或17的氨基酸序列至少有大約35到50％同一性的序列；或(5)能被引物擴(kuò)增，該引物在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下可以與編碼SEQ ID NO7，8和其保守性修飾的變體的簡(jiǎn)并引物的相同序列進(jìn)行雜交。
從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，某些化學(xué)感受GPCR具有“N端結(jié)構(gòu)域”、“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”、包含7個(gè)跨膜區(qū)和相關(guān)胞漿、細(xì)胞外環(huán)的“跨膜結(jié)構(gòu)域”；“胞漿結(jié)構(gòu)域”和”C端結(jié)構(gòu)域”(參見例如，Hoon等，Cell，96541-551(1999)；Buck&Axel，Cell，65175-187(1991))。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以從結(jié)構(gòu)上鑒定這些結(jié)構(gòu)域，例如鑒定親水和疏水結(jié)構(gòu)域的序列分析程序(參見例如，Stryer，Biochemistry，(3rded.1988)；另見任何一款基于因特網(wǎng)的序列分析程序，例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上可以找到的程序)。這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥苽淝逗系鞍缀捅景l(fā)明的體外試驗(yàn)，例如配體結(jié)合試驗(yàn)十分有用。
“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”因而指從細(xì)胞膜向外突出并暴露到細(xì)胞外一邊的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域一般包括暴露到細(xì)胞的細(xì)胞外一邊的“N端結(jié)構(gòu)域”，可選地可能包括暴露到細(xì)胞的細(xì)胞外一邊的跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外環(huán)部分，即跨膜區(qū)2和3之間、跨膜區(qū)4和5之間、跨膜區(qū)6和7之間的環(huán)。
“N端結(jié)構(gòu)域”區(qū)起始于N末端并延伸至靠近跨膜結(jié)構(gòu)域起始部位的區(qū)域。更具體而言，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該結(jié)構(gòu)域起始于N末端，并大約結(jié)束于大約位于563±20個(gè)氨基酸位置處的保守性谷氨酸。SEQ ID40的1-580氨基酸相應(yīng)區(qū)是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的一個(gè)特別的實(shí)施例，它稍微延伸進(jìn)跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部。這些細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ隗w外可溶性和固相配體結(jié)合試驗(yàn)十分有益。另外，下面描述的跨膜區(qū)，與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組合同樣也能夠結(jié)合配體，因而對(duì)于體外配體結(jié)合試驗(yàn)十分有用。
“跨膜結(jié)構(gòu)域”包括7個(gè)“跨膜區(qū)”，是指位于胞漿膜內(nèi)的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，并同樣可能包括相應(yīng)的胞漿(細(xì)胞內(nèi))和細(xì)胞外環(huán)。在一個(gè)實(shí)施例中，該區(qū)對(duì)應(yīng)于T1R家族成員大約起始于位于大約563±20氨基酸處的位置處的保守谷氨酸殘基、結(jié)束于位于大約812±10氨基酸的位置處的保守酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域。使用由Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-32(1982)，或Stryer，Supra描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以對(duì)7個(gè)跨膜區(qū)和細(xì)胞外和胞漿環(huán)進(jìn)行鑒定。
“胞漿結(jié)構(gòu)域”是指朝向細(xì)胞內(nèi)部的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如“C端結(jié)構(gòu)域”和跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)環(huán)，例如跨膜區(qū)1和2之間、跨膜區(qū)3和4之間、跨膜區(qū)5和6之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)?！癈端結(jié)構(gòu)域”是指跨越最后一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域末端和蛋白質(zhì)的C末端的區(qū)域，通常位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，該區(qū)起始于位于大約812±10氨基酸的位置處的保守酪氨酸殘基，并繼續(xù)至多肽的C末端。
術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合區(qū)”或“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指從化學(xué)感受受體特別是味覺(jué)受體衍生出的序列，它基本上包含至少是受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施例中，配體結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可能包含N端結(jié)構(gòu)域和，可選地，跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分，例如跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外環(huán)。配體結(jié)合區(qū)可能能夠結(jié)合配體，特別是味覺(jué)元。
在測(cè)試能夠調(diào)節(jié)T1R家族成員介導(dǎo)的味覺(jué)傳導(dǎo)的化合物的試驗(yàn)中，短語(yǔ)“功能性效果”包括確定任何一個(gè)間接或直接受受體影響的參數(shù)，例如功能性、物理和化學(xué)效果。它包括體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)配體結(jié)合、離子流量、膜電位、電流、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛?如cAMP、cGMP、IP3，或細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度)，還包括其它生理學(xué)效果例如神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放的增加或減少等。
試驗(yàn)中的“確定功能性效果”是指檢驗(yàn)使直接或間接受T1R家族成員影響的參數(shù)增加或減少的化合物，例如功能性、物理和化學(xué)效果。這些功能性效果可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段進(jìn)行測(cè)量，例如光譜特征(例如熒光，吸收，折射率)、流體動(dòng)力學(xué)(如形狀)、色譜的或溶解性、膜片鉗試驗(yàn)(patch clamping)、電壓敏感性染料、全細(xì)胞電流、放射性同位素流出、可誘導(dǎo)標(biāo)志物、卵母細(xì)胞TIR基因表達(dá)的變化；組織培養(yǎng)細(xì)胞T1R表達(dá)；T1R基因的轉(zhuǎn)錄活化；配體結(jié)合試驗(yàn)；電壓、膜電位和電導(dǎo)變化；離子流量試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的變化；細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。
T1R基因或蛋白質(zhì)的“抑制子”、“激活子”和“調(diào)節(jié)子”可交替使用，是指利用體內(nèi)、體外味覺(jué)傳導(dǎo)試驗(yàn)鑒定的抑制性、激活性和調(diào)節(jié)性的分子，例如配體、激動(dòng)劑、拮抗劑和它們的同源物和模擬物。例如抑制子是指例如能夠與味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)合，部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延遲活化，失活、脫敏或負(fù)向調(diào)節(jié)味覺(jué)傳導(dǎo)的化合物，如拮抗劑。激活子是指例如能夠與味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)合，刺激、增加、打開、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活性、增敏或正向調(diào)節(jié)味覺(jué)傳導(dǎo)的化合物，如激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)子包括例如能夠改變受體與以下物質(zhì)相互作用的化合物能夠結(jié)合激活子或抑制子的細(xì)胞外蛋白質(zhì)(例如ebnerin和其它疏水載體家族成員)；G蛋白；激酶(例如參與受體去活化和脫敏的視紫紅質(zhì)激酶和β腎上腺素能受體激酶類似物)；和同樣能夠使受體去活化和脫敏的拘捕素(arrestin)。調(diào)節(jié)子可包括遺傳修飾的T1R家族成員，例如活性改變的以及天然產(chǎn)生的和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、小化學(xué)分子等。這些抑制子和激活子的試驗(yàn)包括，例如，在細(xì)胞或細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)T1R家族成員，在有或無(wú)味覺(jué)元如甜味味覺(jué)元的情況下，應(yīng)用推測(cè)的調(diào)節(jié)子化合物，然后確定對(duì)上述味覺(jué)傳導(dǎo)的功能性影響。包含T1R家族成員的樣品或試驗(yàn)經(jīng)過(guò)潛在的激活子、抑制子或調(diào)節(jié)子處理后與不用抑制子、激活子或調(diào)節(jié)子的對(duì)照樣品比較，檢驗(yàn)調(diào)節(jié)的程度。對(duì)照樣品(未經(jīng)調(diào)節(jié)子處理)指定為100％的相對(duì)T1R活性值。當(dāng)T1R活性值相對(duì)于對(duì)照大約有80％活性，可選地50％或25-0％時(shí)，就判定獲得了對(duì)T1R的抑制。當(dāng)T1R活性值相對(duì)于對(duì)照有110％活性，可選地150％、可選地200-500％或1000-3000％或更高時(shí)，就判定獲得了對(duì)T1R的活化。
此處所用術(shù)語(yǔ)“純化的”、“基本純化的”和“分離的”是指不含其它不同化合物的狀態(tài)(這些不同化合物與本發(fā)明化合物在自然狀態(tài)下是結(jié)合在一起的)，從而以給定樣品的重量計(jì)，“純化的”、“基本純化的”和“分離的”物質(zhì)至少包含樣品的0.5％、1％、5％、10％或20％，和最優(yōu)選地至少50％或70％的質(zhì)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)用來(lái)指(以重量計(jì))至少包含指定的樣品95％的質(zhì)量的本發(fā)明化合物。當(dāng)涉及核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，此處所用術(shù)語(yǔ)“純化的”、“基本純化的”和“分離的”核酸和蛋白質(zhì)是指一種純化狀態(tài)或濃度(不同于哺乳動(dòng)物體特別是人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度)。大于哺乳動(dòng)物體特別是人體內(nèi)天然狀態(tài)和濃度任何程度的純化或濃度，包括(1)從其它相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物中純化或(2)與非哺乳動(dòng)物體特別是人體正常相關(guān)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合，均屬于“分離的”定義范疇。此處描述的核酸或蛋白質(zhì)或核酸或蛋白質(zhì)種類可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和過(guò)程分離，或與自然狀態(tài)下無(wú)關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物相連。
當(dāng)涉及核酸或多肽時(shí)，此處所用術(shù)語(yǔ)“分離的”是指一種純化狀態(tài)或濃度，其不同于哺乳動(dòng)物體特別是人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度。大于機(jī)體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)和濃度任何程度的純化和濃度，包括(1)從其它天然產(chǎn)生的相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物純化或(2)與機(jī)體內(nèi)非正常關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合均屬于此處所用“分離的”定義范疇。此處描述的核酸或多肽可根據(jù)本領(lǐng)域已知的多種方法和過(guò)程分離或與自然狀態(tài)無(wú)正常關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合。
此處所用術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是指如下詳述的為產(chǎn)生或檢測(cè)重組子或天然表達(dá)的核酸的任何合適的擴(kuò)增方法學(xué)的應(yīng)用。例如，本發(fā)明提供方法和試劑(例如，特異性簡(jiǎn)并寡核苷酸引物對(duì))，用于體內(nèi)或體外擴(kuò)增(例如，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)PCR)本發(fā)明的(例如，本發(fā)明的味覺(jué)元結(jié)合序列)天然表達(dá)的(例如，基因組或mRNA)或重組子(例如，cDNA)核酸。
術(shù)語(yǔ)“7-跨膜受體”指屬于跨膜蛋白超家族的多肽，其擁有7個(gè)結(jié)構(gòu)域，橫穿胞漿膜7次(因此，這7個(gè)結(jié)構(gòu)域被稱作“跨膜”或“TM”結(jié)構(gòu)域TM I至TM VII)。嗅覺(jué)家族和某些味覺(jué)受體均屬于這個(gè)超家族。7-跨膜受體多肽具有相似和特征性的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，下面將會(huì)詳細(xì)介紹。
術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”指含有不同核酸或多肽分子的混合制劑，例如重組產(chǎn)生的化學(xué)感受文庫(kù)，特別是由簡(jiǎn)并引物對(duì)擴(kuò)增核酸產(chǎn)生的味覺(jué)受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或分離的含有擴(kuò)增的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體集合，或每個(gè)細(xì)胞都隨機(jī)轉(zhuǎn)染了至少一個(gè)編碼味覺(jué)受體的載體的細(xì)胞混合物。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸序列”指或者是單鏈或者是雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)包括核酸，即含有天然核苷酸已知類似物的寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)(參見例如，Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，ed.F.Eckstein，Oxford Univ.Press(1991)；Antisense Strategies，Annalsof the N.Y.Academy of Sciences，Vol.600，Eds.Baserga等.(NYAS1992)；Milligan，J.Med.Chem.361923-1937(1993)；AntisenseResearch and Applications(1993，CRC Press)，WO 97/03211；WO96/39154；Mata，Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry 368692-8698(1997)；Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6153-156(1996))。
除非另有所指，特定的核酸序列也暗指其保守性修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子替換)和互補(bǔ)序列，以及清楚指出的序列。特別是，簡(jiǎn)并密碼子替換可以通過(guò)產(chǎn)生其中一種或多種定密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基替代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)(Batzer等，Nucleic Acid Res.，195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，891-98(1994))。術(shù)語(yǔ)核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸(polynucleotide)交替使用。
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”此處可交替使用，是指氨基酸殘基多聚物。本術(shù)語(yǔ)適用于序列中一種或多種氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸多聚物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物和非天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物。
術(shù)語(yǔ)“胞漿膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)(plasma membrane translocation domain)域”或簡(jiǎn)稱“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”指摻入到多肽編碼序列的氨基端時(shí)能夠有效地把雜合(“融合”)蛋白“伴隨(chaperone)”或“轉(zhuǎn)位”至胞漿膜的多肽結(jié)構(gòu)域。例如，“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”可以從牛視紫紅質(zhì)受體多肽，一個(gè)7跨膜受體的氨基端衍生出來(lái)。但是，可以使用任何哺乳動(dòng)物的視紫紅質(zhì)，以及其它轉(zhuǎn)位促進(jìn)序列。因此，轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)位7跨膜融合蛋白至胞漿膜時(shí)非常有效，并且包含氨基端轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如味覺(jué)受體多肽)比沒(méi)有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更容易有效地運(yùn)輸至胞漿膜上。但是，如果多肽N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)合中具有活性，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選其它的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。
此處描述的“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”、“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和嵌合受體組分也包括具有與示例序列基本一致的結(jié)構(gòu)和活性的“類似物(analogs)”或“保守性變體”和“模擬物”(“肽模擬物”)。因此，術(shù)語(yǔ)“保守性變體”或“類似物”或“模擬物”指具有修飾過(guò)的氨基酸序列的多肽，這類修飾基本上不影響多肽的(保守性變體的)在此描述的結(jié)構(gòu)和/或活性。這包括氨基酸序列的保守性修飾變異，即替換、增加或缺失對(duì)于蛋白質(zhì)活性無(wú)關(guān)緊要的氨基酸殘基，或使用相似屬性的殘基進(jìn)行氨基酸替換(例如酸性、堿性、正電、負(fù)電、極性或非極性等)，以至于甚至替換關(guān)鍵的氨基酸也基本上不影響結(jié)構(gòu)和/或活性。
更具體而言，“保守性修飾變體”對(duì)氨基酸和核酸序列都適用。至于特定核酸序列，保守性修飾變體是指編碼同樣或基本同樣氨基酸序列的核酸，或當(dāng)核酸并不編碼氨基酸序列時(shí)，是指與它基本相同的序列。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，大量功能性相同的核酸分子編碼任意特定的蛋白質(zhì)。
例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子決定的丙氨酸每一個(gè)位置，密碼子可以改變?yōu)橛伤龅娜魏尾桓淖兙幋a多肽的密碼子。
這些核酸變異是“沉默變異”，是一種保守性修飾的變異。此處的每一條編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每一個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以判斷核酸中的每個(gè)密碼子(除了通常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG，和通常情況下是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)都可以被修飾而產(chǎn)生功能完全相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一個(gè)沉默變異隱含在每個(gè)描述的序列中。
能夠提供功能相似的氨基酸的保守性替換表在本領(lǐng)域眾所周知。例如，一個(gè)選擇保守性替換的示例性指南包括(原始?xì)埢?，其后是示例替換)ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。另一示例指南使用下列六組，每組包含保守性互相替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；(參見例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman和Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of ProteinStructure，Springer-Vrlag(1979))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解上述確定的替換并不是唯一的可能保守性替換。例如，出于某種原因，人們可能將所有帶電的氨基酸互為保守性替換體，不管它們是正電還是負(fù)電。另外，在編碼序列中的個(gè)別替換、缺失或增加從而導(dǎo)致變化、增加或缺失單一氨基酸或小部分氨基酸同樣也被認(rèn)為是“保守性修飾變異”。
術(shù)語(yǔ)“模擬物”和“肽模擬物”指合成的化學(xué)化合物，它具有本發(fā)明受體的基本上同樣結(jié)構(gòu)和/或功能特征，例如轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或嵌合受體。模擬物既可以是完全由化學(xué)合成的非天然氨基酸類似物組成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。該模擬物同樣可以具有任意量的天然氨基酸保守性替換，只要這種替換也同樣基本上不改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性即可。
對(duì)于本發(fā)明中屬于保守性變體的多肽，常規(guī)試驗(yàn)將確定模擬物是否屬于本發(fā)明的范圍，即它的結(jié)構(gòu)和/或活性基本上沒(méi)有被改變。多肽模擬物組分可包括任何非天然結(jié)構(gòu)組分的組合，其通常來(lái)源于三個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)a)非天然酰胺鍵(“肽鍵”)的殘基連接基團(tuán)；b)非天然殘基替代天然產(chǎn)生的氨基酸殘基；或c)可誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)模仿的殘基，即能夠誘導(dǎo)或穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)例如β轉(zhuǎn)角、γ轉(zhuǎn)角、β折疊片和α螺旋構(gòu)象等的殘基。當(dāng)多肽的所有殘基或一些殘基是通過(guò)化學(xué)手段而非天然肽鍵連接的時(shí)，該多肽就可以被鑒定為模擬物。單獨(dú)的肽模似物殘基可以通過(guò)肽鍵、其它的化學(xué)鍵或耦聯(lián)手段連接，諸如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來(lái)酰亞胺、N，N’-雙環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基基碳二酰亞胺(DIC)?？梢猿蔀閭鹘y(tǒng)酰胺鍵(“肽鍵”)的替代物的連接基團(tuán)包括，例如酮亞甲基(例如-C(＝O)-CH2-替換-C(＝O)-NH-)、氨甲基(CH2-NH)、乙烯基、烯烴基(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(參見例如，Spatola，Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357，“PeptideBackbone Modifications，”Marcell Dekker，NY(1983))。包含所有或部分非天然殘基替代天然產(chǎn)生氨基酸殘基的多肽也可以被鑒定為模擬物；非天然殘基在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有詳盡描述。
“標(biāo)記”或”可檢測(cè)的部分”是可以被光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)到的組分。例如有用標(biāo)記包含32P、熒光素、電子致密試劑、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛、或半抗原和可被檢測(cè)(例如通過(guò)在肽中摻入放射標(biāo)記)或用來(lái)檢測(cè)可特異性與肽反應(yīng)的抗體的蛋白質(zhì)。
“標(biāo)記的核酸探針或寡核苷酸”是指一個(gè)或者是通過(guò)接頭或是化學(xué)鍵而共價(jià)結(jié)合，或者是通過(guò)離子、范德華力、靜電、或氫鍵等非共價(jià)結(jié)合而結(jié)合了標(biāo)記的核酸或寡核苷酸，這樣通過(guò)檢測(cè)探針上結(jié)合的標(biāo)記就可以檢測(cè)探針的存在。
此處所用的“核酸探針或寡核苷酸”被定義為能通過(guò)一種或多種形式的化學(xué)鍵結(jié)合到互補(bǔ)序列的靶核酸上的核酸(一般是通過(guò)氫鍵形成的互補(bǔ)堿基配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn))。此處所指的探針可以包括天然的(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥苷酸，次黃嘌呤等)。另外，探針中的堿基可以由非磷酸二酯鍵的連鍵連接，只要它不影響雜交即可。因此，例如，探針可以是其組成堿基由肽鍵連接而非磷酸二酯鍵連接的肽核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針可以結(jié)合不完全與之互補(bǔ)的靶序列。探針任選地直接標(biāo)記同位素、發(fā)色物質(zhì)、熒光物質(zhì)、色原體，或間接標(biāo)記如可被鏈霉親和素復(fù)合物結(jié)合的生物素。通過(guò)分析探針的有無(wú)，人們可以檢測(cè)選擇序列或亞序列的有無(wú)。
當(dāng)針對(duì)核酸的一部分使用術(shù)語(yǔ)“異源的”時(shí)，是指該核酸包含兩個(gè)或更多在天然狀態(tài)下互相沒(méi)有相同關(guān)系的亞序列。例如，核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個(gè)或更多非相關(guān)基因序列重組在一起形成一個(gè)新的功能性核酸分子，例如，一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和另一個(gè)來(lái)源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白質(zhì)指該蛋白包含兩個(gè)或多個(gè)在天然狀態(tài)下不以相同相互關(guān)系存在的亞序列(例如，融合蛋白質(zhì))。
“啟動(dòng)子”是核酸序列陣列，其能指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄，此處所用的啟動(dòng)子包括在轉(zhuǎn)錄起始位置附近的必要的核酸序列，例如在聚合酶II型啟動(dòng)子情形中的TATA元件。啟動(dòng)子可選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏子元件，其可能位于離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)的地方?！敖M成性”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下都具有活性的啟動(dòng)子?！翱烧T導(dǎo)”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”是指核酸表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)排列)和另一核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
此處所用的“重組”是指合成或其它體外操作的多核苷酸(例如，“重組多核苷酸”)，以及使用重組多核苷酸在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多聚核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白質(zhì)”)?！爸亟M手段”也包括將來(lái)源不同、具有不同編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動(dòng)子序列的核酸連接至一個(gè)表達(dá)盒或載體中用于表達(dá)，例如可誘導(dǎo)的或組成性表達(dá)包含本發(fā)明轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和使用本發(fā)明的引物擴(kuò)增的核酸序列的融合蛋白。
短語(yǔ)“選擇性(或特異性)與……雜交”指在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，分子僅與特定的存在于復(fù)合混合物中(例如，總細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)的核苷酸序列結(jié)合、形成雙螺旋或雜交。
短語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指在這樣的條件下，探針僅與通常存在于核酸復(fù)合混合物中的靶序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的并且在不同情況下會(huì)有所不同。長(zhǎng)序列在高溫下才具有雜交特異性。有關(guān)核酸雜交更詳盡的指南參見Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes，“Overview of Principles of Hybridization and the Strategyof Nucleic Acid Assays”(1993)。通常，在特定的離子強(qiáng)度pH下，選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件比特定序列的熱溶解點(diǎn)(thermal melting point，Tm)低大約5-10℃。Tm是指達(dá)到平衡后(此時(shí)靶序列過(guò)剩，在Tm下，平衡條件下50％的探針被飽和)與靶序列互補(bǔ)的探針中有50％與靶序列發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件意味著其中的鹽濃度小于大約1.0M鈉離子，通常大約0.01至1.0M鈉離子(或其它鹽)濃度、pH7.0至8.3，對(duì)于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)溫度至少大約30℃、對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)溫度至少大約60℃。加入一些破壞穩(wěn)定的試劑如甲酰胺也可以形成嚴(yán)謹(jǐn)條件。為了選擇性或特異性的雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景值的兩倍，可選地10倍于雜交背景值。示例嚴(yán)謹(jǐn)條件如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃溫育，或者5×SSC和1％SDS，65℃溫育，使用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。這類雜交和漂洗步驟可以進(jìn)行例如1，2，5，10，15，30，60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
如果核酸編碼的多肽是基本相關(guān)的話，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下互不雜交的核酸仍是基本上相關(guān)的。例如，利用遺傳密碼允許下最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)就會(huì)發(fā)生這種情況。在這些情況下，核酸通常在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。示例的“中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”包括在具有40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS緩沖液中，37℃下的雜交，使用1×SSC在45℃漂洗。這類雜交和漂洗步驟可以進(jìn)行例如1，2，5，10，15，30，60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。陽(yáng)性雜交至少是背景值的兩倍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該很容易認(rèn)識(shí)到其它雜交和漂洗條件可以用以提供相似嚴(yán)謹(jǐn)程度的條件。
“抗體”指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)域的多肽，其可特異性地與抗原結(jié)合和識(shí)別。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、Δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被歸類為κ或λ。重鏈歸類為γ、μ、α、Δ和ε，它們因此分別確定了免疫球蛋白種類，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包括四聚體(tetramer)。每個(gè)四聚體由兩對(duì)等同的多肽鏈組成，每對(duì)多肽鏈具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。每條鏈N末端確定了一個(gè)大約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指的就是這些輕鏈和重鏈。
“嵌合抗體”是指一個(gè)抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換，以至于抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))與類別、效應(yīng)物功能和/或種類不同或被改變的恒定區(qū)相連，或與能夠賦予嵌合抗體以新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子和藥物等)相連接；或(b)可變區(qū)或其部分被改變、替換或交換成具有不同或改變了抗原特異性的可變區(qū)。
“抗T1R抗體”是一種可以特異性結(jié)合T1R基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術(shù)語(yǔ)“免疫試驗(yàn)”是使用抗體特異性結(jié)合抗原的試驗(yàn)。免疫試驗(yàn)的特征是使用特定抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)分離、定向和/或量化抗原。
當(dāng)涉及到蛋白質(zhì)或肽時(shí)，短語(yǔ)與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或“特異性(或選擇性)與……發(fā)生免疫反應(yīng)”是指結(jié)合反應(yīng)，其可以在異源蛋白質(zhì)和其它生物物質(zhì)群中確定蛋白質(zhì)的存在。因此，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，指定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景值的兩倍，并且基本上不與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的結(jié)合。這些條件下與抗體的特異性結(jié)合可能要求針對(duì)其對(duì)某個(gè)特定蛋白質(zhì)的特異性進(jìn)行了選擇的抗體。例如，可選擇針對(duì)特定物種如大鼠、小鼠、或人T1R家族成員產(chǎn)生的多克隆抗體以獲得那些僅與T1R多肽或其免疫原部分而非其它蛋白質(zhì)(T1R多肽直向進(jìn)化同源物或多態(tài)變體和等位基因除外)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這種選擇過(guò)程可以通過(guò)去除與其它物種T1R分子或其它T1R分子有交叉反應(yīng)的抗體來(lái)完成。也可以選擇僅識(shí)別T1R GPCR家族成員而非其它家族GPCR的抗體。有多種免疫試驗(yàn)形式可以用于特異性與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體的選擇。例如，固相ELISA免疫試驗(yàn)一般用來(lái)選擇特異性與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(例如參見，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，(1988)，其中有關(guān)可用于確定特異性免疫反應(yīng)的免疫試驗(yàn)形式和條件的描述)。通常特異性或選擇性反應(yīng)至少是背景信號(hào)或噪聲的兩倍，更優(yōu)選地大于背景10至100倍。
短語(yǔ)“與……選擇性結(jié)合”指核酸與另外上述核酸“選擇性雜交”的能力，或抗體與上述蛋白質(zhì)“選擇性結(jié)合”的能力。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指目的是在任何細(xì)胞，包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，體內(nèi)或體外組成性或誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括線性或環(huán)狀表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括游離狀態(tài)或整合至宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)具有自我復(fù)制或不具有自我復(fù)制的能力，即在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)短暫的表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括重組表達(dá)“盒”，其僅包括重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的最小元件。
“宿主細(xì)胞”是指包含表達(dá)載體和支持表達(dá)載體復(fù)制或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、Hela和HEK-293及其它，例如培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體(explants)和體內(nèi)細(xì)胞等。
C.T1R多肽的分離和表達(dá)本發(fā)明T1R或其片段或變體的分離和表達(dá)可如下所述完成?？墒褂肞CR引物擴(kuò)增編碼味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)域的核酸，可選地建立這些核酸的文庫(kù)。使用單一表達(dá)載體或表達(dá)載體文庫(kù)感染或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，用來(lái)功能性表達(dá)這些核酸或文庫(kù)?？稍隗w內(nèi)或體外表達(dá)這些基因和載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明載體內(nèi)基因和核酸(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)的表達(dá)和活性，可以得到改變和控制核酸表達(dá)的理想表型?？梢允褂冕槍?duì)增加或降低表達(dá)或活性描述的任何已知方法。本發(fā)明的實(shí)踐可以與本領(lǐng)域任何已知的方法或方案相結(jié)合，這些方法或方案在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有詳盡描述。
本發(fā)明的核酸序列和其它用于本發(fā)明實(shí)施的核酸分子，不管是RNA、cDNA、基因組DNA、載體、病毒或其雜合體，可以從多種來(lái)源分離、遺傳工程化加工、擴(kuò)增、和/或重組表達(dá)。可以使用任何一個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)，包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、昆蟲或植物系統(tǒng)。
另外，這些核酸分子可用已知的化學(xué)合成方法體外合成。例如以下描述的方法，Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blomers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；U.S.Patent No.4,458,066。然后或者通過(guò)合成互補(bǔ)鏈，并在適合條件下使之退火，或通過(guò)用合適的引物序列及用DNA聚合酶加入互補(bǔ)鏈的方法可以獲得雙鏈DNA片段。
核酸操作技術(shù)，例如產(chǎn)生序列突變、亞克隆、探針標(biāo)記、測(cè)序、雜交等技術(shù)，在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有詳盡描述。參見例如，Sambrook，ed.，Molecular Cloninga Laboratory Manual(2nded)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor laboratory(1989)；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，ed.Jon Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and NucleicAcid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、載體、衣殼(capsids)、多肽等可以通過(guò)任何一個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來(lái)分析和定量。這些方法包括如分析生物化學(xué)方法例如NMR、光譜、放射、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)和超濾層析等，多種免疫學(xué)方法例如流體或膠沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫試驗(yàn)(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISAs)、免疫熒光試驗(yàn)、Southern分析、Northern分析、點(diǎn)印跡分析、凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物質(zhì)或信號(hào)擴(kuò)增方法、放射標(biāo)記、液體閃爍計(jì)數(shù)和親和層析等。
寡核苷酸探針可以用來(lái)擴(kuò)增編碼味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)域的核酸片段。此處描述的核酸同樣可以利用擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行克隆或定量測(cè)量。擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域眾所周知的方法，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)、PCR(PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications，ed.Innis.Academic Press，N.Y.(1990)and PCR Strategies，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995)、連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR，例如參見，Wu，Genomics 4560(1989)；Landegren，Sciencee 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(例如參見，Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))、自我維持序列復(fù)制(例如參見，Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))、Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增(例如參見，Smith，J.Clin.Microbiol.351477-1491(1997))、自動(dòng)Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增試驗(yàn)(例如參見，Burg，Mol.Cell.Probes10257-271(1996))和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)等，同樣參見，Berger，Methods Enzymol.152307-316(1987)；Sambrook；Ausubel；U.S.Patent NOs.4,683,195and 4,683,202；Sooknanan，Biotechnology 13563-564(1995)。引物可以設(shè)計(jì)成保留有“供體”7跨膜受體的原始序列?；蛘?，引物可以編碼保守性替換的(例如疏水性殘基換成疏水性殘基，參見上面的討論)或功能上有利的替換(例如，不干擾胞漿膜插入、導(dǎo)致肽酶裂解、導(dǎo)致受體非正常折疊等)的氨基酸殘基。一旦擴(kuò)增后，按照本領(lǐng)域已知的方法，使用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將核酸分子單獨(dú)或以文庫(kù)形式按照所需克隆到任意一個(gè)載體上；體外克隆擴(kuò)增核酸的方法參見如U.S.Pat.No.5,426,039的描述。
引物對(duì)可以設(shè)計(jì)成選擇性擴(kuò)增T1R家族成員的配體結(jié)合區(qū)域。對(duì)于不同配體或味覺(jué)元，這些區(qū)域可能變化很大。因此，一種味覺(jué)元的可能是最小的結(jié)合區(qū)域，對(duì)于另一個(gè)味覺(jué)元來(lái)說(shuō)可能具有很大的局限性。因此，需要擴(kuò)增不同大小、包含不同細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合區(qū)域。
設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物對(duì)的范例在本領(lǐng)域已眾所周知。例如，COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略計(jì)算機(jī)程序可以由http//blocks.fhcrc.org/codehop.html處獲得，引物可直接連接到Blockmaker多序列比對(duì)地址進(jìn)行雜合引物預(yù)測(cè)，其由一套相關(guān)蛋白質(zhì)序列開始，如已知的味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)域(例如參見，Rose，Nucleic Acids Res.261628-1635(1998)；Singh，Biotechniques24318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物對(duì)的手段在本領(lǐng)域已眾所周知?？梢允褂谩疤烊弧眽A基對(duì)或合成堿基對(duì)。例如，使用人工核苷酸堿基能夠提供操作引物序列、產(chǎn)生更加復(fù)雜的擴(kuò)增產(chǎn)物混合物的多樣途徑。人工核苷酸堿基多種家族通過(guò)內(nèi)部鍵旋轉(zhuǎn)，能夠采取多種氫鍵方向，從而提供簡(jiǎn)并分子識(shí)別的手段。這些類似物摻入PCR引物的單一位點(diǎn)將導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)雜文庫(kù)的產(chǎn)生。例如參見，Hoops，Nucleic Acids Res.254866-4871(1997)。非極性分子同樣可以用來(lái)模仿天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵形狀模擬物可以對(duì)胸腺嘧啶非極性形狀的模擬物有效和選擇性地復(fù)制(例如參見，Morales，Nat.Struct.Bioo.5950-954(1998))。例如兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基可以是嘧啶堿基6H，8H-3，4-二羥基嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如參見，Hill，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 954258-4263(1998))。本發(fā)明簡(jiǎn)并引物的范例是摻入核堿基類似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲?；?2’-脫氧胞嘧啶，3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(參見如下所述序列中的“P”)。這種嘧啶類似物與嘌呤，包括A和G殘基形成氫鍵。
與此處公開的味覺(jué)受體基本上是等同的多態(tài)變體、等位基因和種間同源體，可以使用下述的核酸探針?lè)蛛x?；蛘撸ㄟ^(guò)檢測(cè)與抗血清或針對(duì)T1R多肽產(chǎn)生的純化抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的表達(dá)同源體(該表達(dá)的同源體同樣可以識(shí)別和選擇性結(jié)合到T1R同源體上)，表達(dá)文庫(kù)可以用于克隆T1R多肽和其多態(tài)變體、等位基因和種間同源體。
編碼味覺(jué)受體的配體結(jié)合區(qū)域的核酸可以使用簡(jiǎn)并引物對(duì)擴(kuò)增(如PCR)適當(dāng)核酸序列得到。擴(kuò)增的核酸可以是來(lái)自任何細(xì)胞或組織的基因組DNA或味覺(jué)受體表達(dá)細(xì)胞衍生的cDNA或mRNA。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建出包含有融合了轉(zhuǎn)位序列的編碼T1R的核酸的雜合蛋白質(zhì)編碼序列。同樣可以提供包含轉(zhuǎn)位基元和其它化學(xué)感受受體，特別是味覺(jué)受體家族的味覺(jué)元結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合T1R。這些核酸序列可以可操作地連接轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列、和其它對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA有用的序列等。在重組表達(dá)盒、載體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過(guò)程中，可以利用啟動(dòng)子片段指導(dǎo)在所有目的細(xì)胞或組織中表達(dá)目的核酸。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可能包括C末端或N末端轉(zhuǎn)位序列。此外，融合蛋白可包括額外的元件，如用于蛋白質(zhì)檢測(cè)、純化或其它應(yīng)用的元件。促進(jìn)檢測(cè)和純化的結(jié)構(gòu)域包括，如金屬鰲合肽如聚組氨酸序列串、組氨酸色氨酸組件或其它可以在固定金屬上純化的結(jié)構(gòu)域等；麥芽糖結(jié)合蛋白；可以在固定的免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域；或FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp，SeattleWA)。
在轉(zhuǎn)位域(為了有效的胞漿膜表達(dá))和新翻譯的多肽其余部分之間，包含一個(gè)可裂解連接物序列如Xa因子(例如參見，Ottavi，Biochimie80289-293(1998))、枯草桿菌素(subtilisin)蛋白酶識(shí)別基元(例如參見，Polyak，Protein Eng.10615-619(1997))、腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等對(duì)促進(jìn)純化可能有利。例如，一個(gè)構(gòu)建體可以包括一條多肽編碼核酸序列(與6個(gè)組氨酸殘基連接，后跟一個(gè)是腸激酶裂解位點(diǎn)的硫氧還蛋白(例如參見，Williams，Biochemistry 341787-1797(1995)))和一個(gè)C末端轉(zhuǎn)位域。組氨酸殘基可促進(jìn)檢測(cè)和純化，而腸激酶裂解位點(diǎn)提供了從剩余融合蛋白中純化目的蛋白的手段。有關(guān)編碼融合蛋白的載體技術(shù)和融合蛋白應(yīng)用的技術(shù)在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中已有詳細(xì)描述，例如參見，Kroll，DNA Cell.Biol.12441-53(1993)。
包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列的表達(dá)載體(不管是單獨(dú)表達(dá)載體還是表達(dá)載體文庫(kù))可以引入細(xì)胞的基因組或胞漿或細(xì)胞核，通過(guò)科學(xué)和專利文獻(xiàn)中描述的多種多樣的常規(guī)方法表達(dá)目的序列。例如參見，Roberts，Nature 328731(1987)；Berger supra；Schneider，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。生物試劑和試驗(yàn)器材廠家提供的產(chǎn)品信息手冊(cè)也會(huì)提供有關(guān)已知生物學(xué)方法的信息。載體可以從天然來(lái)源分離，從諸如ATCC或GenBank文庫(kù)獲得，或通過(guò)合成或重組方法制備。
核酸可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定或短暫表達(dá)(例如游離體表達(dá)系統(tǒng))的表達(dá)盒、載體或病毒中表達(dá)。選擇標(biāo)志物可以摻入到表達(dá)盒和載體中，從而賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標(biāo)記物可以編碼游離體維持和復(fù)制，所以就不必整合至宿主基因組了。例如，標(biāo)志物可能編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素)或除草劑抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以選擇轉(zhuǎn)化了目的DNA序列的細(xì)胞(例如參見，Blondelet-Rouault，Gene 190315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992-997(1997))。賦予新霉素或潮霉素這類底物的抗性的可選擇標(biāo)志物基因僅能用于組織培養(yǎng)，而化學(xué)抗性基因可以作為體內(nèi)和體外的選擇性標(biāo)記物。
嵌合核酸序列可以編碼在任何7跨膜多肽內(nèi)部的T1R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因?yàn)?跨膜受體多肽具有相似的一級(jí)序列以及二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域等)可以很容易地通過(guò)序列分析鑒定。例如，同源性模建、傅立葉分析和螺旋周期檢測(cè)可用于鑒定有7跨膜受體序列的7個(gè)結(jié)構(gòu)域。快速傅立葉轉(zhuǎn)換(FFT)算法可用于評(píng)估代表被分析序列疏水性和可變性概況的顯性周期。周期檢測(cè)增強(qiáng)和α螺旋周期指數(shù)可由如Donnelly，Protein Sci.255-70(1993)的方法完成。其它算法和模建算法在本領(lǐng)域已眾所周知，例如參見，Peitsch，Receptors，Channels 4；161-164(1996)；kyte&Doolittle，J.Md.Bio.，157105-132(1982)；Cronet，Protein Eng.659-64(1993)(同源和“發(fā)現(xiàn)模建”)；http//bioinfo.weizman.ac.il/等。
本發(fā)明還包括具有指定核苷酸和氨基酸序列的核酸和蛋白質(zhì)，同樣包括DNA片段，特別是如40、60、80、100、150、200或250個(gè)核苷酸、或更多核苷酸的片段，以及如10、20、30、50、70、100或150個(gè)氨基酸、或更多氨基酸的蛋白質(zhì)片段?？蛇x地，核酸片段可編碼能夠與針對(duì)T1R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性多肽。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段可選地是能夠與針對(duì)T1R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性片段。
本發(fā)明另外還包括嵌合蛋白，其包含此處公開的至少一種T1R多肽中的至少10、20、30、50、70、100或150個(gè)氨基酸或更多序列，并耦聯(lián)至額外的氨基酸序列(該序列代表另一個(gè)GPCR、優(yōu)選地7跨膜超家族成員的全部或部分)。這些嵌合子可以直接從受體和另一個(gè)GPCR獲得，或組合兩種或多種現(xiàn)有的受體獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合子的一部分對(duì)應(yīng)于本發(fā)明T1R多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或是從該細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域衍生出來(lái)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合子的一部分對(duì)應(yīng)于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和此處描述的T1R多肽的一種或多種跨膜結(jié)構(gòu)域，或是從中衍生出來(lái)而嵌合子剩余部分來(lái)自另一個(gè)GPCR。嵌合受體在本領(lǐng)域眾所周知，制備嵌合受體的技術(shù)和用于摻入的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)構(gòu)域或片段的選擇及界定也是本領(lǐng)域眾所周知。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)可容易用于這種嵌合受體的制備。使用這種嵌合受體可以提供例如一種在此特別描述的受體的味覺(jué)選擇性特征，并與另一個(gè)受體的信號(hào)傳導(dǎo)特征相耦聯(lián)，如現(xiàn)有技術(shù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中已知的一種受體。
例如，象配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域或其任意組合的結(jié)構(gòu)域，可以共價(jià)地連接至異源蛋白質(zhì)上。如T1R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可連接至異源GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，或異源GPCR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可連接至T1R跨膜結(jié)構(gòu)域。其它可選異源蛋白質(zhì)包括，如綠色熒光蛋白、β-gal、谷氨酸受體和視紫紅質(zhì)前序列等。
表達(dá)本發(fā)明的T1R、片段或變體的宿主細(xì)胞也處在本發(fā)明范圍之內(nèi)。為了獲得克隆的基因或核酸(例如編碼本發(fā)明的T1R、片段或變體的cDNA)的高水平表達(dá)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常是將目的核酸序列亞克隆至含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子、并且對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的核酸分子來(lái)說(shuō)，還有轉(zhuǎn)錄起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體中。適合的細(xì)菌啟動(dòng)子本領(lǐng)域眾所周知，例如參見Sambrook等的描述。但是，細(xì)菌或真核表達(dá)系統(tǒng)都可以使用。
可以使用任何已知將外源核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的方法。這些方法包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、微注射、胞漿載體、病毒載體和其它任何已知的將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞的方法(例如參見，Sambrook等)。只要保證特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一條核酸分子引入能表達(dá)目的T1R、片段或變體的宿主細(xì)胞即可。
將表達(dá)載體引入到細(xì)胞中后，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在適合目的受體、片段和變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收。此類技術(shù)的實(shí)施例本領(lǐng)域眾所周知。例如參見WO 00/06593，此處以與本公開內(nèi)容具有一致性的方式引用。
D.T1R多肽的檢測(cè)除了使用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)T1R基因和基因表達(dá)以外，同樣可以使用免疫試驗(yàn)檢測(cè)T1R，例如鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞和T1R家族成員的變體。免疫試驗(yàn)可用以定性或定量分析T1R。此技術(shù)應(yīng)用的總體概述參見Harlow&Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
1.針對(duì)T1R家族成員的抗體產(chǎn)生可以與T1R家族成員特異性反應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如參見，Coligan，CurrentProtocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane，supra；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.1986)；andKohler&Milstein，Nature，256495-497(1975))。此類技術(shù)包括通過(guò)從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫(kù)中選擇抗體來(lái)制備相應(yīng)抗體，以及通過(guò)免疫家兔或小鼠來(lái)制備單克隆抗體和多克隆抗體(例如參見，Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
許多包含T1R的免疫原可用于產(chǎn)生與T1R家族成員特異性反應(yīng)的抗體。例如，重組T1R多肽，或其抗原性片段，可用此處描述的方法分離。合適的抗原區(qū)域包括，例如用于鑒定T1R家族成員的共有序列。重組蛋白可以使用上述方法在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)，和使用上述的方法純化。重組蛋白是優(yōu)選的免疫原，用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體?；蛘?，從此處公開的序列衍生出的合成肽，與載體蛋白綴合后可用作免疫原。天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也可以純凈的或非純凈形式使用。產(chǎn)物然后被注射進(jìn)能夠產(chǎn)生抗體的動(dòng)物?？傻玫絾慰寺』蚨嗫寺】贵w，用于后續(xù)測(cè)量蛋白質(zhì)的免疫試驗(yàn)。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑例如弗氏佐劑和標(biāo)準(zhǔn)免疫程序，用蛋白質(zhì)免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔。通過(guò)采血和確定與T1R的反應(yīng)滴度來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)免疫原制備物的免疫反應(yīng)。當(dāng)獲得合適的針對(duì)免疫原的抗體高滴度后，收集動(dòng)物血液并制備抗血清。如果需要，可以通過(guò)對(duì)抗血清進(jìn)一步分級(jí)分離來(lái)富集與蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體(參見Harlow&Lane，supra)。
可通過(guò)與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)得到單克隆抗體。簡(jiǎn)單地講，通常經(jīng)過(guò)與骨髓瘤融合，使目的抗原免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞永生化(參見kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976))。永生化的另外的方法包括使用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、或反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化、或本領(lǐng)域已知的其它方法。對(duì)由單個(gè)永生的細(xì)胞形成的克隆篩選，選出能夠產(chǎn)生針對(duì)抗原具有所需特異性和親和性的抗體的克隆，通過(guò)多種技術(shù)可以提高這些細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量，包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹腔內(nèi)。或者，按照Huse等，Science，2461275-1281(1989)概述的一般方法，通過(guò)從人B細(xì)胞篩選DNA文庫(kù)，可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清并在免疫試驗(yàn)中用免疫原蛋白滴定，例如固相免疫試驗(yàn)，其中免疫原固定在固相支持物上。通常，選擇具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫試驗(yàn)，測(cè)試它們與非T1R多肽、或甚至其它T1R家族成員、或其它生物體的其它相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體一般結(jié)合的Kd會(huì)至少大約0.1mM，更經(jīng)常地至少大約1pM，可選地至少大約0.1pM或更好，并且可選地0.01pM或更好。
一旦得到T1R家族成員特異性抗體，各T1R蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段可用一系列免疫試驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)。有關(guān)免疫學(xué)和免疫試驗(yàn)程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr eds.，7thed.1991)。而且，本發(fā)明的免疫試驗(yàn)可以由幾種形式來(lái)完成，這些形式在酶免疫學(xué)(Enzyme Immuncassay)中詳述(Maggio，ed.，1980)；和Harlow&Lane，supra。
2.免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)T1R蛋白、片段和變體可用任何一個(gè)已知的免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)和/或定量(例如參見US Patents 4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。對(duì)于一般性免疫試驗(yàn)的綜述，同樣參見細(xì)胞生物學(xué)方法抗體在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用，Methods in Cell Biology Autibodies inCell Biology)volume 37(Asai，ed.1993)；基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(Basicand Clinical Immunoogy)(Stiters&Terr，eds.，7th ed.1991)。免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)(或免疫試驗(yàn))通常使用能夠特異性與所選蛋白質(zhì)或抗原(本專利申請(qǐng)中是T1R家族成員或其抗原性亞序列)結(jié)合的抗體?？贵w(例如抗-T1R)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種手段和如上所述的各種方法產(chǎn)生。
免疫試驗(yàn)也經(jīng)常使用標(biāo)記物，其可特異性地結(jié)合和標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。標(biāo)記物本身可能是包含抗體/抗原復(fù)合物的一個(gè)部分。因此，標(biāo)記物可以是標(biāo)記的T1R多肽或標(biāo)記的抗T1R抗體?；蛘?，標(biāo)記物可以是一個(gè)第三部分，如第二抗體，其能夠特異性地結(jié)合抗體/T1R復(fù)合物(第二抗體通常特異性結(jié)合產(chǎn)生第一抗體的物種產(chǎn)生的抗體)。其它能夠特異結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)，如蛋白A或蛋白G同樣可用作標(biāo)記物。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)活性(例如參見，Kronval等，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.，1352589-2542(1985))?？捎每蓹z測(cè)部分修飾標(biāo)記物，如生物素，其可與另外一個(gè)分子特異結(jié)合，如鏈霉親和素。多種可檢測(cè)部分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
貫穿整個(gè)試驗(yàn)，每結(jié)合一個(gè)試劑都需要孵育和/或漂洗步驟。孵育步驟從5秒鐘到幾個(gè)小時(shí)，可選地從大約5分鐘到大約24小時(shí)。但是，孵育時(shí)間將取決于試驗(yàn)形式、抗原、溶液體積、濃度等。一般情況下試驗(yàn)在室內(nèi)溫度下進(jìn)行，盡管它們可以在一個(gè)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，如10℃到40℃。
a.非競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)形式檢測(cè)樣品中T1R多肽的免疫試驗(yàn)既可以是競(jìng)爭(zhēng)性的也可以是非競(jìng)爭(zhēng)性的。非競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)是其中的抗原量被直接測(cè)定。例如在一個(gè)優(yōu)選的“夾心”(sandwich)試驗(yàn)中，抗T1R抗體直接結(jié)合在其固定的固相支持物上。這些固定化抗體然后捕獲試驗(yàn)樣品中的T1R多肽。T1R多肽因此被固定，然后結(jié)合標(biāo)記物，例如帶有標(biāo)記的第二T1R抗體?；蛘撸摰诙贵w可能沒(méi)有標(biāo)記，但是它可以結(jié)合標(biāo)記了的第三抗體，該第三抗體對(duì)產(chǎn)生第二抗體的物種的抗體具有特異性。該第二抗體或第三抗體通常用可檢測(cè)部分修飾，例如生物素，其可和另外一個(gè)分子特異性結(jié)合如鏈霉親和素，以提供可檢測(cè)部分。
b.競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)形式在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)量用樣品中存在的未知的TIR多肽從抗-TIR抗體中去除(競(jìng)爭(zhēng)去除)已知的外加的(外源的)TIR多肽的量，間接測(cè)量樣品中存在的TIR多肽的量。在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，已知量的T1R多肽加入到樣品中，樣品然后與能特異結(jié)合T1R的抗體接觸。與抗體結(jié)合的外源T1R多肽的量與樣品中T1R多肽濃度成反比。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體被固定在一個(gè)固相底物上。與抗體結(jié)合的T1R多肽的量可以通過(guò)測(cè)量T1R/抗體復(fù)合物中T1R多肽的量，或通過(guò)測(cè)量剩余未形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)的量來(lái)確定。通過(guò)提供一個(gè)標(biāo)記的T1R分子可以檢測(cè)T1R多肽的量。
半抗原抑制試驗(yàn)是另一種優(yōu)選的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。在這個(gè)試驗(yàn)中已知T1R多肽固定在一個(gè)固相底物上。已知量的抗T1R抗體加入到樣品中，樣品然后與固定的T1R接觸?？筎1R抗體結(jié)合到已知的固定化T1R多肽的量與樣品中存在的T1R多肽的量成反比。同樣，固定化抗體的量可以通過(guò)檢測(cè)抗體固定化部分或溶液中剩余抗體部分來(lái)檢測(cè)。抗體被標(biāo)記時(shí)可直接檢測(cè)，或隨后加入一個(gè)如上所述的特異結(jié)合抗體的標(biāo)記部分進(jìn)行間接檢測(cè)。
c.交叉反應(yīng)測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形式的免疫試驗(yàn)也可用來(lái)測(cè)定交叉反應(yīng)。例如，一個(gè)由在此公開的核酸序列至少部分編碼的蛋白質(zhì)可以固定在一個(gè)固相支持物上。蛋白質(zhì)(例如T1R多肽和同源物)加入到試驗(yàn)體系中，與固定的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清。加入蛋白質(zhì)的與固定蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清的競(jìng)爭(zhēng)能力，與在此公開的核酸序列編碼的T1R多肽與自己競(jìng)爭(zhēng)的能力相比較。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算法計(jì)算上述蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)百分比。與每一個(gè)上述加入蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)小于10％的抗血清被選擇出來(lái)并合并在一起。通過(guò)加入特定蛋白質(zhì)，例如遠(yuǎn)源同源物進(jìn)行免疫吸收，交叉反應(yīng)抗體可任選地從合并抗血清中去除。另外，用于鑒定T1R家族成員的含有代表保守基元的氨基酸序列的肽，可用于測(cè)定交叉反應(yīng)性。
免疫吸收的和合并的抗血清然后用于進(jìn)行如上所述的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫試驗(yàn)，用以第二蛋白質(zhì)(該二級(jí)蛋白質(zhì)被認(rèn)為可能是T1R家族成員的一個(gè)等位基因或多態(tài)變體)和免疫原蛋白質(zhì)(即由在此公開的核酸序列編碼的T1R多肽)的比較。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)比較，該兩種蛋白質(zhì)都要在一個(gè)寬范圍濃度內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，確定抑制抗血清與固定的蛋白質(zhì)50％結(jié)合需要的每一種蛋白質(zhì)的量。如果抑制50％結(jié)合需要的第二蛋白質(zhì)量小于在此公開核酸序列編碼的蛋白質(zhì)抑制50％結(jié)合需要的量10倍，那么該第二蛋白質(zhì)就被認(rèn)為能夠特異性地結(jié)合由T1R免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體。
針對(duì)T1R保守性基元的抗體也可用于制備僅與T1R家族GPCR特異性結(jié)合，而不與其它家族的GPCR結(jié)合的抗體。
特異性結(jié)合特定T1R家族成員的多克隆抗體可以通過(guò)使用其它T1R家族成員扣除交叉反應(yīng)性抗體來(lái)制備。物種特異性多克隆抗體可以通過(guò)類似途徑獲得。例如人T1R1特異性抗體的制備，可以通過(guò)扣除例如與大鼠T1R1或小鼠T1R1直向進(jìn)化同源物序列交叉反應(yīng)的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
d.其它試驗(yàn)形式Westem印跡(免疫印跡)分析可用于檢測(cè)和定量樣品中存在的T1R多肽。該技術(shù)一般包括通過(guò)基于分子重量的凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)、將分離開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物上(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜或衍生尼龍膜)、將樣品與特異結(jié)合T1R多肽的抗體孵育?？筎1R多肽抗體特異性與固相支持物上的T1R多肽結(jié)合。這些抗體可能直接被標(biāo)記，或隨后被特異結(jié)合抗T1R抗體的標(biāo)記抗體所檢測(cè)(例如標(biāo)記的綿羊抗小鼠抗體)。
另外，試驗(yàn)形式包括脂質(zhì)體免疫試驗(yàn)(LIA)，其利用設(shè)計(jì)成結(jié)合特定分子(如抗體)，并釋放出封裝好的試劑或標(biāo)志物的脂質(zhì)體。釋放出的試劑然后可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)(參見Monroe等，Amer.Clin.Rev.，534-43(1986))。
e.非特異結(jié)合的降低本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，免疫試驗(yàn)中經(jīng)常希望降低非特異性的結(jié)合。特別是當(dāng)試驗(yàn)涉及固定在固相基質(zhì)上的抗原或抗體時(shí)，希望降低非特異結(jié)合結(jié)合到固相基質(zhì)上的量。降低非特異結(jié)合的手段本領(lǐng)域眾所周知。一般來(lái)講，該技術(shù)涉及使用一個(gè)蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分來(lái)包被基質(zhì)。特別是象牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、明膠這樣的組分具有廣泛的應(yīng)用，最優(yōu)選的方案是使用奶粉。
f.標(biāo)記物(labels)試驗(yàn)中使用的特定標(biāo)記物或可檢測(cè)基團(tuán)不是本發(fā)明的關(guān)鍵因素，只要它不顯著影響試驗(yàn)中抗體特異性結(jié)合即可。可檢測(cè)基團(tuán)可以是任何具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。這類可檢測(cè)標(biāo)記在免疫試驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)展完善，并且通常情況下，這些方法中有用的大多數(shù)標(biāo)記物都可以應(yīng)用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記物是指任何能用光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)的、光學(xué)的或化學(xué)的手段檢測(cè)到的組分。本發(fā)明有用的標(biāo)記物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅(Texas red)、羅丹明等)、放射標(biāo)記物(如3H、125I、3sS、14C或32P)、酶(如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和顯色標(biāo)記物如膠體金或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙乙烯、乳膠等)。
按照本領(lǐng)域已知的方法，標(biāo)記物可以直接或間接耦聯(lián)至試驗(yàn)中目的組分上。如上所述，根據(jù)所需要的靈敏度、與化合物綴合的難易度、所需穩(wěn)定性、現(xiàn)有儀器、和廢物處理?xiàng)l款，可以使用各種各樣的標(biāo)記物。
非放射標(biāo)記物通常使用間接法標(biāo)記。一般來(lái)講，一個(gè)配基分子(如生物素)共價(jià)結(jié)合至分子上。該配基然后結(jié)合另外一個(gè)分子(如鏈霉親和素)，該鏈霉親和素本身可被檢測(cè)或共價(jià)連接至一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)如可檢測(cè)酶、熒光化合物、或化學(xué)發(fā)光化合物上。配基和它們的靶標(biāo)可以與識(shí)別T1R多肽的抗體、或識(shí)別抗T1R多肽的二抗以任意適當(dāng)?shù)慕M合使用。
分子也可以直接綴合至信號(hào)產(chǎn)生化合物上，例如與酶或熒光素綴合。作為標(biāo)記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、脂酶和糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)特別是過(guò)氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰化合物、傘形酮等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括螢光素(luciferin)，和2，3-二氫吩嗪二酮類(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾?？赡苁褂玫亩喾N標(biāo)記或信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)參見U.S.Patent No.4,391,904的綜述。
檢測(cè)標(biāo)記物的方法本領(lǐng)域眾所周知。因此，例如當(dāng)標(biāo)記物是放射標(biāo)記物時(shí)，檢測(cè)手段包括閃爍計(jì)數(shù)器或感光膜放射自顯影。當(dāng)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物時(shí)，可以通過(guò)合適波長(zhǎng)的光激發(fā)熒光素來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。熒光可以肉眼觀察，通過(guò)感光膜，或通過(guò)電子檢測(cè)器如電荷耦聯(lián)裝置(CCDs)或光電倍增器等檢測(cè)。類似地，在提供酶的合適底物后，可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)酶標(biāo)記物。最后，簡(jiǎn)單的顯色標(biāo)記物可以通過(guò)簡(jiǎn)單觀察與標(biāo)記物相關(guān)的顏色來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在一系列試紙條(dipstick)試驗(yàn)中，綴合的膠體金通常顯示粉紅色，而各種綴合的小珠顯示各自小珠本身的顏色。
一些試驗(yàn)形式不需要使用標(biāo)記的組分。例如，凝集試驗(yàn)可用于檢測(cè)靶抗體存在與否。在該試驗(yàn)中，抗原包被顆粒與包含靶抗體的樣品發(fā)生凝集。在該形式中，參與組分均無(wú)需標(biāo)記，通過(guò)肉眼簡(jiǎn)單觀測(cè)就能判定靶抗體的有無(wú)。
E.調(diào)節(jié)子的檢測(cè)確定一個(gè)試驗(yàn)化合物是否能夠在體內(nèi)和體外特異性結(jié)合本發(fā)明的化學(xué)感受受體的組合物和方法如下所述。可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理學(xué)的許多指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)配體結(jié)合本發(fā)明T1R多肽的效果。這些試驗(yàn)可以在表達(dá)化學(xué)感受受體的完整細(xì)胞上進(jìn)行，在通透化的細(xì)胞上進(jìn)行，或在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的膜成分上進(jìn)行。
味覺(jué)受體結(jié)合味覺(jué)元并引發(fā)化學(xué)刺激轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。激活的或抑制的G蛋白因此改變了靶標(biāo)酶、通道、或其它效應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。一些例子如通過(guò)視覺(jué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)素(transducin)而引起cGMP磷酸二酯酶的活化、由刺激性G蛋白引起的腺苷環(huán)化酶的活化、由Gq和其它同類G蛋白引起的磷脂酶C的激活化、和由Gi和其它G蛋白引起的不同通道的調(diào)節(jié)等。下游結(jié)果也能檢驗(yàn)，如由磷脂酶C引發(fā)二?；视秃虸P3的產(chǎn)生，繼而也可以檢驗(yàn)由IP3引發(fā)的鈣遷移。
試驗(yàn)中的T1R蛋白或多肽通常從具有SEQ ID NOS4，10，12，14，17，或其片段或保守性修飾變體序列的多肽中選擇?？蛇x地，片段和變體可以是能夠結(jié)合抗T1R抗體的抗原性片段和變體。
或者，試驗(yàn)中的T1R蛋白或多肽可以從真核宿主細(xì)胞衍生而來(lái)，其包含具有與SEQ ID NOS4，10，12，14，17，或其片段或保守性修飾變體相同的氨基酸序列的氨基酸亞序列。一般來(lái)講，氨基酸序列的相同性至少35至50％，或可選地75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％?？蛇x地，試驗(yàn)中的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的結(jié)構(gòu)域，如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域等。此外如上所述，T1R蛋白或其結(jié)構(gòu)域可以共價(jià)連接異源蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生可用于此處描述的試驗(yàn)的嵌合蛋白。
可以使用如上所述的T1R蛋白質(zhì)或多肽，不管是重組的還是天然產(chǎn)生的，來(lái)測(cè)試T1R受體活性的調(diào)節(jié)子。可以分離、在細(xì)胞中表達(dá)、在由細(xì)胞衍生出的膜上表達(dá)、在動(dòng)物或組織中表達(dá)重組的或者是天然產(chǎn)生的TIR蛋白或多肽。例如，舌切片、從舌上分離下來(lái)的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或膜都可以使用。可以使用此處描述的體內(nèi)或體外試驗(yàn)中的一種來(lái)測(cè)試調(diào)節(jié)作用。
1.體外結(jié)合試驗(yàn)使用一個(gè)本發(fā)明的T1R多肽，利用可溶性的或固相反應(yīng)，可以體外檢測(cè)味覺(jué)傳導(dǎo)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，可以利用T1R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以可溶或固相反應(yīng)形式在體外試驗(yàn)其配體結(jié)合活性。
例如，T1R的N端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為參與了配體結(jié)合。具體而言，TIR屬于GPCR亞家族，其特征是具有大約600個(gè)氨基酸的大細(xì)胞外N端部分。這些N端部分被認(rèn)為是形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，至少是部分地形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且因此對(duì)于T1R激動(dòng)劑和拮抗劑的生物化學(xué)試驗(yàn)鑒定十分有益。配體結(jié)合域可能還包括額外的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分，例如跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外環(huán)。類似試驗(yàn)使用了與T1R相關(guān)的其它GPCR，例如代謝趨向性谷氨酸受體(例如參見，Han和Hampson，J.Biol.Chem.27410008-10013(1999))。這些試驗(yàn)可能涉及替換一個(gè)放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的配體，測(cè)量?jī)?nèi)在熒光的變化或蛋白水解敏感性的變化等。
結(jié)合到本發(fā)明T1R多肽上的配體，可以在溶液、雙層膜(可選地附著到固相上)、脂單層、或囊泡中檢測(cè)。調(diào)節(jié)子的結(jié)合可以利用如光譜特征變化(例如熒光、吸收、折射指數(shù))、流體力學(xué)(如形狀)、層析或溶解性進(jìn)行測(cè)試。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合試驗(yàn)是使用重組可溶性N端T1R結(jié)構(gòu)域的生物化學(xué)結(jié)合試驗(yàn)。
受體-G蛋白相互作用也能被檢驗(yàn)。例如，G蛋白與受體的結(jié)合，或它從受體上的釋放都能被檢驗(yàn)。特別是在沒(méi)有GTP的情況下，活化子(activator)將導(dǎo)致G蛋白(全部三個(gè)亞基)和受體的緊密復(fù)合物的形成。該復(fù)合物可用上述的多種方法檢測(cè)。這種試驗(yàn)改動(dòng)后可用于尋找抑制子(inhibitors)，例如在沒(méi)有GTP的情況下，將活化子加入受體和G蛋白(它們形成緊密復(fù)合物)，然后通過(guò)觀察受體-G蛋白復(fù)合物的解離從而篩選抑制子。在GTP存在的情況下，G蛋白α亞基從其它兩個(gè)G蛋白亞基的釋放可作為活化標(biāo)準(zhǔn)。被活化或抑制的G蛋白將因此改變靶標(biāo)酶、通道和其它效應(yīng)蛋白的性質(zhì)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用GTPγS試驗(yàn)。如上所述，在GPCR的活化下，G蛋白復(fù)合物的Gα亞基被刺激，將結(jié)合的GDP交換成為GTP。配體介導(dǎo)的G蛋白交換活性的刺激可以通過(guò)在生物化學(xué)試驗(yàn)測(cè)量，其中測(cè)定在推測(cè)配體存在情況下，加入的放射標(biāo)記GTPγ35S與G蛋白的結(jié)合。一般情況下，含有目的化學(xué)感受受體的膜與G蛋白復(fù)合物相混合。將潛在抑制子和/或活化子和GTPγS加入到試驗(yàn)中，測(cè)量結(jié)合到G蛋白上的GTPγS?？梢酝ㄟ^(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)或其它本領(lǐng)域已知的手段(包括閃爍接近試驗(yàn)(SPA))測(cè)量結(jié)合作用。在另一種試驗(yàn)形式中，可使用熒光標(biāo)記的GTPγS。
2.熒光偏振試驗(yàn)在另一實(shí)施方案中，基于熒光偏振(“FP”)的試驗(yàn)可用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)配體結(jié)合。熒光偏振試驗(yàn)是測(cè)量平衡結(jié)合、核酸雜交、和酶活性的實(shí)驗(yàn)室通用技術(shù)。熒光偏振試驗(yàn)是均一性的，因?yàn)樗恍枰蛛x步驟如離心、過(guò)濾、層析、沉淀或電泳等。這些試驗(yàn)在溶液中直接實(shí)時(shí)進(jìn)行，不需要一個(gè)固定化階級(jí)。偏振值可重復(fù)測(cè)量，在加入試劑后測(cè)量速度非常快，所以不會(huì)破壞樣品。一般情況下，本技術(shù)可用于測(cè)量低至匹摩爾(picomolar)到微摩爾(micromolar)水平熒光基團(tuán)(fluorophore)的偏振值。本節(jié)描述了怎樣簡(jiǎn)單定量地將熒光偏振應(yīng)用于測(cè)量本發(fā)明T1R多肽與配體的結(jié)合。
當(dāng)熒光標(biāo)記分子被平面偏振光激發(fā)，就發(fā)出具有一定偏振程度的光，偏振程度與其分子旋轉(zhuǎn)成反比。大的熒光標(biāo)記分子在激發(fā)態(tài)(對(duì)于熒光素來(lái)說(shuō)為4納秒)保持一定程度的穩(wěn)定性，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振保持一定程度的恒定。小的熒光標(biāo)記分子在激發(fā)態(tài)快速旋轉(zhuǎn)，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振變化顯著。因此，小分子偏振值較低而大分子偏振值較高。例如，一個(gè)單鏈熒光素標(biāo)記的寡核苷酸具有相對(duì)較低的偏振值，但當(dāng)它與互補(bǔ)鏈雜交后就具有較高的偏振值。當(dāng)使用FP來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)可能活化或抑制本發(fā)明化學(xué)感受受體的味覺(jué)元結(jié)合時(shí)，可以使用熒光素標(biāo)記的味覺(jué)元或自發(fā)熒光味覺(jué)元。
熒光偏振(P)被定義為P=IntΠ-Int⊥IntΠ+Int⊥]]>其中П是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光強(qiáng)度，⊥是與激發(fā)光平面垂直的發(fā)射光強(qiáng)度。P，作為一個(gè)光強(qiáng)度的比值，是一個(gè)沒(méi)有單位的數(shù)字。例如，Beacon和Beacon2000TM系統(tǒng)可以與這些試驗(yàn)結(jié)合使用。這類系統(tǒng)通常用毫偏振單位來(lái)表達(dá)偏振值(1偏振單位＝1000mP單位)。
分子旋轉(zhuǎn)和尺寸之間的關(guān)系由Perrin方程式描述，讀物可以參考Jolley，M.E.(1991)在分析毒理學(xué)雜志236-240頁(yè)(Journal ofAnalytical Toxicology，p236-240)的文獻(xiàn)，在這篇文獻(xiàn)中給出了該方程式的詳細(xì)解釋。概括地講，Perrin方程式認(rèn)為偏振與旋轉(zhuǎn)弛豫(rotational relaxation)時(shí)間成正比關(guān)系，該時(shí)間是一個(gè)分子旋轉(zhuǎn)過(guò)大約68.5°角所需要的時(shí)間。旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間與下列方程式中的粘度(η)、絕對(duì)溫度(T)、分子體積(V)、和氣體常數(shù)(R)有關(guān)
旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間對(duì)于小分子如熒光素非常小(≈1納秒)，對(duì)于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間，也即偏振，與分子體積直接相關(guān)。分子體積的變化可能是由于與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或熒光標(biāo)記分子的構(gòu)象變化等引起。例如，熒光偏振已被用于測(cè)量大分子熒光素標(biāo)記的聚合物的酶裂解，如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同樣被用于測(cè)量蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、抗體/抗原結(jié)合、和DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡結(jié)合作用。
3.固相和可溶性高通量試驗(yàn)在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用T1R多肽，或表達(dá)TlR多肽的細(xì)胞或組織的可溶性試驗(yàn)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明以高通量形式提供了基于固相的體外試驗(yàn)，其中T1R多肽、或表達(dá)T1R多肽的細(xì)胞或組織附著在固相底物上。
在本發(fā)明的高通量試驗(yàn)中，在一天內(nèi)篩選多達(dá)幾千個(gè)不同的調(diào)節(jié)子或配體是可能的。特別是微孔板的每一個(gè)孔都可以用于進(jìn)行針對(duì)選擇的潛在調(diào)節(jié)子的單獨(dú)的試驗(yàn)，或者如果是觀察濃度或孵育時(shí)間效果，每5-10個(gè)孔可以測(cè)試一個(gè)調(diào)節(jié)子。因此，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微孔板可以試驗(yàn)大約100個(gè)(例如96個(gè))調(diào)節(jié)子。如果使用1536孔板，那么一個(gè)板可以輕松分析1000到大約1500個(gè)不同化合物。也可能在每個(gè)平板也中分析幾個(gè)化合物。每天都可以分析幾個(gè)不同的微孔板；使用本發(fā)明的這種整體系統(tǒng)分析多達(dá)大約6,000-20,000種不同的化合物是可行的。最近又發(fā)展了試劑操作的微流控制方法。
目的分子可以直接或間接通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵如經(jīng)由一個(gè)標(biāo)記物結(jié)合到固態(tài)組分上。標(biāo)記物可以是任何的各種各樣的組分。一般來(lái)講，將可結(jié)合標(biāo)記物的分子(標(biāo)記物結(jié)合物)固定在一個(gè)固相支持物上，通過(guò)標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物的相互作用，標(biāo)記了的目的分子(如味覺(jué)傳導(dǎo)目的分子)就固定在了固相支持物上。
根據(jù)文獻(xiàn)描述的已知的分子相互作用，可以使用許多標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物。例如，當(dāng)一個(gè)標(biāo)記物具有一個(gè)天然結(jié)合物時(shí)，例如生物素、蛋白A、或蛋白G，它就可以與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物結(jié)合物(親和素、鏈霉親和素、中性親和素、免疫球蛋白Fc區(qū)等)結(jié)合使用。針對(duì)具有天然結(jié)合物的分子如生物素的抗體也可被廣泛應(yīng)用，并是合適的標(biāo)記物結(jié)合物(參見，Sigma Immunochemicals 1998Catalogue Sigma，St.Louis MO)。
類似地，任何半抗原或抗原化合物都可與適當(dāng)抗體結(jié)合使用以形成標(biāo)記物/標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)。幾千種抗體都已商業(yè)化并且文獻(xiàn)中還描述了許多其它的抗體。例如，在一個(gè)常見方法中，標(biāo)記物是第一抗體，標(biāo)記物結(jié)合物是特異識(shí)別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用外，受體-配體相互作用也可以作為合適的標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)。例如，細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑和拮抗劑(例如，細(xì)胞受體-配體相互作用如轉(zhuǎn)鐵蛋白、c-盒、病毒受體配體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、選擇蛋白(selectin)家族等，例如參見，Pogott&Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。類似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如鴉片、類固醇等)、細(xì)胞內(nèi)受體(例如，其介導(dǎo)各種小配體效果，包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A(retinoids)和維生素D，和肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)狀聚合物構(gòu)型)、寡糖、蛋白質(zhì)、磷脂和抗體等都可以與不同細(xì)胞受體作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲類、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯(polyacetates)同樣可以形成合適的標(biāo)記物或標(biāo)記物結(jié)合物。許多其它的標(biāo)記物/標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)同樣對(duì)于在此描述的試驗(yàn)系統(tǒng)十分有益，在瀏覽本公開專利時(shí)這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
一般連接物如肽、聚醚等同樣可以作為標(biāo)記物，并且包括多肽序列，例如大約5到200氨基酸的聚甘氨酸序列。這類彈性接頭對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，聚(乙二醇)接頭可以從ShearwaterPolymers，Inc.Huntsville，Alabama得到。這些接頭可選地具有酰胺鍵、巰基鍵或異源功能鍵等。
標(biāo)記物結(jié)合物可以使用現(xiàn)有的各種方法固定到固相底物上。通常固相底物全部或部分暴露于化學(xué)試劑(將一個(gè)能與標(biāo)記物結(jié)合物的一部分發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)固定到表面)中以完成衍生或功能化。例如，適合附著在一個(gè)長(zhǎng)鏈部分上的基團(tuán)可包括胺、羥基、硫醇和羧基基團(tuán)。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羥烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于一系列表面的功能化，例如玻璃表面。構(gòu)建此類固相生物聚合膜陣列的方法文獻(xiàn)中均有詳細(xì)描述。例如參見，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)(描述了固相如肽的合成)；Geysen et al.，J.Immun.Meth.，102259-274(1987)(描述了在針上固相組分的合成)；Frank&Doring，Tetrahedron，446031-6040(1988)(描述了在纖維素盤上合成多種肽序列)；Fodor et al.，Science，251767-777(1991)；Sheldon et al.，Clinical Chemistry，39(4)718-719(1993)；和Kozalet al.，Nature Medicine，2(7)753-759(1996)(均描述了固定在固相支持物上的生物聚合物排列)。固定標(biāo)記物結(jié)合物到底物上的非化學(xué)方法包括其它常用方法，如加熱、UV輻射交聯(lián)等。
4.基于計(jì)算機(jī)的試驗(yàn)另外一種測(cè)定調(diào)節(jié)T1R多肽活性的化合物的試驗(yàn)涉及計(jì)算機(jī)輔助化合物設(shè)計(jì)，其中計(jì)算機(jī)系統(tǒng)在氨基酸序列編碼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，用于產(chǎn)生T1R多肽的三維結(jié)構(gòu)。輸入的氨基酸序列與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中預(yù)先建立的算法直接并積極相互作用，產(chǎn)生出蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)模型。然后檢驗(yàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，來(lái)確定具有結(jié)合例如配體的能力的結(jié)構(gòu)區(qū)域。這些區(qū)域然后用于鑒定可結(jié)合蛋白質(zhì)的配體。
通過(guò)輸入至少有10個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)氨基酸序列或相應(yīng)的編碼T1R多肽的核酸序列到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中，產(chǎn)生蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。編碼T1R多肽的核酸序列，或其氨基酸序列，可以是此處公開的任何序列和其保守性修飾的變體。
氨基酸序列代表了蛋白質(zhì)的一級(jí)序列或亞序列，其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。將至少10個(gè)殘基的氨基酸序列(或編碼10個(gè)氨基酸的核苷酸序列)通過(guò)鍵盤輸入到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中，計(jì)算機(jī)可讀的底物包括但并不局限于，電子存儲(chǔ)介質(zhì)(如磁盤、磁帶、盒帶(cartridges)、和芯片)、光學(xué)介質(zhì)(如CD ROM)、由因特網(wǎng)和RAM發(fā)布的信息。然后通過(guò)氨基酸序列與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的相互作用，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知軟件，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。
氨基酸序列代表了一級(jí)結(jié)構(gòu)，其編碼形成目的蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)必要的信息。本軟件根據(jù)一級(jí)序列編碼的特定參數(shù)來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模型。這些參數(shù)被稱為“能量術(shù)語(yǔ)”，主要包括靜電電勢(shì)、疏水電勢(shì)、溶劑可接近性表面、和氫鍵形成。二級(jí)能量術(shù)語(yǔ)包括范德華電勢(shì)。生物分子形成以一種累積形式使該能量術(shù)語(yǔ)值最小化的結(jié)構(gòu)。計(jì)算機(jī)程序然后使用這些由一級(jí)結(jié)構(gòu)或氨基酸序列編碼的術(shù)語(yǔ)值來(lái)產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
在二級(jí)結(jié)構(gòu)能量術(shù)語(yǔ)的基礎(chǔ)上，形成由二級(jí)結(jié)構(gòu)編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用戶此時(shí)可以輸入另外的變量，如蛋白質(zhì)是膜結(jié)合的或是可溶性的、在機(jī)體內(nèi)的定位、它的細(xì)胞內(nèi)定位如胞漿、表面或細(xì)胞核等。這些變量以及二級(jí)結(jié)構(gòu)能量術(shù)語(yǔ)用來(lái)產(chǎn)生三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。在三級(jí)結(jié)構(gòu)模建中，計(jì)算機(jī)程序?qū)⒍?jí)結(jié)構(gòu)疏水面和類似物匹配，以及將二級(jí)結(jié)構(gòu)親水面和類似物匹配。
一旦產(chǎn)生結(jié)構(gòu)，計(jì)算機(jī)就會(huì)鑒定出潛在的配體結(jié)合區(qū)域。通過(guò)輸入如上所述的氨基酸或核苷酸序列或化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式，產(chǎn)生潛在配體的三維結(jié)構(gòu)。潛在配體的三維結(jié)構(gòu)然后與T1R多肽的三維結(jié)構(gòu)相比較，從而鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)的配體。通過(guò)能量術(shù)語(yǔ)確定蛋白質(zhì)和配體間的結(jié)合親和性，由此可以確定哪些配體具有增加的與蛋白質(zhì)結(jié)合的可能性。
計(jì)算機(jī)系統(tǒng)同樣可用于篩選T1R基因的突變、多態(tài)變體、等位基因、和種間同源體。這類突變可能與疾病狀態(tài)或遺傳性狀相關(guān)。如上所述，基因芯片(GeneChipTM)和相關(guān)技術(shù)同樣可用于篩選突變、多態(tài)變體、等位基因、和種間同源體。一旦變體被鑒定，可以用診斷試驗(yàn)確定具有突變的基因的患者。突變T1R基因的鑒定涉及接收T1R基因或其保守性修飾變體第一核酸或氨基酸序列的輸入。序列用如上所述的方法輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。該第一條核酸或氨基酸序列然后與第二條與第一序列基本相同的核酸或氨基酸序列比較。第二序列用如上所述的方法輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。一旦比較第一和第二序列，就能確定兩序列中核苷酸或氨基酸的差異。這些序列能夠代表不同的T1R基因中的等位基因差異、與疾病狀態(tài)和遺傳性狀相關(guān)的突變。
5.基于細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)在一個(gè)實(shí)施方案中，T1R蛋白或多肽在真核細(xì)胞中表達(dá)為嵌合受體，其帶有異源的、能夠促進(jìn)其成熟和定向通過(guò)分泌途徑的伴侶序列。這類嵌合T1R多肽可在任何真核細(xì)胞中表達(dá)，如HEK-293細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞包含一個(gè)功能性G蛋白，例如Gα15，其可以耦聯(lián)嵌合受體至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生途徑上，或耦聯(lián)至信號(hào)發(fā)生蛋白如磷脂酶C上。細(xì)胞內(nèi)這類嵌合受體的化活可以用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的FURA-2依賴性熒光變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。
激活的GPCR受體變成激酶的底物，激酶能夠使受體C端尾部磷酸化(也可能是其它位置)。因此，激活子能促進(jìn)32P從γ標(biāo)記的GTP到受體的轉(zhuǎn)移，其可用閃爍計(jì)數(shù)器分析。C端尾部磷酸化能促進(jìn)捕獲素(arrestin)樣蛋白的結(jié)合，從而干擾G蛋白的結(jié)合。激酶/捕獲素途徑在許多GPCR受體的脫敏中起著重要的作用。例如，調(diào)節(jié)味覺(jué)受體保持活性的持續(xù)期的化合物可用作延長(zhǎng)目的味道或去除一個(gè)不愉快的味道。GPCR信號(hào)傳導(dǎo)和分析信號(hào)傳導(dǎo)的方法的一般性綜述參見，Methods in Enzymology，vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983)；Bourne et al.，Nature，10349117-27(1991)；Bourne et al.，Nature，348125-32(1990)；Pitcher et al.，Annu.Rev.Biochem.，67653-92(1998)。
通過(guò)比較由推定的調(diào)節(jié)子處理過(guò)的T1R多肽的反應(yīng)和未處理過(guò)的對(duì)照樣品的反應(yīng)從而分析T1R調(diào)節(jié)作用。這類推定的T1R調(diào)節(jié)子可包括抑制或活化T1R多肽活性的味覺(jué)元。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照樣品(未用活化子或抑制子處理)的T1R相對(duì)活性值被指定為100。當(dāng)T1R活性值相對(duì)于對(duì)照為大約90％，可選地50％，可選地25-0％時(shí)，就獲得T1R多肽的抑制。當(dāng)T1R活性值相對(duì)于對(duì)照為110％，可選地150％、200-500％或1000-2000％時(shí)，就獲得T1R多肽的活化。
離子流量變化可通過(guò)確定表達(dá)T1R多肽的細(xì)胞或膜的離子偏振(即電勢(shì))變化來(lái)評(píng)價(jià)。確定細(xì)胞偏振變化的一個(gè)手段就是用電壓-鉗(voltage-clamp)和補(bǔ)丁-鉗(patch-clamp)技術(shù)(例如參見，“細(xì)胞附著”模式、“內(nèi)-外”模式、和“全細(xì)胞”模式，如Ackerman et al.，New Engl.J Med.，3361575-1595(1997)))測(cè)量電流變化(從而檢測(cè)偏振的變化)。全細(xì)胞電流可用標(biāo)準(zhǔn)方法很方便地測(cè)量到。其它已知的試驗(yàn)包括放射標(biāo)記離子流量試驗(yàn)和使用電壓敏感性染料的熒光試驗(yàn)(例如參見，Vestergarrd-Bogind et al.，J.Membrane Biol.，8867-75(1988)；Gonzales&Tsien，Chem.Biol.，4269-277(1997)；Daniel et al.，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky et al.，J.Membrane Biol.，13759-70(1994))。一般來(lái)講，待測(cè)試化合物的存在濃度為從1pM到100mM。
待測(cè)試化合物對(duì)于多肽功能的效果可以通過(guò)檢驗(yàn)如上所述的任何一個(gè)參數(shù)來(lái)測(cè)量。任何影響GPCR活性的適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)變化都可用于評(píng)價(jià)一個(gè)待測(cè)試化合物對(duì)本發(fā)明多肽的影響。當(dāng)使用完整細(xì)胞或動(dòng)物確定功能結(jié)果時(shí)，同樣可測(cè)量一系列效果如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知或未鑒定遺傳標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄變化(例如Northern印跡)、細(xì)胞代謝變化如細(xì)胞生長(zhǎng)或pH變化、和細(xì)胞內(nèi)第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的變化等。
優(yōu)選的分析GPCR的試驗(yàn)包括載有離子或電壓敏感性染料，能夠報(bào)告受體活性的細(xì)胞。確定這類受體活性的試驗(yàn)同樣可使用其它G蛋白耦聯(lián)受體已知的激動(dòng)劑和拮抗劑作為陰性或陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)評(píng)價(jià)待測(cè)化合物的活性。在鑒定調(diào)節(jié)活性化合物(例如激動(dòng)劑、拮抗劑)的試驗(yàn)中，胞漿內(nèi)離子水平或膜電位的變化可以分別使用離子敏感或膜電位熒光指示劑來(lái)監(jiān)測(cè)?？赡苁褂玫降碾x子敏感指示劑和電壓探頭在Molecular Probes1997 Catalot中有描述。對(duì)于G蛋白耦聯(lián)受體，混棲G蛋白如Gα15和Gα16可用于選擇實(shí)驗(yàn)(Wilkie et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，8810049-10053(1991))。這類混棲蛋白允許廣泛的受體分子的耦聯(lián)。
受體活化通常啟動(dòng)隨后的細(xì)胞內(nèi)事件，如第二信使如IP3的增加，其能夠釋放細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)存。一些G蛋白耦聯(lián)受體的活化通過(guò)磷脂酶C介導(dǎo)的磷脂酰肌醇水解作用刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge&Irvine，Nature，312315-21(1984))。IP3繼而刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)存的釋放。因此胞漿鈣離子水平變化，或第二信使如IP3水平的變化可用于評(píng)價(jià)G蛋白耦聯(lián)受體的功能。表達(dá)這類G蛋白耦聯(lián)受體的細(xì)胞可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)庫(kù)存釋放和通過(guò)離子通道活化而表現(xiàn)出胞漿鈣離子水平增加，在這種情況下盡管不是十分必要但也應(yīng)盡量在沒(méi)有鈣離子的緩沖液中進(jìn)行該試驗(yàn)，可選地在溶液中加入一種鰲合劑如EGTA，用來(lái)區(qū)分由內(nèi)部庫(kù)存鈣釋放引起的熒光反應(yīng)。
其它試驗(yàn)可包括確定受體活性，其活化后，通過(guò)活化或抑制酶如腺苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸如cAMP或cGMP水平的變化。環(huán)核苷酸門控離子通道如錐狀光受體細(xì)胞通道和嗅覺(jué)神經(jīng)元通道，在結(jié)合cAMP或cGMP而活化下，對(duì)陽(yáng)離子具有通透性(例如參見，Altenhofen et al.，Proc.Natl Acad.Sci.，889868-9872(1991)and Dhallan et al.，Nature，347184-187(1990))。在受體活化導(dǎo)致環(huán)核苷酸水平降低的情況下，可優(yōu)選在加入一個(gè)受體激活化合物到試驗(yàn)細(xì)胞之前，將細(xì)胞暴露在能夠增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的試劑如毛喉素中。用于這種類型的試驗(yàn)中的細(xì)胞可通過(guò)用編碼環(huán)核苷酸門控離子通道、GPCR磷酸酶的DNA和編碼受體(例如某些谷氨酸受體、蕈毒堿性乙酰膽堿受體、多巴胺受體、五羥色胺受體等)的DNA共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而制備，其在活化后將引起胞漿內(nèi)環(huán)核苷酸水平的變化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在異源細(xì)胞中表達(dá)T1R基因，以及可以將受體連接至磷脂酶C信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的混棲G蛋白，測(cè)量T1R多肽的活性(參見Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995))?？蛇x地該細(xì)胞系是HEK-293(其在天然狀態(tài)下不表達(dá)T1R基因)，混棲G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，supra)。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平(其通過(guò)吸收與T1R多肽結(jié)合的分子，響應(yīng)于T1R信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)作用而變化)的變化來(lái)分析味覺(jué)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。鈣離子水平可選地由熒光鈣離子指示劑染料和熒光成像技術(shù)來(lái)測(cè)量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用免疫試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的cAMP或cGMP的變化。Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995)描述的方法可以用于確定cAMP水平。同樣，F(xiàn)elley-Bosco et al.，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11159-164(1994)描述的方法可以用于確定cGMP水平。此外，測(cè)量cAMP和/或cGMP的試驗(yàn)試劑盒見美國(guó)專利4,115,538，在此引用作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以按照U.S.Patent 5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解，在此引用作為參考。簡(jiǎn)單地講，該試驗(yàn)涉及用3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。標(biāo)記后的細(xì)胞用待測(cè)化合物處理1小時(shí)。處理后的細(xì)胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提，其后通過(guò)離子交換層析分離磷酸肌醇，用閃爍計(jì)數(shù)定量。計(jì)算存在激動(dòng)劑時(shí)的cpm和存在緩沖液對(duì)照時(shí)的cpm的比率，確定刺激作用倍數(shù)。類似地，計(jì)算存在拮抗劑時(shí)的cpm和存在緩沖液對(duì)照(可能含有或不含有激動(dòng)劑)時(shí)的cpm的比率，可以確定抑制作用倍數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平用于評(píng)價(jià)待測(cè)化合物對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的影響。將包含目的T1R多肽的宿主細(xì)胞與待測(cè)化合物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)任何相互作用，然后測(cè)量基因表達(dá)水平。實(shí)現(xiàn)這些相互作用的時(shí)間可以憑經(jīng)驗(yàn)確定，例如執(zhí)行一個(gè)時(shí)間進(jìn)程并且測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平作為時(shí)間的函數(shù)。轉(zhuǎn)錄量可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的方法測(cè)量。例如，目的蛋白mRNA的表達(dá)可以通過(guò)Northern印跡檢測(cè)或利用免疫試驗(yàn)鑒定其多肽產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)?；蛘?，可使用利用報(bào)告基因的基于轉(zhuǎn)錄的試驗(yàn)，參見U.S.Patent 5,436,128的描述，在此引用作為參考。報(bào)告基因可以是，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、3’-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。此外，經(jīng)過(guò)附著在第二報(bào)告子如綠色熒光蛋白后，目的蛋白可以間接用作報(bào)告子(例如參見，Mistili&Spector，NatureBiotechnology，15961-964(1994))。
然后將轉(zhuǎn)錄量與在缺少待測(cè)化合物時(shí)相同細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄量相比較，或者與缺少目的T1R多肽的基本相同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄量相比較。基本相同的細(xì)胞可以從用于制備重組細(xì)胞的相同細(xì)胞衍生而來(lái)，但是未被引進(jìn)異源DNA修飾。轉(zhuǎn)錄量的任何差異意味著待測(cè)化合物在一定程度上改變了目的T1R多肽的活性。
6.表達(dá)化學(xué)感受受體的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物表達(dá)一種或多種本發(fā)明化學(xué)感受受體序列的非人類動(dòng)物同樣可用于受體試驗(yàn)。這種表達(dá)可用于確定試驗(yàn)化合物在體內(nèi)是否可以特異性地結(jié)合至哺乳動(dòng)物味覺(jué)跨膜受體多肽，具體方法是將用編碼化學(xué)感受受體或其配體結(jié)合區(qū)域的核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的非人類動(dòng)物與待測(cè)化合物接觸，并確定該動(dòng)物是否通過(guò)特異性結(jié)合受體多肽而對(duì)待測(cè)化合物起反應(yīng)。
使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或感染過(guò)的動(dòng)物對(duì)于鑒定和鑒別可結(jié)合特異性或一組受體的味覺(jué)元/配體的試驗(yàn)特別有用。這類經(jīng)載體感染、能表達(dá)人類化學(xué)感受受體序列的動(dòng)物，可用于體內(nèi)篩選味覺(jué)元和分析味覺(jué)元對(duì)細(xì)胞生理學(xué)(如對(duì)味覺(jué)神經(jīng)元)、對(duì)CNS或行為的影響。
單獨(dú)或作為文庫(kù)形式感染/表達(dá)核酸和載體的手段本領(lǐng)域眾所周知。各種各樣個(gè)體細(xì)胞、器官、或整個(gè)動(dòng)物的參數(shù)可用多種手段來(lái)測(cè)量。通過(guò)用感染劑如腺病毒表達(dá)載體投遞，可在動(dòng)物味覺(jué)組織中例如表達(dá)本發(fā)明的TIR序列。
內(nèi)源性化學(xué)感受受體基因可保持有功能，并且野生型(天然的)活性仍然存在。在其它情況下，當(dāng)需要所有的化學(xué)感受受體活性都是由引入的異源雜合受體引起時(shí)，優(yōu)選使用敲除品系(knockout line)。構(gòu)建非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因小鼠，和產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的重組構(gòu)建體的選擇和制備的方法本領(lǐng)域眾所周知。
構(gòu)建“敲除”細(xì)胞和動(dòng)物基于的前提是，通過(guò)將干擾待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因組中，可以降低或完全消除哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平。同樣，“基因誘捕插入”(gene trapinsertion)，可用于破壞宿主基因，小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)可用于產(chǎn)生敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如參見，Holzschu，Transgenic Res.697 106(1997))。異源序列的插入通常由互補(bǔ)核酸序列間的同源重組實(shí)現(xiàn)。異源序列是待修飾靶基因的一部分，例如內(nèi)部、外部或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或任何可影響靶基因表達(dá)水平的基因組序列；或其組合。多能胚胎干細(xì)胞中經(jīng)過(guò)同源重組的基因打靶可以允許對(duì)目的基因組序列進(jìn)行精確修飾。任何技術(shù)都可用于產(chǎn)生、篩選、繁殖敲除動(dòng)物，例如參見Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6321-328(1997)；U.S.Patents NOs.5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO95/31560；WO 91/12650。
本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生“敲除”人細(xì)胞及其后代的試劑。類似地，本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生小鼠“敲入(knock-ins)”的試劑。人或大鼠T1R基因序列可以替換小鼠基因組中的直向進(jìn)化同源T1R。通過(guò)這個(gè)途徑，產(chǎn)生表達(dá)人或大鼠T1R的小鼠。該小鼠然后可用于分析人或大鼠T1R的功能，和鑒定這類T1R的配體。
F.調(diào)節(jié)子作為T1R家族成員調(diào)節(jié)子測(cè)試的化合物可以是任何小的化學(xué)化合物，或生物學(xué)實(shí)體如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂。或者，調(diào)節(jié)子可以是T1R基因的遺傳變體。一般情況下，試驗(yàn)化合物可以是小的化學(xué)分子和肽?；旧先魏位瘜W(xué)化合物都可以作為本發(fā)明試驗(yàn)中的潛在調(diào)節(jié)子或配體，盡管在大多數(shù)情況下化合物溶解于水或有機(jī)溶劑(特別是基于DMSO的)中。通過(guò)自動(dòng)化試驗(yàn)步驟，及從任何方便的來(lái)源中提供化合物用于試驗(yàn)，這些試驗(yàn)可用于篩選大的化學(xué)文庫(kù)，這些試驗(yàn)通常是平行方式進(jìn)行(例如在機(jī)器試驗(yàn)中在微量滴定板上以微量滴定方式進(jìn)行)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到有很多化學(xué)化合物供應(yīng)商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，F(xiàn)luka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，高通量篩選方法涉及提供包含大量潛在治療性化合物(潛在調(diào)節(jié)子或配體化合物)的組合化學(xué)或肽文庫(kù)。然后在一種或多種上述試驗(yàn)中篩選這類“組合化學(xué)文庫(kù)”或“配體文庫(kù)”，來(lái)鑒定這些顯示所需特征性活性的文庫(kù)成員(特別是化學(xué)種類或亞類)。因此鑒定的化合物可以作為常規(guī)的“引導(dǎo)化合物(lead compounds)”或本身就可作為潛在或真正的治療劑。
組合化學(xué)文庫(kù)是不同化學(xué)化合物(由化學(xué)合成或生物合成產(chǎn)生的)的集合，通過(guò)大量化學(xué)“構(gòu)造部件(building blocks)”如試劑組合而成。例如，線性組合化學(xué)文庫(kù)如多肽文庫(kù)是由一系列化學(xué)構(gòu)造部件(氨基酸)用各種可能方式以指定化合物長(zhǎng)度(即多肽化合物中含有氨基酸的數(shù)目)組合而形成。通過(guò)這種化學(xué)構(gòu)造部件的組合混合可以合成出上百萬(wàn)個(gè)化學(xué)化合物。
組合化學(xué)文庫(kù)的制備和篩選本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。這類組合化學(xué)文庫(kù)包括肽庫(kù)，但并不局限于肽文庫(kù)(例如參見，U.S.Patent 5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)and Houghtonet al.，Nature，35484-88(1991))。同樣可以用其它產(chǎn)生化學(xué)多樣文庫(kù)的化學(xué)物質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)包括，但并不局限于類肽(例如PCTPublication No.WO 91/19735)、編碼的肽(PCT Publication No.WO93/20242)、隨機(jī)生物寡聚物(PCT Publication No.WO 92/00091)、苯并二氮雜(例如U.S.Pat.No.5,288,514)、乙內(nèi)酰脲和苯并二氮雜以及二肽的異聚物(diversomers)(Hubbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.，906906-6913(1993))、聯(lián)乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模仿物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))、類似的有機(jī)合成小分子化合物文庫(kù)(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science，26611303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.，59658(1994))、核酸文庫(kù)(Ausubel，Berger and Sambrook，all supra)、肽核酸文庫(kù)(U.S.Patent5,539,083)、抗體文庫(kù)(Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)and PCT/US96/10278)、糖類文庫(kù)(Liang等，Science，274152001522(1996)and U.S.Patent 5,593853)，有機(jī)小分子文庫(kù)(苯并二氮雜，Baum，C&EN，Jan 18，page 33(1993)；噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones，U.S.Patent 5,549,974；pynrolidines，U.S.Patents 5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，U.S.Patent 5,506,337；苯并二氮雜，5,288,514等)。
制備組合文庫(kù)的裝置已經(jīng)商業(yè)化(例如參見，357 MPS，390 MPS(Advanced Chem Tech，Louisville KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，9050 Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，無(wú)數(shù)組合文庫(kù)本身也已經(jīng)商業(yè)化(例如參見，ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3DPharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences；Columbia，MD等)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是，T1R調(diào)節(jié)子可用于任何食品、糖果、藥物組合物及其成分，從而以所需的方式調(diào)節(jié)產(chǎn)品、組合物或成分的味道。例如，可以加入能夠增強(qiáng)甜味感覺(jué)的T1R調(diào)節(jié)子以增加產(chǎn)品或組合物的甜味，而可加入能阻斷不愉快味覺(jué)的T1R調(diào)節(jié)子以改善產(chǎn)品或組合物的味道。
G.描述和預(yù)測(cè)味覺(jué)感受的方法本發(fā)明同樣優(yōu)選地提供在哺乳動(dòng)物特別是人類中描述味覺(jué)感知和/或預(yù)測(cè)味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用在此公開的這些受體和使用此處公開的編碼該T1R多肽的基因來(lái)完成。
本發(fā)明還包括一種篩選一種或多種化合物以檢測(cè)是否存在可被哺乳動(dòng)物察覺(jué)到的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物與公開受體接觸，優(yōu)選地其中哺乳動(dòng)物是人。本發(fā)明同樣可以包括展示哺乳動(dòng)物對(duì)特定味道的味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟提供代表該脊椎動(dòng)物n種化學(xué)感受受體中每一種的定量刺激的X1到Xn值，其中n大于或等于2；從這些值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述?；瘜W(xué)感受受體可以是此處公開的化學(xué)感受受體，描述可能包含一個(gè)點(diǎn)或n維空間的一個(gè)體積，可能包含一個(gè)圖或一個(gè)譜，還可能包含一個(gè)定量描述矩陣。同樣，提供的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的化學(xué)感受受體與待測(cè)組合物接觸，定量測(cè)量該組合物與該受體的作用。
本發(fā)明同樣涵蓋預(yù)測(cè)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的味覺(jué)感知的法，包括以下步驟對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)化學(xué)感受受體中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于2；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知，從該值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述，對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)化學(xué)感受受體中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于2；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知，從該值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述，預(yù)測(cè)一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的未知味覺(jué)感知，方法是將一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的未知味覺(jué)感知引起的定量的描述與一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的已知味覺(jué)感知引起的定量的描述相比較。本方法中所用化學(xué)感受受體可以包括此處公開的一個(gè)化學(xué)感受受體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)確定如上所述的已知分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；確定一種或多種未知分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；將一種或多種未知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值和一種或多種已知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值相比較；選擇能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物特定味覺(jué)感知的分子或分子組合；并合并兩個(gè)或更多未知分子或分子組合以形成能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物中預(yù)定味覺(jué)感知的分子或分子組合，從而獲得在哺乳動(dòng)物中引發(fā)預(yù)定味覺(jué)感知的新型分子或分子組合。合并步驟產(chǎn)生能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)特定味覺(jué)感知的單獨(dú)分子或分子組合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是提供刺激味覺(jué)的方法，包括以下步驟對(duì)于克隆化學(xué)感受受體群，優(yōu)選的是人類受體群中的每一個(gè)，確定化學(xué)感受受體與味覺(jué)元的作用程度；合并各自預(yù)先確定與一種或多種所述受體有相互作用的化合物群，其用量是在一起能提供模擬味覺(jué)元作用圖的受體-刺激作用圖。通過(guò)在此描述的任何一種結(jié)合或報(bào)告子試驗(yàn)可以確定味覺(jué)元與化學(xué)感受受體的相互作用。該多數(shù)化合物然后可以合并以形成一種混合物。如果需要，該多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價(jià)結(jié)合。組合后的化合物基本上刺激至少75％、80％或90％的基本上由味覺(jué)元刺激的受體。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)多數(shù)化學(xué)感受受體測(cè)試多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化合物，來(lái)確定每一個(gè)受體和每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物的相互作用程度，因此針對(duì)每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物產(chǎn)生一個(gè)受體刺激圖。然后這些受體刺激圖可以存儲(chǔ)在存在于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中。本方法可進(jìn)一步包括提供味覺(jué)的所需受體刺激圖；比較所需受體刺激圖與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)；確定與所需的受體刺激圖最密切匹配的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物組合。本方法還進(jìn)一步包括將標(biāo)準(zhǔn)化合物組合成一種或多種已經(jīng)確定的組合形式來(lái)刺激味覺(jué)。
H.試劑盒T1R基因和它們的同源體是鑒定化學(xué)感受受體細(xì)胞、法醫(yī)學(xué)和親子鑒定、檢驗(yàn)味覺(jué)傳導(dǎo)的有利工具。能夠特異性與T1R核酸雜交的T1R家族特異性試劑，如T1R探針和引物，以及能夠特異性結(jié)合T1R多肽的T1R特異性試劑，例如T1R抗體，可以用于檢驗(yàn)味覺(jué)細(xì)胞表達(dá)和味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。
確定樣品中T1R家族成員DNA和RNA是否存在的核酸試驗(yàn)包括本領(lǐng)域眾所周知的許多技術(shù)，例如Southern分析、Northern分析、點(diǎn)印跡、RNA酶保護(hù)、S1分析、擴(kuò)增技術(shù)如PCR、和原位雜交。例如在原位雜交中，靶核酸從它的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中釋放出來(lái)，以便能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交，同時(shí)保持細(xì)胞形態(tài)，利于隨后的解釋和分析。以下文章提供了原位雜交的概況Singer等，Biotechniques，4230-250(1986)；Haase等，Methodsin Virology，vol.VII pp.189-226(1984)；and Nucleic AcidHybridizationA Practical Approach(Names et al.，eds.1987)。另外，T1R多肽可以使用如上描述的各種免疫試驗(yàn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)。測(cè)試樣品通常同時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照(例如，表達(dá)重組T1R多肽的樣品)和陰性對(duì)照比較。
本發(fā)明同樣提供了篩選T1R家族成員調(diào)節(jié)子的試劑盒。這些試劑盒可以從現(xiàn)成材料和試劑中制備。例如，這些試劑盒可以包含以下材料中的任何一種或多種T1R核酸或蛋白質(zhì)、反應(yīng)試管、測(cè)試T1R活性的指南等?？蛇x地，試劑盒包含生物活性的T1R受體。按照本發(fā)明可以制備多種試劑盒和組分，這取決于試劑盒的特定用戶和用戶的特殊需求。
實(shí)施例此處提供的蛋白質(zhì)序列中，單字母X或Xaa指二十種常見氨基酸殘基中的任意一種。此處提供的DNA序列中，單字母N或n代表四種常見核苷酸堿基A、T、C、G中的任意一種。
實(shí)施例1-hT1R3下面提供為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的hT1R3基因組DNA，其中推測(cè)的編碼序列(cds)用粗體顯示。5’和3’毗連(序列)群之間的切斷用省略號(hào)(‘……’)表示。hT1R3推測(cè)的cds描述于SEQ ID NO3中。最后，優(yōu)選的、推測(cè)的hT1R3氨基酸序列描述于SEQ ID NO4中，其中使用單字母表示氨基酸。
hT1R3基因組DNA-5’毗連(序列)群(SEQ ID NO 1)AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGAGGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAATCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACCTGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGGTGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGGTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCGAGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCCCACCATCACCCACCCCCAACCAACCCCTGCCCCGTGGGAGCCCCTTGTGTCAGGAGAATGC(SEQ ID NO1)
hT1R3基因組DNA-3’毗連(序列)群(SEQ ID NO 2)……………TACATGCACCCCACCCAGCCCTGCCCTGGGAGCCCTGTGTCAGAAGATGCTCTTGGCCTTGCAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGA AGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGGTGAGCCCGGGAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACGGCCACCACGCCTGAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCGTGCCCGTGGTAGCCCCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCCGTGGGCATGCCCAGCCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGAGCCGCCTTCCCGGCAGGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGACTCTGAGACCAGAGCCCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCC
AGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCCCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGACCCAACCCTGTGATCTCAGCCCCGGTGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACCCGTGTCTCGCTACAGAGACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCTGACCCCACAGTGAGCCCTAGGCCTGGAGCACGTGGACACCCCTGTGACCATC(SEQ ID NO2)hT1R3全長(zhǎng)基因組DNA(SEQ ID NO 20)AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGAGGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAATCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACCTGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGGTGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGGTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCGAGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCCCACCATCACCCACCCCCAACCAACCCCTGCCCCGTGGGAGCCCCTTGTGTCAGGAGAATGCTACATGCACCCCACCCAGCCCTGCCCTGGGAGCCCTGTGTCAGAAGATGCTCTTGGCCTTGCAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGG
ACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGGTGAGCCCGGGAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACGGCCACCACGCCTGAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCGTGCCCGTGGTAGCCCCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCCGTGGGCATGCCCAGCCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGAGCCGCCTTCCCGGCAGGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGACTCTGAGACCAGAGCCCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCCCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGACCCAACCCTGTGATCTCAGCCCCGGTGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACCCGTGTCTCGCTACAGAGACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCTGACCCCACAGTGAGCCCTAGGCCTGGAGCACGTGGACACCCCTGTGACCATC(SEQ ID NO 20)
hT1R3推測(cè)的cds(SEQ ID NO 3)ATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCACTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACA ACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCCCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGC
CCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGA(SEQ ID NO 3)hT1R3概念性翻譯(SEQ ID NO 4)MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPLCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCTRFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPVVAMKPSLMFLAKAGSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPHYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLGKVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGMAQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDVVGQRCPQCDCITLQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVGGLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRTERLKIRWHTSDNQKPVSRCSRQCQEGQVRRVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLAWGEPAVLLLLLLLSLALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPGQPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAMLVEVALCTWYLVAFPPEVVTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVRSQPGCYNRARGLTFAMLAYFITWVSFVPLLANVQVVLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCYLLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQNDGNTGNQGKHE(SEQ ID NO 4)實(shí)施例2-rT1R3和mT1R3用基于人T1R3序列的簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法從基因組DNA分離大鼠和小鼠T1R3基因區(qū)段。簡(jiǎn)并引物SAP077(5’-CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3’；SEQ ID NO 5)和SAP079(5’-CGNGCNCGRTTRTARCANCCNGG-3’；SEQ ID NO 6)分別與人T1R3殘基RFLAWGEPA(相應(yīng)于SEQ ID NO 7)和PGCYNRAR(相應(yīng)于SEQ ID NO 8)互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物克隆后被測(cè)序。SAV115質(zhì)粒攜帶小鼠T1R3基因的克隆區(qū)段，SAV118質(zhì)粒攜帶大鼠基因的克隆區(qū)段。下面顯示的這些序列，清楚地顯示出人T1R3在嚙齒類動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)部分，因?yàn)樾∈髤^(qū)段有74％與相應(yīng)的人T1R3區(qū)段相同，大鼠區(qū)段有80％與相應(yīng)的人T1R3區(qū)段相同。小鼠和大鼠區(qū)段有88％相同。其它數(shù)據(jù)庫(kù)序列與這些T1R3區(qū)段相比沒(méi)有超過(guò)40％相同。
感覺(jué)定位中的SAV115小鼠T1R3區(qū)段(與簡(jiǎn)并引物相關(guān)的序列已被去除)(SEQ ID NO 9)GTGCTGTCACTCCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGTCTAGCACTGGCTGCTCTGGGGCTCTCTGTCCACCACTGGGACAGCCCTCTTGTCCAGGCCTCAGGCGGCTCACAGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGGCCAAGCTCTGCCAGCTGCCTTGCACAACAACCAATGGCTCA CCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCTGAGACCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGCTGGGCAAACTGGCTATGCAGCTACCTTCGGGACTCTGGCCTGCTAGTGGTACTGTTGGCCACTTTTGTGGAGGCAGCACTATGTGCCTGGTATTTGACCGCTTCACCAGAAGTGGTGACAGACTGGTCAGTGCTGCCCACAGAGGTACTGGAGCACTGCCACGTGCGTTCCTGGGTCAACCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAATGGTAGCTTTTCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAAGACCAG(SEQ ID NO 9)mT1R3區(qū)段，概念性翻譯(SEQ ID NO 10)VLSLLLLLCLVLGLALAALGLSVHHWDSPLVQASGGSQFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPSSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAETFVESELPLSWANWLCSYLRDSGLLVVLLATFVEAALCAWYLTASPEVVTDWSVLPTEVLEHCHVRSWVNLGLVHITNAMVAFLCFLGTFLVQDQ(SEQ IDNO 10)感覺(jué)定位中的SAV118大鼠T1R3區(qū)段(與簡(jiǎn)并引物相應(yīng)的序列已被去除)(SEQ ID NO 11)GTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCA ATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGGCAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTTCCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGGGGTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAAAGCCAG(SEQ ID NO 11)
rT1R3區(qū)段，概念性翻譯(SEQ ID NO 12)VLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAALCAWYLMAFPPEVVTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAGVAFLCFLGTFLVQSQ(SEQ ID NO 12)實(shí)施例3-rT1R3的克隆上述鑒定為SEQ ID 9和11的mT1R3和rT1R3片段用于篩選大鼠味覺(jué)組織-衍生的cDNA文庫(kù)。一個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)含有全長(zhǎng)的下面SEQ ID NO 13所示的rT1R3序列。與mT1R3和rT1R3部分序列和全長(zhǎng)hT1R3序列比較后發(fā)現(xiàn)，該cDNA代表了hT1R3的大鼠對(duì)應(yīng)序列。例如rT1R3和hT1R3之間的氨基酸成對(duì)相同性大約是72％，然而公開DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中與rT1R3最相關(guān)的注釋序列只有大約33％的相同性。
rT1R3推測(cè)的cds(SEQ TD NO 13)ATGCCGGGTTTGGCTATCTTGGGCCTCAGTCTGGCTGCTTTCCTGGAGCTTGGGATGGGGTCCTCTTTGTGTCTGTCACAGCAATTCAAGGCACAAGGGGACTATATATTGGGTGGACTATTTCCCCTGGGCACAACTGAGGAGGCCACTCTCAACCAGAGAACACAGCCCAACGGCATCCTATGTACCAGGTTCTCGCCCCTTGGTTTGTTCCTGGCCATGGCTATGAAGATGGCTGTAGAGGAGATCAACAATGGATCTGCCTTGCTCCCTGGGCTGCGACTGGGCTATGACCTGTTTGACACATGCTCAGAGCCAGTGGTCACCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCATGGCCAAGGTGGGAAGTCAAAGCATTGCTGCCTACTGCAACTACACACAGTACCAACCCCGTGTGCTGGCTGTCATTGGTCCCCACTCATCAGAGCTTGCCCTCATTACAGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCACAGGTCAGCTATAGTGCCAGCATGGATCGGCTAAGTGACCGGGAAACATTTCCATCCTTCTTCCGCACAGTGCCCAGTGACCGGGTGCAGCTGCAGGCCGTTGTGACACTGTTGCAGAATTTCAGCTGGAACTGGGTGGCTGCCTTAGGTAGTGATGATGACTATGGCCGGGAAGGTCTGAGCATCTTTTCTGGTCTGGCCAACTCACGAGGTATCTGCATTGCACACGAGGGCCTGGTGCCACAACATGACACTAGTGGCCAACAATTGGGCAAGGTGGTGGATGTGCTACGCCAAGTGAACCAAAGCAAAGTACAGGTGGTGGTGCTGTTTGCATCTGCCCGTGCTGTCTACTCCCTTTTTAGCTACAGCATCCTTCATGACCTCTCACCCAAGGTATGGGTGGCCAGTGAGTCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGACACTTCCCAATATTGCCCGTGTGGGCACTGTTCTTGGGTTTCTGCAGCGCGGTGCCCTACTGCCTGAATTTTCCCATTATGTGGAGACTCGCCTTGCCCTAGCTGCTGACCCAACATTCTGTGCCTCCCTGAAAGCTGAGTTGGATCTGGAGGAGCGCGTGATGGGGCCACGCTGTTCACAATGTGACTACATCATGCTACAGAACCTGTCATCTGGGCTGATGCAGAACCTATCAGCTGGGCAGTTGCACCACCAAATATTTGCAACCTATGCAGCTGTGTACAGTGTGGCTCAGGCCCTTCACAACACCCTGCAGTGCAATGTCTCACATTGCCACACATCAGAGCCTGTTCAACCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAATATGAGTTTCCGTGCTCGAGACTT
GACACTGCAGTTTGATGCCAAAGGGAGTGTAGACATGGAATATGACCTGAAGATGTGGGTGTGGCAGAGCCCTACACCTGTACTACATACTGTAGGCACCTTCAACGGCACCCTTCAGCTGCAGCACTCGAAAATGTATTGGCCAGGCAACCAGGTGCCAGTCTCCCAGTGCTCCCGGCAGTGCAAAGATGGCCAGGTGCGCAGAGTAAAGGGCTTTCATTCCTGCTGCTATGACTGTGTGGACTGCAAGGCAGGGAGCTACCGGAAGCATCCAGATGACTTCACCTGTACTCCATGTGGCAAGGATCAGTGGTCCCCAGAAAAAAGCACAACCTGCTTACCTCGCAGGCCCAAGTTTCTGGCTTGGGGGGAGCCAGCTGTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGGCAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTTCCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGTGTTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAGAGCCAGCCTGGTCGCTATAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTCGCCATGCTAGCTTATTTCATCATCTGGGTCTCTTTTGTGCCCCTCCTGGCTAATGTGCAGGTGGCCTACCAGCCAGCTGTGCAGATGGGTGCTATCTTATTCTGTGCCCTGGGCATCCTGGCCACCTTCCACCTGCCCAAATGCTATGTACTTCTGTGGCTGCCAGAGCTCAACACCCAGGAGTTCTTCCTGGGAAGGAGCCCCAAGGAAGCATCAGATGGGAATAGTGGTAGTAGTGAGGCAACTCGGGGACACAGTGAATGA(SEQ ID NO 13)
rT1R3概念性翻譯(SEQ ID NO.14)MPGLAILGLSLAAFLELGMGSSLCLSQQFKAQGDYILGGLFPLGTTEEATLNQRTQPNGILCTRFSPLGLFLAMAMKMAVEEINNGSALLPGLRLGYDLFDTCSEPVVTMKPSLMFMAKVGSQSIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELALITGKFFSFFLMPQVSYSASMDRLSDRETFPSFFRTVPSDRVQLQAVVTLLQNFSWNWVAALGSDDDYGREGLSIFSGLANSRGICIAHEGLVPQHDTSGQQLGKVVDVLRQVNQSKVQVVVLFASARAVYSLFSYSILHDLSPKVWVASESWLTSDLVMTLPNIARVGTVLGFLQRGALLPEFSHYVETRLALAADPTFCASLKAELDLEERVMGPRCSQCDYIMLQNLSSGLMQNLSAGQLHHQIFATYAAVYSVAQALHNTLQCNVSHCHTSEPVQPWQLLENMYNMSFRARDLTLQFDAKGSVDMEYDLKMWVWQSPTPVLHTVGTFNGTLQLQHSKMYWPGNQVPVSQCSRQCKDGQVRRVKGFHSCCYDCVDCKAGSYRKHPDDFTCTPCGKDQWSPEKSTTCLPRRPKFLAWGEPAVLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAALCAWYLMAFPPEWTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAVLAFLCFLGTFLVQSQPGRYNRARGLTFAMLAYFIIWVSFVPLLANVQVAYQPAVQMGAILFCALGILATFHLPKCYVLLWLPELNTQEFFLGRSPKEASDGNSGSSEATRGHSE(SEQ ID NO 14)實(shí)施例4-mT1R3表達(dá)如上所述的、SAV115包含的小鼠T1R3片段用M13正向和M13反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用凝膠純化。T1R3DNA模板放置到一個(gè)體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反應(yīng)體系，其中地高辛標(biāo)記的UTP摻入到反義cRNA探針上。該探針與包含輪廓乳頭的成年小鼠味覺(jué)組織雜交。T1R3原位雜交和檢測(cè)按照Schaeren-Wiemers等，Histochemistry，100431-400(1993)的方案進(jìn)行。簡(jiǎn)單來(lái)講，將新鮮冰凍小鼠舌切成14μm并準(zhǔn)備雜交。200ng/mL的反義地高辛T1R3探針在72℃雜交14小時(shí)。后雜交過(guò)程包括72℃，0.2×SSC漂洗。通過(guò)與1∶5000稀釋的抗-DIG堿性磷酸酶抗體孵育，然后在NBT/BCIP中與磷酸酶反應(yīng)12小時(shí)，進(jìn)行地高辛檢測(cè)試驗(yàn)。圖1顯示T1R3基因在小鼠輪廓乳頭的味蕾中的表達(dá)。
實(shí)施例5-hT1R1提供的對(duì)應(yīng)大鼠味覺(jué)受體rT1R1的人的直向進(jìn)化同源物(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AL159177)為下列的SEQ ID N015。推測(cè)的cds用粗體顯示，一些內(nèi)含子序列間隔用一長(zhǎng)串N表示。核苷酸和概念性翻譯的hT1R1此處分別描述為SEQ ID NO 16和17。
hT1R1基因組DNA(SEQID NO 15)GAGAATCTCGCGAGATCCCGTCGGTCCGCCCCGCTGCCCTCCCAGCTGCCGAAAAGAGGGGCCTCCGAGCCGCCGGCGCCCTCTGCCGGCAACCTCCGGAAGCACACTAGGAGGTTCCAGCCGATCTGGTCGAGGGGCTCCACGGAGGACTCCATTTACGTTACGCAAATTCCCTACCCCAGCCGGCCGGAGAGAGAAAGCCAGAAACCTCGCGACCAGCCATGGGCCACCTCTCCGGAAAAACACCGGGATATTTTTTTTCTCCTGCAGAAAAAGCTTTAGGATTGGCAGTTTAAACAAAACATGTCTATTTGCATACCTTCGGTTTGCATGCATTTGTTTCGAAGTGAGCAACCCTGGGTAACAAGGCGAAAGTATATGACAATTTGCTCAGAATCTTAATGTCAGAAAACTGGAGACTGGGGCAGGGGGGTGTCGACTCAAAGCTGTGTCTCATTTAGTAAACTGAGGCCCAGGTAAAAAGTTCTGAAACCTCGCAACACCCGGAGAAATTGTGTTCCAGCCTCCCACCTCGCCCCAAAATGCCAGAGCTCCTTTTCTAAGCCAGGTGAAGTCACAGAGCGTGGACAGAACCCACAACCGTCCAGAGGAAGGGTCACTGGGTGCCACCTGGTTTGCATCTGTGCCTTCGTCCTGCCCAGTTCCTGAGTGGGACCGCAGGCCCGGAATGTCAAGGCAAACAGTCCTGCTTCAGCCACTGGGCTCCAGTCCCACCCTTTTGGGGGCCTGAAGTTAGGAAGCATCCGGCAGCTGCCTTCTATTTAAGCAACTGGCCTCCTTAGAGGCCACTCCTTGGCCATGCCAGGCGCGGGCATCTGGCCAGCATGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGGCCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGAGGTGACCCTGTGTGACAGGTGAGTGAGGGGCCAGCAGAGCCACACTTAGTGGGACCCCTGGCTATAGGGCCCCTCTGGCTGCCATCCTCCAAACAGGACCTTGCCTCTGCCTTTGCCCCTTGAACTGTCCCCAGGCCTTGTTCATCAATCCACTTGCCACCTAAGTGCTGGCTAGACCTTCCTAGACACTTCGGCCAGTTTCCAATTATTTCACCCTTGCTGTTAGAATGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATTCCTTAAACTAAATTTCTCACTTTCTCTCTCTCTCTGGAAAACACTGACTAATGTAGCAGGTTTCTCTGCTCCAGGACTTC
AGGACCTTTTCGATGCTAATAAGTTTCTCCATCAGGGCCAGCTTGTTCCTCCTACTGAGCTTGAGAGCCCTTGTTGAAGTTGTGGTTTGGGGGACTGGACCGATGACCTCAAAGGTTCCCTTTGCTCCCAAGCCTCAGAGTCTAGGAGGCCAGAGGGTCTCAGCAGGCCTTTGTCCTTCTCAGCTGTCTCTTACTGGCTTTCTCCACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCCCATGGTAAGCTGGAGCCTCAGACCTTTGCCCATCTCCCTTCAGGCAAGTCTGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCCACCATGCCCGGCTAATTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGCTGGTCGCAAACTCCTAACCTCGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAATGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACTGCACCCGGCCATAATGTATTAATATAATAAAATAATTATACAACTCACCATAATGTAGAATCAGTGGGAGCCTGAGCTTGTTTTCCTACAACTAGATGGTCCCATCTGGGGGTGATGGGAGACAGTGACAGATCATCAGACATTAGATTCTCATAAGTAGCGTGCAACCCAGATCCCTCGCATGTGCAGTTCACAGTAGGGTTCAAGCTCCTACAAGAATCTGATGCTGCTGCTGATCTGACAGGAGGGGAGCAGCTGTAAATACAGATGAAGCTTCGCTTACTCACCAGCTGCTCACCTCCTCCTGTGAGGCCCGGTTCCTAACAGGCCACTGACCTAACTTCTGCCCTGACCTACACATGCTTCTCTTCTTCCTTGCAAACTGCCTCCAGTGGAAGTCCCTGAAGGTCCCCAAACACACGGGACTATTTCACTCCTATGCAGGTTTTGTCTCCTTTGCTTGGAATGCATCCCCTCACCCCTTGTCCCCAGGCAGATTCCCACCCCTCCCCCAGAACCTGCCCCAGTGGAGCCTTCGCAGGTGATTTGTCAGTTTCACAGGCTGAGGGGTGCTCTCCTGGTCTCCCCGGCTCCCTGTATCCCCACACCCAGCACAGGGCCAGGCACTGGGGGGGCCTTCAGTGGAGACTGAAATGGCTGAACGGGACCTCCCATAGATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCCCAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCAGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTCCACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGGTAAGAGAGCCCACCCCAGCACCTCCTGTCAGGGAGAACAGCCAATCCTGAGATGAGCAGAGTGGGCACTCTCCGGTCACTCTAAATGCCAAGGGGGATAAATGCCAC
TAACTTGAGGTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTGAGACAGTCTGGCTCTGTCACCCAGGCTGCAGTGTAGTGATGCGATCTCGGCTCTCTGCAACTTCCACCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCTTGCCTCGGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCACCCACCACCATGCCTGGATAATTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTGAGATAGAGTCTCGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAATGCAGTGGTGCGATCTTGGCTCACTGTGAGCTCCGCCTCCCAGGTTCACTCCATTCCCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGGTGGGACTACGGGCGCCCGCCACCACGCCCAGCTAATTTTTTTTGTATTTTGAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTAGCCAGGATGGTCTCAATCTCCTGACCTTGTCATCCGCCCACCTCGTCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGCACCCGGCCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGGCATCAAGTGATCCTCCTGCTTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATTAGCTCTCTTCTCTTAGACAGATCTTTCTCTCTGATCCTTGCCTTCTCTCACCCACTGTGTCTTGGAAGTGTCAAGTGATAAGATCCAGGGCTAAAACTGTCTGTAAAGGAGTGTTTGTTAGAGGCCTCCTCTCAGGAGGTTGGTGGGGAAGATTGAGGGGCTTCCTAAGAAGGAAGGGACGAGACCTTCCTGATGGGCTGAAACCACCAGGACGGAAACCCAGGAAGGCCCCAGGCCCTTGCTTCTGGGACCATGTGGGTCTGTGCTGTCTGTGGTGGCTTCATGATACGCGTTTCTTTCAGCTTTTGGAGCAGATCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCACGGAAAGGACAACCAGGTAATGGGGATGTGGCTACTCACCATGTAACTGGCTTATGGGCAACCTAGAGCCTGGGGGTGATGCTGACACAGTGTACAGGGAGCAGGAGGGGGGCCCCAGGGGTCCAGCTGCCACCACTCTACCCATCCTGGCCAGGGAAGCAGGGAAGACACTCCGTAGGCGAGTGTGCAGATGCCCTGGGGCGGAAGTTCACACGACCAGGGGCCCTGCCCTGGGAGTGAGCCCTGAGGGCAGATGCACAGAGATTCTGTTTTCTGTTCCACATGTGAGCTGTCCTTTGACTTGGGCCCCTACGTGTGGCCCCTCTGGCTTCTTACAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACCTTCCTCAACAAGAGTGGTGAGTGGGCAATGGAGCAGGCGAGCTACCCAGCACTCCCGGGGGCTGCACGGTGGAGGGAGGGCCTCCCTTGGGCCCCATGTGCCCTGCCCCAGAACCAAGGCCCAGTCACTGGGCTGCCAGTTAGCTTCAGGTTGGAGGACACCTGCTACCAGACAGAATTCTGATCAAGAGAATCAGCCACTGGGTGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCGGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACCAAAAATATAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATGCATTCCAGCCTGGACCACAAAGCGAGAATTCGTCCCCCCAAAAAAAGAAAGGAGGCCGGGCGCGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAAAAGTTAGCCGGGCGTTGTGGCGTGTGCCTGTAATTCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATTGCACCATTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGAAAAACTCTGTCTCAAAAAAAAAGAAAGAAAGAA
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hT1R1推測(cè)的cds(SEQ ID NO 16)ATGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGGCCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGAGGTGACCCTGTGTGACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCCCATGATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCCCAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCAGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTCCACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGATCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCACGGAAAGGACAACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACCTTCCTCAACAAGAGTGACCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGGAAAGAAGAGTGGGCACCTGAGGGAAGCCAGACCTGCTTCCCGCGCACTGTGGTGTTTTTGGCTTTGCGTGAGCACACCTCTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGTGCTTTCTTATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGGAACCCACAAGGCCTGCGTGCTTGCTACGCCAGGCCCTCTTTGCCCTTGGTTTCACCATCTTCCTGTCCTGCCTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCAAGGTACCTACATTCTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGATCAGCTCAGCGGCCCAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGCCTGCTAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACTCCCTGGGCTTCATACTGGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCTGCAGCTACCTGGGTAAGGACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCTTCAACTTCG
TGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACGGCAAGTACCTGCCTGCGGCCAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCGGTGGGTATTTTCTGCCTAAGTGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAGAGCACTTCCAGGCCTCCATTCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGA(SEQ TD NO 16)hT1R1概念性翻譯(SEQ ID NO 17)MLLCTARLVGLQLLISCCWAFACHSTESSPDFTLPGDYLLAGLFPLHSGCLQVRHRPEVTLCDRSCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNITLGYQLYDVCSDSANVYATLRVLSLPGQHHIELQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVPMISYAASSETLSVKRQYPSFLRTIPNDKYQVETMVLLLQKFGWTWISLVGSSDDYGQLGVQALENQATGQGICIAFKDIMPFSAQVGDERMQCLMRHLAQAGATVVVVFSSRQLARVFFESVVLTNLTGKVWVASEAWALSRHITGVPGIQRIGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKKAPRPCHKGSWCSSNQLCRECQAFMAHTMPKLKAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASGACSRGRVYPWQLLEQIHKVHFLLHKDTVAFNDNRDPLSSYNIIAWDWNGPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQWHGKDNQVPKSVCSSDCLEGHQRVVTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSDLYRCQPCGKEEWAPEGSQTCFPRTVVFLALREHTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPVVRSAGGRLCFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPTRPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLIIIFKFSTKVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLICLTWLVVWTPLPAREYQRFPHLVMLECTETNSLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENYNEAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYDGKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDLNSTEHFQASIQDYTRRCGST(SEQ ID NO 17)雖然前面詳盡的敘述已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，但必需認(rèn)識(shí)到以上的描述只是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而不是限定。本發(fā)明僅由下面的權(quán)利要求來(lái)限定。
序列表<110>SENOMYX，INC.
<120>T1R味覺(jué)受體及其編碼基因<130>078003-0128439<140>PCT/US01/07265<141>2001-03-07<150>60/187,546<151>2000-03-07<150>60/195,536<151>2000-04-07<150>60/209,840<151>2000-06-06<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>876<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1agcctggcag tggcctcagg cagagtctga cgcgcacaaa ctttcaggcc caggaagcga 60ggacaccact ggggccccag ggtgtggcaa gtgaggatgg caagggtttt gctaaacaaa 120tcctctgccc gctccccgcc ccgggctcac tccatgtgag gccccagtcg gggcagccac 180ctgccgtgcc tgttggaagt tgcctctgcc atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc 240ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg 300atgaaggggg actacgtgct gggggggctg ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc 360ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct gtgtgcacca ggtacagagg tgggacggcc 420tgggtcgggg tcagggtgac caggtctggg gtgctcctga gctggggccg aggtggccat 480ctgcggttct gtgtggcccc aggttctcct caaacggcct gctctgggca ctggccatga 540aaatggccgt ggaggagatc aacaacaagt cggatctgct gcccgggctg cgcctgggct 600acgacctctt tgatacgtgc tcggagcctg tggtggccat gaagcccagc ctcatgttcc 660tggccaaggc aggcagccgc gacatcgccg cctactgcaa ctacacgcag taccagcccc 720gtgtgctggc tgtcatcggg ccccactcgt cagagctcgc catggtcacc ggcaagttct 780tcagcttctt cctcatgccc cagtggggcg ccccccacca tcacccaccc ccaaccaacc 840cctgccccgt gggagcccct tgtgtcagga gaatgc 876<210>2<211>2687<212>DNA<213>人<400>2tacatgcacc ccacccagcc ctgccctggg agccctgtgt cagaagatgc tcttggcctt 60gcaggtcagc tacggtgcta gcatggagct gctgagcgcc cgggagacct tcccctcctt 120cttccgcacc gtgcccagcg accgtgtgca gctgacggcc gccgcggagc tgctgcagga 180gttcggctgg aactgggtgg ccgccctggg cagcgacgac gagtacggcc ggcagggcct 240gagcatcttc tcggccctgg ccgcggcacg cggcatctgc atcgcgcacg agggcctggt 300
gccgctgccc cgtgccgatg actcgcggct ggggaaggtg caggacgtcc tgcaccaggt 360gaaccagagc agcgtgcagg tggtgctgct gttcgcctcc gtgcacgccg cccacgccct 420cttcaactac agcatcagca gcaggctctc gcccaaggtg tgggtggcca gcgaggcctg 480gctgacctct gacctggtca tggggctgcc cggcatggcc cagatgggca cggtgcttgg 540cttcctccag aggggtgccc agctgcacga gttcccccag tacgtgaaga cgcacctggc 600cctggccacc gacccggcct tctgctctgc cctgggcgag agggagcagg gtctggagga 660ggacgtggtg ggccagcgct gcccgcagtg tgactgcatc acgctgcaga acgtgagcgc 720agggctaaat caccaccaga cgttctctgt ctacgcagct gtgtatagcg tggcccaggc 780cctgcacaac actcttcagt gcaacgcctc aggctgcccc gcgcaggacc ccgtgaagcc 840ctggcaggtg agcccgggag atgggggtgt gctgtcctct gcatgtgccc aggccaccag 900gcacggccac cacgcctgag ctggaggtgg ctggcggctc agccccgtcc cccgcccgca 960gctcctggag aacatgtaca acctgacctt ccacgtgggc gggctgccgc tgcggttcga 1020cagcagcgga aacgtggaca tggagtacga cctgaagctg tgggtgtggc agggctcagt 1080gcccaggctc cacgacgtgg gcaggttcaa cggcagcctc aggacagagc gcctgaagat 1140ccgctggcac acgtctgaca accaggtgag gtgagggtgg gtgtgccagg cgtgcccgtg 1200gtagcccccg cggcagggcg cagcctgggg gtgggggccg ttccagtctc ccgtgggcat 1260gcccagccga gcagagccag accccaggcc tgtgcgcaga agcccgtgtc ccggtgctcg 1320cggcagtgcc aggagggcca ggtgcgccgg gtcaaggggt tccactcctg ctgctacgac 1380tgtgtggact gcgaggcggg cagctaccgg caaaacccag gtgagccgcc ttcccggcag 1440gcgggggtgg gaacgcagca ggggagggtc ctgccaagtc ctgactctga gaccagagcc 1500cacagggtac aagacgaaca cccagcgccc ttctcctctc tcacagacga catcgcctgc 1560accttttgtg gccaggatga gtggtccccg gagcgaagca cacgctgctt ccgccgcagg 1620tctcggttcc tggcatgggg cgagccggct gtgctgctgc tgctcctgct gctgagcctg 1680gcgctgggcc ttgtgctggc tgctttgggg ctgttcgttc accatcggga cagcccactg 1740gttcaggcct cgggggggcc cctggcctgc tttggcctgg tgtgcctggg cctggtctgc 1800ctcagcgtcc tcctgttccc tggccagccc agccctgccc gatgcctggc ccagcagccc 1860ttgtcccacc tcccgctcac gggctgcctg agcacactct tcctgcaggc ggccgagatc 1920ttcgtggagt cagaactgcc tctgagctgg gcagaccggc tgagtggctg cctgcggggg 1980ccctgggcct ggctggtggt gctgctggcc atgctggtgg aggtcgcact gtgcacctgg 2040tacctggtgg ccttcccgcc ggaggtggtg acggactggc acatgctgcc cacggaggcg 2100ctggtgcact gccgcacacg ctcctgggtc agcttcggcc tagcgcacgc caccaatgcc 2160acgctggcct ttctctgctt cctgggcact ttcctggtgc ggagccagcc gggctgctac 2220aaccgtgccc gtggcctcac ctttgccatg ctggcctact tcatcacctg ggtctccttt 2280gtgcccctcc tggccaatgt gcaggtggtc ctcaggcccg ccgtgcagat gggcgccctc 2340ctgctctgtg tcctgggcat cctggctgcc ttccacctgc ccaggtgtta cctgctcatg 2400cggcagccag ggctcaacac ccccgagttc ttcctgggag ggggccctgg ggatgcccaa 2460ggccagaatg acgggaacac aggaaatcag gggaaacatg agtgacccaa ccctgtgatc 2520tcagccccgg tgaacccaga cttagctgcg atccccccca agccagcaat gacccgtgtc 2580tcgctacaga gaccctcccg ctctaggttc tgaccccagg ttgtctcctg accctgaccc 2640cacagtgagc cctaggcctg gagcacgtgg acacccctgt gaccatc 2687<210>3<211>2553<212>DNA<213>人<400>3atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg 60gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg atgaaggggg actacgtgct gggggggctg 120ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct 180gtgtgcacca ggttctcctc aaacggcctg ctctgggcac tggccatgaa aatggccgtg 240gaggagatca acaacaagtc ggatctgctg cccgggctgc gcctgggcta cgacctcttt 300gatacgtgct cggagcctgt ggtggccatg aagcccagcc tcatgttcct ggccaaggca 360ggcagccgcg acatcgccgc ctactgcaac tacacgcagt accagccccg tgtgctggct 420gtcatcgggc cccactcgtc agagctcgcc atggtcaccg gcaagttctt cagcttcttc 480ctcatgcccc actacggtgc tagcatggag ctgctgagcg cccgggagac cttcccctcc 540ttcttccgca ccgtgcccag cgaccgtgtg cagctgacgg ccgccgcgga gctgctgcag 600
gagttcggct ggaactgggt ggccgccctg ggcagcgacg acgagtacgg ccggcagggc 660ctgagcatct tctcggccct ggccgcggca cgcggcatct gcatcgcgca cgagggcctg 720gtgccgctgc cccgtgccga tgactcgcgg ctggggaagg tgcaggacgt cctgcaccag 780gtgaaccaga gcagcgtgca ggtggtgctg ctgttcgcct ccgtgcacgc cgcccacgcc 840ctcttcaact acagcatcag cagcaggctc tcgcccaagg tgtgggtggc cagcgaggcc 900tggctgacct ctgacctggt catggggctg cccggcatgg cccagatggg cacggtgctt 960ggcttcctcc agaggggtgc ccagctgcac gagttccccc agtacgtgaa gacgcacctg 1020gccctggcca ccgacccggc cttctgctct gccctgggcg agagggagca gggtctggag 1080gaggacgtgg tgggccagcg ctgcccgcag tgtgactgca tcacgctgca gaacgtgagc 1140gcagggctaa atcaccacca gacgttctct gtctacgcag ctgtgtatag cgtggcccag 1200gccctgcaca acactcttca gtgcaacgcc tcaggctgcc ccgcgcagga ccccgtgaag 1260ccctggcagc tcctggagaa catgtacaac ctgaccttcc acgtgggcgg gctgccgctg 1320cggttcgaca gcagcggaaa cgtggacatg gagtacgacc tgaagctgtg ggtgtggcag 1380ggctcagtgc ccaggctcca cgacgtgggc aggttcaacg gcagcctcag gacagagcgc 1440ctgaagatcc gctggcacac gtctgacaac cagaagcccg tgtcccggtg ctcgcggcag 1500tgccaggagg gccaggtgcg ccgggtcaag gggttccact cctgctgcta cgactgtgtg 1560gactgcgagg cgggcagcta ccggcaaaac ccagacgaca tcgcctgcac cttttgtggc 1620caggatgagt ggtccccgga gcgaagcaca cgctgcttcc gccgcaggtc tcggttcctg 1680gcatggggcg agccggctgt gctgctgctg ctcctgctgc tgagcctggc gctgggcctt 1740gtgctggctg ctttggggct gttcgttcac catcgggaca gcccactggt tcaggcctcg 1800ggggggcccc tggcctgctt tggcctggtg tgcctgggcc tggtctgcct cagcgtcctc 1860ctgttccctg gccagcccag ccctgcccga tgcctggccc agcagccctt gtcccacctc 1920ccgctcacgg gctgcctgag cacactcttc ctgcaggcgg ccgagatctt cgtggagtca 1980gaactgcctc tgagctgggc agaccggctg agtggctgcc tgcgggggcc ctgggcctgg 2040ctggtggtgc tgctggccat gctggtggag gtcgcactgt gcacctggta cctggtggcc 2100ttcccgccgg aggtggtgac ggactggcac atgctgccca cggaggcgct ggtgcactgc 2160cgcacacgct cctgggtcag cttcggccta gcgcacgcca ccaatgccac gctggccttt 2220ctctgcttcc tgggcacttt cctggtgcgg agccagccgg gctgctacaa ccgtgcccgt 2280ggcctcacct ttgccatgct ggcctacttc atcacctggg tctcctttgt gcccctcctg 2340gccaatgtgc aggtggtcct caggcccgcc gtgcagatgg gcgccctcct gctctgtgtc 2400ctgggcatcc tggctgcctt ccacctgccc aggtgttacc tgctcatgcg gcagccaggg 2460ctcaacaccc ccgagttctt cctgggaggg ggccctgggg atgcccaagg ccagaatgac 2520gggaacacag gaaatcaggg gaaacatgag tga 2553<210>4<211>850<212>PRT<213>人<400>4Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His1 5 10 15Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys20 25 30Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95
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<221>修飾的堿基<222>(1951)..(2000)<223>a，t，c或g<400>15gagaatctcg cgagatcccg tcggtccgcc ccgctgccct cccagctgcc gaaaagaggg 60gcctccgagc cgccggcgcc ctctgccggc aacctccgga agcacactag gaggttccag 120ccgatctggt cgaggggctc cacggaggac tccatttacg ttacgcaaat tccctacccc 180agccggccgg agagagaaag ccagaaacct cgcgaccagc catgggccac ctctccggaa 240aaacaccggg atattttttt tctcctgcag aaaaagcttt aggattggca gtttaaacaa 300aacatgtcta tttgcatacc ttcggtttgc atgcatttgt ttcgaagtga gcaaccctgg 360gtaacaaggc gaaagtatat gacaatttgc tcagaatctt aatgtcagaa aactggagac 420tggggcaggg gggtgtcgac tcaaagctgt gtctcattta gtaaactgag gcccaggtaa 480aaagttctga aacctcgcaa cacccggaga aattgtgttc cagcctccca cctcgcccca 540aaatgccaga gctccttttc taagccaggt gaagtcacag agcgtggaca gaacccacaa 600ccgtccagag gaagggtcac tgggtgccac ctggtttgca tctgtgcctt cgtcctgccc 660agttcctgag tgggaccgca ggcccggaat gtcaaggcaa acagtcctgc ttcagccact 720gggctccagt cccacccctt ttgggggcct gaagttagga agcatccggc agctgccttc 780tatttaagca actggcctcc ttagaggcca ctccttggcc atgccaggcg cgggcatctg 840gccagcatgc tgctctgcac ggctcgcctg gtcggcctgc agcttctcat ttcctgctgc 900tgggcctttg cctgccatag cacggagtct tctcctgact tcaccctccc cggagattac 960ctcctggcag gcctgttccc tctccattct ggctgtctgc aggtgaggca cagacccgag 1020gtgaccctgt gtgacaggtg agtgaggggc cagcagagcc acacttagtg ggacccctgg 1080ctatagggcc cctctggctg ccatcctcca aacaggacct tgcctctgcc tttgcccctt 1140gaactgtccc caggccttgt tcatcaatcc acttgccacc taagtgctgg ctagaccttc 1200ctagacactt cggccagttt ccaattattt cacccttgct gttagaatgt nnnnnnnnnn 1260nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aattccttaa actaaatttc 1320tcactttctc tctctctctg gaaaacactg actaatgtag caggtttctc tgctccagga 1380cttcaggacc ttttcgatgc taataagttt ctccatcagg gccagcttgt tcctcctact 1440gagcttgaga gcccttgttg aagttgtggt ttgggggact ggaccgatga cctcaaaggt 1500tccctttgct cccaagcctc agagtctagg aggccagagg gtctcagcag gcctttgtcc 1560ttctcagctg tctcttactg gctttctcca caggtcttgt agcttcaatg agcatggcta 1620ccacctcttc caggctatgc ggcttggggt tgaggagata aacaactcca cggccctgct 1680gcccaacatc accctggggt accagctgta tgatgtgtgt tctgactctg ccaatgtgta 1740tgccacgctg agagtgctct ccctgccagg gcaacaccac atagagctcc aaggagacct 1800tctccactat tcccctacgg tgctggcagt gattgggcct gacagcacca accgtgctgc 1860caccacagcc gccctgctga gccctttcct ggtgcccatg gtaagctgga gcctcagacc 1920tttgcccatc tcccttcagg caagtctggg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1980nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gccaccatgc ccggctaatt tttttgtatt tttagtagag 2040acggggtttc accgtgttag ccaggctggt cgcaaactcc taacctcgtg atccacccac 2100ctcggcctcc caatgtgctg ggattacagg tgtgagccac tgcacccggc cataatgtat 2160taatataata aaataattat acaactcacc ataatgtaga atcagtggga gccctgagct 2220tgttttccta caactagatg gtcccatctg ggggtgatgg gagacagtga cagatcatca 2280gacattagat tctcataagt agcgtgcaac ccagatccct cgcatgtgca gttcacagta 2340gggttcaagc tcctacaaga atctgatgct gctgctgatc tgacaggagg ggagcagctg 2400taaatacaga tgaagcttcg cttactcacc agctgctcac ctcctcctgt gaggcccggt 2460tcctaacagg ccactgacct aacttctgcc ctgacctaca catgcttctc ttcttccttg 2520caaactgcct ccagtggaag tccctgaagg tccccaaaca cacgggacta tttcactcct 2580atgcaggttt tgtctccttt gcttggaatg catcccctca ccccttgtcc ccaggcagat 2640tcccacccct cccccagaac ctgccccagt ggagccttcg caggtgattt gtcagtttca 2700
caggctgagg ggtgctctcc tggtctcccc ggctccctgt atccccacac ccagcacagg 2760gccaggcact gggggggcct tcagtggaga ctgaaatggc tgaacgggac ctcccataga 2820ttagctatgc ggccagcagc gagacgctca gcgtgaagcg gcagtatccc tctttcctgc 2880gcaccatccc caatgacaag taccaggtgg agaccatggt gctgctgctg cagaagttcg 2940ggtggacctg gatctctctg gttggcagca gtgacgacta tgggcagcta ggggtgcagg 3000cactggagaa ccaggccact ggtcagggga tctgcattgc tttcaaggac atcatgccct 3060tctctgccca ggtgggcgat gagaggatgc agtgcctcat gcgccacctg gcccaggccg 3120gggccaccgt cgtggttgtt ttttccagcc ggcagttggc cagggtgttt ttcgagtccg 3180tggtgctgac caacctgact ggcaaggtgt gggtcgcctc agaagcctgg gccctctcca 3240ggcacatcac tggggtgccc gggatccagc gcattgggat ggtgctgggc gtggccatcc 3300agaagagggc tgtccctggc ctgaaggcgt ttgaagaagc ctatgcccgg gcagacaaga 3360aggcccctag gccttgccac aagggctcct ggtgcagcag caatcagctc tgcagagaat 3420gccaagcttt catggcacac acgatgccca agctcaaagc cttctccatg agttctgcct 3480acaacgcata ccgggctgtg tatgcggtgg cccatggcct ccaccagctc ctgggctgtg 3540cctctggagc ttgttccagg ggccgagtct acccctggca ggtaagagag cccaccccag 3600cacctcctgt cagggagaac agccaatcct gagatgagca gagtgggcac tctccggtca 3660ctctaaatgc caagggggat aaatgccact aacttgaggt tttttgtttt gttttgtttt 3720gttttttgag acagtctggc tctgtcaccc aggctgcagt gtagtgatgc gatctcggct 3780ctctgcaact tccacctcct gggttcaagt gattctcttg cctcggcctc ctgagtagct 3840gggattacag gcacccacca ccatgcctgg ataatttttc ttttcttttt tttttttttg 3900agatagagtc tcgctctgtt gcccaggctg gaatgcagtg gtgcgatctt ggctcactgt 3960gagctccgcc tcccaggttc actccattcc cctgcctcag cctcccaagt aggtgggact 4020acgggcgccc gccaccacgc ccagctaatt ttttttgtat tttgagtaga gacggggttt 4080caccatgtta gccaggatgg tctcaatctc ctgaccttgt catccgccca cctcgtcctc 4140ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccgcacccgg cctaattttt gtatttttag 4200tagagatggg gtttcaccat gttggccagg ctggtctcga actcctggca tcaagtgatc 4260ctcctgcttc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat tagctctctt ctcttagaca 4320gatctttctc tctgatcctt gccttctctc acccactgtg tcttggaagt gtcaagtgat 4380aagatccagg gctaaaactg tctgtaaagg agtgtttgtt agaggcctcc tctcaggagg 4440ttggtgggga agattgaggg gcttcctaag aaggaaggga cgagaccttc ctgatgggct 4500gaaaccacca ggacggaaac ccaggaaggc cccaggccct tgcttctggg accatgtggg 4560tctgtgctgt ctgtggtggc ttcatgatac gcgtttcttt cagcttttgg agcagatcca 4620caaggtgcat ttccttctac acaaggacac tgtggcgttt aatgacaaca gagatcccct 4680cagtagctat aacataattg cctgggactg gaatggaccc aagtggacct tcacggtcct 4740cggttcctcc acatggtctc cagttcagct aaacataaat gagaccaaaa tccagtggca 4800cggaaaggac aaccaggtaa tggggatgtg gctactcacc atgtaactgg cttatgggca 4860acctagagcc tgggggtgat gctgacacag tgtacaggga gcaggagggg ggccccaggg 4920gtccagctgc caccactcta cccatcctgg ccagggaagc agggaagaca ctccgtaggc 4980gagtgtgcag atgccctggg gcggaagttc acacgaccag gggccctgcc ctgggagtga 5040gccctgaggg cagatgcaca gagattctgt tttctgttcc acatgtgagc tgtcctttga 5100cttgggcccc tacgtgtggc ccctctggct tcttacaggt gcctaagtct gtgtgttcca 5160gcgactgtct tgaagggcac cagcgagtgg ttacgggttt ccatcactgc tgctttgagt 5220gtgtgccctg tggggctggg accttcctca acaagagtgg tgagtgggca atggagcagg 5280cgagctaccc agcactcccg ggggctgcac ggtggaggga gggcctccct tgggccccat 5340gtgccctgcc ccagaaccaa ggcccagtca ctgggctgcc agttagcttc aggttggagg 5400acacctgcta ccagacagaa ttctgatcaa gagaatcagc cactgggtgc ggtggctcat 5460gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcgggtgga tcacttgagg tcgggagttc 5520gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc catctctacc aaaaatataa aaaattagct 5580gggtgtggtg gcgcgtgcct gtaatcccag ctactcggga ggctgaggca ggagaatcac 5640ttgaacccag gaggcggagg ttgcagtgag ccaagatgca ttccagcctg gaccacaaag 5700cgagaattcg tccccccaaa aaaagaaagg aggccgggcg cggtggctca cacctgtaat 5760cccagcactt tgggaggccg aggtgggtgg atcacctgag gtcaggagtt cgagaccagc 5820ctgaccaaca tggtgaaacc ccatctctac taaaaataca aaaaaagtta gccgggcgtt 5880gtggcgtgtg cctgtaattc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat tgcttgaacc 5940cgggaggcgg aggttgcagt gagccaagat tgcaccattg cactccagcc tgggcgacaa 6000gagaaaaact ctgtctcaaa aaaaaagaaa gaaagaaaga attagccaac tgaaagcctt 6060agactgaggt gtgtcctctg ttagagagct gtcatcacaa ctcctacaaa agcagtcgta 6120tcctgaattc aacctctttc tctaaatgaa tatagctatt gttccctttg tgccctcttg 6180
tcctactgtc ccttctgttg cccatgccaa agacagctag ctccttgaac agcttggcct 6240gaatacagat actagcgtgt ctgcagcaga gaaaaaaaca gcattcccca tccagaaatg 6300caaggtcaag aacagagagc aaattaggta gctaaggact caggtcctta gttggtgtcc 6360aggggccaca ttctttcctt tcaccatctc tgtagggaca ggaatacttc ccttctgtcc 6420tcagagggtc aggactcaga gaaaccacag agcagcagct caggaaagtg gttcatggaa 6480atgctggcaa gagagagggg ttacaatgcc ctcccttggg agcaggctgc tcccatcaga 6540tcgtaacctc tctggtatgt gggcagagct accaggttaa ggtcctccct agggtttgca 6600aaaccctcat gggatcatga gccatacaga accgacctgt gtgtctccag agtctgtaat 6660taacacaggc attttgagga aatgcgtggc ctcaggcccc actcccggct acccccatcc 6720cactatgcct agtatagtct agctgccctg gtacaattct cccagtatct tgcaggcccc 6780tatttcctat tcctactctg ctcatctggc tctcaggaac cttcttggcc ttccctttca 6840gacctctaca gatgccagcc ttgtgggaaa gaagagtggg cacctgaggg aagccagacc 6900tgcttcccgc gcactgtggt gtttttggct ttgcgtgagc acacctcttg ggtgctgctg 6960gcagctaaca cgctgctgct gctgctgctg cttgggactg ctggcctgtt tgcctggcac 7020ctagacaccc ctgtggtgag gtcagcaggg ggccgcctgt gctttcttat gctgggctcc 7080ctggcagcag gtagtggcag cctctatggc ttctttgggg aacccacaag gcctgcgtgc 7140ttgctacgcc aggccctctt tgcccttggt ttcaccatct tcctgtcctg cctgacagtt 7200cgctcattcc aactaatcat catcttcaag ttttccacca aggtacctac attctaccac 7260gcctgggtcc aaaaccacgg tgctggcctg tttgtgatga tcagctcagc ggcccagctg 7320cttatctgtc taacttggct ggtggtgtgg accccactgc ctgctaggga ataccagcgc 7380ttcccccatc tggtgatgct tgagtgcaca gagaccaact ccctgggctt catactggcc 7440ttcctctaca atggcctcct ctccatcagt gcctttgcct gcagctacct gggtaaggac 7500ttgccagaga actacaacga ggccaaatgt gtcaccttca gcctgctctt caacttcgtg 7560tcctggatcg ccttcttcac cacggccagc gtctacgacg gcaagtacct gcctgcggcc 7620aacatgatgg ctgggctgag cagcctgagc agcggcttcg gtgggtattt tctgcctaag 7680tgctacgtga tcctctgccg cccagacctc aacagcacag agcacttcca ggcctccatt 7740caggactaca cgaggcgctg cggctccacc tgaccagtgg gtcagcaggc acggctggca 7800gccttctctg ccctgagggt cgaaggtcga gcaggccggg ggtgtccggg aggtctttgg 7860gcatcgcggt ctggggttgg gacgtgtaag cgcctgggag agcctagacc aggctccggg 7920ctgccaataa agaagtgaaa tgcgtatctg gtctcctgtc gtgggagagt gtgaggtgta 7980acggattcaa gtctgaaccc agagcctgga aaaggctgac cgcccagatt gacgttgcta 8040ggcaactccg gaggcgggcc cagcgccaaa agaacagggc gaggcgtcgt ccccgcatcc 8100cattggccgt tctctgcggg gccccgccct cgggggccgg agctagaagc tctacgcttc 8160cgaggcgcac ctcctggcct gcacgctttg acgt 8194<210>16<211>2526<212>DNA<213>人<400>16atgctgctct gcacggctcg cctggtcggc ctgcagcttc tcatttcctg ctgctgggcc 60tttgcctgcc atagcacgga gtcttctcct gacttcaccc tccccggaga ttacctcctg 120gcaggcctgt tccctctcca ttctggctgt ctgcaggtga ggcacagacc cgaggtgacc 180ctgtgtgaca ggtcttgtag cttcaatgag catggctacc acctcttcca ggctatgcgg 240cttggggttg aggagataaa caactccacg gccctgctgc ccaacatcac cctggggtac 300cagctgtatg atgtgtgttc tgactctgcc aatgtgtatg ccacgctgag agtgctctcc 360ctgccagggc aacaccacat agagctccaa ggagaccttc tccactattc ccctacggtg 420ctggcagtga ttgggcctga cagcaccaac cgtgctgcca ccacagccgc cctgctgagc 480cctttcctgg tgcccatgat tagctatgcg gccagcagcg agacgctcag cgtgaagcgg 540cagtatccct ctttcctgcg caccatcccc aatgacaagt accaggtgga gaccatggtg 600ctgctgctgc agaagttcgg gtggacctgg atctctctgg ttggcagcag tgacgactat 660gggcagctag gggtgcaggc actggagaac caggccactg gtcaggggat ctgcattgct 720ttcaaggaca tcatgccctt ctctgcccag gtgggcgatg agaggatgca gtgcctcatg 780cgccacctgg cccaggccgg ggccaccgtc gtggttgttt tttccagccg gcagttggcc 840agggtgtttt tcgagtccgt ggtgctgacc aacctgactg gcaaggtgtg ggtcgcctca 900gaagcctggg ccctctccag gcacatcact ggggtgcccg ggatccagcg cattgggatg 960
gtgctgggcg tggccatcca gaagagggct gtccctggcc tgaaggcgtt tgaagaagcc 1020tatgcccggg cagacaagaa ggcccctagg ccttgccaca agggctcctg gtgcagcagc 1080aatcagctct gcagagaatg ccaagctttc atggcacaca cgatgcccaa gctcaaagcc 1140ttctccatga gttctgccta caacgcatac cgggctgtgt atgcggtggc ccatggcctc 1200caccagctcc tgggctgtgc ctctggagct tgttccaggg gccgagtcta cccctggcag 1260cttttggagc agatccacaa ggtgcatttc cttctacaca aggacactgt ggcgtttaat 1320gacaacagag atcccctcag tagctataac ataattgcct gggactggaa tggacccaag 1380tggaccttca cggtcctcgg ttcctccaca tggtctccag ttcagctaaa cataaatgag 1440accaaaatcc agtggcacgg aaaggacaac caggtgccta agtctgtgtg ttccagcgac 1500tgtcttgaag ggcaccagcg agtggttacg ggtttccatc actgctgctt tgagtgtgtg 1560ccctgtgggg ctgggacctt cctcaacaag agtgacctct acagatgcca gccttgtggg 1620aaagaagagt gggcacctga gggaagccag acctgcttcc cgcgcactgt ggtgtttttg 1680gctttgcgtg agcacacctc ttgggtgctg ctggcagcta acacgctgct gctgctgctg 1740ctgcttggga ctgctggcct gtttgcctgg cacctagaca cccctgtggt gaggtcagca 1800gggggccgcc tgtgctttct tatgctgggc tccctggcag caggtagtgg cagcctctat 1860ggcttctttg gggaacccac aaggcctgcg tgcttgctac gccaggccct ctttgccctt 1920ggtttcacca tcttcctgtc ctgcctgaca gttcgctcat tccaactaat catcatcttc 1980aagttttcca ccaaggtacc tacattctac cacgcctggg tccaaaacca cggtgctggc 2040ctgtttgtga tgatcagctc agcggcccag ctgcttatct gtctaacttg gctggtggtg 2100tggaccccac tgcctgctag ggaataccag cgcttccccc atctggtgat gcttgagtgc 2160acagagacca actccctggg cttcatactg gccttcctct acaatggcct cctctccatc 2220agtgcctttg cctgcagcta cctgggtaag gacttgccag agaactacaa cgaggccaaa 2280tgtgtcacct tcagcctgct cttcaacttc gtgtcctgga tcgccttctt caccacggcc 2340agcgtctacg acggcaagta cctgcctgcg gccaacatga tggctgggct gagcagcctg 2400agcagcggct tcggtgggta ttttctgcct aagtgctacg tgatcctctg ccgcccagac 2460ctcaacagca cagagcactt ccaggcctcc attcaggact acacgaggcg ctgcggctcc 2520acctga2526<210>17<21l>841<212>PRT<213>人<400>17Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser1 5 10 15Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe20 25 30Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser35 40 45Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg50 55 60Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg65 70 75 80Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile85 90 95Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val100 105 110Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu115 120 125
Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile130 135 140Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser145 150 155 160Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu165 170 175Ser Val Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp180 185 190Lys Tyr Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp195 200 205Thr Trp Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly210 215 220Val Gln Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala225 230 235 240Phe Lys Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met245 250 255Gln Cys Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val260 265 270Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val275 280 285Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala290 295 300Leu Ser Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met305 310 315 320Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala325 330 335Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg Pro Cys340 345 350His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln355 360 365Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser370 375 380Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu385 390 395 400His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val405 410 415Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu420 425 430
His Lys Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser435 440 445Tyr Asn Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr450 455 460Val Leu Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu465 470 475 480Thr Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val485 490 495Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe500 505 510His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu515 520 525Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp530 535 540Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu545 550 555 560Ala Leu Arg Glu His Thr Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu565 570 575Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu580 585 590Asp Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met595 600 605Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly610 615 620Glu Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu625 630 635 640Gly Phe Thr Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu645 650 655Ile Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala660 665 670Trp Val Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala675 680 685Ala Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu690 695 700Pro Ala Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys705 710 715 720Thr Glu Thr Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly725 730 735
Leu Leu Ser Ile Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu740 745 750Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe755 760 765Asn Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp770 775 780Gly Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu785 790 795 800Ser Ser Gly Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu805 810 815Cys Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln820 825 830Asp Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr835 840<210>18<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述T1R家族共有序列<220>
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<223>人工序列描述T1R家族共有序列<220>
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<221>MOD_RES<222>(13)<223>f或l<220>
<221>MOD_RES<222>(14)<223>a或s<220>
<221>MOD_RES<222>(15)<223>m或l<400>19Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa1 5 10 15<210>20<211>3563<212>DNA<213>人<400>20agcctggcag tggcctcagg cagagtctga cgcgcacaaa ctttcaggcc caggaagcga 60ggacaccact ggggccccag ggtgtggcaa gtgaggatgg caagggtttt gctaaacaaa 120tcctctgccc gctccccgcc ccgggctcac tccatgtgag gccccagtcg gggcagccac 180ctgccgtgcc tgttggaagt tgcctctgcc atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc 240ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg 300atgaaggggg actacgtgct gggggggctg ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc 360ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct gtgtgcacca ggtacagagg tgggacggcc 420tgggtcgggg tcagggtgac caggtctggg gtgctcctga gctggggccg aggtggccat 480ctgcggttct gtgtggcccc aggttctcct caaacggcct gctctgggca ctggccatga 540aaatggccgt ggaggagatc aacaacaagt cggatctgct gcccgggctg cgcctgggct 600acgacctctt tgatacgtgc tcggagcctg tggtggccat gaagcccagc ctcatgttcc 660tggccaaggc aggcagccgc gacatcgccg cctactgcaa ctacacgcag taccagcccc 720gtgtgctggc tgtcatcggg ccccactcgt cagagctcgc catggtcacc ggcaagttct 780tcagcttctt cctcatgccc cagtggggcg ccccccacca tcacccaccc ccaaccaacc 840cctgccccgt gggagcccct tgtgtcagga gaatgctaca tgcaccccac ccagccctgc 900cctgggagcc ctgtgtcaga agatgctctt ggccttgcag gtcagctacg gtgctagcat 960ggagctgctg agcgcccggg agaccttccc ctccttcttc cgcaccgtgc ccagcgaccg 1020tgtgcagctg acggccgccg cggagctgct gcaggagttc ggctggaact gggtggccgc 1080cctgggcagc gacgacgagt acggccggca gggcctgagc atcttctcgg ccctggccgc 1140ggcacgcggc atctgcatcg cgcacgaggg cctggtgccg ctgccccgtg ccgatgactc 1200gcggctgggg aaggtgcagg acgtcctgca ccaggtgaac cagagcagcg tgcaggtggt 1260gctgctgttc gcctccgtgc acgccgccca cgccctcttc aactacagca tcagcagcag 1320gctctcgccc aaggtgtggg tggccagcga ggcctggctg acctctgacc tggtcatggg 1380
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1.分離的核酸，其選自(i)基本由編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成的基因組DNA序列，其中所述的核酸序列基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成；(ii)基本由編碼具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列的T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成的基因組DNA序列組成；(iii)具有與編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列至少大約50％相同的基因組DNA序列，其中所述的核酸序列基本由選自SEQ IDNOs 15和20的核酸序列組成；(iv)基本由編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成的基因組DNA序列，所述的多肽具有與選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列至少大約40％相同的氨基酸序列；(v)基本由編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列組成的基因組DNA序列，所述的多肽包含選自SEQ ID NOs 18和19中和與SEQ ID NOs18或19有至少大約75％相同性的序列的共有序列；(vi)具有與在選自SEQ ID NOs 15和20的基因組DNA序列中的T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體編碼區(qū)相同的核酸序列的cDNA序列；(vii)編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的cDNA序列，所述的多肽具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列；(viii)編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的cDNA序列，所述的多肽包含選自SEQ ID NOs 18和19和與SEQ ID NOs 18或19有至少大約75％相同性的序列中的共有序列；(ix)選自SEQ ID NOs 3，13和16的cDNA序列；(x)具有與在選自SEQ ID NOs 15和20的基因組DNA中的T1R G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)至少大約50％序列相同性的cDNA序列；(xi)與編碼T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列具有至少大約50％序列相同性的cDNA序列，所述的多肽具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列；(xii)具有與選自SEQ ID NOs 3，13和16的序列至少大約50％相同性的cDNA序列；(xiii)選自SEQ ID NOs 3，13，15，16和20的核苷酸序列的變體，其中在編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的T1R G蛋白耦聯(lián)受體多肽的區(qū)域中包含至少一個(gè)保守性替換；(xiv)編碼T1R G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核苷酸序列的變體，所述的多肽具有選自SEQ ID NOs 4，14，和17的氨基酸序列，該變體含有至少一個(gè)位于T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)域內(nèi)的保守性替換；和(xv)選自SEQ ID NOs 3，13，和16的cDNA序列的變體，其中包含至少一處保守性替換。
2.分離的基因組DNA分子，其基本上由編碼哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成，其中所述的核酸序列基本由SEQ ID NOs 15或20組成。
3.從權(quán)利要求2中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄的分離的RNA分子。
4.能夠與權(quán)利要求2中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
5.能夠與權(quán)利要求2中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
6.權(quán)利要求2中的基因組DNA分子的至少為大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
7.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求2的DNA分子中的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
8.權(quán)利要求7中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
9.權(quán)利要求7中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
10.權(quán)利要求9中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
11.權(quán)利要求7中的嵌合或融合分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
12.基本上由編碼哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體核酸序列組成的分離基因組DNA分子，所述的受體具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列。
13.從權(quán)利要求12中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
14.能夠與權(quán)利要求12中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
15.能夠與權(quán)利要求12中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
16.權(quán)利要求12中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
17.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求12的DNA分子中的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
18.權(quán)利要求17中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
19.權(quán)利要求17中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是一個(gè)促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
20.權(quán)利要求19中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
21.權(quán)利要求17中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
22.分離的基因組DNA分子，其基本由與編碼哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列有至少大約50％相同性的核酸序列組成，其中所述的核酸基本由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成。
23.從權(quán)利要求22中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
24.能夠與權(quán)利要求22中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
25.能夠與權(quán)利要求22中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
26.權(quán)利要求22中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
27.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求22中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
28.權(quán)利要求27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
29.權(quán)利要求27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
30.權(quán)利要求29中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
31.權(quán)利要求27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
32.分離的基因組DNA分子，其基本由編碼哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體的核酸序列組成，所述的受體具有與選自SEQ ID NOs 14和17的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列。
33.從權(quán)利要求32中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
34.能夠與權(quán)利要求32中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
35.能夠與權(quán)利要求32中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
36.權(quán)利要求32中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
37.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求32中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
38.權(quán)利要求37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
39.權(quán)利要求37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
40.權(quán)利要求39中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
41.權(quán)利要求37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
42.分離的cDNA分子，它包含與哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)域序列相同的核酸序列，所述的多肽編碼區(qū)域存在于基本由選自SEQID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組DNA序列中。
43.從權(quán)利要求42中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
44.能夠與權(quán)利要求42中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
45.能夠與權(quán)利要求42中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
46.權(quán)利要求42中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
47.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求42中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
48.權(quán)利要求47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
49.權(quán)利要求47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
50.權(quán)利要求49中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
51.權(quán)利要求47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
52.包含權(quán)利要求42中分離的cDNA分子、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
53.權(quán)利要求52中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
54.分離的cDNA分子，其包含編碼具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列。
55.從權(quán)利要求54中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
56.能夠與權(quán)利要求54中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
57.能夠與權(quán)利要求54中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
58.權(quán)利要求54中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
59.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求54中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
60.權(quán)利要求59中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
61.權(quán)利要求59中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
62.權(quán)利要求61中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
63.權(quán)利要求59中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
64.包含權(quán)利要求54中分離的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
65.權(quán)利要求64中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
66.分離的cDNA分子，其包含與G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)域有至少大約50％序列相同性的核酸序列，所述的編碼區(qū)域存在于基本由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組DNA序列中。
67.從權(quán)利要求66中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
68.能夠與權(quán)利要求66中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
69.能夠與權(quán)利要求66中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
70.權(quán)利要求66中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
71.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求66中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
72.權(quán)利要求71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
73.權(quán)利要求71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
74.權(quán)利要求73中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
75.權(quán)利要求71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
76.包含權(quán)利要求66中分離的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
77.權(quán)利要求76中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
78.分離的cDNA分子，其包含與編碼T1R G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列有至少大約40％序列相同性的核酸序列，所述的多肽包含選自SEQ IDNOs 4，10，12，14，和17的氨基酸序列。
79.從權(quán)利要求78中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
80.能夠與權(quán)利要求78中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
81.能夠與權(quán)利要求78中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
82.權(quán)利要求78中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
83.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求78中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
84.權(quán)利要求83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
85.權(quán)利要求83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
86.權(quán)利要求85中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
87.權(quán)利要求83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
88.包含權(quán)利要求78中分離的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
89.權(quán)利要求88中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
90.分離的變體DNA分子，其包含基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的核酸序列，并在具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體編碼區(qū)域中包含至少一個(gè)保守性替換。
91.從權(quán)利要求90中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
92.能夠與權(quán)利要求90中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
93.能夠與權(quán)利要求90中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
94.權(quán)利要求90中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
95.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求90中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
96.權(quán)利要求95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
97.權(quán)利要求95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
98.權(quán)利要求97中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
99.權(quán)利要求95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
100.具有與權(quán)利要求90中的變體DNA分子編碼區(qū)相同的核酸序列的cDNA分子。
101.包含權(quán)利要求100中的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
102.權(quán)利要求101中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
103.分離的變體分子，其包含編碼具有選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，并在編碼區(qū)中含有至少一處保守性替換。
104.從權(quán)利要求103中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
105.能夠與權(quán)利要求103中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
106.能夠與權(quán)利要求103中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
107.權(quán)利要求103中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
108.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求103中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
109.權(quán)利要求108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
110.權(quán)利要求108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
111.權(quán)利要求110中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
112.權(quán)利要求108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
113.具有與權(quán)利要求103中的變體DNA分子編碼區(qū)相同的核酸序列的cDNA分子。
114.包含權(quán)利要求113中的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
115.權(quán)利要求114中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
116.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其中所述的核酸編碼在大鼠、小鼠或人的味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
117.含有權(quán)利要求1中的分離的核酸分子的表達(dá)載體，其中所述的載體選自哺乳動(dòng)物載體、細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌粒、哺乳動(dòng)物病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體載體和線性或環(huán)狀具有整合至宿主細(xì)胞基因組的能力的DNA分子。
118.被權(quán)利要求117中至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞能在其細(xì)胞表面表達(dá)G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
119.包含至少一種權(quán)利要求1中分離的核酸分子的至少大約20到30個(gè)核苷酸的核酸陣列，其中所述至少一種核酸分子共價(jià)或非共價(jià)地連接至固相支持物上。
120.篩選能活化味覺(jué)信號(hào)發(fā)生的化合物的方法，包括(i)將權(quán)利要求118中的宿主細(xì)胞與推定的味覺(jué)活化化合物接觸；并(ii)測(cè)量所述的在細(xì)胞表面表達(dá)的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的活性。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽活性是通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、cAMP、cGMP和IP3、或GTPγS的G蛋白結(jié)合的變化測(cè)量的。
122.權(quán)利要求120的方法，其中所述的宿主細(xì)胞被至少一個(gè)另外的編碼參與味覺(jué)信號(hào)發(fā)生的基團(tuán)的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。
123.權(quán)利要求122的方法，其中所述的至少一個(gè)另外的基因編碼參與味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)的G蛋白。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述的G蛋白是混棲G蛋白。
125.篩選可調(diào)節(jié)味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物的方法，包括(i)將權(quán)利要求118的宿主細(xì)胞與已知的味覺(jué)活化化合物和推定的參與味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的化合物接觸；(ii)將權(quán)利要求118的宿主細(xì)胞與已知的味覺(jué)活化化合物單獨(dú)接觸；并(iii)比較步驟(i)中宿主細(xì)胞表面表達(dá)的所述G蛋白耦聯(lián)受體多肽的活性和步驟(ii)中宿主細(xì)胞表面表達(dá)的所述G蛋白耦聯(lián)受體多肽的活性，用來(lái)鑒定味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)子。
126.權(quán)利要求125的方法，其中所述的調(diào)節(jié)性化合物選自活化子、抑制子、刺激子、增強(qiáng)子、激動(dòng)劑和拮抗劑。
127.權(quán)利要求125的方法，其中所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽活性是通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、cAMP、cGMP和IP3、或GTPγS的G蛋白結(jié)合的變化測(cè)量的。
128.權(quán)利要求125中的方法，其中所述的宿主細(xì)胞被至少一個(gè)另外的編碼參與味覺(jué)信號(hào)發(fā)生的基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。
129.權(quán)利要求128的方法，其中所述的至少一個(gè)另外的基因編碼參與味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的G蛋白。
130.權(quán)利要求129的方法，其中所述的G蛋白是混棲G蛋白。
131.檢測(cè)G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，包括(i)將所述的細(xì)胞與可與權(quán)利要求1中分離的核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸分子接觸；并(ii)檢測(cè)雜交結(jié)果，以檢測(cè)所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的表達(dá)。
132.編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的分離的核酸分子。
133.編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的分離的核酸分子。
134.編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的分離的核酸分子。
135.編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有SEQ ID NO11的核苷酸序列的分離的核酸分子。
136.具有SEQ ID NO3核苷酸序列的分離的核酸分子。
137.具有SEQ ID NO13核苷酸序列的分離的核酸分子。
138.具有SEQ ID NO15核苷酸序列的分離的核酸分子。
139.具有SEQID NO16核苷酸序列的分離的核酸分子。
140.編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。
141.分離的核酸分子，其編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的具有SEQID NO10的氨基酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
142.分離的核酸分子，其編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的具有SEQID NO12的氨基酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
143.編碼具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。
144.編碼具有SEQ ID NO17的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。
145.分離的核酸分子，其編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的、包含SEQ ID NO18的共有序列或與SEQ ID NO18序列具有至少75％相同性的共有序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
146.分離的核酸分子，其編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的、含SEQID NO19的共有序列或與SEQ ID NO19序列具有至少75％相同性的共有序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
147.基因組DNA，其為使用至少一種具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由編碼SEQ ID NO 18或19共有序列的核酸序列組成的簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來(lái)的，其中所述的擴(kuò)增的DNA包含編碼在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列。
148.分離包含具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼序列的基因組序列的方法，所述的方法包括將哺乳動(dòng)物基因組與至少一種具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由編碼SEQ ID No 18或19共有序列的核酸序列組成的簡(jiǎn)并引物接觸，在聚合酶、游離核苷酸和輔因子存在的情況下擴(kuò)增包含所述引物序列的所述基因組序列。
149.篩選哺乳動(dòng)物基因組中具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體編碼序列的方法，包括(i)將所述的哺乳動(dòng)物基因組與至少一種具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由編碼SEQ ID 18或19共有序列的核酸序列組成的簡(jiǎn)并引物接觸；(ii)在聚合酶、游離核苷酸和輔因子存在的情況下擴(kuò)增包含所述的引物序列的所述基因組序列；并(iii)檢測(cè)包含G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的擴(kuò)增序列的存在。
150.包含小鼠T1R3基因的SAV115質(zhì)粒。
151.包含大鼠T1R3基因的SAV118質(zhì)粒。
152.分離的多肽，其選自(i)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含選自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2組成的基因組序列的核酸序列的核酸分子編碼；(ii)G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含選自SEQ ID NOs 3，13，和16以及基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組序列的核酸序列的核酸分子編碼；(iii)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含選自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列；(iv)G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含選自SEQ ID NOs 4，14，和17的氨基酸序列；(v)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含與選自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2組成的基因組序列的核酸序列具有至少大約50％相同性的核酸序列的核酸分子編碼；(vi)G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含與選自SEQ ID NOs 3、13和16以及基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組序列的核酸序列具有至少大約50％相同性的核酸序列的核酸分子編碼；(vii)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含與選自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列；(viii)G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含與選自SEQ ID NOs 4，14和17的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列；(ix)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其由包含選自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2組成的基因組序列的核酸序列的核酸分子編碼，其中所述的變體蛋白相對(duì)于所述的核苷酸序列編碼的G蛋白耦聯(lián)受體包含至少一處保守性替換；(x)G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其由包含選自SEQ ID NOs 3，13，和16的核酸序列以及基本上由SEQ ID NOs 15或20組成的基因組序列的核酸序列的核酸分子編碼，其中所述的變體蛋白相對(duì)于所述的核苷酸序列編碼的G蛋白耦聯(lián)受體包括至少一處保守性替換；(xi)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中具有活性、包含選自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其中包含至少一處保守性替換；和(xii)含有選自SEQ ID NOs 4，14，和17的氨基酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其中包含至少一處保守性替換。
153.權(quán)利要求152所述多肽的片段，其中所述的片段包含至少大約5-7個(gè)氨基酸。
154.權(quán)利要求153中的片段，其中所述的片段包含T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
155.權(quán)利要求154中的片段，其中所述的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域能與參與味覺(jué)活化或調(diào)節(jié)的化合物相互作用。
156.權(quán)利要求154中的片段，其中所述的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域能與參與味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互作用。
157.權(quán)利要求156中的片段，其中所述的參與味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)是G蛋白亞基。
158.權(quán)利要求157中的片段，其中所述的G蛋白亞基是混棲G蛋白。
159.嵌合或融合多肽，其包含權(quán)利要求152所述多肽的氨基酸序列的至少部分，和至少部分異源氨基酸序列。
160.權(quán)利要求159的嵌合或融合多肽，其中所述的異源序列是來(lái)源于不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
161.權(quán)利要求159的嵌合或融合多肽，其中所述的異源序列是來(lái)源于綠色熒光蛋白的序列。
162.篩選能夠激活或調(diào)節(jié)味覺(jué)信號(hào)發(fā)生的一種或多種化合物的方法，包括將所述的一種或多種化合物與一種或多種權(quán)利要求152的多肽中的一種或多種片段接觸，其中所述一種或多種片段長(zhǎng)為至少大約5到7個(gè)氨基酸。
163.篩選能夠與具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體相互作用的一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟將所述的一種或多種蛋白質(zhì)與一種或多種權(quán)利要求152的多肽中的一種或多種片段接觸，其中所述一種或多種片段長(zhǎng)為至少大約5到7個(gè)氨基酸。
164.包含權(quán)利要求152中一種或多種多肽中的至少大約5到7個(gè)氨基酸區(qū)段的多肽陣列，其中所述的一個(gè)或多肽多肽區(qū)段共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到固相支持物上。
165.能夠與權(quán)利要求152中的多肽特異性結(jié)合的分離的抗體或抗體片段。
166.具有SEQ ID NO4氨基酸序列的分離的多肽。
167.具有SEQ ID NO10氨基酸序列的分離的多肽。
168.具有SEQ ID NO12氨基酸序列的分離的多肽。
169.具有SEQ ID NO14氨基酸序列的分離的多肽。
170.具有SEQ ID NO17氨基酸序列的分離的多肽。
171.描述在一種或多種哺乳動(dòng)物中一種或多種味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟(i)提供代表所述的哺乳動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量的X1到Xn值；并(ii)從所述的值中產(chǎn)生味覺(jué)感知的定量表示法，其中至少一種所述的味覺(jué)受體是味覺(jué)受體多肽，其具有與選自SEQ ID NOs 4，10，12，14，和17的序列至少大約40％的相同性的序列。
172.權(quán)利要求171中的方法，其中所述的表示法由n維空間的體積或點(diǎn)構(gòu)成。
173.權(quán)利要求171中的方法，其中所述的表示法由圖表或圖譜構(gòu)成。
174.權(quán)利要求171中的方法，其中所述的表示法由一個(gè)定量表示法的矩陣構(gòu)成。
175.權(quán)利要求171中的方法，其中所述的提供步驟包括將多種重組產(chǎn)生的味覺(jué)受體與待測(cè)組合物接觸，并定量測(cè)量所述的組合物與所述的受體的相互作用。
176.預(yù)測(cè)在哺乳動(dòng)物中由一種或多種分子或分子組合引起的味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟(i)針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供代表所述的哺乳動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量的X1到Xn值，(ii)從所述的值中，針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知的所述一種或多種分子或分子組合，產(chǎn)生哺乳動(dòng)物中味覺(jué)感知的定量表示法；(iii)對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供代表所述的哺乳動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量的X1到Xn值；(iv)對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的所述一種或多種分子或分子組合，從所述的值產(chǎn)生哺乳動(dòng)物中味覺(jué)感知的定量表示法；并(v)通過(guò)比較哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合的味覺(jué)感知定量表示法和哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合的味覺(jué)感知定量表示法，預(yù)測(cè)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的味覺(jué)感知；其中至少一種所述味覺(jué)受體是具有與選自SEQ ID NOs 4，10，12，14，和17的序列具有至少大約40％的相同性的序列的味覺(jué)受體多肽。
177.基因組DNA分子，其基本由編碼具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成，所述的多肽含有選自SEQ IDNOs 18和19以及與SEQ ID NOs 18或19具有至少大約75％相同性的序列的共有序列。
178.從權(quán)利要求177中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
179.能夠與權(quán)利要求177中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
180.能夠與權(quán)利要求177中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
181.權(quán)利要求177中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
182.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求177中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
183.權(quán)利要求182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
184.權(quán)利要求182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
185.權(quán)利要求184中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
186.權(quán)利要求182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
187.編碼具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的cDNA序列，所述的多肽包含選自SEQ ID NOs 18和19以及與SEQ ID NOs18或19具有至少大約75％相同性的序列的共有序列。
188.從權(quán)利要求187中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
189.能夠與權(quán)利要求187中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
190.能夠與權(quán)利要求187中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
191.權(quán)利要求187中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
192.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求187中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
193.權(quán)利要求192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
194.權(quán)利要求192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
195.權(quán)利要求194中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
196.權(quán)利要求192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
197.包含權(quán)利要求187中分離的cDNA、以及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
198.權(quán)利要求197中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
199.包含選自SEQ ID NOs 3，13和16的核酸序列的cDNA分子。
200.從權(quán)利要求199的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
201.能夠與權(quán)利要求199中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
202.能夠與權(quán)利要求199中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
203.權(quán)利要求199中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
204.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求199中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
205.權(quán)利要求204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
206.權(quán)利要求204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
207.權(quán)利要求206中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
208.權(quán)利要求204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
209.包含權(quán)利要求199中分離的cDNA、以及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
210.權(quán)利要求209中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
211.含有與選自SEQ ID NOs 3，13和16的核酸序列具有至少大約50％相同性的核酸序列的cDNA分子。
212.從權(quán)利要求211的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
213.能夠與權(quán)利要求211中的DNA分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分離的核酸分子。
214.能夠與權(quán)利要求211中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
215.權(quán)利要求211中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的分離的片段。
216.嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含權(quán)利要求211中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
217.權(quán)利要求216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
218.權(quán)利要求216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是促進(jìn)所述的哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細(xì)胞表面表達(dá)的序列。
219.權(quán)利要求218中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)基因。
220.權(quán)利要求216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來(lái)源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測(cè)標(biāo)志物基因。
221.包含權(quán)利要求211中分離的cDNA以及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動(dòng)子的核酸分子。
222.權(quán)利要求211中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境或發(fā)育狀況下為可誘導(dǎo)的。
223.權(quán)利要求153中的片段，其中所述的片段至少包括G蛋白耦聯(lián)受體的N端片段。
224.權(quán)利要求223中的片段，其中所述的N端片段參與配體結(jié)合。
225.權(quán)利要求224中的多肽片段，其中所述的片段具有至少大約100個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
226.權(quán)利要求224中的多肽片段，其中所述的片段具有至少大約600個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
227.用于鑒定能特異結(jié)合具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體的味覺(jué)元配體的生物化學(xué)試驗(yàn)，包括(i)將一種或多種權(quán)利要求224的片段與一種或多種推定的味覺(jué)元配體或包含一種或多種推定的味覺(jué)元配體的組合物接觸；并(ii)檢測(cè)對(duì)具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體有結(jié)合特異性的味覺(jué)元配體的結(jié)合。
228.權(quán)利要求227的試驗(yàn)，其中結(jié)合作用由替換放射標(biāo)記的已知的結(jié)合配體來(lái)檢測(cè)。
229.權(quán)利要求228的試驗(yàn)，其中所述的已知的結(jié)合配體是與所述的G蛋白耦聯(lián)受體具有結(jié)合特異性的抗體或抗體片段。
230.具有SEQ ID NO 20的核酸序列的分離的核酸分子。
231.嵌合或融合多肽，其至少包括權(quán)利要求152中至少一種多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，和至少部分異源氨基酸序列。
232.權(quán)利要求231中的嵌合或融合多肽，其中所述的異源氨基酸序列來(lái)源于不同G蛋白耦聯(lián)受體。
233.權(quán)利要求232中的嵌合或融合多肽，其中所述的不同G蛋白耦聯(lián)受體是T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體，所述的異源氨基酸序列至少包括所述T1R哺乳動(dòng)物G蛋白耦聯(lián)受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
234.用于鑒定對(duì)具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體具有結(jié)合特異性的味覺(jué)元配體的生物化學(xué)試驗(yàn)，包括(i)將一種或多種權(quán)利要求224的片段與G蛋白和GTPγS的制劑，及一種或多種推定的味覺(jué)元配體或包含一種或多種推定的味覺(jué)元配體的組合物進(jìn)行接觸；并(ii)通過(guò)測(cè)量GTPγS與G蛋白的結(jié)合，檢測(cè)與具有味覺(jué)信號(hào)發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體有結(jié)合特異性的味覺(jué)元配體的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明描述了新鑒定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體，以及編碼這些受體的基因和cDNA。尤其描述了具有味覺(jué)信號(hào)形成活性的T1R G蛋白耦聯(lián)受體及其編碼基因和cDNA，以及分離這些基因和分離和表達(dá)這些受體的方法。本發(fā)明同時(shí)描述了表征哺乳動(dòng)物中特定味覺(jué)元的味覺(jué)感知的方法，以及產(chǎn)生能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)預(yù)定味覺(jué)感知的新分子和分子組合的方法，和刺激一種或多種味覺(jué)的方法。此外，本發(fā)明也描述了在哺乳動(dòng)物中刺激或阻斷味覺(jué)感知的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1766108SQ20051011339
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2001年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月7日
發(fā)明者J·E·阿德勒, S·佐祖利亞, S·M·奧康奈爾, 李曉東, L·斯達(dá)祖斯凱 申請(qǐng)人:塞諾米克斯公司