專利名稱：提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法及其專用載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高植物轉化頻率的方法及其專用載體，特別涉及一種提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法及其專用載體。
背景技術：
在植物轉基因操作中，通過根農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導法，將外源基因導入植物體內獲得轉基因植物是非常重要的方法，相對于基因槍法、PEG法、電激法等方法，根農桿菌介導法具有操作簡便，成本低，插入的外源基因拷貝數低，轉基因后代中染色體重排和基因沉默頻率相對較低等優(yōu)點。但是根農桿菌介導法的轉化頻率較低，特別是對單子葉植物而言，因此提高根農桿菌介導法轉化頻率具有非常重要的意義。
農桿菌介導的DNA轉化的分子機制目前已經逐漸被人們所認識，它是在一系列vir基因產物的作用下，將T-DNA輸入到植物細胞中，并最終整合到植物染色體，從而穩(wěn)定存在和表達。在這些vir基因產物中，位于細胞膜上的VirA在植物組織所產生的酚類化合物(如乙酰丁香酮)的存在下，發(fā)生自磷酸化反應，隨即將磷酸化信號轉遞給VirG，使VirG磷酸化(Lee，Y.-W.et al.1995.Proc.Natl.Acad.Sci.9212245-12249；Winans，S.C.1991.Mol.Microbiol.52345-2350；Jin，S.et al.1990.J.Bacteriol.1724945-4950.)。非磷酸化的VirG是無活性的，磷酸化的VirG結合在vir基因的啟動子區(qū)，促進自身及其它vir基因的轉錄水平。從而開啟了T-DNA的轉移過程(Das，A.et al.1986.Nucleic Acids Res.141355-1364；Pazour，G.J.1990.Nucleic Acids Res.186909-6913；Stachel，S.E.，and P.C.Zambryski.1986.Cell 46325-333)。有文獻表明，一些具有組成型活性的VirA突變可在不存在誘導物的情況下促進vir基因的表達水平(Ankenbauer，R.G.et al.1991.Mol.Plant-Microbe Interact.4400-406；McLean，B.G.et al.1994.J.Biol.Chem.2692645-2651.；Pazour，G.J.etal.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.886941-6945)，增加virG的表達能有效提高農桿菌的侵染能力(Jin，S.-G.et al.1987.J.Bacteriol.1694417-4425；Liu，C.-N.et al.1992.Plant Mol.Bio.201071-1087)。VirD1和VirD2在T-DNA的右邊界結合并切割，形成T-DNA鏈，此外含有核定位信號的VirD2具有引導T-DNA穿過細胞膜進入植物細胞，并整合到染色體上的功能。VirE2是一種單鏈結合蛋白，可與T-DNA形成復合體，可保護T-DNA在植物細胞中免遭降解，并在T-DNA轉移并最終整合到染色體上的過程中起重要的作用(Rossi，L.et al.1993.Mol.Gen.Genet.239345-353；Young，J.et al.2001.Int.J.Sys.Evol.Microbiol.5189-103)。增加的virE基因的表達可以提高煙草的轉化頻率(Srivatanakul，M.et al.2000.J.Plant Physiol.157685-690)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法及其專用載體。
本發(fā)明所提供的提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的載體，是在原核細胞表達載體的多克隆位點插入根農桿菌的virA基因、virG基因和virE基因，得到在根農桿菌中過量表達virA、virG和virE的重組表達載體。
所述原核細胞表達載體包括根農桿菌的DNA復制區(qū)(Rep)。
所述的農桿菌復制子區(qū)可來源于任意的雙元載體，如Bin19(XXU09365)，pBI121(AF485783)，pCAMBIA(CAMBIA公司)等。
所述virA基因可以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P95’-ACTAGTGCCGACTCCATCCCCTTAC，P105’-TCTAGATGGTGGTGTCATAGCTGGT為引物，PCR擴增得到。PCR擴增產物包括virA基因和它的啟動子序列(X06826，自5′端核苷酸序列第2024位至第4892位)。
所述virG基因可以根農桿菌EHA105為模板，以寡核苷酸P115’-ACTAGTGCTGTAACCTCGAAGCGTTTC，P125’-TCTAGACGGAACCCCTCACCAAATA為引物，PCR擴增得到。PCR擴增產物包括virG基因和它的啟動子序列(AB027257，自5′端核苷酸序列第2344位至第3374位)。
所述virE基因由virE和virE2組成，可以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P135’-ACTAGTCCAACAATGCTCACAGGGATA，P145’-TCTAGAGGGTCAACGAGCTTCCTCA為引物，PCR擴增得到。PCR擴增產物包括virE1、virE2基因和它們的啟動子序列(X06826，自5′端核苷酸序列第31828位至第34038位)。
所述原核細胞表達載體可為如圖1所示的pXCA18。
所述提高植物轉化頻率的載體可為如圖2所示的pXCA18::GEA。
導入上述提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的載體的宿主菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述宿主菌可為根農桿菌、大腸桿菌等。
本發(fā)明所提供的提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法，是將上述提高植物轉化頻率的載體導入根農桿菌，得到virA基因、virG基因和virE基因表達增強的改造根農桿菌；利用該改造根農桿菌介導轉化目的植物，可提高植物的轉化頻率。
所述改造根農桿菌可為根農桿菌LBA4404、根農桿菌EHA101或根農桿菌EHA105等。
所述植物可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。
本發(fā)明巧妙地將virA、virG和virE基因插入原核細胞表達載體，構建過量表達virA、virG和virE基因的重組表達載體，再將該重組表達載體轉化根農桿菌，得到過量表達virA、virG和virE基因的改造根農桿菌菌株，該改造根農桿菌菌株浸染植物的能力增強，與出發(fā)根農桿菌菌株相比，可提高轉基因植物的轉化效率及轉化頻率。
煙草和高羊茅轉基因實驗表明本發(fā)明的方法對煙草的轉化效率比常規(guī)根農桿菌轉化方法平均高提高近一倍，對高羊茅的轉化效率平均高提高近一倍，說明本發(fā)明可以明顯提高農桿菌介導的植物轉化頻率。


圖1為pXCA18載體的結構圖。
圖2為pXCA18::GEA質粒的結構圖。
具體實施例方式
下述實施例中的方法如無特別說明均為常規(guī)方法。以下實驗操作過程均按照常規(guī)分子操作過程進行(Sambrook et al.，2001 Molecular cloningA LaboratoryManual)。PCR反應體系均為5μl 10×buffer，0.5μl 20μM正反向引物，1μl(0.1ug)模板DNA，1μl 10mM dNTP，2.5U pfu DNA聚合酶，加無菌水至50μl。
實施例1、構建表達質粒pXCA18::GEA1、Virulence基因表達質粒pXCA18::GEA的構建(1)大腸桿菌-農桿菌穿梭載體pXCA18的構建利用常規(guī)克隆手段，以大腸桿菌克隆載體pUC18為骨架，插入氯霉素抗性基因-氯霉素氨基轉移酶基因(cat)，以及農桿菌復制區(qū)DNA片段，得到以氯霉素做為篩選標記的大腸桿菌-農桿菌穿梭載體。
氯霉素氨基轉移酶基因的獲得是以質粒pACYC184(X06403)為模板，用引物P15’-GACGTCATCACCCG ACGCACTTTGC和P25’-ATCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCA進行PCR擴增反應。其中，PCR反應溫度條件為先94℃預變性2min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到962bp的DNA片段。將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒按照北京天緯時代科技有限公司提供的方案回收該片段，將該片段插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V位點，進行測序(三博遠志生物技術公司)，測序結果表明擴增產物為氯霉素抗性基因cat，同時得到含有cat的質粒pBS::cat。
以質粒pUC18為模板，利用引物P35’-TACTTTCACCAGCGTTTCT，P45’-AACTGTCAGACCAAGTTTACTC進行PCR擴增。PCR反應程序為先94℃預變性2min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到1920bp的DNA片段。將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，擴增產物為去除了青霉素抗性基因的pUC18骨架，并用Aat II酶切后，與經Aat II和EcoR V酶切pBS:cat得到的cat片段連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，在含有25mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選陽性克隆，得到的質粒被命名為pXC18。該質粒具有與pUC18相同的復制子，以及一致的多克隆位點。
以質粒Bin19(XXU09365)為模板，引物P55’-CCATACGTTTGGACGAGCAA GGCAAGACCG，P65’-GTCGACCATTTTTGGGGTGAGGC，在(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1m)條件下擴增。將擴增得到的約745bp長的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，并插入pBluescript II的EcoR V位點，測序(三博遠志生物技術公司)，擴增產物為負責在農桿菌中復制的復制子片段oriV，同時得到質粒pBS::oriV。以質粒Bin19(XXU09365)為模板，以引物P75’-CTCGAGAATTGTTTTAGTACCTAGATGTGG，P85’-GACGTCGCGATACTGAGCGAAGCAA，在(94℃，30s；55℃，30s；72℃，2m)條件下擴增，擴增產物為提高在農桿菌中復制拷貝數和穩(wěn)定性的基因trfA，將擴增得到的約1575bp長的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，并插入pBluescript II的EcoR V位點，測序(三博遠志生物技術公司)，擴增產物為幫助質粒在農桿菌中穩(wěn)定復制的片段trfA，同時得到質粒pBS::trfA。
以SalI酶切質粒pBS::oriV得到含oriV的片段插入質粒pBS::trfA的XhoI位點，得到質粒pBS::oriV-trfA。以BstXI和Aat II雙酶切質粒pBS::oriV-trfA得到含oriV-trfA的片段，插入到pXC18的Aat II位點，獲得農桿菌-大腸桿菌穿梭質粒載體pXCA18(圖1)。將該質粒轉化農桿菌LBA4404，并在含有10mg/L的氯霉素的YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選，挑取單克隆，提取質粒并測序確認，得到含有該質粒的根農桿菌菌株。
(2)T-DNA轉移相關基因virA、virG、virE的克隆及pXCA18::GEA構建以根農桿菌EHA105和LBA4404為模板，PCR擴增virA、virG、virE基因。
以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P95’-ACTAGTGCCGACTCCATCCCCTTAC，P105’-TCTAGATGGTGGTGTCATAGCTGGT為引物，PCR擴增virA基因。其中，PCR反應程序為先94℃預變性2min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到約2882bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V位點，測序(三博遠志生物技術公司)，結果表明該片段含有virA基因和它的啟動子序列(X06826，自5′端核苷酸序列第2024位至第4892位)，質粒命名為pBS::virA。
以根農桿菌EHA105為模板，以寡核苷酸P115’-ACTAGTGCTGTAACCTCGAAGCGTTTC，P125’-TCTAGACGGAACCCCTCACCAAATA為引物，PCR擴增virG基因。PCR反應程序為先94℃預變性2min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到1200bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript IIKS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V位點，測序(三博遠志生物技術公司)，結果表明該片段含有virG基因和它的啟動子序列(AB027257，自5′端核苷酸序列第2344位至第3374位)，質粒命名為pBS::virG。
以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P135’-ACTAGTCCAACAATGCTCACAGGGATA，P145’-TCTAGAGGGTCAACGAGCTTCCTCA為引物，PCR擴增virE基因。其中，PCR反應程序為先94℃預變性2min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到2223bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V酶識別位點，測序(三博遠志生物技術公司)，結果表明該片段含有包括virE1、virE2基因和它們的啟動子序列(X06826，自5′端核苷酸序列第31828位至第34038位)，質粒命名為pBS::virE。
以質粒pBI121(AF485783)為模板，以P155’-ACTAGTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCC，P165’-CGTAACATAAGGGACTGACCACC為引物，PCR擴增35S啟動子。其中，PCR反應程序為先94℃預變性4min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)；最后72℃ 4min。擴增得到872bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V酶識別位點，測序(三博遠志生物技術公司)，將測序表明含有35S的啟動子區(qū)的pBluescript II KS(-)質粒，命名為pBS::35S。
將質粒pBS::virA用Kpn I和Xba I酶切下包括virA基因的片段插入pUC19質粒的相同位點，得到質粒pUC19::virA。用Kpn I和Xba I酶切下pBS::virE的含virE基因的片段，插入pUC19::virA的Kpn I和Spe I位點，得到質粒pUC19::virE-virA。用Kpn I和Xba I酶切下pBS::35S的含35S啟動子的片段插入pUC19::virE-virA的Kpn I和Spe I位點，得到質粒pUC19::35S-virE-virA。用Kpn I和Xba I酶切下pBS::virG的含virG基因的片段，插入pUC19::35S-virE-virA的KpnI和Spe I位點，得到質粒pUC19:virG-35S-virE-virA。用Kpa I和Xba I酶切下質粒pUC19::virG-35S-virE-vira的含vir6-35S-virE-virA基因的片段插入pXCA18的相同位點，得到可在農桿菌中大量表達virG、virE、vitA基因的重組質粒pXCA18::GEA(圖2)。
2、農桿菌介導的植物轉基因實驗首先將質粒pXCA18::GEA轉化根農桿菌LBA4404，得到含有增強表達virA、virG、virE基因的根農桿菌TpXCA18::GEA，隨后轉化質粒pBI121，獲得同時包含兩個外源質粒的根農桿菌TpXCA18::GEA-pBI121，同時用質粒pBI121轉化根農桿菌LBA4404獲得只含有pBI121的農桿菌LBA4404，命名為TpBI121做為對照，用于下述轉化煙草和高羊茅的實驗來測驗pXCA18::GEA對農桿菌侵染頻率的影響。
(1)煙草轉化實驗:煙草的轉化采用葉盤共培養(yǎng)法，取生長4-5周的無菌培養(yǎng)的煙草葉片，切割成四邊長約5mm的煙草葉盤，分別浸泡在109CFU/ml的上述農桿菌TpXCA18::GEA-pBI121和TpBI121中15min后，轉接入MS培養(yǎng)基，于25℃暗培養(yǎng)2天，隨后葉片被分別轉入到新鮮的含有卡那霉素(100mg/L)和頭孢霉素(500mg/L)、只含頭孢霉素(500mg/L)的MS培養(yǎng)基中，在25℃、每天16小時光照的條件下培養(yǎng)。2周后計數卡那霉素抗性的愈傷組織數和總愈傷組織數。并進行了三次重復實驗，轉化效率通過兩者之比來計算(表1總結了三次不同實驗的結果)。
表1 pXCA18::GEA對煙草葉盤轉化的影響

表1表明，用質粒pXCA18::GEA轉化根農桿菌LBA4404后，可提高根農桿菌介導的目的質粒的轉化效率。
(2)高羊茅轉化實驗高羊茅轉化實驗采用胚愈傷組織侵染法選取成熟飽滿的高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)種子，將胚剝下，再橫切成兩半后接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基。每升愈傷組織誘導培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎上加入生長素類物質2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3-8mg，水解酪蛋白濃度在0.5-2g，pH5.8。每兩至三星期將愈傷組織轉皿一次。侵染前將愈傷組織轉接到愈傷組織狀態(tài)調整培養(yǎng)基(每升愈傷組織狀態(tài)調整培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎上加入2，4-D 0.5-2mg，細胞分裂素類物質6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.1-0.5mg，KT濃度0.1-0.5mg，水解酪蛋白濃度在0.5-2g，pH 5.8)上，培養(yǎng)30天后，將愈傷組織分別置于根農桿菌TpXCA18::GEA-pBI121和TpBI121菌液中浸泡10分鐘，倒去菌液，轉接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，25℃共培養(yǎng)3天后，將愈傷組織分成約1-2mm3的小塊轉接入含有羧芐青霉素250mg/L新的愈傷誘導培養(yǎng)基中。2周后，進行葡糖醛酸糖苷酶活性染色實驗，在實體鏡下計數藍斑數，實驗設三次重復。轉化效率通過計數藍斑數來計算(表2總結了三次重復實驗的結果)。
表2 pXCA18::GEA對高羊茅愈傷轉化的影響

表2表明，用質粒pXCA18::GEA轉化根農桿菌LBA4404后，可提高根農桿菌介導的目的質粒的轉化效率。
從以上兩組數據可以看出，通過提高virA、virG、virE的表達水平可以明顯提高農桿菌介導的轉化效率。
權利要求
1.一種提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的載體，是在原核細胞表達載體的多克隆位點插入根農桿菌的virA基因、virG基因和virE基因，得到的可在根農桿菌中過量表達virA基因、virG基因和virE基因的重組表達載體。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于所述原核細胞表達載體包括根農桿菌的DNA復制區(qū)。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述根農桿菌的DNA復制區(qū)來自質粒Bin19、pBI121或pCAMBIA。
4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于所述virA基因以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P95’-ACTAGTGCCGACTCCATCCCCTTAC，P105’-TCTAGATGGTGGTGTCATAGCTGGT為引物，PCR擴增得到；所述virG基因以根農桿菌EHA105為模板，以寡核苷酸P115’-ACTAGTGCTGTAACCTCGAAGCGTTTC，P125’-TCTAGACGGAACCCCTCACCAAATA為引物，PCR擴增得到；所述virE基因由virE1和virE2組成，以根農桿菌LBA4404為模板，以寡核苷酸P135’-ACTAGTCCAACAATGCTCACAGGGATA，P145’-TCTAGAGGGTCAACGAGCTTCCTCA為引物，PCR擴增得到。
5.根據權利要求1至4中任一所述的載體，其特征在于所述原核細胞表達載體為如圖1所示的pXCA18。
6.根據權利要求1至4中任一所述的載體，其特征在于所述提高植物轉化頻率的載體為如圖2所示的pXCA18∷GEA。
7.導入權利要求1至6中任一所述的提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的載體的宿主菌。
8.根據權利要求7所述的宿主菌，其特征在于所述宿主菌為根農桿菌或大腸桿菌。
9.一種提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法，是將權利要求1至6中任一所述的提高植物轉化頻率的載體導入根農桿菌，得到vira基因、virG基因和virE基因表達增強的改造根農桿菌；利用該改造根農桿菌介導轉化目的植物，可提高植物的轉化頻率。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述根農桿菌為根農桿菌LBA4404、根農桿菌EHA105或根農桿菌EHA101。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高根農桿菌介導的植物轉化頻率的方法及其專用載體。該專用載體是在原核細胞表達載體的多克隆位點插入根農桿菌的virA基因、virG基因和virE基因，得到的可在根農桿菌中過量表達virA、virG和virE的重組表達載體。本發(fā)明巧妙地將virA、virG和virE基因插入原核細胞表達載體，構建過量表達virA、virG和virE基因的重組表達載體，再將該重組表達載體轉化根農桿菌，得到過量表達virA、virG和virE基因的重組根農桿菌菌株，該重組根農桿菌菌株浸染植物的能力增強，與出發(fā)根農桿菌菌株相比，可提高轉基因植物的轉化效率及轉化頻率。
文檔編號C12N15/74GK1793378SQ200510115089
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權日2005年11月28日
發(fā)明者陳蕾, 徐建勇 申請人:北京北方杰士生物科技有限責任公司