專利名稱：一種特異靶向線粒體的真核表達(dá)載體，其構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)載體，具體地說(shuō)涉及一種特異靶向線粒體的真核表達(dá)載體，還涉及其構(gòu)建方法及用途。
背景技術(shù)：
人線粒體DNA是哺乳動(dòng)物核基因組外唯一有自主復(fù)制能力的細(xì)胞器，它通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生機(jī)體所需的能量。1988年Wallace等第一次提出Leber遺傳性視神經(jīng)眼病是由線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變引起。此后的研究發(fā)現(xiàn)約有上百種疾病與mtDNA突變有關(guān)，包括Leler遺傳性視神經(jīng)眼病、線粒體腦肌病、乳酸中毒、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤以及人類老化等。到目前為止，對(duì)于mtDNA突變相關(guān)疾病的治療尚無(wú)有效的措施。由于線粒體疾病的根本原因?yàn)閙tDNA的突變以及突變的mtDNA在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，因此一般的生化手段起不到相應(yīng)的作用。治療線粒體疾病，只有通過(guò)基因治療的手段，輸入正確的線粒體的基因去置換或修正突變的線粒體基因，從而根本上糾正線粒體疾病。
線粒體疾病的基因治療，最關(guān)鍵是使其表達(dá)的基因或蛋白進(jìn)入線粒體內(nèi)部而發(fā)揮活性。De-Grey(Trends Biotechnol.2000，18394-9)認(rèn)為，線粒體疾病治療途徑大致可以分為直接輸入核表達(dá)的蛋白或RNA到線粒體內(nèi)、直接置換線粒體內(nèi)的一個(gè)基因以及在一定范圍內(nèi)限制突變的mtDNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄等。然而目前仍沒(méi)有合適的載體能將DNA特別是mtDNA直接導(dǎo)入線粒體內(nèi)部。
大多數(shù)線粒體多肽是在胞漿中合成，然后導(dǎo)入線粒體，在線粒體內(nèi)正確的位置組裝成最后的蛋白。這是通過(guò)位于外膜、膜內(nèi)腔、內(nèi)膜以及基質(zhì)上若干元件組成的線粒體導(dǎo)入機(jī)制完成的。典型的靶向線粒體基質(zhì)的蛋白的N端有20個(gè)～30個(gè)氨基酸的靶向信號(hào)肽，此信號(hào)肽形成含有大量負(fù)電荷的α螺旋。當(dāng)其在胞漿內(nèi)翻譯后，此蛋白具有導(dǎo)入能力，并在胞漿分子“伴娘”的作用下維持非折疊狀態(tài)，其靶序列與線粒體外膜受體結(jié)合，然后此蛋白在線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶機(jī)制的作用下穿過(guò)外膜上的親水孔道，此時(shí)被拉成線狀。在線粒體基質(zhì)中，信號(hào)序列常被肽酶切掉，而多肽則被組裝到最后的蛋白質(zhì)中。利用這一短的信號(hào)肽足以將附著其上的多肽導(dǎo)向線粒體。在進(jìn)行線粒體基因缺失疾病的治療方法的體外細(xì)胞研究中，導(dǎo)入的正確編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物的N端連以信號(hào)序列，可成功地將其靶向?qū)刖€粒體。
利用蛋白質(zhì)導(dǎo)入機(jī)制，Partikian等(J Cell Biol.1998，140821-829)構(gòu)建了含有COX8前導(dǎo)序列的真核表達(dá)的靶向載體，并將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染到線粒體內(nèi)部。Owen等(Hum Gene Ther.2000；112067-78)把前導(dǎo)序列插入到重組的腺相關(guān)病毒(rAAV)載體中，也成功將外源性綠色熒光蛋白導(dǎo)入到線粒體內(nèi)部。Guy等(Annals of Neurology 2002；52535-542)結(jié)合異位表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建了線粒體靶向的病毒載體，將人的mtDNA的ND4基因定點(diǎn)突變?yōu)楹司幋a的基因，由信號(hào)肽引導(dǎo)成功進(jìn)入線粒體內(nèi)部，為糾正由ND4突變引起的疾病開(kāi)辟了新的途徑。
但目前的靶向線粒體的真核表達(dá)載體同樣面臨著像普通的基因治療所用的真核表達(dá)載體的問(wèn)題，那就是如何高效地將外源基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)部。病毒型載體盡管轉(zhuǎn)染效率高，但其制備復(fù)雜，有免疫原性，不能體內(nèi)反復(fù)應(yīng)用，存在安全性隱患，因此必須進(jìn)一步改善。而非病毒載體最大的問(wèn)題是轉(zhuǎn)染效率低，表達(dá)時(shí)間短暫，且插入的外源基因與選擇標(biāo)記基因由于采用各自獨(dú)立的表達(dá)盒，選擇壓力施加在抗藥基因的表達(dá)上，篩選出克隆的目的基因的表達(dá)往往不高，甚至檢測(cè)不到。目前尚未見(jiàn)到將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的序列引入靶向載體中，建立允許插入基因與篩選基因同時(shí)表達(dá)的靶向線粒體的真核表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是構(gòu)建特異靶向真核細(xì)胞線粒體的真核表達(dá)載體，為線粒體疾病的實(shí)驗(yàn)研究提供一種有用的工具。本發(fā)明公開(kāi)了一種線粒體靶向的真核表達(dá)載體，該載體含有COX8的前導(dǎo)信號(hào)肽作為引導(dǎo)線粒體特異的信號(hào)肽，并提供了CMV立早增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)，和RFP熒光指示信號(hào)。本發(fā)明的載體還包括內(nèi)源性核糖進(jìn)入位點(diǎn)IRES序列。
本發(fā)明的載體可以將一個(gè)外源性的蛋白、或線粒體蛋白通過(guò)異位表達(dá)，在胞漿轉(zhuǎn)錄后，與信號(hào)肽形成融合蛋白，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，進(jìn)入線粒體內(nèi)部而發(fā)揮效應(yīng)。含有的IRES序列允許G418與目的蛋白共表達(dá)。利用本發(fā)明的載體，將外源性的紅色熒光蛋白pDsREDnl中熒光蛋白基因序列克隆至構(gòu)建的載體的多克隆位點(diǎn)，導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體中獲得穩(wěn)定表達(dá)。
本發(fā)明構(gòu)建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP載體質(zhì)粒用于將外源性的由核表達(dá)的線粒體基因，或是由線粒體表達(dá)的線粒體基因通過(guò)異位表達(dá)輸送至線粒體內(nèi)部；本發(fā)明構(gòu)建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP載體質(zhì)粒，含有IRES序列，允許COX8與外源性插入基因構(gòu)成融合的蛋白與neo基因共同表達(dá)，提高克隆篩選效率。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述靶向線粒體的真核表達(dá)載體的制備方法，該方法包括如下步驟1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的構(gòu)建首先選取COX8的前29個(gè)氨基酸作為前導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增其全長(zhǎng)的PCR引物，通過(guò)RT-PCR方法，從人胚肺成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增全長(zhǎng)靶向序列，插入到pcDNA3.1A中，構(gòu)建pcDNAmito。然后將從pDsREDnl上切下來(lái)的RFP克隆至pcDNAmito，構(gòu)建pcDNAmito-RFP。
2.pIRESmito及pIRESmito-RFP載體的構(gòu)建從pcDNAmito及pcDNAmito-RFP中獲取COX8及COX8-RFP，分別插入pIRESneo載體，構(gòu)建pIRESmito及pIRESmito-RFP。
3.pmito-IRES-RFP載體構(gòu)建將COX8克隆至pDsREDnl中，構(gòu)建pmito-RFP。從pIRESneo中獲取IRES片段，克隆至pmito-RFP中，構(gòu)建pmito-IRES-RFP。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述靶向線粒體的真核表達(dá)載體在攜帶、表達(dá)外源基因，提高克隆篩選效率中的應(yīng)用。
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)導(dǎo)入機(jī)制，構(gòu)建了靶向線粒體的真核表達(dá)載體，它包含了來(lái)源于小RNA病毒科腦心肌炎病毒RNA 5’端的一段非翻譯區(qū)的IRES序列。IRES序列具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的功能，即能在內(nèi)部起始位點(diǎn)獨(dú)立啟動(dòng)不依賴帽子的翻譯，其優(yōu)點(diǎn)在于將IRES與多個(gè)非相關(guān)基因連接在一起，可同時(shí)轉(zhuǎn)錄成一條單鏈RNA，但翻譯又是各自獨(dú)立的，這樣就可保證用IRES序列連接的非相關(guān)基因各自獨(dú)立的表達(dá)。利用這一特性，可以使前導(dǎo)信號(hào)與RFP形成的融合基因與篩選抗性基因共同表達(dá)，提高靶向載體轉(zhuǎn)染克隆效率。


圖1為本發(fā)明所用的基本質(zhì)粒載體pcDNAmito的構(gòu)建2為本發(fā)明構(gòu)建pIRESmito的過(guò)程圖3為本發(fā)明構(gòu)建pmito-IRES-RFP的過(guò)程圖4激光共聚焦顯微鏡鑒定結(jié)果。其中a為羅丹明123激發(fā)綠光熒光，b為RFP激發(fā)紅色熒光，c為重合圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 靶向線粒體載體的構(gòu)建一、材料pDsREDl-nl、pIRESneo載體為CLONTECH公司產(chǎn)品。RT-PCR及連接試劑盒購(gòu)于MBI公司。pcDNA3.1/myc-HisA購(gòu)自Invitrogen公司。宿主菌DH5α、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶klenow片段購(gòu)自Takara公司。pGEM-T-Easy載體為Promega公司產(chǎn)品。質(zhì)粒DNA純化、凝膠回收試劑盒為上海申能博彩公司產(chǎn)品。
二、方法與結(jié)果1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的構(gòu)建(1)用PCR擴(kuò)增COX8信號(hào)肽序列根據(jù)線粒體蛋白細(xì)胞色素C氧化亞單位VIII(COX8)的信號(hào)肽序列(Genebank GI1311703)，選取COX8的前29個(gè)氨基酸作為前導(dǎo)序列，其cDNA序列如序列表中序列1所示，設(shè)計(jì)擴(kuò)增COX8前導(dǎo)序列全長(zhǎng)的PCR引物，并在其5’端加上KpN I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，3’端加上EcoR I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，分別如序列表中序列2和序列3所示。
從人胚肺成纖維細(xì)胞中純化總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件94℃變性5min，94℃40s，57℃40s，72℃40s，30循環(huán)，72℃5min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)100bp左右的擴(kuò)增帶，符合設(shè)計(jì)長(zhǎng)度。將PCR產(chǎn)物用無(wú)水乙醇沉淀后，溶于TE中。
(2)連接PCR產(chǎn)物到pGEM-T-Easy載體中將PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下，克隆至pGEM-T-Easy載體中，經(jīng)X-gal/IPTG篩選，獲得陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切鑒定符合大小。
(3)構(gòu)建重組的pcDNAmito及pcDNAmito-RFP從構(gòu)建的含COX8的pGEM-T-Easy載體中用KpNI及EcoR工雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收COX8序列，插入到pcDNA3.1A中的KpN I，EcoR I位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pcDNAmito，經(jīng)內(nèi)切酶、DNA序列分析證實(shí)插入片段正確(圖1)。然后將從pDsREDnl(Clontech公司)上用Not I及EcoR I雙酶切切下來(lái)的RFP克隆至pcDNAmito，構(gòu)建pcDNAmito-RFP。
2.構(gòu)建pIRES-mito及pIRESmito-RFP重組質(zhì)粒首先，KpN I酶切pcDNAmito及pcDNAmito-RFP質(zhì)粒，再用DNA聚合酶Klenow片段補(bǔ)平粘末端后，用Not I酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收COX8及COX8-RFP片段，分別插入到pIRESneo的EcoR V，Not I酶切位點(diǎn)，克隆篩選，獲得pIRESmito及pIRESmito-RFP質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR鑒定符合(圖2)。
本發(fā)明所構(gòu)建的載體的特征是，包含線粒體特異的靶向信號(hào)肽序列，可以將克隆于多克隆位點(diǎn)的目的基因形成融合蛋白而進(jìn)入線粒體內(nèi)部。含有IRES序列，可以使目的基因與G418基因?qū)崿F(xiàn)共同表達(dá)，提高克隆篩選的效率。
3.pmito-IRES-RFP的構(gòu)建及特征(1)構(gòu)建pmito-RFP將pcDNAmito載體用HindIII及EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收含COX8片段，在T4連接酶作用下，克隆至pDsREDnl中，構(gòu)建pmito-RFP。
(2)構(gòu)建pmito-IRES-RFP用Sam I及EcoR I酶切pIRESneo，瓊脂糖凝膠電泳回收IRES片段，同時(shí)用Sam I及EcoR I酶切pmito-RFP，將IRES片段插入到pmito-RFP中的Sam I，EcoR I酶點(diǎn)，構(gòu)建pmito-IRES-RFP(圖3)(3)特征本發(fā)明構(gòu)建的線粒體特異的真核載體pmito-IRES-RFP，具有能特異導(dǎo)向真核細(xì)胞線粒體的靶向信號(hào)序列，并含有紅色熒光的指示信號(hào)。含有IRES序列，允許插入片段與紅色熒光蛋白同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)，且紅色熒光蛋白定位于胞漿中減少外源性蛋白進(jìn)入線粒體的不利因素。
實(shí)施例2 pIRES-mito及pIRES-mito-RFP在腫瘤細(xì)胞系Hela中的表達(dá)一、材料lipofectamine2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrgene公司，DMEM購(gòu)自Gibco BRL公司，羅丹明123，G418為Sigma公司產(chǎn)品，Radiance2000型激光共聚焦顯微鏡(LSCM)系美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。
二、方法1.采用SDS堿裂解-聚乙二醇沉淀法純化pIRESmito-RFP，pcDNAmito-RFP及pDsREDnl質(zhì)粒DNA。
2.轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞按6×104個(gè)細(xì)胞/孔將Hela細(xì)胞接種24孔扳上，待細(xì)胞長(zhǎng)至50％融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。pIRESmito-RFP及pDsREDnl分別按1∶3加lipofectamin2000脂質(zhì)體，混勻并置室溫下孵育30min后，加于培養(yǎng)板中，置37℃，30％CO2孵箱培養(yǎng)5h，棄含質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，加入10％小牛血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。
3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在16、24、48、72h于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)；穩(wěn)定表達(dá)在72h時(shí)按1∶8-1∶10傳代，加入200μg/ml的G418壓力篩選，至克隆出現(xiàn)，挑取克隆繼續(xù)用100μg/ml的G418維持。
4.激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步鑒定將克隆細(xì)胞傳代至6孔板內(nèi)，內(nèi)含有小蓋玻片，至50％單層時(shí)，棄培養(yǎng)基并用PBS沖洗細(xì)胞，加1mg/ml羅丹明123，37℃避光溫育15min，吸去標(biāo)記液，用PBS沖洗后封片，激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)。羅丹明123在激發(fā)波長(zhǎng)504nm激發(fā)綠光，作為線粒體的示蹤劑，RFP在激發(fā)波長(zhǎng)558nm激發(fā)紅色熒光。
5.G418篩選陽(yáng)性率轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞經(jīng)G418篩選，20天后培養(yǎng)板中清晰可見(jiàn)克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數(shù)克隆數(shù)和產(chǎn)生熒光的克隆數(shù)，結(jié)果pIRES-mito-RFP轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中共獲得11個(gè)克隆，獲得8個(gè)紅色熒光克隆，而轉(zhuǎn)染pcDNAmito-RFP的Hela細(xì)胞孔中共有9個(gè)克隆，只有2個(gè)克隆中有紅色熒光。pIRES-mito-RFP的轉(zhuǎn)染的形成克隆的基因表達(dá)率明顯高于pcDNAmito-RFP。
三、結(jié)果1.表達(dá)蛋白的檢測(cè)在熒光顯微鏡下，pIRES-mito-RFP在16h觀察到散在的紅色熒光，熒光定位于胞漿呈散在顆粒，至72h時(shí)熒光最強(qiáng)，熒光信號(hào)彌散于整個(gè)胞漿，胞核沒(méi)有熒光出現(xiàn)；而對(duì)照質(zhì)粒pDsREDnl產(chǎn)生的紅色熒光均勻充滿整個(gè)細(xì)胞。
2.激光共聚焦顯微鏡鑒定結(jié)果紅色熒光蛋白的散在顆粒的位置與羅丹明123激發(fā)的綠色熒光的位置相同，證明在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，信號(hào)肽與RFP產(chǎn)生的融合蛋白特異進(jìn)入線粒體內(nèi)內(nèi)部(圖4)。
3.G418篩選陽(yáng)性率在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數(shù)克隆數(shù)和產(chǎn)生熒光的克隆數(shù)，結(jié)果pIRES-mito-RFP轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中共獲得11個(gè)克隆，獲得8個(gè)紅色熒光克隆，而轉(zhuǎn)染pcDNAmito-RFP的Hela細(xì)胞孔中共有9個(gè)克隆，只有2個(gè)克隆中有紅色熒光。pIRES-mito-RFP的轉(zhuǎn)染的形成克隆的基因表達(dá)率明顯高于pcDNAmito-RFP。
實(shí)施例3 pmito-IRES-RFP在腫瘤細(xì)胞系Hela中的表達(dá)一、材料lipofectamine2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrgene公司，DMEM購(gòu)自Gibco BRL公司，羅丹明123、G418為Sigma公司產(chǎn)品，Radiance2000型激光共聚焦顯微鏡(LSCM)系美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。
二、方法1.采用SDS堿裂解-聚乙二醇沉淀法純化pmito-IRES-RFP，pmito-RFP質(zhì)粒DNA。
2.轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞按6×104個(gè)細(xì)胞/孔將Hela細(xì)胞接種24孔扳上，待細(xì)胞長(zhǎng)至50％融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。Pmito-IRES-RFP及pmito-RFP分別按1∶3加lipofectamin2000脂質(zhì)體，混勻并置室溫下孵育30min后，加于培養(yǎng)板中，置37℃，3％CO2孵箱培養(yǎng)5h，棄含質(zhì)粒DNA/月旨質(zhì)體的培養(yǎng)基，加入10％小牛血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。
3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在16、24、48、72h于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)；穩(wěn)定表達(dá)在72h時(shí)按1∶8-1∶10傳代，加入200μg/ml的G418壓力篩選，至克隆出現(xiàn)，挑取克隆繼續(xù)用100μg/ml的G418維持。
4.G418篩選陽(yáng)性率轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞經(jīng)G418篩選，20天后培養(yǎng)板中清晰可見(jiàn)克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數(shù)克隆數(shù)和產(chǎn)生熒光的克隆數(shù)。
三、結(jié)果1.表達(dá)蛋白的檢測(cè)在熒光顯微鏡下，24h觀察到散在的紅色熒光，pmito-RFP熒光定位于胞漿呈散在顆粒，至72h時(shí)熒光最強(qiáng)，熒光信號(hào)彌散于整個(gè)胞漿，胞核沒(méi)有熒光出現(xiàn)；而pmito-IRES-RFP在24h只有個(gè)別的熒光產(chǎn)生，至72h時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng)，紅色熒光均勻分布整個(gè)細(xì)胞。
3.G418篩選陽(yáng)性率轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞經(jīng)G418篩選，20天后培養(yǎng)板中清晰可見(jiàn)克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數(shù)克隆數(shù)和產(chǎn)生熒光的克隆數(shù)，結(jié)果pmito-IRES-RFP轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中共獲得8個(gè)克隆，獲得6個(gè)紅色熒光克隆，而轉(zhuǎn)染pmito-RFP的Hela細(xì)胞孔中共有15個(gè)克隆，只有4個(gè)克隆中有紅色熒光。Pmito-IRES-RFP的轉(zhuǎn)染的形成克隆的基因表達(dá)率明顯高于pmito-RFP。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種特異靶向線粒體的真核表達(dá)載體，其構(gòu)建方法及用途<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>87<212>DNA<213>
<400>1atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca60gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttg 87<210>2<211>27<212>DNA<213>
<400>2cggggtacca tgtccgtcct gacgccg 27<210>3<211>29<212>DNA<213>
<400>3ggccttaagc aacgaatgga tcttggcgc 29
權(quán)利要求
1.一種特異靶向線粒體的真核表達(dá)載體，其特征在于含有COX8的前導(dǎo)信號(hào)肽、HCMV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)，以及RFP紅色熒光指示信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述真核表達(dá)載體，其特征在于含有內(nèi)源性核糖進(jìn)入位點(diǎn)IRES序列。
3.權(quán)利要求1或2所述真核表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟(1)將COX8的前導(dǎo)序列插入到pcDNA3.1A中，構(gòu)建pcDNAmito載體；(2)從pDsREDn1中制備RFP，克隆至pcDNAmito，制備pcDNAmito-RFP；(3)從上述制備的兩載體中制備COX8及COX8-RFP，分別克隆至pIRESneo中，制備pIRESmito及pIRESmito-RFP載體；(4)將COX8克隆至pDsREDn1中制備pmito-RFP，從pIRESneo中制備IRES片段，將其克隆至pmito-RFP中，制備pmito-IRES-RFP。
4.權(quán)利要求1或2所述pIRESmito及pmito-IRES-RFP載體在攜帶、表達(dá)外源基因，提高克隆篩選效率中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向線粒體表達(dá)載體，還公開(kāi)了其制備方法及用途。本發(fā)明的載體，含有COX的前導(dǎo)信號(hào)肽序列、HCMV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)、以及RFP紅色熒光指示信號(hào)。本發(fā)明載體的制備方法包括pcDNAmito的制備、pcDNAmito－RFP的制備、pIRESmito及pIRESmito－RFP制備，及pmito－IRES－RFP的制備等步驟。本發(fā)明的載體可以將外源基因插入到載體多克隆位點(diǎn)，用于將外源基因輸送至線粒體內(nèi)部；還可用于將外源性插入基因與COX8、neo基因共表達(dá)，提高克隆篩選效率。
文檔編號(hào)C12N15/65GK1847401SQ20051012379
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2005年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者陸應(yīng)麟, 郝好杰, 徐元基, 王妍, 杜芝燕 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所