專利名稱：：作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)移胞質(zhì)體受體的未激活卵母細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包括(但不限于)遺傳選擇和/或遺傳修飾動物在內(nèi)的動物的產(chǎn)生，涉及可用于產(chǎn)生這些動物的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：通過將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至一個去核卵母細(xì)胞或一個細(xì)胞合子中重組哺乳動物胚，使生產(chǎn)遺傳相同的個體。這顯然既有利于研究(即作為生物學(xué)控制)，也有利于商業(yè)應(yīng)用(即有遺傳價(jià)值的家畜的繁殖、肉產(chǎn)品的均一性、動物管理)。首先計(jì)劃通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移重組胚(Spemann，EmbryonicDevelopmentandInduction210-211HofnerPublishingCo.，NewYork(1938))，目的是為了回答核等值或‘核在發(fā)育期間改變嗎？’的問題。設(shè)計(jì)這些實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)移來自不斷發(fā)育的胚胎期的核以確定核在什么時候其發(fā)育潛能變?yōu)槭芟拗?。由于技術(shù)上的限制以及Spemann的不幸去世，直至1952年才完成這些研究，這時證明在青蛙中，某些核可以指導(dǎo)青蛙發(fā)育為性成熟的成體(Briggs和King，Proc.NatlAcad.Sci.USA38455-461(1952))。他們的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生目前的概念當(dāng)來自單一個體的同等全能核轉(zhuǎn)移至去核卵時，產(chǎn)生“遺傳上相同”的個體。其真正含義是，由于每個個體中未知的胞質(zhì)對核轉(zhuǎn)移的影響不同，這些個體不是克隆，并且也必須證明不存在任何染色體重排。自從證明兩棲類動物中的胚克隆，相似的技術(shù)已被用于哺乳動物物種中。這些技術(shù)分為兩類1)將供體核轉(zhuǎn)移至已經(jīng)除去染色體DNA的成熟的中期II卵母細(xì)胞中，以及2)將供體核轉(zhuǎn)移至一個已除去兩個原核的受精細(xì)胞合子中。在有蹄類動物中，采用前一方法，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道不在交換原核時采用后一方法細(xì)胞合子不發(fā)育。一般通過誘導(dǎo)細(xì)胞融合，將供體核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中。在有蹄類動物中，通過在該對細(xì)胞(couplet)的接觸/融合平面上施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的同樣脈沖也激活受體卵母細(xì)胞。胚重組后的進(jìn)一步發(fā)育取決于多種因素，包括該核指導(dǎo)發(fā)育的能力-即全能性、受體胞質(zhì)體的發(fā)育感受態(tài)(即卵母細(xì)胞的成熟)、卵母細(xì)胞激活、胚培養(yǎng)(Campbell和Wilmut在VthWorldCongressonGeneticsasAppliedtoLivestock20180-187(1994)中的綜述)。除上述因素外，我們已經(jīng)表明在重組胚的第一細(xì)胞周期維持正確的倍性是至關(guān)重要的(Campbell等，Biol.Reprod.49933-942(1993)；Campbell等，Biol.Reprod.501385-1393(1994))。在單個細(xì)胞周期中，在有絲分裂前所有基因組DNA必須復(fù)制一次并且只復(fù)制一次。如果任何DNA或者不能復(fù)制，或者復(fù)制多于一次，那么在有絲分裂時該核的倍性將不正確。在每個細(xì)胞周期中復(fù)制限于一個循環(huán)的機(jī)制尚不清楚，然而，幾種證據(jù)的跡象表明，完整的核膜對于這一控制是決定性的。已經(jīng)在包括小鼠(Czolowiska等，J.CellSci.6919-34(1984))、兔(Collas和Robl，Biol.Reprod.45455-465(1991))、豬(Prather等，J.Exp.Zool.225355-358(1990))、母牛(Kanka等，Mol.Reprod.Dev.29110-116(1991))在內(nèi)的多個物種中研究了在供體核轉(zhuǎn)移到去核中期II卵母細(xì)胞后發(fā)生在供體核中的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象。恰好在融合時，供體核膜破裂(NEBD)，染色體早熟濃縮(PCC)。這些作用是由稱為成熟/有絲分裂/減數(shù)分裂啟動因子(MPF)的胞質(zhì)活性催化。在所有有絲分裂和減數(shù)分裂的細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了該活性，在中期達(dá)到最大活性。成熟的哺乳動物卵母細(xì)胞停頓在第二成熟分裂的中期(中期II)并具有高M(jìn)PF活性。受精時或激活時，MPF活性下降，完成第二成熟分裂并擠出第二極體，然后染色質(zhì)去濃縮，發(fā)生原核形成。在核轉(zhuǎn)移重組胚中，當(dāng)MPF水平高時，發(fā)生NEBD和PCC；當(dāng)MPF活性下降時，在這些現(xiàn)象發(fā)生后，染色質(zhì)去濃縮，再形成核，隨后進(jìn)行DNA復(fù)制。在重組胚中，可以用兩種方法中的一種維持正確的倍性；第一種方法是在激活時，將限定的細(xì)胞周期階段的核(例如G1期細(xì)胞的二倍體核)轉(zhuǎn)移到中期II卵母細(xì)胞中；或第二種方法是激活受體卵母細(xì)胞，在MPF活性消失后轉(zhuǎn)移供體核。在羊中，采用16個細(xì)胞胚的分裂球作為核供體時，這后一方法已經(jīng)將發(fā)育至胚囊期的頻率由重組胚的21％提高至55％(Campbell等，Biol.Reprod.501385-1393(1994))。這些重組胚發(fā)育頻率的提高尚未回答核重編程序的問題。在發(fā)育期間，某些基因變?yōu)椤翱躺嫌浱枴保窗l(fā)生改變，使得他們不再轉(zhuǎn)錄。對印痕的研究已經(jīng)表明，在生殖細(xì)胞形成期間除去該“印痕”(即重編程序)。一個可能性是，這種重編程序受染色質(zhì)暴露于經(jīng)歷減數(shù)分裂細(xì)胞中存在的胞質(zhì)因子的影響。這產(chǎn)生一個問題在通過核轉(zhuǎn)移重組胚期間，我們?nèi)绾文M這一情形以便重編供體核發(fā)育鐘的程序?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果維持正常倍性(即二倍性)并且該胚在核轉(zhuǎn)移時不激活，那么將核轉(zhuǎn)移到停頓在中期II的卵母細(xì)胞中可以產(chǎn)生能活胚。激活的延遲使得該核一直暴露于受體胞質(zhì)中。
發(fā)明內(nèi)容按照本發(fā)明的第一個方面，提供一個重組動物胚的方法，該方法包括將二倍體核轉(zhuǎn)移到停頓在第二成熟分裂中期的卵母細(xì)胞中，同時不激活卵母細(xì)胞，保持該核暴露于受體胞質(zhì)中，暴露時間足以使重組胚變得能夠產(chǎn)生活體分娩，隨后激活重組胚，同時維持正確的倍性。在該階段，重組胚為單細(xì)胞。原則上，本發(fā)明可應(yīng)用于所有動物，包括諸如家禽之類的鳥、兩棲類物種和魚物種。然而實(shí)際上，對于非人類動物，尤其是非人類哺乳動物，特別是有胎盤哺乳動物而言，它是目前想象的最具有商業(yè)用途的應(yīng)用。對于有蹄類動物，特別是經(jīng)濟(jì)上重要的有蹄類動物，諸如牛、羊、山羊、水牛、駱駝和豬等，本發(fā)明作為克隆動物的方法和作為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法，都可能是最有用的。大家也應(yīng)該注意到，本發(fā)明也可以應(yīng)用于其它經(jīng)濟(jì)上重要的動物物種，諸如馬、駝羊或嚙齒動物，例如大鼠和小鼠或兔。本發(fā)明同樣可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)中。可以由遺傳改變的供體細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。與常規(guī)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因(即遺傳修飾的)動物的方法相比，整個方法有幾個優(yōu)點(diǎn)，可以總結(jié)如下(1)需要較少的受體；(2)可以采用克隆的供體細(xì)胞產(chǎn)生多個同系基因建立者；(3)允許通過基因靶進(jìn)行精細(xì)的遺傳改變；(4)由于每個動物都得自單個核，因此由通過本發(fā)明制備的胚生產(chǎn)的所有動物都應(yīng)該通過種系傳遞相關(guān)的遺傳修飾；相反，在通過胚囊注射包含修飾的干細(xì)胞種群后，通過原核注射或嵌合現(xiàn)象生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，產(chǎn)生一部分嵌合動物，在后者中，不是所有的細(xì)胞都含有該修飾，可能不通過種系傳遞該修飾；(5)在產(chǎn)生整個動物之前，可以選擇具有遺傳修飾(例如整合)位點(diǎn)的細(xì)胞。大家應(yīng)該注意，與動物有關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不應(yīng)該有限地用來指種系中含有一個或多個另一物種基因的動物，盡管許多轉(zhuǎn)基因動物含有這樣的一個或多個基因。相反地，更廣義地講，該術(shù)語是指其種系為重組DNA技術(shù)進(jìn)行技術(shù)介入的對象的任何動物。因此，本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因動物既是例如種系中缺失、復(fù)制、激活或修飾一個內(nèi)源基因的動物，也是種系中加入外源DNA序列的動物。在該動物為轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明實(shí)施方案中，對供體核進(jìn)行遺傳修飾。供體核可以含有一個或多個轉(zhuǎn)基因，可以在核轉(zhuǎn)移和胚重組之前進(jìn)行遺傳修飾。盡管與注射到合子的雄性原核或雌性原核類似的微注射可以用作遺傳修飾的方法，但本發(fā)明不限于該方法也可以使用物質(zhì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染或脂染(1ipofection)。在上述本發(fā)明方法中，二倍體核由供體轉(zhuǎn)移至去核受體卵母細(xì)胞中。供體在轉(zhuǎn)移時必需為二倍體，以便維持重組胚的正確倍性；因此，供體可以或者處于G1期，或者最好為我們今天申請的共同未決的PCT專利申請PCT/GB96/02099(由GB9517780.4要求優(yōu)先權(quán))的對象-處于細(xì)胞周期的G0期。有絲分裂細(xì)胞周期有四個不同的時期，為G、S、G2和M期。在細(xì)胞周期中稱為起始(start)的開始現(xiàn)象發(fā)生在G1期，具有獨(dú)特的功能。在起始時作出進(jìn)行另一細(xì)胞周期的決定或保證。一旦細(xì)胞通過起始，則細(xì)胞通過余下的G1期，這是前DNA合成期。DNA合成時，為第二階段S期。隨后為G2期，為DNA合成與有絲分裂之間的時期。有絲分裂本身發(fā)生在M期。一般認(rèn)為靜止細(xì)胞(包括已經(jīng)誘導(dǎo)靜止的細(xì)胞以及天然靜止的細(xì)胞，諸如某些完全分化的細(xì)胞)不處于該周期四個時期中的任一期內(nèi)；通常描述它們處于G0狀態(tài)，以便表示它們不能正常地通過該周期進(jìn)行。同G1細(xì)胞的核一樣，靜止G0細(xì)胞的核具有二倍體DNA含量；這兩種二倍體核都可以用于本發(fā)明中。根據(jù)上述描述，我們相信對于可以用于核供體的細(xì)胞沒有明顯的限制如細(xì)胞可以體外培養(yǎng)或體外(exvivo)提煉一樣，可以使用完分化或部分分化的細(xì)胞或未分化細(xì)胞。唯一的限制是，供體細(xì)胞具有正常的DNA含量并且核型正常。在我們共同未決的專利申請PCT專利申請PCT/GB95/02095(以WO96/07732公開)中公開了推薦的細(xì)胞源。我們相信所有這類正常細(xì)胞都含有產(chǎn)生成年動物所需的所有遺傳信息。本發(fā)明通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，允許為發(fā)育中的胚提供該信息，使得遺傳物質(zhì)可以重新指導(dǎo)發(fā)育。可用于本發(fā)明的受體細(xì)胞為停頓在第二成熟分裂中期的去核卵母細(xì)胞。在大多數(shù)脊椎動物中，卵母細(xì)胞的成熟在體內(nèi)進(jìn)行至這一卵成熟過程的相當(dāng)晚的時期，然后停頓。排卵時，停頓的卵母細(xì)胞從卵巢中排出(如果發(fā)生受精，那么自然刺激卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂)。在本發(fā)明的實(shí)施中，卵細(xì)胞可以或者體外成熟，或者體內(nèi)成熟，分別在出現(xiàn)第一極體時，或在排卵后盡可能快地收集卵母細(xì)胞。受體最好去核。盡管一般假定在核轉(zhuǎn)移方法中受體卵母細(xì)胞的去核是必需的，但該判斷沒有公開的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。最初描述用于有蹄類動物的方法涉及將該細(xì)胞分裂為兩半，其中一半可以去核(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。該方法的缺點(diǎn)是，未知的另一半仍具有中期器，并且胞質(zhì)體積減小將促進(jìn)新胚的分化模式(Eviskov等，Development109322-328(1990))。新近，已經(jīng)使用不同的方法試圖除去染色質(zhì)，同時除去最小量的胞質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)吸出第一極體和相鄰的胞質(zhì)除去67％羊卵母細(xì)胞中的中期II器(Smith&WilmutBiol.Reprod.401027-1035(1989))。只有使用DNA特異性熒光染料(Hoechst33342)提供的一個方法，用該方法去核可以保證最小限度地減少胞質(zhì)體積(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))。在家畜物種中，這可能是一個目前常規(guī)使用的方法(Prather&FirstJ.Rprod.Fertil.Suppl.41125(1990))；Westhusin等，Biol.Reprod.(Suppl.)42176(1990))。在哺乳動物中很少有非侵入性去核方法，而在兩棲類動物中，將用紫外光輻射用作常規(guī)方法(GurdonQ.J.Microsc.Soc.101299-311(1960))。盡管在使用DNA特異性熒光染料期間，注意到小鼠卵母細(xì)胞暴露于紫外光超過30秒，將減小該細(xì)胞發(fā)育的潛力(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))，但在哺乳動物中沒有使用該方法的詳細(xì)報(bào)道。如上所述，可以通過實(shí)際除去核、原核或中期板(取決于受體細(xì)胞)進(jìn)行物理性去核，或者諸如通過應(yīng)用紫外光輻射或另一種去核影響，進(jìn)行功能性去核。去核后，或者在不誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活的條件下與供體細(xì)胞融合，或者通過在非激活條件下進(jìn)行注射導(dǎo)入供體核。為維持重組胚的正確倍性，供體核融合時必須為二倍體(即為細(xì)胞周期的G0或G1期)。一旦已經(jīng)制備出適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞和受體細(xì)胞，那么前者的核必需轉(zhuǎn)移到后者中。更好是通過融合進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。不應(yīng)該在融合時進(jìn)行激活。已經(jīng)建立的用來誘導(dǎo)融合的三個方法為(1)將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)藥品，諸如聚乙二醇；(2)使用失活病毒，諸如仙臺病毒；(3)使用電刺激。將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)藥品(諸如聚乙二醇或其它二醇)為體細(xì)胞融合的常規(guī)方法，但它尚未廣泛地用于胚。由于聚乙二醇有毒，必需將細(xì)胞進(jìn)行最短時間的暴露，需要能夠快速除去化學(xué)藥品迫使除去透明帶(Kanka等，Mol.Rprod.Dev.29110-116(1991))。在用小鼠胚的實(shí)驗(yàn)中，失活仙臺病毒提供一個融合卵裂期胚的細(xì)胞的有效方法(GrahamWistarInst.Symp.Monogr.919(1969))，其另一實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是不誘導(dǎo)激活。在有蹄類動物中，通常使用與誘導(dǎo)單性生殖激活相同的電刺激達(dá)到融合(WilladsenNature320(6)63-65(1986)；Prather等，Biol.Rprod.37859-866(1987))。在這些物種中，仙臺病毒在一部分情況下誘導(dǎo)融合，但不能完全用于常規(guī)應(yīng)用(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。盡管細(xì)胞-細(xì)胞融合為進(jìn)行核轉(zhuǎn)移的推薦方法，但它不是可以使用的唯一方法。其它適宜的技術(shù)包括微注射(Ritchie和Campbell，J.ReproductionandFertilityAbstractSeriesNo.15，第60頁)。在本發(fā)明的推薦實(shí)施方案中，在缺乏激活的情況下，通過在0.3M甘露醇溶液或0.27M蔗糖溶液中進(jìn)行電脈沖處理，完成卵母細(xì)胞細(xì)胞核對(couplet)的融合；另一方法是，可以通過在無鈣培養(yǎng)基中進(jìn)行注射導(dǎo)入該核。融合/注射時卵母細(xì)胞的年齡和融合/注射介質(zhì)缺乏鈣離子，防止受體卵母細(xì)胞激活。實(shí)際上，最好在卵母細(xì)胞達(dá)到中期II后盡可能快地去核和進(jìn)行轉(zhuǎn)移。該時間是在成熟開始(體內(nèi))或激素處理(體外)后，這取決于物種。對于牛或羊，核轉(zhuǎn)移應(yīng)該最好在24小時內(nèi)進(jìn)行；對于豬，應(yīng)該在48小時內(nèi)進(jìn)行；對于小鼠，在12小時內(nèi)進(jìn)行；而對于兔，最好在20-24小時內(nèi)進(jìn)行。盡管可以較遲進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但隨著卵母細(xì)胞年齡變得越來越難以達(dá)到轉(zhuǎn)移。需要高M(jìn)PF活性。隨后，一般回到成熟培養(yǎng)基的融合重組胚維持不被激活，使得供體核暴露于受體胞質(zhì)中，其時間足以使重組胚變得最終能夠產(chǎn)生活體分娩(最好為可育后代)。激活前的最適時間隨物種而變化，這可容易地通過實(shí)驗(yàn)確定。對于牛，6-20小時的時間是合適的。該時間可能至少不低于允許染色體形成的時間，但該時間也不能長到融合對同時激活或者在極端情況下重組胚死亡。當(dāng)應(yīng)該激活時，可以使用任何常規(guī)的或其它適當(dāng)?shù)募せ罘桨浮Ｗ罱膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，單性生殖激活的需求比想象的更復(fù)雜。已經(jīng)假定，激活為全或無現(xiàn)象，能夠誘導(dǎo)原核形成的多種處理全都引起“激活”。然而，將兔卵母細(xì)胞暴露于重復(fù)的電脈沖表明，僅選擇適當(dāng)系列的脈沖并控制Ca2+能夠促進(jìn)二倍體化卵母細(xì)胞發(fā)育至妊娠中期(OzilDevelopment109117-127(1990))。在受精期間，胞內(nèi)鈣濃度重復(fù)地瞬時提高(Cutbertson&CobboldNature316541-542(1985))，相信電脈沖引起類似的鈣濃度的增加。有證據(jù)表明，鈣的瞬變模式隨物種而變化，預(yù)期電脈沖的最佳模式以類似方式變化。在兔中，脈沖之間的間隔大約為4分鐘(OzilDevelopment109117-127(1990))，在小鼠中，為10-20分鐘(Cutbertson&CobboldNature316541-542(1985))，而在母牛中的初步觀察為20-30分鐘(Robl等，SymposiumonCloningMammalsbyNucleartransplantation(seideled.)，ColoradoStateUniversity，24-27(1992))。在大多數(shù)建立的實(shí)驗(yàn)中，用單個電脈沖誘導(dǎo)激活，但新的觀察表明，通過暴露于幾個脈沖，將增加發(fā)育的重組胚比例(Collas&RoblBiol.Reprod.43877-884(1990))。在任一個別情況下，可以進(jìn)行常規(guī)調(diào)整，以優(yōu)化脈沖數(shù)、場強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時間以及培養(yǎng)基的鈣濃度。在本發(fā)明的實(shí)施中，在激活期間必須維持正確的倍性。需要抑制或穩(wěn)定微管聚合，以便防止產(chǎn)生多個原核，由此保持正確的倍性。通過應(yīng)用有效濃度(諸如大約5μg/ml)的微管抑制劑(諸如nocodazole)可以做到這一點(diǎn)。另一方法是，可以使用微管穩(wěn)定劑，諸如taxol。微管的分子組分(微管蛋白)處于聚合和非聚合狀態(tài)之間的動態(tài)平衡。微管抑制劑(諸如nocodazole)防止微管蛋白分子加入微管中，由此打破平衡并導(dǎo)致微管解聚和紡錘體分解。最好在激活前加入微管抑制劑并留有足夠的時間，以確保完成或幾乎完成微管的解聚。在大多數(shù)情況下20-30分鐘可能是足夠的。諸如taxol的微管抑制劑防止紡錘體分解，因此也可以防止產(chǎn)生多個原核。最好在與使用微管抑制劑的相似條件下使用微管穩(wěn)定劑。在激活后應(yīng)該保持微管抑制劑或穩(wěn)定劑的存在，直至形成原核。此后以及在發(fā)生第一分裂前的任何活動中應(yīng)將其除去。在本發(fā)明的推薦實(shí)施方案中，成熟開始后30-42小時(對于牛和羊，即核轉(zhuǎn)移后6-18小時)時，將重組卵母細(xì)胞置于含有nocodazole(5μg/ml)的培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法激活。在激活刺激后，可以在nocodazole中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(取決于物種和卵母細(xì)胞的年齡)。按照本發(fā)明的第二個方面，提供用前述方法制備的活重組動物胚。按照本發(fā)明的第三個方面，提供制備動物的方法，該方法包括(a)按上述方法重組動物胚；(b)使動物由胚發(fā)育至足月；(c)可選地由如此形成的動物進(jìn)行繁殖。上面已經(jīng)深入地描述了步驟(a)。本發(fā)明該方面方法中的第二步-步驟(b)是使動物由胚發(fā)育至足月。這可以直接或間接進(jìn)行。在直接發(fā)育中，簡單地讓步驟(a)的重組胚進(jìn)行發(fā)育，除允許進(jìn)行發(fā)育可能必需的介入外，不用進(jìn)一步的介入。然而在間接發(fā)育中，該胚在完全發(fā)育前可以進(jìn)一步進(jìn)行操作。例如，為了增加產(chǎn)量，可以使胚分裂，克隆細(xì)胞增加?；蛘呋蛄硗猓柚诒景l(fā)明，通過克隆擴(kuò)大培養(yǎng)供體和/或如果采用系列(核)轉(zhuǎn)移方法，可以增加能活胚的產(chǎn)量。由于大多數(shù)胚不“重編程序”(盡管可接受數(shù)量的胚“重編程序”)，可能引起目前得到的胚事囊形成速率的限制。如果是這樣，那么可以如下提高該速率。每個能自身發(fā)育的胚在32-64細(xì)胞階段可以用作核供體；另一方法是，可以使用胚囊期的內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞。如果這些胚實(shí)際上確實(shí)反映出已經(jīng)具有重編程序的基因表達(dá)并且那些核事實(shí)上發(fā)生重編程序(看上去可能是)，那么這樣每個發(fā)育中的胚的繁殖有賴于核轉(zhuǎn)移方法的效率?？赡艿玫降脑黾映潭热Q于細(xì)胞類型。在羊中，通過將16細(xì)胞胚的單個分裂球轉(zhuǎn)移至預(yù)激活的“通用受體”卵母細(xì)胞中，可以容易地獲得55％的胚囊期胚。因此，可以這樣假設(shè)，由單個細(xì)胞發(fā)育的每個胚可以產(chǎn)生8個16細(xì)胞期的胚。盡管這些數(shù)字只是大致的指導(dǎo)原則，但很明顯，在較遲的發(fā)育階段時，收益程度取決于該階段時該方法的效率。除提高產(chǎn)量的權(quán)宜之計(jì)的問題外，重組胚還可以體內(nèi)或體外培養(yǎng)至胚囊。經(jīng)驗(yàn)表明，通過核轉(zhuǎn)移得到的胚與正常胚不同，有時得益于體內(nèi)培養(yǎng)條件或甚至需要體內(nèi)培養(yǎng)條件，而不是胚通常培養(yǎng)的條件(至少在體內(nèi))。不知道其原因。在牛胚常規(guī)增殖中，已經(jīng)將重組胚(一次多個胚)在羊輸卵管中培養(yǎng)5-6天(如Willadsen在MammalianEggTransfer(Adams，E.E.，ed.)185CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida(1982)中所述)。但是在本發(fā)明實(shí)施中，為了保護(hù)該胚，在轉(zhuǎn)移前最好應(yīng)該將該胚包埋在保護(hù)性培養(yǎng)基(諸如瓊脂)中，然后在從臨時受體回收后從瓊脂中解剖出來。保護(hù)性瓊脂或其它培養(yǎng)基的功能有兩個第一，它起該胚的結(jié)構(gòu)輔助器的作用，使透明帶保持在一起；第二，它對受體動物的免疫系統(tǒng)細(xì)胞起屏障的作用。盡管該方法提高形成胚囊的胚的比例，但其缺點(diǎn)是可能損失大量的胚。如果使用體外培養(yǎng)條件，那么本領(lǐng)域采用的那些常規(guī)條件是相當(dāng)可接受的。在胚囊期，可以篩選該胚發(fā)育至足月的適應(yīng)性。通常，這在該胚為轉(zhuǎn)基因和進(jìn)行篩選，并且已經(jīng)選擇穩(wěn)定的整合體時進(jìn)行。在該階段也可以篩選非轉(zhuǎn)基因的遺傳標(biāo)記。然而，因?yàn)楸景l(fā)明方法允許早期篩選供體，因此一般最好進(jìn)行篩選。如果進(jìn)行篩選，那么在篩選后，讓胚囊胚發(fā)育至足月。這一般在體內(nèi)進(jìn)行。如果在體外發(fā)育至胚囊，那么在該階段轉(zhuǎn)移到最終受體動物中。如果在體內(nèi)進(jìn)行胚囊發(fā)育，那么盡管原則上可以讓胚囊在胚囊前宿主中發(fā)育至足月，但實(shí)際上通常從(臨時)胚囊前受體中取出胚囊，在從保護(hù)性培養(yǎng)基中解剖出來后，將其轉(zhuǎn)移至(永久)胚囊后受體中。在本發(fā)明該方面的可選步驟(c)中，可以由用先前步驟制備的動物繁殖動物。這樣，可以用一個動物來建立具有所需遺傳特性的一群動物。通過轉(zhuǎn)移來自遺傳相同細(xì)胞的核生產(chǎn)的動物共享相同的核，但嚴(yán)格來講這些動物是不相同的，因?yàn)樗鼈兊米圆煌穆涯讣?xì)胞。不清楚這種不同來源的重要性，但它可能影響商業(yè)品質(zhì)。最近在IowaStateUniversityBreedHerd的奶牛中進(jìn)行的線粒體DNA分析表明與牛奶和生殖性能有關(guān)(Freeman和Beitz，SymposiumonCloningMammalsbyNuclearTransplantation(Seidel，G.E.Jr.，ed.)17-20，ColoradoStateUniversity，Colorado(1992))。仍有待于證實(shí)在整個牛群體中存在相似的作用，并且考慮是否可能或必需在特定情況下考慮卵母細(xì)胞的選擇。在牛育種領(lǐng)域中，由高遺傳價(jià)值供體生產(chǎn)大量胚的能力在通過國家牧群傳播遺傳改良方面可能具有相當(dāng)大的潛在價(jià)值。應(yīng)用范圍取決于每個胚的成本和能夠發(fā)育至足月的轉(zhuǎn)移胚的比例。通過說明和概述，以下流程陳述了可以制備轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因動物的一般方法。該方法包括5個步驟(1)分離二倍體供體細(xì)胞；(2)可選地，例如通過轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)木哂谢虿痪哂羞x擇標(biāo)記的構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因；(2a)可選地篩選和選擇穩(wěn)定的整合體(微注射越過此步驟)；(3)通過核轉(zhuǎn)移進(jìn)行胚重組；(4)體內(nèi)或體外培養(yǎng)至胚囊；(4a)可選地篩選和選擇穩(wěn)定的整合體(如果在2a進(jìn)行篩選，則省略此步驟)或其它所需的特性；(5)必要時轉(zhuǎn)移至最終受體中。與先前建立的核轉(zhuǎn)移方法相比，該方案具有多個優(yōu)點(diǎn)1)供體核的染色質(zhì)可以在缺乏激活的受體卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂胞質(zhì)中暴露適當(dāng)?shù)臅r間。這可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)增加供體核的“重編程序”。2)當(dāng)轉(zhuǎn)移G0/G1核時，維持重組胚的正確倍性。3)現(xiàn)有研究已經(jīng)表明，牛/羊卵母細(xì)胞的激活反應(yīng)性隨年齡而提高。先前觀察到的一個問題是，在未去核的老化卵母細(xì)胞中發(fā)生減數(shù)分裂紡錘體極體的復(fù)制，并觀察到多極紡錘體。然而我們報(bào)道，在重組并維持該MPF水平的胚中，盡管核膜破裂并且發(fā)生染色質(zhì)濃縮，但沒有觀察到形成的紡錘體。早熟濃縮的染色質(zhì)保持緊密集攏，因此我們可以利用老化過程，提高重組胚的激活反應(yīng)，而對重組胚的倍性不產(chǎn)生消極影響。按照本發(fā)明的第四個方面，提供按上述方法制備的動物。本發(fā)明每個方面的推薦特征是對其它方面而言的，可予以必需的修改。現(xiàn)在參考所附的實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例的提供是為了說明本發(fā)明，不要解釋為限制本發(fā)明。在以下描述中參考附圖，其中圖1表明牛卵母細(xì)胞的體外成熟速率。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1采用鈉卵母細(xì)胞的“MAGIC”方法該實(shí)驗(yàn)方法的對象-受體卵母細(xì)胞命名為MAGIC(中期停頓的G1/G0接納胞質(zhì)體MetaphaseArrestedG1/G0AcceptIngCytoplast)受體。研究了體外卵母細(xì)胞成熟期間核和胞質(zhì)的活動。此外，也研究了融合和激活在不同年齡重組的胚中的作用。研究已經(jīng)表明，卵母細(xì)胞的成熟是不同步的；然而，可以從形態(tài)學(xué)上選擇18小時的成熟卵母細(xì)胞群體(圖1)。卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)選擇在圖1中，由當(dāng)?shù)赝涝讏霁@得卵巢，在運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室期間維持28-32℃。用皮下注射針(內(nèi)徑為1.2mm)在直徑為3-10mm的卵泡中吸出丘卵卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC’3)，將其置于無菌塑料通用容器中。將通用容器置于溫室(35℃)中，在倒出四分之三上清液之前，讓卵泡物質(zhì)沉淀10-15分鐘。余下的卵泡材料用等體積添加10％牛血清的解剖培養(yǎng)基(具有Earles鹽(Gibco)的TCM199，75.0mg/l卡那霉素、30.0mMHepes，pH7.4、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)稀釋，轉(zhuǎn)移至85mm陪替氏培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下尋找COC’s。選擇具有至少2-3個致密層的卵丘細(xì)胞的復(fù)合體，在解剖培養(yǎng)基中洗滌3次，轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)基(具有Earles鹽(Gibco)的TC培養(yǎng)基199，75mg/l卡那霉素、30.0mMHepes、7.69mMNaHCO3，pH7.8、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)中，該培養(yǎng)基添加10％牛血清和1×106粒膜細(xì)胞/ml，于39℃在空氣中5％CO2的氛圍中培養(yǎng)在搖床(rockingtable)上。從成熟培養(yǎng)皿中取出卵母細(xì)胞，在乙醇清洗的玻片上濕裝片，在蓋玻片下用5％石油膠凍和95％蠟的混合物將其粘附。然后裝片的胚在新鮮制備的甲醇∶冰醋酸(3∶1)中固定24小時，用45％的乙酸地衣紅(Sigma)染色，用NikonMicrophot-SA相差DIC顯微鏡檢查，圖1中的圖表示MII卵母細(xì)胞的百分比以及具有可見極體的卵母細(xì)胞的百分比。牛卵泡卵母細(xì)胞的激活如果繼續(xù)成熟直至24小時，那么這些卵母細(xì)胞在含鈣甘露醇中的激活比率非常低(24％)(表1a)。然而，從電脈沖介質(zhì)中除去鈣和鎂將防止激活。表1a表示在體外不同時間成熟的牛卵泡卵母細(xì)胞的激活。從成熟培養(yǎng)基中取出卵母細(xì)胞，在激活培養(yǎng)基中洗滌1次，將其置于激活室中，給予80μs的電脈沖1.25kV/cm。表1a*許多2個或多個原核假去核牛卵母細(xì)胞的激活反應(yīng)表1b表示體外成熟的在成熟開始后大約22小時(hpm)時假去核的牛卵母細(xì)胞的激活反應(yīng)。卵母細(xì)胞完全按去核的方法進(jìn)行處理，吸出不含中期板的小體積胞質(zhì)。操作后，給予卵母細(xì)胞1.25KV/cm的單個直流脈沖，放回成熟培養(yǎng)基中，在30hpm和42hpm時將卵母細(xì)胞組裝片、固定和用乙酸地衣紅染色。結(jié)果表明5個單獨(dú)實(shí)驗(yàn)每個時間點(diǎn)時的卵母細(xì)胞數(shù)，按相對于細(xì)胞總數(shù)具有原核的細(xì)胞數(shù)計(jì)。表1bhpm＝開始成熟后的小時數(shù)在去核牛卵母細(xì)胞中形成原核表2表示在與初級牛成纖維細(xì)胞融合(24hpm)并隨后激活(42hpm)的去核卵母細(xì)胞中原核的形成。結(jié)果代表5個實(shí)驗(yàn)。將卵母細(xì)胞分為兩組，A組在激活前在nocodazole中溫育1小時，激活后在nocodazole中溫育6小時。B組不用nocodazole處理。在激活后12小時固定激活的卵母細(xì)胞，并用乙酸地衣紅染色。然后在相差下記錄每個parthenote中的原核(PN)數(shù)。結(jié)果以含有1個或多個原核的激活卵母細(xì)胞百分比表示。表2缺乏形成的紡錘體和缺乏極體表示，為了維持重組胚的正確倍性，那么應(yīng)該只將二倍體(即G0/G1)核轉(zhuǎn)移至該胞質(zhì)環(huán)境中。激活的卵母細(xì)胞在激活刺激前后，在微管抑制劑nocodazole中溫育5小時、1小時，防止形成小核(表2)，因此當(dāng)供體核處于細(xì)胞周期的G0/G1期時，維持重組胚的正確倍性。結(jié)果這些結(jié)果表明i)這些卵母細(xì)胞可以在成熟開始后18小時去核(圖1)；ii)去核卵母細(xì)胞可以在0.3M甘露醇中或者在0.27M蔗糖中與供體分裂球/供體細(xì)胞融合，也可以在缺乏任何激活反應(yīng)的情況下，在無鈣介質(zhì)中注射供體細(xì)胞或供體核；iii)重組胚或脈沖處理的去核卵母細(xì)胞可以在成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不進(jìn)行同時激活；iv)觀察轉(zhuǎn)移的核經(jīng)歷核膜破裂(NEBD)和染色體濃縮。無論在轉(zhuǎn)移核的任何細(xì)胞周期階段，都沒有觀察到形成的減數(shù)分裂/有絲分裂紡錘體；v)這類操作的融合對在30小時和42小時時激活，激活頻率等于未操作的對照卵母細(xì)胞；vi)無論在轉(zhuǎn)移核的任何細(xì)胞周期階段，在隨后激活后都沒有觀察到極體；viii)隨后激活時，每個重組合子形成1-5個小核(表2)。采用“MAGIC”方法重建牛胚在初步實(shí)驗(yàn)中，使用通過血清饑餓5天在細(xì)胞周期G0期同步的初級成纖維細(xì)胞，已經(jīng)將該技術(shù)應(yīng)用于牛胚的重組。結(jié)果總結(jié)于表3中。表3表明通過將核由血清饑餓的(G0)牛初級成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移至去核未激活MII卵母細(xì)胞中重組的牛胚的發(fā)育。在24hpm時重組胚，而在42hpm時該融合對激活。在激活前，融合對在含nocodazole(5μg/ml)的M2培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時，在激活后培養(yǎng)5小時。用80μs的單個直流脈沖1.25KV/cm激活融合對。表3實(shí)施例2采用羊卵母細(xì)胞的“MAGIC”方法我們也已經(jīng)在在體內(nèi)已成熟的羊卵母細(xì)胞中進(jìn)行了與實(shí)施例1相似的觀察?？梢酝ㄟ^在前列腺素處理后24小時，沖洗超刺激母羊的輸卵管，取出新排卵的卵母細(xì)胞。使用無鈣鎂的PBS/1.0％FCS作為沖洗介質(zhì)，防止卵母細(xì)胞激活。卵母細(xì)胞可以在無鈣介質(zhì)中去核，在缺乏激活的情況下按上述方法導(dǎo)入供體細(xì)胞。沒有觀察到形成的紡錘體，在隨后激活時形成多個核，這可以通過nocodazole處理抑制。結(jié)果在羊的初步實(shí)驗(yàn)中，單次妊娠已經(jīng)導(dǎo)致一個活羔羊出生。結(jié)果總結(jié)于表4和表5中。表4表示通過將得自建立的細(xì)胞系的胚轉(zhuǎn)移至未激活的體內(nèi)成熟的去核羊卵母細(xì)胞中重組的羊胚的發(fā)育。由超刺激的蘇格蘭黑臉母羊獲得卵母細(xì)胞，由得自威爾士mountainewe獲得的9天大的胚的胚盤建立細(xì)胞系。重組胚在臨時受體母羊的結(jié)扎輸卵管中培養(yǎng)6天，然后取出，分析發(fā)育。表4表5表示將所有桑椹胚期/胚囊期重組的胚轉(zhuǎn)移至同步的最后受體黑臉母羊的子宮角后，誘導(dǎo)妊娠。該表表明，來自妊娠頻率的每個轉(zhuǎn)移組的胚總數(shù)，以母羊和胚計(jì)，在大多數(shù)情況下，每只母羊轉(zhuǎn)移2個胚。建立了導(dǎo)致單個活羔羊出生的單次雙妊娠。表5權(quán)利要求1.一個重組動物胚的方法，該方法包括將二倍體核轉(zhuǎn)移到停頓在第二成熟分裂中期的卵母細(xì)胞中，同時不激活卵母細(xì)胞，保持該核暴露于受體胞質(zhì)中，暴露時間足以使該胚變得能夠產(chǎn)生活體分娩，隨后激活重組胚，同時維持正確的倍性。2.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的一個方法，其中該動物為有蹄類動物。3.權(quán)利要求2中要求保護(hù)的一個方法，其中該動物為母牛或公牛、豬、山羊、羊、駱駝或水牛。4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中對供體核進(jìn)行遺傳修飾。5.權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中由靜止期細(xì)胞貢獻(xiàn)二倍體核。6.權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中將受體卵母細(xì)胞去核。7.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中通過細(xì)胞融合達(dá)到核轉(zhuǎn)移。8.權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中該動物為母牛或公牛，而在激活前保持供體核暴露于受體胞質(zhì)6-20小時。9.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中在激活期間，通過微管抑制維持正確的倍性。10.權(quán)利要求9中要求保護(hù)的一個方法，其中通過應(yīng)用nocodazole達(dá)到微管抑制。11.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的一個方法，其中在激活期間，通過微管穩(wěn)定維持正確的倍性。12.權(quán)利要求11中要求保護(hù)的一個方法，其中通過應(yīng)用taxol達(dá)到微管穩(wěn)定。13.制備動物的方法，該方法包括(a)按任一前述權(quán)利要求要求保護(hù)的方法重組動物胚；(b)使動物由胚發(fā)育至足月；(c)可選地由如此形成的動物進(jìn)行育種。14.權(quán)利要求13中要求保護(hù)的一個方法，其中該動物胚在完全發(fā)育之前進(jìn)行進(jìn)一步操作。15.權(quán)利要求14中要求保護(hù)的一個方法，其中由該胚得到不止1個動物。16.重組動物胚，它能夠產(chǎn)生活體分娩，并用權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法制備。17.用權(quán)利要求13-15的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法制備的動物。18.由權(quán)利要求16中要求保護(hù)的胚發(fā)育的動物。全文摘要重組一個動物胚胎的方法涉及將二倍體核轉(zhuǎn)移至一個停滯在第二成熟分裂中期的卵母細(xì)胞中。卵母細(xì)胞在轉(zhuǎn)移時是未激活的，因此供體核保持暴露于受體細(xì)胞質(zhì)一定時間?？梢杂赊D(zhuǎn)移時為細(xì)胞周期G0或G1期的細(xì)胞提供二倍體核。隨后，激活重組胚胎。在激活期間，例如通過在諸如nocodazole等的微管抑制劑存在下培養(yǎng)重組胚胎，保持正確的倍性。然后重組胚胎導(dǎo)致一個或多個動物的誕生。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)以及具有高遺傳價(jià)值的非轉(zhuǎn)基因動物。文檔編號C12N15/873GK1772891SQ20051012702公開日2006年5月17日申請日期1996年8月30日優(yōu)先權(quán)日1995年8月31日發(fā)明者K·H·S·坎貝爾,I·維慕特申請人:羅斯林學(xué)院(愛丁堡),英國農(nóng)漁業(yè)及食品部,生物技術(shù)及生物科學(xué)研究委員會