專利名稱：含兩個表達載體的腺苷甲硫氨酸高產菌株及腺苷甲硫氨酸生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵工程。具體而言，本發(fā)明涉及含兩個表達載體的腺苷甲硫氨酸高產菌株的構建方法以及利用此菌株發(fā)酵生產腺苷甲硫氨酸的關鍵技術。
背景技術：
腺苷甲硫氨酸(SAMe)是細胞內主要的甲基供體，是生物體內重要的中間代謝物，參與眾多生化反應。腺苷甲硫氨酸在臨床上主要用于治療抑郁癥、肝病、冠心病和輕度關節(jié)炎。目前國內對腺苷甲硫氨酸的需求完全依賴于進口。
目前國內研究工作的主要缺陷有1、單位體積發(fā)酵液中腺苷甲硫氨酸含量太低，且僅為小試發(fā)酵，未做放大實驗；2、發(fā)酵成本過高，國內研究者使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為分析純及進口蛋白胨酵母粉，所需試劑價格昂貴，不適用于工業(yè)化生產。綜上，國內對發(fā)酵生產腺苷甲硫氨酸的研究僅停留于實驗階段，發(fā)酵產量和發(fā)酵成本都遠遠達不到工業(yè)化生產的要求。這也是國內一些廠家在已有生產批文的情況下仍然沒有腺苷甲硫氨酸產品上市的根本原因。

發(fā)明內容本發(fā)明通過基因工程手段，將控制或影響SAMe表達的兩個載體pPIC-SAM2和pGAPZ-SAM2轉入宿主菌巴斯德畢赤酵母菌株GS115構建成重組的腺苷甲硫氨酸高表達菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2。兩個載體以整合于宿主菌基因組的方式改變宿主菌株細胞內SAMe的代謝調控，大大強化了宿主菌的SAMe表達量。本發(fā)明中含兩個表達載體的工程菌株在丙三醇及甲醇的誘導下，成功克服了培養(yǎng)后期腺苷甲硫氨酸表達量下降等缺陷(含單一表達載體的工程菌株很難克服此缺陷)，五天發(fā)酵時間里可以持續(xù)累積SAMe；SAMe表達量兩倍于含單一表達載體的菌株。結合優(yōu)化的、新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，大大提高了SAMe的產量，降低了生產成本。
腺苷甲硫氨酸雙表達載體的構建和重組菌株的獲得方法按照《分子克隆實驗指南》所述方法，抽提S.Cerevisiae基因組DNA，同時根據Genbank中的Saccharomyces.Cerevisiae來源的S-alenosylmethionine sythetase(SAM2)基因，設計兩條專一引物，以Saccharomyces.Cerevisiae基因組為模板進行PCR擴增，擴增的PCR目的產物回收與pGEM-T載體連接，構建pGEM-T/SAM2載體，用BamHI和EcoRI雙酶切將SAM2切出，分別裝入pPIC3.5k和pGAPZ表達載體中，先將表達質粒pPIC3.5-SAM2用SacI酶線性化，用電轉化法轉入酵母細胞GS115菌，涂布于含G418抗生素的YPD平板，30℃培養(yǎng)3-6天，得到含G418抗性的菌株。經過Dot-blot鑒定及HPLC測定SAM含量，篩選出含量最高的菌株SAM2工程菌。再將pGAPZ-SAM2用Avr II線性化，用電轉化法轉入篩選出來的SAM2工程菌，涂布于含Zeocin抗生素的YPD平板，30℃培養(yǎng)2-5天，得到含pGAPZ-SAM2和pPIC3.5-SAM2的雙載體菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，經過PCR鑒定得陽性菌株，用高氯酸法提取SAM進行HPLC定量分析。結果表明雙載體工程菌的SAMe產量達8.7g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
利用菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵生產腺苷甲硫氨酸的工藝方法將菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵培養(yǎng)五天(培養(yǎng)基為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇、2％蛋氨酸和0.3％PTM1)，發(fā)酵過程中控制pH在5.0-6.0范圍內，溫度30℃，DO值大于30％，先后流加丙三醇、甲醇及PTM1。五天后停止發(fā)酵，將菌體破細胞得SAMe抽提液，用層析柱純化抽提液，得SAMe純品。用HPLC測定含量，在1000L發(fā)酵罐中SAMe最終累積量為14-16g/L發(fā)酵液，處于國內領先水平。
本發(fā)明的效果及意義本發(fā)明從根本上克服了國內腺苷甲硫氨酸研究中存在的產量低、發(fā)酵成本過高的缺陷。本發(fā)明中1000L發(fā)酵罐的產量達14-16g/L發(fā)酵液，所用培養(yǎng)基均為工業(yè)試劑，價格低廉，各項指標均達到了工業(yè)化生產要求；轉向市場后，將徹底改變國內腺苷甲硫氨酸需求完全依賴進口的局面。

附圖1為pPIC-SAM2表達載體構建圖譜。
pPIC3.5k載體結構為乙醇氧化酶1啟動子區(qū)域第1-937bp載體多克隆位點第938-968bp
乙醇氧化酶1轉錄終止區(qū)域981-1314bp組氨酸脫氫酶基因區(qū)域4242-1708bp卡那霉素抗性基因區(qū)域5458-4656bp乙醇氧化酶1基因片段第5850-6607bp來源于pBR322載體的基因片段7689-7016bp氨芐西林抗性基因8694-7834bp附圖2為pGAPZ-SAM2表達載體構建圖譜。
pGAPZ-A載體結構為磷酸丙三醇酸脫氫酶基因啟動子區(qū)域第1-483bp載體多克隆位點第484-563bpmyc抗原決定簇包第564-593bp多聚組氨酸包第609-626bp乙醇氧化酶1轉錄終止區(qū)域第630-970bp轉錄延伸因子1啟動子區(qū)域第971-1381bp合成原核啟動子第1382-1449bp鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1450-1824bp細胞色素合成酶1轉錄終止區(qū)域第1825-2142bp大腸桿菌復制子1(來源于pUC載體)第2153-2826bp具體實施方式以下結合實施例介紹本發(fā)明的技術細節(jié)和具體應用。
實施例一 SAMe雙表達載體的構建及畢赤酵母工程菌株的獲得(一)材料1.1菌株和質粒畢赤酵母(P.pastoris)宿主菌GS115(his4)、E.coliTop10F′酵母表達質粒pGAPZ-A、pPIC3.5K均為Invitrogen公司產品?？寺≠|粒載體pGEM-T為Promega公司產品。E.coli菌株DH5α為華美公司產品。
1.2酶與試劑實驗所用的限制性內切酶(除Avr II為Biolabs公司產品外)、T4-DNA連接酶、Wizard DNA clean-up kit均購自Promega公司；RNeasy Mini Kit、cDNA synthesisKit for RT-PCR(AMV)，DIG DNA Labeling and Detection Kit、尼龍膜等購自Boehringer Mannheim公司，使用方法參照廠家使用說明書。Pichia EasyCompTransformation kit為Invitrogen公司產品；PCR Marker(1543、994、695、515、377、237bp)為華美生物工程公司產品，常規(guī)生化試劑均為國產分析純。
1.3主要儀器DNA合成儀為Backman Instruments Inc.OLIGO 1000M DNA Synthesizer，ABI377測序儀、2400型PCR儀是PE公司產品，水浴鍋、電泳儀、電轉移儀等是LKB公司產品，臺式低溫離心機是Eppendof公司產品。
(二)方法SAM2克隆、載體構建及序列分析2.1.1 RT-PCR擴增SAM2基因利用RT-PCR技術，從Saccharomyces Cerevisiae基因組中制備SAM2基因片斷，并插入克隆載體pGEM-T Vector，進行基因序列的分析。
2.1.2 Saccharomyces Cerevisiae總RNA的獲取收集生長狀態(tài)良好的S.Cerevisiae細胞，離心，按RNeasy Mini Kit的說明書進行操作。提取的總RNA取2ul進行甲醛凝膠電泳，可見清晰的一條帶，證明所提取的RNA無降解。
2.1.3 cDNA第一鏈的合成具體操作參見寶靈曼反轉錄試劑盒說明書進行。反應總體積為20uL，RNA為7.5ug，oligo dT 1uL，10×反轉錄緩沖液2uL，25mmol/LMgCl24uL，2.5mmol/LdNTPS 2uL，RNasin 20單位，反轉錄酶40單位，42℃水浴2hrs，取出置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.4 SAM2基因擴增引物的設計與合成1)引物的設計根據Genbank發(fā)表的Saccharomyces Cerevisiae來源的S-alenosylmethionine sythetase，SAM2基因序列(登陸號為M23368)，及酵母表達質粒pGAPZ-A、pPIC3.5K，設計兩對引物。引物序列如下PP1 5′-GAGGATCCACCATGGCCAAGAGCAAAACT23′(下劃線為BamH I酶切位點)PP2 3′-GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA25′(下劃線為EcoR I酶切位點)PG1 5′-TATTCTAGAACCATGGCCAAGAGCAAAACT23′(下劃線為XbaI酶切位點)PG2 3′-GCGGCCGCCTCGAGAGCCTAGCATAAAGAAA25′(下劃線為XhoI酶切位點)2)引物的合成與純化引物的合成與純化由大連寶生物工程公司完成。
2.2 SAM2基因擴增取反轉錄反應液2ul，加入兩對正、反引物各20umol/L，2.5mmol/L dNTPs4uL，10×PCR反應緩沖液5uL，Taq DNA聚合酶2U，加ddH2O至50uL；熱循環(huán)條件為94℃變性5min.后；94℃，30sec.；43℃，30sec.；72℃，1.0min.；循環(huán)35次后，72℃ 10min。循環(huán)結束后取5uL做1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴增結果，可見有約1200bp的特異擴增帶，與預期的SAM2cDNA大小一致。
2.3 SAM2克隆載體的構建2.3.1用Wizard DNA clean-up kit回收PCR產物，具體操作見Wizard的產品說明書。
2.3.2載體兩種PCR產物按1∶3比例進行pGEM T-Vector克隆，其反應體系為2×buffer 5ulpGEM-T Vector(50ng/ul) 1ulPCR產物 3ulT4-DNA Ligase(3U/ul)1ulTotal volume10ul4℃冰箱放置18hrs。
2.3.3 DH5α感受態(tài)細胞制備 用CaCl2法制備，具體操作參見《分子克隆實驗指南》2.3.4 重組體轉化 以改良法進行，具體操作為新配制2∶1的0.1mol/LCaCl2/2×SSC混合液，分別加入兩種10uL連接反應液，混勻后，冰上放置1.5min.，立即加入100uL的感受態(tài)細胞，冰上放置時間不少于5min.，42℃熱擊2min.，冰浴1min.后，分別涂布LB Amp.100ug/mL平板，37℃培養(yǎng)16hrs。
2.4重組子鑒定與DNA序列測定2.4.1分別挑取白色單菌落，用LB附加Amp.100ug/mL液體培養(yǎng)基，在37℃搖床上，以300r/min.的轉速，振蕩培養(yǎng)12-16hrs后，用堿法小量提取質粒，提出的質粒分別用BamH I/EcoR I和XhoI/XbaI對重組體作酶切分析，若能切出約1200bp DNA片段，則為陽性克隆。
2.4.2各取一個陽性重組體作中量搖菌和質粒提取，用PEG法純化質粒，具體操作見《分子克隆實驗指南》；用標樣法估測質粒濃度，并校正至200ng/uL用作DNA序列測定。
2.4.3DNA序列測定和分析 測序引物為SP6/T7，測序具體操作程序按PE公司提供的產品說明書進行。將測序正確的質粒分別命名為pGEM-SAM2(pPIC)和pGEM-SAM2(pGAPZ)。
(三)表達載體構建和酵母轉化3.1.1表達載體構建 用BamH I/EcoR I分別酶切pGEM-SAM2(pPIC)和pPIC3.5K，回收目標片段后按常規(guī)方法構建表達載體，即將基因插入AOX1啟動子下游的BamH I/EcoR I位點，構建酵母表達載體pPIC-SAM2，見附圖1。同時用Xho I/Xba I分別酶切pGEM-SAM2(pGAPZ)和pGAPZ-A，回收目標片段后按常規(guī)方法構建表達載體，即將基因插入GAP啟動子下游的Xho I/Xba I位點，構建酵母表達載體pGAPZ-SAM2，見附圖2。兩種載體分別轉化E.coli TOP10F’。E.coliTOP10F’感受態(tài)細胞的制備及連接產物的轉化方法見Pichia產品使用指南。
3.1.2用XhoI/XbaI酶切分析E.coli TOP10F’/pGAPZ-SAM2重組體的質粒，對重組體篩選、鑒定，能切下1200bp片段則為陽性克隆，將陽性克隆載體命名為pGAPZ-SAM2；用BamH I/EcoR I酶切分析E.coli TOP10F’/pPIC-SAM2重組體的質粒，對重組體篩選、鑒定，能切下1200bp片段則為陽性克隆，將陽性克隆載體命名為pPIC-SAM2。從酶切分析的結果可見所篩選鑒定的2個表達載體均為陽性克隆。
3.1.3將篩選到的陽性工程菌株(單菌落)E.coli TOP10F′/pGAPZ-SAM2和E.coli TOP10F’/pPIC-SAM2，用低鹽LB附加zeocin25ug/mL搖活(37℃)，將菌液制成含15％丙三醇的混和液，-70℃冰柜保存；同時在低鹽LB附加zeocin25ug/mL平板上劃線，37℃培養(yǎng)出現單菌落后，貯存于4℃冰箱，作為擴大培養(yǎng)的菌種板。
3.2雙載體工程菌株構建及鑒定分析3.2.1 GS115/pPIC-SAM2工程菌株構建 以Bgl II酶切pPIC-SAM2載體呈線性化并用Pichia EasyComp Transformation Kit轉化酵母P.pastoris GS115，具體操作為(1)Bgl II酶切陽性載體反應體系為10×buffer25ulBgl II(5U/ul) 1ul載體 3ugddH2O定容至 50ul37℃水浴10hrs以上，用2×無水乙醇沉淀，離心去上清，最終溶于5ul。
(2)轉化 酵母轉化操作見Pichia EasyComp Transformation Kit產品使用指南。
3.2.2工程菌株鑒定分析(1)平板篩選 將轉化液涂布于YPD+G418 1.0mg/ml平板，30℃培養(yǎng)2-3天，平板上長出單菌落。
(2)PCR鑒定分析 用牙簽挑取1/4-1/2菌落投入5mLYPD+Zeocin100mg/L液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)24hrs以上，至OD600＝1.8-2.0，以Pichia產品使用指南的方法提取酵母工程菌株基因組DNA，用作PCR的模板，PCR鑒定具體操作見2.2。
(3)點雜交鑒定分析 按DIG DNA Labeling and Detection Kit產品說明書操作。結果表明有90％以上的被鑒定重組菌株為陽性菌株。確定為陽性菌株后可用于進一步的搖瓶發(fā)酵，用高氯酸法提取SAM進行HPLC定量分析。結果表明，GS115/pPIC-SAM2工程菌的SAM產量可達5.1g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
3.2.3 GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2雙載體工程菌株構建以Avr II酶切pGAPZ-SAM2載體呈線性化并用Pichia EasyCompTransformation Kit轉化GS115/pPIC-SAM2工程菌，操作見Pichia EasyCompTransformation Kit產品使用指南。
3.2.4雙載體工程菌株鑒定分析(1)平板篩選 將轉化液涂布于YPD+Zeocin 0.1g/L+G418 1.0g/L平板，30℃培養(yǎng)2-3天，平板上長出單菌落。
(2)PCR鑒定分析 用牙簽挑取1/4-1/2菌落投入5mL YPD+Zeocin100mg/L液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)24hrs以上，至OD600＝1.8-2.0，以Pichia產品使用指南的方法提取酵母工程菌株基因組DNA，用作PCR的模板，并以pGAPZ的專有引物進行PCR鑒定分析。結果表明有80％以上的被鑒定重組菌株為陽性菌株。確定為陽性菌株后作進一步的搖瓶發(fā)酵，用高氯酸法提取SAM進行HPLC定量分析。結果表明GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2雙載體工程菌的腺苷甲硫氨酸產量達8.7g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
實施例二 利用重組菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵生產腺苷甲硫氨酸將GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2工程菌按7.5％的接種量接入培養(yǎng)基中(1000L發(fā)酵罐)，培養(yǎng)基配方為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇和2％蛋氨酸。接種后補加PTM1至終濃度為0.3％，用氨水(28％)調節(jié)pH至5.5，溫度控制在30℃，DO大于30％，培養(yǎng)16-24hrs時工程菌完成對數生長，DO值和pH值均快速上升，此時開始流加50％丙三醇，當濕菌體量大于300g/L發(fā)酵液時停止流加丙三醇，開始流加甲醇，同時流加60％山梨醇，并調節(jié)pH至5.8，培養(yǎng)120hrs時停止發(fā)酵，將菌體破細胞得SAMe抽提液，用層析柱純化抽提液，得SAMe純品。用HPLC測定含量，在1000L發(fā)酵罐中SAMe最終累積量為14.6g/L發(fā)酵液。
權利要求
1.一種腺苷甲硫氨酸高產菌株，其特征在于宿主菌中含兩個腺苷甲硫氨酸表達載體pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，
2.根據權利要求1所述的腺苷甲硫氨酸高產菌株，其特征在于所述的宿主菌為巴斯德畢赤酵母菌株GS115，構建成的重組菌為腺苷甲硫氨酸高表達菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2。
3.一種腺苷甲硫氨酸的生產方法，其特征在于培養(yǎng)腺苷甲硫氨酸高表達菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，收集目標產品。
4.根據權利要求3所述的腺苷甲硫氨酸的生產方法，其特征在于所述的培養(yǎng)工藝為發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，培養(yǎng)基成分為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇、2％蛋氨酸和0.3％PTM1；發(fā)酵過程中控制pH在5.0-6.0范圍內，溫度30℃，DO值大于30％，并先后流加丙三醇和甲醇作為誘導劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含兩個表達載體的腺苷甲硫氨酸高產菌株的構建方法及利用此菌株發(fā)酵生產腺苷甲硫氨酸的關鍵技術。本發(fā)明把影響腺苷甲硫氨酸表達的兩個載體轉入同一宿主菌得到重組菌株GS115/pPIC－SAM2、pGAPZ－SAM2。此菌株在丙三醇及甲醇的誘導下，成功克服了培養(yǎng)后期腺苷甲硫氨酸累積量下降等缺陷，其產量是含單一表達載體菌株的兩倍。結合新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，1000L發(fā)酵罐中腺苷甲硫氨酸產量達14－16g/L發(fā)酵液，遠高于國內研究水平。發(fā)酵所用培養(yǎng)基均為工業(yè)試劑，成本低廉。各項指標都達到了工業(yè)化生產的要求。
文檔編號C12P13/12GK1824768SQ200510129888
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權日2005年12月9日
發(fā)明者梁國棟, 蒲廣西, 鄧剛, 郝新保, 白玉杰 申請人:海南國棟藥物研究所有限公司