專利名稱：高比活HuG－CSF酵母表達(dá)載體、高產(chǎn)菌株及HuG－CSF生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵工程。具體而言，本發(fā)明涉及高比活HuG-CSF酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、分泌表達(dá)HuG-CSF的酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用它來(lái)生產(chǎn)HuG-CSF的分離純化方法。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)和銷售的G-CSF產(chǎn)品都是大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)，不能對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工修飾(如糖基化等)，而且表達(dá)的蛋白多以包涵體形式存在，在生產(chǎn)過(guò)程中需要變性、復(fù)性，但復(fù)性率很低，因此活性低，只有6.0×107IU/mg蛋白，在臨床使用上亦有較大的副作用；并且分離純化過(guò)程十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本很高。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，目標(biāo)蛋白HuG-CSF不需要復(fù)性，其生物比活性可達(dá)8.0×108單位/毫克蛋白；純化過(guò)程非常簡(jiǎn)單，兩次柱層析后即可從發(fā)酵液中提取獲得純度達(dá)98％以上的目標(biāo)蛋白HuG-CSF，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，降低了生產(chǎn)成本。
HuG-CSF酵母重組菌株的構(gòu)建方法為將克隆修飾的HuG-CSF基因插入pGAPZα-A之GAP啟動(dòng)子/α-factor信號(hào)肽下游位點(diǎn)，刪除Kex2位點(diǎn)Lys-Arg之后的Ste13位點(diǎn)Glu-Ala-Glu-Ala，構(gòu)建成HuG-CSF基因分泌型表達(dá)載體；利用Invitrogen公司的PichiaEasyComp Transformation Kit的方法，將HuG-CSF基因分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母(Pichia pastori5)的菌株GS115，構(gòu)建成分泌型表達(dá)HuG-CSF的酵母工程菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115；通過(guò)抗生素篩選、生物比活性測(cè)定和蛋白總量測(cè)定，獲得高表達(dá)的目標(biāo)酵母重組菌株。
上述的酵母重組菌株目標(biāo)蛋白HuG-CSF的表達(dá)量占分泌蛋白總量的80％以上，比活性為8.0×108單位/毫克蛋白；目標(biāo)蛋白HuG-CSF具有與天然HuG-CSF相同的免疫原性。
本工程菌株接受外源基因是以整合于基因組的形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨(dú)立染色體組外的質(zhì)粒表達(dá)體系有顯著差別，故本工程菌株較大腸桿菌、釀酒酵母穩(wěn)定，不易發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象，以本工程菌作為樣品模板，通過(guò)PCR、分子雜交等技術(shù)鑒定選擇出來(lái)的陽(yáng)性菌株一定是真實(shí)可靠的，且其目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物HuG-CSF直接分泌在發(fā)酵液中，因此檢測(cè)其蛋白表達(dá)量及目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性非常簡(jiǎn)易，這較大腸桿菌表達(dá)體系——表達(dá)產(chǎn)物需復(fù)性——優(yōu)越得多；另外，酵母是一種低等真核生物，其表達(dá)后加工模式類似高等真核生物，故用它表達(dá)的基因產(chǎn)物不僅與天然產(chǎn)物有相同的生物活性，而且毒副作用低，產(chǎn)品加工成本低，適用性更廣。
HuG-CSF的純化方法為利用獲得的高產(chǎn)物表達(dá)量、高產(chǎn)物活性的酵母重組菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115進(jìn)行發(fā)酵，離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH在4.0-5.0范圍內(nèi)，過(guò)CM Sepharose層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過(guò)疏水層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，得到HuG-CSF。
本發(fā)明的效果及意義本發(fā)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)HuG-CSF，是由酵母工程菌直接將G-CSF分泌到發(fā)酵液中，分泌的HuG-CSF蛋白占總分泌蛋白的80％以上，表達(dá)量達(dá)到30-40mg蛋白/L發(fā)酵液水平。在分離純化過(guò)程中只需要將離心后的上清液直接過(guò)離子交換柱和疏水柱即可達(dá)到98％以上的純度，比活性可達(dá)到8.0×108IU/mg蛋白。大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用將有良好的經(jīng)濟(jì)效益。附圖
為HuG-CSF表達(dá)載體構(gòu)建圖pGAPZα-A載體結(jié)構(gòu)為磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動(dòng)子區(qū)域第1-483bp
α-交配因子分泌信號(hào)肽序列第493-759bp載體多克隆位點(diǎn)第760-828bpmyc抗原決定簇包第827-856bp多聚組氨酸包第872-889bp乙醇氧化酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第893-1233bp轉(zhuǎn)錄延伸因子1啟動(dòng)子區(qū)域第1234-1644bp合成原核啟動(dòng)子第1645-1712bp鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1713-2087bp細(xì)胞色素合成酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第2088-2405bp大腸桿菌復(fù)制子1(來(lái)源于pUC載體)第2416-3089bp具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明在HuG-CSF重組酵母工程菌株的構(gòu)建和HuG-CSF純化工藝中的具體應(yīng)用。
實(shí)施例1 HuG-CSF酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的獲得(一)材料1.HuG-CSF基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)均購(gòu)自Invitrogen公司。
(二)方法由于HuG-CSF基因的481-486位具有一個(gè)Xho I位點(diǎn)ctcgag，所以通過(guò)引物介導(dǎo)的PCR方法利用同義突變?yōu)閏tcgaa；編碼HuG-CSF基因的全長(zhǎng)序列525bp(不含起始密碼子atg，但含終止密碼子tag)，其5’和3’端分別通過(guò)XhoI(ctcgag)、NotI(gcggccgc)克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pGAPZa-A的多克隆位點(diǎn)。
1.基因PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)在5’端引物中刪除Kex2位點(diǎn)Lys-Arg之后的Ste13位點(diǎn)Glu-Ala-Glu-Ala和起始密碼子ATG。
P1-5’GCCTCGAGAAAAGAACTCCACTGGGTCCAGCACGCTCTCTXhoI Lys-Arg(Kex2位點(diǎn))GCCGCAGTCTTTCCTGC 3’P2-5’TGGCGGCCGCCTACGGCTGGGCCAGGTGACGCAGANotIACGCGGTAAGACACTTC3’(2)熱循環(huán)94℃，5’；94℃，30’’→58℃，30’’→72℃，30’’；72℃，7’；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。
2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與克隆(1)HuG-CSF基因經(jīng)擴(kuò)增電泳后獲得約525bp的DNA帶；(2)用德國(guó)寶靈曼公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物高純度試劑盒回收目標(biāo)片段并進(jìn)行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美國(guó)PE公司生產(chǎn)的ABI 377A DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表達(dá)載體構(gòu)建采用基因克隆技術(shù)將HuG-CSF基因通過(guò)XhoI/NotI插入pGAPZα-A之GAP啟動(dòng)子/α-factor信號(hào)肽下游的Xho I/Not I位點(diǎn)，構(gòu)建成含α-factor信號(hào)肽的分泌型酵母表達(dá)載體。pGAPZα-A/G-CSF表達(dá)載體分子大小為3.672kb。其中pGAPZα-A為3.147kb，HuG-CSF為525bp(包含終止密碼子3bp)；HuG-CSF插入于載體pGAPZα-A第747bp與第810bp(NotI I位點(diǎn))之間。具體情況見(jiàn)附圖一。
5.表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌GS115利用Invitrogen公司生產(chǎn)的Pichia EasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)經(jīng)稍作改進(jìn)的方法進(jìn)行。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法，具體操作如下
(1)挑取畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115單菌落，在30℃，300轉(zhuǎn)/分鐘條件下以YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同樣培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600＝6-8，在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心5分鐘，去上清液，用10毫升溶液I重懸，制成感受態(tài)細(xì)胞；(2)取100微升感受態(tài)，加入5-10微升線性化的HuG-CSF重組表達(dá)載體，再加400毫升溶液II，混勻后28℃培養(yǎng)1小時(shí)，加1毫升YPD，30℃培養(yǎng)1小時(shí)；(3)將培養(yǎng)物在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心15分鐘，去上清，用200毫升溶液III重懸，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，產(chǎn)生單菌落。
6.高表達(dá)酵母工程菌株的獲得用Zeocin抗生素篩選獲得陽(yáng)性菌株后，提取工程菌基因組DNA，進(jìn)一步以引物P1/P2作PCR分析和以德國(guó)寶靈曼公司生產(chǎn)的DiG Labelling and Detection Kit標(biāo)記HuG-CSF基因之525bp DNA片段為探針，進(jìn)行Southern blotting鑒定，篩選出陽(yáng)性菌株，再進(jìn)行生物比活性測(cè)定和總蛋白測(cè)定，結(jié)果表明HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115為高表達(dá)G-CSF的工程菌株。
實(shí)施例2 HuG-CSF的純化方法構(gòu)建HuG-CSF分泌表達(dá)的酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115后，-80℃保存菌種。發(fā)酵前，接種平板，使菌種活化，在YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基中，接種單菌落發(fā)酵36小時(shí)，離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0范圍內(nèi)，過(guò)CM Sepharose層析柱，收集0.4摩爾/升氯化鈉洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過(guò)PhenylSepharose層析柱，收集2％硫酸銨洗脫峰，洗脫液經(jīng)透析后得到純度大于98％的HuG-CSF原液。
權(quán)利要求
1.一種HuG-CSF酵母表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A，其特征在于將克隆修飾的HuG-CSF基因插入pGAPZα-A之GAP啟動(dòng)子/α-factor信號(hào)肽下游位點(diǎn)，刪除載體上Kex2位點(diǎn)Lys-Arg之后的Ste13位點(diǎn)Glu-Ala-Glu-Ala，構(gòu)建成HuG-CSF分泌型表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A。
2.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于宿主被分泌型表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述的宿主為巴斯德畢赤酵母菌株GS115，構(gòu)建成的分泌型HuG-CSF重組酵母菌株為HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115。
4.一種HuG-CSF的純化方法，其特征在于直接從分泌型HuG-CSF酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115的發(fā)酵液中分離純化HuG-CSF離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH在4.0-5.0范圍內(nèi)，過(guò)CM Sepharose層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過(guò)疏水層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，得到HuG-CSF。
全文摘要
本發(fā)明涉及HuG－CSF分泌表達(dá)的酵母菌株HuG－CSF/pGAPZ α－A/GS115構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用此菌株生產(chǎn)HuG－CSF的純化方法。本發(fā)明采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)酵液上清中的HuG－CSF蛋白含量占總分泌蛋白的80％以上，目標(biāo)蛋白HuG－CSF不需要復(fù)性，其生物比活性可達(dá)到8.0×10
文檔編號(hào)C12R1/84GK1824781SQ200510129889
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者梁國(guó)棟, 陳海寧, 鄧剛, 蒲廣西, 郝新保, 白玉杰 申請(qǐng)人:海南國(guó)棟藥物研究所有限公司