專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚羥基脂肪酸酯的生產(chǎn)領(lǐng)域，更具體地本發(fā)明公開(kāi)了一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯尤其是聚羥基丁酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類(lèi)由微生物合成的高分子聚酯，其分子量一般由幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)，廣泛存在于自然界的多種微生物體內(nèi)。它的某些物理性質(zhì)與傳統(tǒng)的由石油合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯類(lèi)似，可由可再生的能源合成，并且可以完全降解，進(jìn)入自然界的生態(tài)循環(huán)，被認(rèn)為是一種可能替代不可降解的傳統(tǒng)塑料的“生物可降解塑料”，引起了世界各國(guó)科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。
生物可分解塑料的共同特點(diǎn)不僅是在自然界可被微生物完全分解而減輕陸地和海洋的污染，而且在廢棄后焚燒處理時(shí)所釋放的CO2量都明顯低于合成塑料，從而能對(duì)保護(hù)地球大氣環(huán)境、減少溫室效應(yīng)起到積極作用。
而以3-羥基丁酸為單體組成的聚3-羥基丁酸酯P(3HB)，因其物理性質(zhì)較脆等而不適合于工業(yè)應(yīng)用。由3-羥基丁酸分別與4-羥基丁酸、3-羥基戊酸或3-羥基己酸共聚合形成的P(3HB-co-4HB)、P(3HB-co-3HV)或P(3HB-co-3HHx)，由于它們具有優(yōu)良的物理和機(jī)械性能(可按不同要求通過(guò)共聚比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，獲得具有不同剛性、結(jié)晶性、熔點(diǎn)和玻璃化溫度適合于不同用途的聚合物材料)，特別是具有生物相容性和可吸收性，能用作生物醫(yī)學(xué)材料，而成為當(dāng)今世界研究最熱門(mén)的PHA之一。
1997年，日本理化學(xué)研究所的主任研究員土肥儀治等發(fā)現(xiàn)在食酸叢毛單孢菌(Comomanas acidovorans IFO 13582，同義代爾夫嗜酸菌Delftia acidovorans)發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入不同的脂肪酸或醇以及控制不同的發(fā)酵條件，可以得到不同種類(lèi)的PHA，特別是獲得具有優(yōu)良物理性能從而有著廣泛用途的3-羥基丁酸與4-羥基丁酸的共聚物P(3HB-co-4HB)(詳見(jiàn)JP08-089264，JP09-098793)。
近年來(lái)，基因重組微生物生產(chǎn)PHA最引人矚目的成就是將真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的PHA生物合成途徑基因和克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的琥珀酰半醛代謝途徑基因都重組到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行表達(dá)。由于琥珀酰半醛代謝途徑以6碳糖或5碳糖為起始物質(zhì)產(chǎn)生4-羥基丁酰輔酶A中間體，它與PHA生物合成途徑的結(jié)合意味著可以不依賴(lài)前體4-羥基丁酸或1，4-丁二醇或γ-丁內(nèi)酯產(chǎn)生4HB單體的PHA共聚物。用葡萄糖為碳源對(duì)這一重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得分子量1.8×106Da，4HB含量1.5mol％，細(xì)胞內(nèi)積蓄量占細(xì)胞干重46％的(P3HB-co-4HB)。另外，早在1988年土肥儀治等就發(fā)現(xiàn)，真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌可以由4-羥基丁酸，γ-丁內(nèi)酯、1，4-丁二醇和1，6-己二醇合成P(3HB-co-4HB)共聚物。通過(guò)調(diào)節(jié)碳、氮源的組成，這一共聚物中4HB的比例可以在0～100％的范圍內(nèi)改變。P(3HB-co-4HB)的生物降解性和材料性能與P(3HB)和P(3HB-co-3HV)都有所不同，因而具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
以γ-丁內(nèi)酯為碳源，在無(wú)氮培養(yǎng)基中用真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌30小時(shí)發(fā)酵，得到分子量240,000～425,000、占細(xì)胞干重29％的共聚物P(3HB-co-4HB)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中γ-丁內(nèi)酯用量由10％增加到25％，所得共聚物中4HB的含量可從9％增加到21％。上述培養(yǎng)基里加入果糖，可提高P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)率和分子量，細(xì)胞中共聚物含量達(dá)細(xì)胞干重的48％，而共聚物中4HB的含量減少為17％。土肥儀治等還用食酸叢毛單胞菌為生產(chǎn)菌，以丁酸或1，4-丁二醇為碳源，獲得的產(chǎn)物分別是P(3HB)和P(3HB-co-4HB)(其中4HB含量為94mol％)。如以丁酸或1，4-丁二醇為混合碳源，則4HB在P(3HB-co-4HB)中的含量隨1，4-丁二醇在混合碳源中的比例增加而增加。所得共聚物不是均一的，而是含有4HB不同含量共聚物的混合物(Appl.Envir.Microbiol.1998 643437-3443.)。
Kim等采用甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.KCTC 0048)細(xì)菌發(fā)酵，以甲醇及γ-丁內(nèi)酯為碳源，也可以得到P(3HB-co-4HB)。聚合物積蓄量為細(xì)胞干重的2.0％～13.1％，其中4HB的含量為1.9％～5.5％(Biotechnol.Lett.，15，1017-1020(1993) 36)。
盡管目前已經(jīng)有利用各種不同的微生物、調(diào)節(jié)底物中炭源、氨源的組成及在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料和控制不同的發(fā)酵條件從而提高P(3HB-co-4HB)產(chǎn)量的方法，但不斷利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)的菌株進(jìn)行改造而得到新的重組菌從而使P(3HB-co-4HB)方便易得一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員著力解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了1.一種新的重組產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008；2.上述1的重組菌的表達(dá)載體pGB_ZV；3.一種獲得上述1所述的重組菌的方法，包括(1)克隆代爾夫菌的PHA解聚酶的基因得到質(zhì)粒pGEMT_phaZ；(2)克隆透明顫菌血紅蛋白基因獲得質(zhì)粒pGEMT_VHb；(3)獲得表達(dá)載體pGEMT_ZV；(4)得到重組產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008。
4.一種利用上述1所述的重組菌產(chǎn)生P(3HB-co-4HB)的方法，包括(1)重組菌進(jìn)行培養(yǎng)；
(2)對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵；(3)分離發(fā)酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。
5.上述5所述的方法，其中重組菌的培養(yǎng)階段培養(yǎng)條件為37℃，220rpm培養(yǎng)5小時(shí)。
6.上述5所述的方法，其中重組菌的發(fā)酵階段發(fā)酵條件為補(bǔ)料分批發(fā)酵30℃發(fā)酵40小時(shí)。
7.上述5所述的方法，其中提取目的物的溶劑為氯仿/無(wú)水乙醇。
8.上述8的方法，其中溶劑氯仿/無(wú)水乙醇的體積比為1∶4。
本發(fā)明將編碼代爾夫菌的胞內(nèi)PHA解聚酶的基因和透明顫菌血紅蛋白基因克隆到質(zhì)粒中，得到了表達(dá)載體pGEMT_ZV，進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化到Delftiasp.中，篩選轉(zhuǎn)化子從而獲得重組突變?nèi)笔HA解聚酶的重組整合型的Delftiasp.一種新的重組產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008。利用此重組菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、發(fā)酵得到P(3HB-co-4HB)，其含量占細(xì)胞干重的30.29％，其中4HB的摩爾百分含量為17.2％，與利用傳統(tǒng)的Delftia acidovorans得到的P(3HB-co-4HB)相比即使在氧缺乏的培養(yǎng)、發(fā)酵條件下仍然可以增加P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)量，從而有利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。


附圖1質(zhì)粒pGEMT_ZV的物理圖譜；具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
本發(fā)明中所用的分子克隆技術(shù)，包括DNA的分離純化、DNA合成、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶切、DNA的連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化篩選都是本領(lǐng)域中非常熟悉的，在Sambrook等著的MolecularCloning，a laboratory manual一書(shū)中有充分地描述。
氣相色譜儀的型號(hào)及生產(chǎn)廠(chǎng)家安捷倫公司6890型pGEM-T easy載體、T4連接酶、AatII、SalI、EcoRI、NcoI限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自Promega公司，E.coli DH5α購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，天然代爾夫菌(Delftia sp.)由本實(shí)驗(yàn)室從活性污泥中分離，公司菌種保藏號(hào)GBSX267。
本發(fā)明中如果沒(méi)有特別說(shuō)明，所有試劑均為市售。
本發(fā)明中如果沒(méi)有特別說(shuō)明，胞內(nèi)含量百分比(胞內(nèi)蓄積量百分比)均為P(3HB-co-4HB)干重占細(xì)胞總干重的重量百分比，4HB含量百分比為P(3HB-co-4HB)中4HB摩爾數(shù)占3HB與4HB摩爾數(shù)之和的摩爾百分比。
實(shí)施例1血紅蛋白基因的克隆和質(zhì)粒構(gòu)建1.1代爾夫菌(Delftia sp.)的PHA解聚酶的基因克隆為了將編碼代爾夫菌的胞內(nèi)PHA解聚酶的基因克隆到質(zhì)粒中采用引物1，5’-TTATATGACGTCCGCGCGGCGGCGGCCGC-3’(SEQ NO.1)引物2，5’-ATTAGCGTCGACCGGACTGGCCCGTGAGGTC-3’(SEQ NO.2)通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，以從天然代爾夫菌(Delftia sp.GBSX267)中分離得到的基因作為模板克隆PHA解聚酶。這些引物的制備來(lái)自代爾夫嗜酸菌的胞內(nèi)PHA解聚酶的基因的核苷酸序列(參見(jiàn)Kasuya，K.，GenBankSequence Database，AB003186，1998)。按下列條件進(jìn)行PCR首先在94℃變性5分鐘，然后35次循環(huán)94℃變性50秒，50℃退火1分鐘以及72℃延伸3分鐘后，最后加上72℃延伸10分鐘。經(jīng)過(guò)PCR獲得的DNA用AatII和SalI限制性?xún)?nèi)切酶消化后瓊脂糖凝膠電泳下分離大約2kb的DNA片段，該片段隨后連接到用AatII和SalI限制性?xún)?nèi)切酶已經(jīng)消化好的經(jīng)過(guò)改造的pGEM-T easy自連空載體上從而產(chǎn)生重組質(zhì)粒pGB/phaZ。通過(guò)電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化給E.coli DH5α然后在含有氨芐青霉素(50ug/l)的LB瓊脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l；瓊脂粉15g/l)篩選轉(zhuǎn)化子從而獲得重組的E.coli DH5α/pGB_phaZ。
1.2透明顫菌血紅蛋白基因克隆為了將編碼透明顫菌血紅蛋白基因克隆到質(zhì)粒中采用引物1；5’-GGACGCTGGGGTTAAAAGTAT-3’(SEQ NO.3)引物2；5’-GTCCCAAGTTTTGGCAACAGC-3’(SEQ NO.4)以從透明顫菌中分離得到的基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法得到血紅蛋白基因。這些引物的制備來(lái)自透明顫菌的血紅蛋白基因的核酸序列(參見(jiàn)Khosla，C.和Bailey等，GenBank Sequence Database，M30794，1993)。按照下列條件進(jìn)行PCR首先在94℃變性5分鐘，然后35次循環(huán)的94℃變性50秒，50℃退火1分鐘以及72℃延伸2分鐘后，最后加上72℃延伸10分鐘。經(jīng)過(guò)PCR獲得的DNA在瓊脂糖凝膠電泳下分離大約650bp的DNA片段，該片段隨后連接到pGEM-T easy T載體上從而產(chǎn)生重組質(zhì)粒pGB_VHb。通過(guò)電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化給E.coli DH5α然后在含有氨芐青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB瓊脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；瓊脂粉15g/L)篩選轉(zhuǎn)化子從而獲得重組的E.coli DH5α/pGB_VHb。
1.3打靶質(zhì)粒的構(gòu)建分別用EcoRI和NcoI消化質(zhì)粒pGB_VHb和用EcoRI和NcoI消化質(zhì)粒pGB_phaZ，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離650bp的VHb DNA片段和約5kb的pGB_phaZ線(xiàn)性DNA片段，然后用T4連接酶連接兩個(gè)線(xiàn)性片段形成質(zhì)粒pGB_ZV。通過(guò)電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化給E.coli DH5α然后在含有氨芐青霉素(50ug/l)的LB瓊脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl10g/l；瓊脂粉15g/l)挑選單克隆培養(yǎng)抽提質(zhì)粒并酶切鑒定篩選轉(zhuǎn)化子從而獲得重組的E.coli DH5α/pGB_ZV。
實(shí)施例2重組代爾夫菌株的獲得。
將pGB_ZV質(zhì)粒用電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化給天然代爾夫菌(Delftia sp.)然后在含有氨芐青霉素(50ug/l)的LB瓊脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l；瓊脂粉15g/l，pH7.0)篩選轉(zhuǎn)化子從而獲得重組突變?nèi)笔HA解聚酶的重組整合型的Delftia sp./pGB_ZV。并根據(jù)克隆號(hào)重新命名為產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯重組代爾夫菌R-Delftiasp.GBR008。
實(shí)施例3利用天然代爾夫菌(Delffia sp.GBSX267)產(chǎn)生P(3HB-co-4HB)菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基(LB)酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)2g/L NH4Cl，0.2g/L MgSO4.7H2O，9g/LNa2HPO4.12H2O，1.5g/L KH2PO4，50ul/L氨芐青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g/L)9.7gFeCl3，7.8gCaCl2，0.218gCoCl2.6H2O，0.156g CuSO4.5H2O，0.118g NiCl3.6H2O，0.105g CrCl3.6H2O，0.05g MnCl2.4H2O，0.06g ZnSO4.7H2O)，pH6.8。葡萄糖10g/L。1，4-丁二醇濃度為1％(V/V)。
以各100ul接種量將含有15％甘油的-80℃保藏的天然代爾夫菌(Delftia sp.)接種于100ml(250ml三角瓶)菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基(LB)中。以八層紗布覆蓋。37℃，220rpm培養(yǎng)5小時(shí)。
將在LB中培養(yǎng)好的菌體按照1∶10的比例將10ml菌液接入裝在250ml三角瓶中的上述發(fā)酵培養(yǎng)基100ml中，以十六層無(wú)菌紗布覆蓋。30℃，220rpm培養(yǎng)40小時(shí)。離心收集菌體用氯仿/乙醇沉淀法(體積比1∶4)提取P(3HB-co-4HB)共聚物干燥稱(chēng)重。
共進(jìn)行八批次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 天然代爾夫菌(Delftia sp.GBSX267)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中細(xì)胞干重為發(fā)酵細(xì)胞干重；P(34HB)/CDW(％)為P(3HB-co-4HB)重量占細(xì)胞干重的百分比；4HB含量(％)為P(3HB-co-4HB)中4HB摩爾數(shù)占3HB與4HB摩爾數(shù)之和的摩爾百分比。
所得到的發(fā)酵細(xì)胞干重平均為2.98g/L，產(chǎn)物經(jīng)分析驗(yàn)證為含4HB16.3mol％的3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚物。檢測(cè)方法稱(chēng)取8-10mg干細(xì)胞，加入2ml氯仿，然后加入1.7ml甲醇，再加入0.3ml濃硫酸，100℃酯化4小時(shí)，酯化后的液體加入1ml水，振蕩后取下層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)(Braunegg，G.et al.Eur.J.Microbiol.Biotechnol.1978，6，29-37)，計(jì)算得到P(3HB-co-4HB)含量占細(xì)胞干重的28.12％，其中4HB的摩爾百分含量為16.3％。
實(shí)施例4利用重組代爾夫菌(R-Delftia sp.GBR008)產(chǎn)生P(3HB-co-4HB)改變發(fā)酵培養(yǎng)基在250ml三角瓶中的裝量增加到150ml，并將覆蓋的紗布層數(shù)增加到二十四層，以限制培養(yǎng)過(guò)程中氧的供給，并將發(fā)酵菌種改為實(shí)施例2得到的重組菌(R-Delftia sp.GBR008)，其它實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例3。重復(fù)實(shí)驗(yàn)八批，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 重組代爾夫(R-Delftia sp.GBR008)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中細(xì)胞干重、P(34HB)/CDW(％)、4HB含量(％)同表1。
所得到的發(fā)酵細(xì)胞平均干重為3.27g/L。產(chǎn)物經(jīng)分析驗(yàn)證(同實(shí)施例3)計(jì)算平均值得到為含4HB 17.2％的3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚物，P(3HB-co-4HB)含量占細(xì)胞干重的30.29％，其中4HB的摩爾百分含量為17.2％。
由上述搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，利用本發(fā)明公開(kāi)的重組代爾夫菌(R-Delftiasp.GBR008)與利用天然代爾夫菌Delftia sp.GBSX267得到的P(3HB-co-4HB)相比在氧缺乏的條件下培養(yǎng)、發(fā)酵可以增加P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)量，有利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。
SEQUENCE LISTINGSEQ NO.1<110>天津國(guó)韻生物科技有限公司<120>一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌及應(yīng)用<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>1ttatatgacgtccgcgcggcggcggccgc 29SEQ NO.2<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>2attagcgtcgaccggactggcccgtgaggtc 31SEQ NO.3<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ggacgctggggttaaaagtat 21SEQ NO.4<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gtcccaagttttggcaacagc 2權(quán)利要求
1.一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008。
2.一種表達(dá)載體pGB_ZV；
3.一種獲得權(quán)利要求1所述的重組菌的方法，包括(1)克隆天然代爾夫菌的PHA解聚酶的基因得到質(zhì)粒pGEMT_phaZ；(2)克隆透明顫菌血紅蛋白基因獲得質(zhì)粒pGEMT_VHb；(3)獲得表達(dá)載體pGEMT_ZV；(4)得到重組產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的重組菌產(chǎn)生P(3HB-co-4HB)的方法，包括(1)對(duì)重組菌進(jìn)行培養(yǎng)；(2)對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵；(3)分離發(fā)酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中重組菌的培養(yǎng)階段培養(yǎng)條件為37℃，220rpm培養(yǎng)5小時(shí)。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中重組菌的發(fā)酵階段發(fā)酵條件為搖瓶分批發(fā)酵30℃發(fā)酵40小時(shí)。
7.權(quán)利要求4所述的方法，其中提取目的物的溶劑為氯仿/無(wú)水乙醇。
8.權(quán)利要求7的方法，其中溶劑氯仿/無(wú)水乙醇的體積比為1∶4。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008及其表達(dá)載體pGB_ZV；本發(fā)明還公開(kāi)了一種獲得此菌株的方法及其應(yīng)用，利用本發(fā)明公開(kāi)的重組代爾夫菌(R－Delftia sp.GBR008)得到的P(3HB－co－4HB)與利用天然的代爾夫菌(Delftia sp.GBSX267)相比在氧缺乏的條件下培養(yǎng)、發(fā)酵可以增加P(3HB－co－4HB)的產(chǎn)量，有利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/64GK1807595SQ20051013363
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者呂渭川, 周子振 申請(qǐng)人:天津國(guó)韻生物科技有限公司