專利名稱：含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種含剝層二氧化錳的電化學(xué)生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
電化學(xué)生物傳感器具有性能穩(wěn)定、選擇性高、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、易微型化等特點(diǎn)，已在臨床診斷、工業(yè)控制、食品檢測(cè)、藥物分析、環(huán)境分析、生物芯片和軍事領(lǐng)域等諸多方面得到廣泛應(yīng)用。其中利用生物活性物質(zhì)與電極間的直接電化學(xué)行為(即直接電子傳遞)進(jìn)行檢測(cè)的第三代無試劑電化學(xué)生物傳感器更是備受人們關(guān)注，是當(dāng)前電化學(xué)生物傳感器研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
但無試劑電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和應(yīng)用范圍尚存在一定的局限性，這主要是因?yàn)?1)缺少簡(jiǎn)便高效的方法對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行固定；(2)大部分生物活性物質(zhì)(如酶、細(xì)胞等)的活性中心在一定程度上被蛋白質(zhì)所掩蔽，生物活性中心與電極之間的直接電子傳遞比較困難。
為了解決上述問題，人們將納米材料引入電化學(xué)生物傳感器生物敏感膜體系，利用納米材料的比表面積大、表面活性中心多、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)異性質(zhì)，提高生物敏感膜的響應(yīng)靈敏度、穩(wěn)定性及抗干擾能力等性能指標(biāo)。到目前為止，被用于生物敏感膜的納米材料包括納米金屬顆粒(Au、Ag、Cu等)、納米金屬氧化物顆粒(SiO2、TiO2、MnO2等)及納米層狀材料(蒙脫土、層狀雙羥基復(fù)合金屬氧化物等)等。
在文獻(xiàn)(1)Analytical Biochemistry，2002，307110中，Song-Qin Liu等人研究了通過納米金膠將辣根過氧化酶固定在碳糊電極上的生物電化學(xué)傳感器，結(jié)果表明納米金使生物活性中心與電極間更易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)了辣根過氧化酶的直接電化學(xué)行為，增強(qiáng)了傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和再生性能。該傳感器對(duì)H2O2的響應(yīng)范圍為0～0.3mmol/L，線性范圍為0.48～50μmol/L，當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為0.21μmol/L。
在文獻(xiàn)(2)Electrochimica Acta，2004，491981中，Yan Zhang等人研究了將辣根過氧化酶通過納米TiO2固定在熱解石墨電極上的生物傳感器，結(jié)果表明納米TiO2固定的辣根過氧化酶在電極上有效地實(shí)現(xiàn)了直接電化學(xué)行為，增強(qiáng)了傳感器的穩(wěn)定性。該傳感器對(duì)H2O2的線性響應(yīng)范圍為7.5×10-6～1.23×10-4mol/L，信噪比為3時(shí)，檢出限為2.5μM。
在文獻(xiàn)(3)Electrochemistry Communications，2004，61169中，Jing-Juan Xu等人將納米二氧化錳顆粒引入到殼聚糖修飾的葡萄糖傳感器中，研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化錳顆粒能夠在殼聚糖膜中穩(wěn)定存在，并且能夠消除抗壞血酸對(duì)葡萄糖傳感器檢測(cè)的干擾。當(dāng)抗壞血酸與葡萄糖的濃度比為1∶10時(shí)，抗壞血酸的干擾誤差小于9％，當(dāng)抗壞血酸與葡萄糖的濃度比為1∶50時(shí)，抗壞血酸的干擾誤差小于3％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將一種新型剝層二氧化錳納米材料引入到生物傳感器敏感膜中，提供一種含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。利用剝層二氧化錳比表面積大、表面活性中心多、帶有負(fù)電荷及具有良好導(dǎo)電性等特性，提高生物傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性、抗干擾能力等，從而提高生物傳感器的綜合性能指標(biāo)。
本發(fā)明提供的含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜，是由氧化酶、固定酶的高分子物質(zhì)及剝層二氧化錳組成，其中氧化酶的含量是0.42～7.0μg/mm2，剝層二氧化錳的含量0.14～14.2μg/mm2，其余為固定酶的高分子物質(zhì)。上述氧化酶為辣根過氧化酶、細(xì)胞色素C中的任意一種；固定酶的高分子物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛、聚乙二醇、殼聚糖中的任意一種；剝層二氧化錳具有二維的片層結(jié)構(gòu)，厚度約為1～4nm，層板帶有負(fù)電荷。
本發(fā)明含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法是A剝層二氧化錳溶膠的制備A-1.按OH-與Mn2+摩爾比為3∶1～4∶1，H2O2與Mn2+摩爾比為6∶1～8∶1，將含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加入到0.3～0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)20～30分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，按OH-與MnO2摩爾比為2∶1～4∶1且裝滿度≤80％加入濃度為2～3mol/L的NaOH溶液，攪拌呈糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在150～160℃水熱處理15～20小時(shí)。將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8～9。將濾餅在70～80℃空氣氣氛中干燥6～9小時(shí)，得到層狀二氧化錳。
A-2.按照H+與層狀二氧化錳摩爾比為10∶1～15∶1，將上述層狀二氧化錳固體粉末加入濃度為1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1.0～1.5mol/L HNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6～7，將濾餅在70～80℃空氣氣氛中干燥6～9小時(shí)，得到氫交換的二氧化錳。
A-3.按四甲基氫氧化銨與二氧化錳摩爾比為2∶1～4∶1，將上述氫交換的二氧化錳加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％～2.0％的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)7～10天，將混合液在10000～12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心5～10分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度在0.1～2.0mg/mL范圍備用。
B.含剝層二氧化錳的酶功能敏感膜的制備將濃度為0.1～2.0mg/mL剝層二氧化錳溶膠與濃度為1～10mg/mL的氧化酶的二次蒸餾水溶液按體積比1∶1～2∶1的比例混合，然后置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以150～180轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的速率混合5～10分鐘直至混合均勻，將該混合液滴涂在潔凈的玻碳電極表面，在室溫下干燥后將其浸入到濃度為0.5～5％(m/v)的高分子凝膠中保持2～20分鐘，用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，室溫放置10～20小時(shí)使溶劑全部揮發(fā)，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的酶功能敏感膜。
上述氧化酶為辣根過氧化酶、細(xì)胞色素C中的一種，其中辣根過氧化酶的活性為100～330U/mg；高分子凝膠分別是聚乙烯醇縮丁醛凝膠、聚乙二醇凝膠或殼聚糖凝膠，其中聚乙烯醇縮丁醛凝膠、聚乙二醇凝膠的溶劑為無水乙醇，殼聚糖凝膠的溶劑為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的醋酸二次蒸餾水溶液。
采用日本日立H-800透射電鏡(TEM)對(duì)水熱反應(yīng)方法制備的二氧化錳及剝層后的二氧化錳進(jìn)行表征(如圖1所示)。水熱反應(yīng)方法制備的二氧化錳為顆粒狀，剝層后的二氧化錳為二維片層狀，厚度約為1～4nm。
本發(fā)明的效果可以從用本發(fā)明含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜制作的生物傳感器電極看出。將含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜修飾的玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，組成辣根過氧化酶生物傳感器。將辣根過氧化酶生物傳感器的三電極體系置于pH值為6～7.5的磷酸鹽緩沖，采用CHI660B電化學(xué)工作站對(duì)含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜修飾電極進(jìn)行了電化學(xué)循環(huán)伏安表征(如圖2所示)，結(jié)果表明剝層二氧化錳的引入，有效地增強(qiáng)了辣根過氧化酶在電極上的直接電化學(xué)行為，為制備無試劑生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。采用i-t法測(cè)試電極對(duì)H2O2響應(yīng)電流，由圖3可以看出，含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜對(duì)過氧化氫的響應(yīng)靈敏度較不含有剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜提高2倍以上，響應(yīng)時(shí)間小于5秒，當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出限為0.16μmol/L；由圖4可以看出，含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜對(duì)H2O2的響應(yīng)范圍較寬，為0～5mmol/L，線性范圍為5×10-7～4.3×10-4mol/L。
采用不同納米材料固定辣根過氧化酶制備的敏感膜的式量電位E0’、檢出限及線性范圍等主要性能的對(duì)照見下表表1.不同納米材料固定辣根過氧化酶制備的敏感膜的性能比較

由表1可以看出，采用本發(fā)明方法制備的含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜得到的辣根過氧化酶的式量電位更接近自由酶的式量電位，這說明剝層二氧化錳給酶提供了更加有利的微環(huán)境。在性能上，采用本發(fā)明方法制備的含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜，可以獲得和引入納米金膠所制備的敏感膜相當(dāng)?shù)男阅?，但本發(fā)明采用的剝層二氧化錳更加廉價(jià)，制備工藝簡(jiǎn)單。另外，剝層二氧化錳層板帶有負(fù)電荷，與帶正電荷的氧化酶之間有較強(qiáng)的靜電作用力，可以提高酶功能敏感膜的穩(wěn)定性，剝層二氧化錳的存在還可以大幅度減小抗壞血酸等底物的干擾，抗干擾性能也明顯提高(參見實(shí)施例1)。


圖1.水熱法合成二氧化錳和剝層二氧化錳的透射電鏡(TEM)1A-水熱法合成的層狀二氧化錳的TEM1B-剝層二氧化錳的TEM2.辣根過氧化酶在含剝層二氧化錳的敏感膜修飾的玻碳電極上的直接電化學(xué)行為CV圖橫坐標(biāo)-電壓E(單位V，參比電極為Ag/AgCl)縱坐標(biāo)-電流i(單位μA)圖2a-剝層二氧化錳+辣根過氧化酶修飾電極的CV曲線圖2b-辣根過氧化酶修飾電極的CV曲線圖2c-剝層二氧化錳修飾電極的CV曲線圖3.含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜修飾電極和不含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜修飾電極的i-t曲線橫坐標(biāo)-時(shí)間t(單位秒)縱坐標(biāo)-響應(yīng)電流i(單位μA)圖3a-剝層二氧化錳+辣根過氧化酶修飾電極對(duì)10-5mol/L H2O2的i-t響應(yīng)圖3b-辣根過氧化酶修飾電極對(duì)10-5mol/L H2O2的i-t響應(yīng)圖4.H2O2濃度與含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜修飾電極響應(yīng)電流的關(guān)系曲線橫坐標(biāo)-過氧化氫的濃度c(單位mol/L)縱坐標(biāo)-響應(yīng)電流i(單位μA)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1A制備剝層二氧化錳溶膠A-1.將200mL含有0.6mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.3mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)20分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯杯中，加入30mL濃度為2mol/L的NaOH溶液，攪拌呈漿糊狀，將聚四氟乙烯杯密封于水熱釜中，在150℃水熱處理20小時(shí)。將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8。將濾餅在70℃空氣氣氛中干燥9小時(shí)，得到層狀二氧化錳。
A-2.將2.6g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到300mL濃度為1mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1mol/L HNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6，將濾餅在70℃空氣氣氛中干燥9小時(shí)，得到氫交換二氧化錳。
A-3.量取12mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.4g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)7天。將混合液在10000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度在0.15mg/mL備用。
B制備含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜將濃度為0.15mg/mL剝層二氧化錳溶膠10μL與濃度為10mg/mL活性為250U/mg的辣根過氧化酶10μL混合，將混合液置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以180轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘速率分散5分鐘，得到混合均勻的混合液。分散好的混合液滴加在表面潔凈的玻碳電極表面。待其在室溫下自然晾干后，再將電極置于濃度為2％(m/v)的聚乙烯醇縮丁醛無水乙醇溶液中5分鐘。取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，室溫放置10小時(shí)揮發(fā)掉溶劑，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜，然后將修飾好的電極保存在4℃下磷酸緩沖液中備用。
以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為30±1℃，測(cè)試體系為pH＝6.5的磷酸緩沖液。用循環(huán)伏安法表征，發(fā)現(xiàn)剝層二氧化錳有效地提高了辣根過氧化酶在電極上的直接電化學(xué)行為(見圖2所示)；i-t法檢測(cè)電極對(duì)底物H2O2的響應(yīng)，該生物傳感器的平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)，響應(yīng)時(shí)間小于5秒，響應(yīng)靈敏度提高2倍以上(如圖3所示)，線形范圍為5×10-7～4.3×10-4mol/L(如圖4所示)，當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出限為0.16μmol/L；該電極穩(wěn)定性保持1個(gè)月以上；當(dāng)過氧化氫與抗壞血酸的濃度比為1∶1時(shí)，干擾誤差小于9％。
實(shí)施例2A制備剝層二氧化錳溶膠A-1.將200mL含有0.8mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)30分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯杯中，加入50 mL濃度為3mol/L的NaOH溶液，攪拌呈漿糊狀，將聚四氟乙烯杯密封于水熱釜中，在160℃水熱處理15小時(shí)。將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為9。將濾餅在80℃空氣氣氛中干燥6小時(shí)，得到層狀二氧化錳。
A-2.將2.5g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到280mL濃度為1.5mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1.5mol/LHNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為7，將濾餅在80℃空氣氣氛中干燥6小時(shí)，得到氫交換二氧化錳。
A-3.量取18mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.1g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)10天。將混合液在12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度為2.0mg/mL備用。
B制備含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜將濃度為2.0mg/mL的剝層二氧化錳溶膠50μL與濃度為5mg/mL活性為330U/mg的辣根過氧化酶40μL混合，將混合液置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以150轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘速率分散10分鐘，得到混合均勻的混合液。分散好的混合液滴加在表面潔凈的玻碳電極表面。待其在室溫下自然晾干后，再將電極置于濃度為1％(m/v)殼聚糖水溶液中10分鐘。取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，室溫放置20小時(shí)揮發(fā)掉溶劑，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜，然后將修飾好的電極保存在4℃下磷酸緩沖液中備用。
以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為30±1℃，測(cè)試體系為pH＝7.5的磷酸緩沖液。用i-t法檢測(cè)電極對(duì)底物H2O2的響應(yīng)電流，該生物傳感器的平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)，響應(yīng)時(shí)間小于5秒，線性范圍為6.5×10-6～3.3×10-4mol/L，當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出限為0.8μmol/L；穩(wěn)定性保持2個(gè)月以上；當(dāng)過氧化氫與抗壞血酸的濃度比為10∶1時(shí)，干擾誤差小于5％。
實(shí)施例3A制備剝層二氧化錳溶膠A-1.將200mL含有0.6mol/L NaOH和1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)30分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯杯中，加入40mL濃度為3mol/L的NaOH溶液，攪拌呈漿糊狀，將聚四氟乙烯杯密封于水熱釜中，在160℃水熱處理18小時(shí)。將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8。將濾餅在80℃空氣氣氛中干燥8小時(shí)，得到層狀二氧化錳。
A-2.將2.5g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到300mL濃度為1.2mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1.2mol/LHNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6，將濾餅在70℃空氣氣氛中干燥7小時(shí)，得到氫交換二氧化錳。
A-3.量取16mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.2g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)9天。將混合液在12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心6分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度為0.5mg/mL備用。
B.制備含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜將濃度為0.5mg/mL剝層二氧化錳膠100μL與濃度為10mg/mL活性為100U/mg的辣根過氧化酶50μL混合，將混合液置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以180轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘速率分散10分鐘，得到混合均勻的混合液。將分散好的混合液滴加在表面潔凈的玻碳電極表面。待其在室溫下自然晾干后，再將電極置于濃度為5％(m/v)聚乙二醇無水乙醇溶液中15分鐘，用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，室溫放置15小時(shí)揮發(fā)掉溶劑，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的辣根過氧化酶敏感膜，然后將修飾好的電極保存在4℃下磷酸緩沖液中備用。
以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為30±1℃，測(cè)試體系為pH＝6.0的磷酸緩沖液。i-t法檢測(cè)電極對(duì)底物H2O2的響應(yīng)，該生物傳感器的平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)，響應(yīng)時(shí)間小于5秒，線性范圍為8.5×10-7～4×10-4mol/L；當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出限為0.42μmol/L，該電極穩(wěn)定性保持1個(gè)月以上；當(dāng)過氧化氫與抗壞血酸的濃度比為1∶1時(shí)，干擾誤差小于9％。
實(shí)施例4A制備剝層二氧化錳溶膠A-1.將200mL含有0.6mol/L NaOH和1.0mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.3mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)20分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯杯中，加入40mL濃度為2.5mol/L的NaOH溶液，攪拌呈漿糊狀，將聚四氟乙烯杯密封于水熱釜中，在150℃水熱處理16小時(shí)。將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為9。將濾餅在80℃空氣氣氛中干燥7小時(shí)，得到層狀二氧化錳。
A-2.將2.5g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到200mL濃度為1.5mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1.5mol/LHNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6，將濾餅在80℃空氣氣氛中干燥8小時(shí)，得到氫交換二氧化錳。
A-3.量取20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的四甲基氫氧化銨，溶解于250mL去離子水中，稱取2.0g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)8天。將混合液在11000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心8分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度為0.8mg/mL備用。
B制備含剝層二氧化錳的細(xì)胞色素C敏感膜將濃度為0.8mg/mL的剝層二氧化錳溶膠60μL與濃度為1mg/mL的細(xì)胞色素C40μL混合，將混合液置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以180轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘分散6分鐘，得到混合均勻的混合液。將分散好的混合液滴加在表面潔凈的玻碳電極表面。待其在室溫下自然晾干后，再將電極置于濃度為1％(m/v)的殼聚糖水溶液中20分鐘，用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的細(xì)胞色素C，室溫放置15小時(shí)揮發(fā)掉溶劑，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的細(xì)胞色素C敏感膜，然后將修飾好的電極在4℃下干態(tài)保存?zhèn)溆谩?br> 以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為30±1℃，測(cè)試體系為pH＝7.0的磷酸緩沖液。用i-t法檢測(cè)工作電極對(duì)底物H2O2的響應(yīng)電流，該生物傳感器的平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)，響應(yīng)時(shí)間小5秒，穩(wěn)定性保持2個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜，是由氧化酶、固定酶的高分子物質(zhì)及剝層二氧化錳組成，其中氧化酶的含量是0.42～7.0μg/mm2，剝層二氧化錳的含量0.14～14.2μg/mm2，其余為固定酶的高分子物質(zhì)；所述氧化酶為辣根過氧化酶、細(xì)胞色素C中的任意一種；所述固定酶的高分子物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛、聚乙二醇、殼聚糖中的任意一種；剝層二氧化錳具有二維的片層結(jié)構(gòu)，厚度約為1～4nm，層板帶有負(fù)電荷。
2.含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法具體步驟如下A剝層二氧化錳溶膠的制備A-1.按OH-與Mn2+摩爾比為3∶1～4∶1，H2O2與Mn2+摩爾比為6∶1～8∶1，將含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加入到0.3～0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)20～30分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，按OH-與MnO2摩爾比為2∶1～4∶1且裝滿度≤80％加入濃度為2～3mol/L的NaOH溶液，攪拌呈糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在150～160℃水熱處理15～20小時(shí)，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8～9，將濾餅在70～80℃空氣氣氛中干燥6～9小時(shí)，得到層狀二氧化錳；A-2.按照H+與層狀二氧化錳摩爾比為10∶1～15∶1，將上述層狀二氧化錳固體粉末加入濃度為1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天，其間每隔24小時(shí)更換一次新的1.0～1.5mol/L HNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6～7，將濾餅在70～80℃空氣氣氛中干燥6～9小時(shí)，得到氫交換的二氧化錳；A-3.按四甲基氫氧化銨與二氧化錳摩爾比為2∶1～4∶1，將上述氫交換的二氧化錳加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％～2.0％的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)7～10天，將混合液在10000～12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心5～10分鐘，上層溶膠即為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度在0.1～2.0mg/mL范圍備用；B.含剝層二氧化錳的酶功能敏感膜的制備將濃度為0.1～2.0mg/mL剝層二氧化錳溶膠與濃度為1～10mg/mL的氧化酶的二次蒸餾水溶液按體積比1∶1～2∶1的比例混合，然后置于25±1℃恒溫?fù)u床中，以150～180轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的速率混合5～10分鐘直至混合均勻，將該混合液滴涂在潔凈的玻碳電極表面，在室溫下干燥后將其浸入到濃度為0.5～5％(m/v)的高分子凝膠中保持2～20分鐘，用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，室溫放置10～20小時(shí)使溶劑全部揮發(fā)，在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的酶功能敏感膜；步驟B所述氧化酶為辣根過氧化酶、細(xì)胞色素C中的一種，高分子凝膠分別是聚乙烯醇縮丁醛凝膠、聚乙二醇凝膠或殼聚糖凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含剝層二氧化錳的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法，其特征是辣根過氧化酶的活性為100～330U/mg；聚乙烯醇縮丁醛凝膠、聚乙二醇凝膠的溶劑為無水乙醇，殼聚糖凝膠的溶劑為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的醋酸二次蒸餾水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含剝層二氧化錳的電化學(xué)生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。該敏感膜是由氧化酶、固定酶的高分子物質(zhì)及剝層二氧化錳組成。利用剝層二氧化錳比表面積大、表面活性中心多、帶有負(fù)電荷及具有良好導(dǎo)電性等特性，可以提高生物傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性及抗干擾能力，從而提高生物傳感器的綜合性能指標(biāo)。該敏感膜的制備方法是將剝層二氧化錳的溶膠與氧化酶混合均勻，然后滴涂在潔凈的玻碳電極表面，在室溫下干燥后將其浸入到高分子凝膠中固定，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，即在玻碳電極表面形成一層含剝層二氧化錳的酶功能敏感膜。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1804608SQ20051013471
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者楊文勝, 吳金玲, 張熊, 段雪 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)