專利名稱：電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程與細(xì)胞工程，具體是一種誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的技術(shù)。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉提取出來的一種國際上公認(rèn)的最有效的抗癌藥物(Kingston etal，1993)。目前，生產(chǎn)紫杉醇仍然是從紅豆杉屬植物提取為主。但因紅豆杉生長緩慢，取材困難，成本昂貴，因此，開展細(xì)胞培養(yǎng)方法來生產(chǎn)紫杉醇就成為當(dāng)務(wù)之急。
細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法是先以紅豆杉外植體(莖、葉、芽等)培養(yǎng)愈傷組織，然后對愈傷組織的懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞繁殖，從細(xì)胞及培養(yǎng)液中提取紫杉醇。但是，細(xì)胞培養(yǎng)中的問題是細(xì)胞擴(kuò)增到一定程度會(huì)發(fā)生褐化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，中斷培養(yǎng)進(jìn)程，大大限制了培養(yǎng)細(xì)胞的生物量及紫杉醇的產(chǎn)量。而且，培養(yǎng)細(xì)胞本身的紫杉醇含量也比較低。所以，防止細(xì)胞褐化，提高細(xì)胞的紫杉醇產(chǎn)量就成為細(xì)胞培養(yǎng)工藝的必須解決的問題。
因此，國內(nèi)外就轉(zhuǎn)而利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)誘導(dǎo)紅豆杉產(chǎn)生發(fā)根(又稱毛狀根)；通過繁殖發(fā)根(避開細(xì)胞培養(yǎng))來生產(chǎn)紫杉醇。由于發(fā)根生長速度大大超過正常植物及培養(yǎng)細(xì)胞的生長速度，產(chǎn)物產(chǎn)量高，而且穩(wěn)定，不褐化，具有很大潛力。
但是，在發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染紅豆杉的過程中，要經(jīng)過菌株活化、增殖、接種、轉(zhuǎn)染等繁雜的步驟；尤其在轉(zhuǎn)染過程中，發(fā)根農(nóng)桿菌與紅豆杉細(xì)胞之間是一個(gè)復(fù)雜的相互作用的過程，有一些影響因素至今還不清楚。在T-DNA進(jìn)入細(xì)胞前，往往因?yàn)槟骋徊襟E、某一因素的失常而導(dǎo)致發(fā)根產(chǎn)生的失敗。眾所周知，發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子葉植物比較容易，而感染單子葉植物就比較困難，感染裸子植物(如紅豆杉)就更困難。對于紅豆杉來說，研究證明，只有ATCC 31798轉(zhuǎn)染短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)有效，其他的發(fā)根農(nóng)桿菌幾乎不起作用(黃遵錫等，1997)。
鑒于基因工程技術(shù)已經(jīng)證明，在轉(zhuǎn)基因過程中，目的基因整合進(jìn)基因組中，并不一定需要像Ri(或Ti)質(zhì)粒那樣的結(jié)構(gòu)(T-DNA/Vir區(qū))及感染過程。經(jīng)物理或化學(xué)技術(shù)直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因載體(如各種質(zhì)粒)，都會(huì)按照傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因的分子機(jī)制，隨機(jī)地切下目的基因，并整合到宿主的基因組中。因此，本發(fā)明就開發(fā)了電穿孔(電擊或電激)轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的技術(shù)來生產(chǎn)發(fā)根。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明原理是利用電擊法轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把發(fā)根農(nóng)桿菌中含有T-DNA的Ri質(zhì)粒直接地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，省卻了在自然狀態(tài)下發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的步驟，也就避免了多種自然因素的影響；使得誘導(dǎo)發(fā)根產(chǎn)生的宿主范圍大大擴(kuò)大，把多步驟、多因素的微生物轉(zhuǎn)染過程提升為傳統(tǒng)基因工程的轉(zhuǎn)基因過程；轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因載體(如Ri質(zhì)粒)，將按照傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因過程在細(xì)胞內(nèi)把目的基因(如T-DNA)切下，并整合到基因組中。
本發(fā)明的目的是提供一種電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法，并把電擊轉(zhuǎn)基因技術(shù)與發(fā)根農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)基因技術(shù)融為一體，以期實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)紅豆杉發(fā)根，提取紫杉醇的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、Ri質(zhì)粒提取按常規(guī)提取發(fā)根農(nóng)桿菌(如A4或15834)的Ri質(zhì)粒；(2)、原生質(zhì)體制備取紅豆杉的疏松愈傷組織繼代培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞制備原生質(zhì)體；(5)、電穿孔轉(zhuǎn)基因在兼有電穿孔轉(zhuǎn)基因所需成分與發(fā)根農(nóng)桿菌感染紅豆杉所需成分的電擊緩沖溶液中，使Ri質(zhì)粒進(jìn)入原生質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)；把感染過程融于電擊過程之中；(6)、原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞；(7)、發(fā)根培養(yǎng)當(dāng)原生質(zhì)體形成小細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織后，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，生長發(fā)根；再將發(fā)根轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)；(8)、收集發(fā)根。
上述的方法，其特征在于(1)Ri質(zhì)粒提取按“李昌禹法”提取完整的Ri質(zhì)粒。
(2)、制備原生質(zhì)體的具體步驟為a、取紅豆杉疏松愈傷組織繼代培養(yǎng)第3天的懸浮細(xì)胞，加入原生質(zhì)體制備酶液，消化細(xì)胞壁；b、吸去上清液，收集原生質(zhì)體；原生質(zhì)體用KM8P培養(yǎng)基反復(fù)洗滌，離心后備用；(3)、電擊轉(zhuǎn)基因的具體步驟為a、離心后的原生質(zhì)體，棄去洗液，加入電擊緩沖液重懸；b、取0.5ml原生質(zhì)體懸液，移入間距0.2cm的電擊杯中，加入Ri質(zhì)粒及乙酰丁香酮、鮭精DNA、甜菜堿，PEG等，施加350V-1.5kV/cm電場進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)基因，使Ri質(zhì)粒進(jìn)入原生質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)；
c、離心，除去電擊緩沖液，用KM8P液體培養(yǎng)基洗滌；(4)、原生質(zhì)體培養(yǎng)的具體步驟為用含0.2％瓊脂糖的KM8P培養(yǎng)基固化，置于25℃黑暗下進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞；(5)、發(fā)根培養(yǎng)的具體步驟為轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞在KM8P培養(yǎng)基上形成小細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織后，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，生長發(fā)根；再將發(fā)根放入液體KM8P培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
上述的方法，其特征在于(1)、液體培養(yǎng)基B5基本成分附加2.5mg/L 2，4-D；(2)、原生質(zhì)體制備酶液2％纖維素酶RS，0.1％果膠酶Y23，5mmol/L MES[2-(N-嗎啉)-乙基磺酸]，5mmol/L CaCl2，KM8P無機(jī)鹽，0.6mol/L甘露醇(pH5.6)；(3)、KM8P培養(yǎng)基KM8P+2，4-D1.0+ZT1.0+NAA0.3+蔗糖10g/L+葡萄糖50g/L+甘露醇50g/L(pH5.6)；(4)、固體分化培養(yǎng)基B5+500mg/L羧芐青霉素+1.5mg/L 6-BA；(5)、電擊緩沖液0.6mol/L甘露醇，50mmol/L NaCl，5mmol/L Ca(NO3)2，10mmol/L Hepes(pH7.2)；實(shí)施電擊即電穿孔時(shí)，加入原生質(zhì)體，Ri質(zhì)粒，鮭精DNA，PEG，乙酰丁香酮，甜菜堿等。
李昌禹法是指采用下列文獻(xiàn)中所報(bào)道的方法李昌禹，馬海琴，趙壽經(jīng)，減埔，Ri質(zhì)粒的快速提取及roIC基因的克隆，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2003，25(3)263-265)。
本發(fā)明的特征是1、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)一步到位地，把含有T-DNA的Ri質(zhì)粒直接地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞——紅豆杉細(xì)胞，把多步驟、多因素的微生物轉(zhuǎn)染過程提升為分子生物學(xué)的基因操作。避免了感染過程中各種因素的影響。
2、本發(fā)明在電擊時(shí)所用的成分實(shí)際上是常規(guī)電擊轉(zhuǎn)基因的成分(電擊緩沖液、Ri質(zhì)粒、鮭精DNA、PEG、紅豆杉細(xì)胞)與發(fā)農(nóng)桿菌感染紅豆杉所需的成分(Ri質(zhì)粒、紅豆杉細(xì)胞、乙酰丁香酮、甜菜堿)的混合體。把感染過程融于電擊過程之中，使Ri質(zhì)粒在電擊前后(細(xì)胞內(nèi)外)均能得到激活與切割，有利于T-DNA對宿主細(xì)胞的整合。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一步到位地把含有T-DNA的Ri質(zhì)粒直接地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞——紅豆杉細(xì)胞。把多步驟、多因素的微生物轉(zhuǎn)染過程提升為精確的分子生物學(xué)的基因操作。省時(shí)、省力、避免了感染過程中各種因素的影響。
2、打破了發(fā)根農(nóng)桿菌感染的物種限制。在轉(zhuǎn)染過程中，發(fā)根農(nóng)桿菌與紅豆杉細(xì)胞之間是一個(gè)復(fù)雜的相互作用、相互選擇的過程，有一些影響因素至今還不清楚。例如發(fā)根農(nóng)桿菌能順利感染大多數(shù)雙子葉植物，但對單子葉植物則很難感染；現(xiàn)有研究表明，只有ATCC 31798(A4)才能轉(zhuǎn)染短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)，其它的發(fā)根農(nóng)桿菌幾乎不起作用。電擊法使用的是提純的Ri質(zhì)粒，不受發(fā)根農(nóng)桿菌物種的限制；它借助于物理的力量(電擊)把Ri質(zhì)粒直接送入細(xì)胞，不管這些細(xì)胞來源于何種紅豆杉，均適用本發(fā)明方法。
3、本發(fā)明是把電擊轉(zhuǎn)基因技術(shù)與發(fā)根農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)基因技術(shù)融為一體的新技術(shù)。它既有電擊法的快速、有效，又具有感染過程中，對Ri質(zhì)粒中Vir基因的天然的激活、對T-DNA的準(zhǔn)確切割的作用。大大降低了在常規(guī)的電擊法轉(zhuǎn)基因中，細(xì)胞內(nèi)酶體系對Ri質(zhì)粒的隨機(jī)切割，及對T-DNA的破壞。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過了長達(dá)兩年的研究，并獲得成功。用A4(或15834)發(fā)根農(nóng)桿菌對不同的紅豆杉細(xì)胞(短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)[或南方紅豆杉(Taxus mairei)]進(jìn)行了電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)，均能成功地產(chǎn)生發(fā)根。產(chǎn)生的發(fā)根的生物量及紫杉醇含量均高于紅豆杉植株及愈傷組織。
實(shí)驗(yàn)材料短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)或南方紅豆杉(Taxus mairei)儀器ECM 830(BTX)電擊轉(zhuǎn)基因儀(美國)發(fā)根農(nóng)桿菌株A4、15834試劑(1)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基B5基本成分附加2.5mg/L 2，4-D。
(2)、原生質(zhì)體制備酶液2％纖維素酶RS，0.1％果膠酶Y23，5mmol/L MES[2-(N-嗎啉)-乙基磺酸]，5mmol/L CaCl2，KM8P無機(jī)鹽，0.6mol/L甘露醇(pH5.6)。
(3)、KM8P培養(yǎng)基KM8P+2，4-D1.0+ZT1.0+NAA0.3+蔗糖10g/L+葡萄糖50g/L+甘露醇50g/L(pH5.6)。
(4)、分化培養(yǎng)基B5+500mg/L羧芐青霉素+1.5mg/L 6-BA。
(5)、EP緩沖液0.6mol/L甘露醇，50mmol/L NaCl，5mmol/L Ca(NO3)2，10mmol/LHepes(pH7.2)。
(6)、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)，紫杉醇單克隆抗體(Hawaii Biotechnology Group Inc.)電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法步驟1、Ri質(zhì)粒提取按李昌禹法(李昌禹等，2003)提取發(fā)根農(nóng)桿菌A4(或15834)的Ri質(zhì)粒。
2、愈傷組織培養(yǎng)取短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)或南方紅豆杉(Taxus mairei)的嫩莖或葉的切段，按常規(guī)方法誘導(dǎo)愈傷組織。
3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)將疏松愈傷組織轉(zhuǎn)入懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基(即液體B5培養(yǎng)基)中，于26℃恒溫?fù)u床上，130r/min暗培養(yǎng)，將愈傷組織搖散；每周繼代培養(yǎng)一次。
4、原生質(zhì)體制備(1)、取繼代培養(yǎng)第3天的懸浮細(xì)胞放入兩支50ml離心管中，500r/min離心5min收集細(xì)胞。
(2)、加入5倍體積的原生質(zhì)體制備酶液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入150ml的三角瓶中。于26～28℃、黑暗條件下，50r/min搖動(dòng)，酶解2～3h。然后靜止酶解1～3h。其間鏡檢細(xì)胞壁消化程度。
(3)、將酶解混合液先后用50目/200目/400目不銹鋼網(wǎng)過濾，去除未消化細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。
(4)、酶-原生質(zhì)體混合液500r/min離心5分鐘，吸去上清液，收集原生質(zhì)體。原生質(zhì)體用KM8P培養(yǎng)基反復(fù)洗3次，離心后備用。
5、電擊法轉(zhuǎn)基因(1)、離心后的原生質(zhì)體，棄去洗液，加入電擊緩沖液(EP)重懸，并離心3分鐘去掉上清液，再加入適量的電擊緩沖液，將原生質(zhì)體密度調(diào)節(jié)到1×106～2×106個(gè)/ml。
(2)、取0.5ml原生質(zhì)體懸液，移入間距0.2cm的電擊杯中，置于冰上，然后加入10μg Ri質(zhì)粒和25-50μg鮭精DNA，PEG 7.8％(w/v)，100μmol/L乙酰丁香酮，10mg/L的甜菜堿，于冰上放置10min，并不時(shí)振動(dòng)電擊杯使原生質(zhì)體保持懸浮狀態(tài)。
(3)、施加350～1.5kV/cm電場，54s-10s，于冰上放置10～20min。
(4)、600r/min離心3min除去電擊緩沖液，用KM8P液體培養(yǎng)基洗滌原生質(zhì)體。
6、原生質(zhì)體培養(yǎng)將部分原生質(zhì)體移到平皿中，用0.2％瓊脂糖的KM8P固化，密度為≤1×106/ml，置于25℃黑暗下培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(注例如15834含有抗頭孢噻肟(cefotaxime)的選擇性標(biāo)記基因。經(jīng)15834轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞對頭孢噻肟有抗性，在加了頭孢噻肟的培養(yǎng)基上能生存，并長出毛狀根。)
7、發(fā)根培養(yǎng)待KM8P培養(yǎng)基中形成小細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織后，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，生長發(fā)根。生長出的發(fā)根截取成1-2cm長，放到不合激素的B5培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)25天，發(fā)根可迅速增長，生物量增加8-10倍。
8、紫杉醇測定把發(fā)根進(jìn)行冷凍干燥，稱重，保存于-4℃?zhèn)溆谩Ｃ珷罡械淖仙即汲樘?、純化按Richard(1993)法。紫杉醇含量的測定，以紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)為對照，用HPLC和紫杉醇單克隆抗體間接ELISA測定。
9、測定的結(jié)果發(fā)根的紫杉醇含量平均約為0.165mg/g DW，折合干重0.0165％，約為紅豆杉干重含量(0.01％)的1.5-1.8倍。
25天培養(yǎng)的發(fā)根的紫杉醇含量與5年生紅豆杉植株的比較(平均干重) DW干重
權(quán)利要求
1.電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、Ri質(zhì)粒提取按常規(guī)提取發(fā)根農(nóng)桿菌(如A4或15834)的Ri質(zhì)粒；(2)、原生質(zhì)體制備取紅豆杉的疏松愈傷組織繼代培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞制備原生質(zhì)體；(5)、電穿孔轉(zhuǎn)基因在兼有電穿孔轉(zhuǎn)基因所需成分與發(fā)根農(nóng)桿菌感染紅豆杉所需成分的電擊緩沖溶液中，使Ri質(zhì)粒進(jìn)入原生質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)；把感染過程融于電擊過程之中；(6)、原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞；(7)、發(fā)根培養(yǎng)當(dāng)原生質(zhì)體形成小細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織后，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，生長發(fā)根；再將發(fā)根轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)；(8)、收集發(fā)根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于(1)Ri質(zhì)粒提取按“李昌禹法”提取完整的Ri質(zhì)粒；(2)、制備原生質(zhì)體的具體步驟為a、取紅豆杉疏松愈傷組織繼代培養(yǎng)第3天的懸浮細(xì)胞，加入原生質(zhì)體制備酶液，消化細(xì)胞壁；b、吸去上清液，收集原生質(zhì)體；原生質(zhì)體用KM8P培養(yǎng)基反復(fù)洗滌，離心后備用；(3)、電擊轉(zhuǎn)基因的具體步驟為a、離心后的原生質(zhì)體，棄去洗液，加入電擊緩沖液重懸；b、取0.5ml原生質(zhì)體懸液，移入間距0.2cm的電擊杯中，加入Ri質(zhì)粒及乙酰丁香酮、鮭精DNA、甜菜堿，PEG等，施加350V-1.5kV/cm電場進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)基因，使Ri質(zhì)粒進(jìn)入原生質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)；c、離心，除去電擊緩沖液，用KM8P液體培養(yǎng)基洗滌；(4)、原生質(zhì)體培養(yǎng)的具體步驟為用含0.2％瓊脂糖的KM8P培養(yǎng)基固化，置于25℃黑暗下進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞；(5)、發(fā)根培養(yǎng)的具體步驟為轉(zhuǎn)基因成功的細(xì)胞在KM8P培養(yǎng)基上形成小細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織后，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，生長發(fā)根；再將發(fā)根放入液體KM8P培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于(1)、液體培養(yǎng)基B5基本成分附加2.5mg/L 2，4-D；(2)、原生質(zhì)體制備酶液2％纖維素酶RS，0.1％果膠酶Y23，5mmol/L MES[2-(N-嗎啉)-乙基磺酸]，5mmol/L CaCl2，KM8P無機(jī)鹽，0.6mol/L甘露醇(pH5.6)；(3)、KM8P培養(yǎng)基KM8P+2，4-D1.0+ZT1.0+NAA0.3+蔗糖10g/L+葡萄糖50g/L+甘露醇50g/L(pH5.6)；(4)、固體分化培養(yǎng)基B5+500mg/L羧芐青霉素+1.5mg/L 6-BA；(5)、電擊緩沖液0.6mol/L甘露醇，50mmol/L NaCl，5mmol/L Ca(NO3)2，10mmol/L Hepes(pH7.2)；實(shí)施電擊即電穿孔時(shí)，加入原生質(zhì)體，Ri質(zhì)粒，鮭精DNA，PEG，乙酰丁香酮，甜菜堿等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種電穿孔轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘發(fā)紅豆杉發(fā)根的方法，本發(fā)明原理是利用電擊法轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把發(fā)根農(nóng)桿菌中含有T－DNA的Ri質(zhì)粒直接地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞——紅豆杉細(xì)胞，并培養(yǎng)發(fā)根。省卻了在自然狀態(tài)下發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的步驟，也就避免了多種自然因素的影響；使得誘導(dǎo)發(fā)根產(chǎn)生的宿主范圍大大擴(kuò)大。通過繁殖發(fā)根來生產(chǎn)紫杉醇。由于發(fā)根生長速度大大超過正常植物及培養(yǎng)細(xì)胞的生長速度，因此發(fā)根產(chǎn)物產(chǎn)量高，而且穩(wěn)定，不褐化，具有很大潛力。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1861797SQ20051013493
公開日2006年11月15日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者李振剛, 王會(huì)文, 張俊 申請人:合肥宏源生物技術(shù)開發(fā)有限公司