專利名稱：一種大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全失活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水魚類染色體操作技術(shù)，具體地說是一種我國(guó)重要海水養(yǎng)殖對(duì)象-大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全滅活的方法。
背景技術(shù)：
精子遺傳物質(zhì)的完全滅活是與受精卵第二極體和第一次卵裂抑制技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生同質(zhì)和異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的關(guān)鍵技術(shù)。雖然目前已經(jīng)具有海水魚類精子紫外遺傳失活的方法，但主要是針對(duì)牙鲆魚的，而大黃魚精子的特點(diǎn)與牙鲆魚精子的完全不同，其精液濃度、pH適合范圍以及精子內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)與后者的有較大差別，使得大黃魚精子對(duì)紫外照射的敏感性和耐受力也存在很大差異。將牙鲆等鲆鰈魚類精子遺傳失活條件直接應(yīng)用于大黃魚精子的遺傳失活中一直未獲得成功，其遺傳失活率只有88-92％；而有關(guān)于大黃魚精子完全遺傳失活的方法實(shí)驗(yàn)的報(bào)道也尚未見到。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種滅活效果完全的適用于大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活的紫外照射方法和優(yōu)化參數(shù)、以避免大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)可能帶來分析結(jié)果混亂情形的大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下滅活步驟為①精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟情液避光保存于2～4℃低溫條件下備用。
②精液稀釋采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，稀釋倍數(shù)為20～100倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預(yù)冷到0～5℃的培養(yǎng)皿中，其培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.3cm；其中按重量體積百分比計(jì)所述預(yù)冷的稀釋液成份為NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl20.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH7.0～7.3；預(yù)冷溫度為0～5℃。
③精子遺傳物質(zhì)失活紫外光源預(yù)熱5～10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黃魚遺傳物質(zhì)失活；其中紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離恒定為15cm，紫外光源的照射劑量為1800～6000erg/mm2；所述紫外光源的照射劑量用Cole-Parmer Instrument Company的VLX-3W數(shù)字紫外輻射照度計(jì)測(cè)定。
④失活效果檢測(cè)將照射后的精子與正常大黃魚卵子受精，根據(jù)受精后6h胚胎存活率、孵化率和單倍率獲得率，對(duì)遺傳物質(zhì)失活效果進(jìn)行檢測(cè)。
各步驟中的優(yōu)選參數(shù)為采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40～80倍；培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.25cm；稀釋液與培養(yǎng)皿都預(yù)冷到0～2℃；紫外照射強(qiáng)度劑量為3000～4200erg/mm2；照射時(shí)間為2.5～3.5min。
本發(fā)明原理是當(dāng)紫外照射強(qiáng)度達(dá)到一定劑量時(shí)，不僅將精子的遺傳物質(zhì)完全滅活，也同時(shí)保證精子的受精能力，并可以使卵子正常啟動(dòng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于1.本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，所需設(shè)備少，便于操作，解決了大黃魚雌核發(fā)育誘導(dǎo)過程中最關(guān)鍵的精子遺傳物質(zhì)滅活不徹底的問題。
2.利用本發(fā)明不僅可使大黃魚精子遺傳物質(zhì)失活率達(dá)到100％，且精子仍具有活力可以正常啟動(dòng)卵子發(fā)育，同時(shí)還保證了滅活后精子對(duì)卵子較高的啟動(dòng)率(80～90％)及其受精后較高的6h胚胎存活率(75～85％)和孵化率(60～70％)。
3.本發(fā)明用于大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中已獲得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，保證了誘導(dǎo)后的個(gè)體全部為雌核發(fā)育的后代。對(duì)于進(jìn)行大規(guī)模大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育和全雌大黃魚誘導(dǎo)及其應(yīng)用于實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
4.適用范圍較廣，本發(fā)明不僅適用于大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，也適用于大黃魚同質(zhì)雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，這也將為大黃魚純系的建立提供基本參數(shù)和基礎(chǔ)。其技術(shù)方案和其中的一些處理參數(shù)也適用于其它非鲆鰈類的海水魚的雌核發(fā)育誘導(dǎo)。


圖1(a)為本發(fā)明實(shí)施例1獲得的大黃魚雌核發(fā)育單倍體的初孵仔魚圖。
圖1(b)為本發(fā)明實(shí)施例1大黃魚二倍體的初孵仔魚圖。
圖2(a)為本發(fā)明實(shí)施例2獲得的大黃魚雌核發(fā)育單倍體初孵仔魚的細(xì)胞流儀檢測(cè)圖。
圖2(b)為本發(fā)明實(shí)施例2大黃魚二倍體初孵仔魚的細(xì)胞流儀檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳述本發(fā)明。
實(shí)施例1滅活步驟為1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于2℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預(yù)冷到0℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1cm。
其中預(yù)冷的稀釋液為按重量體積百分比計(jì)NaCl 0.60％；KCl 0.03％；CaCl20.01％；葡萄糖0.05％；pH7.0；稀釋液預(yù)冷到0℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預(yù)熱5min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射2.5min，其紫外光源照射劑量為3000erg/mm2，所述紫外照射劑量用Cole-Parmer InstrumentCompany的VLX-3W數(shù)字紫外輻射照度計(jì)測(cè)定。
4.失活效果檢測(cè)將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中DNA相對(duì)含量對(duì)遺傳物質(zhì)失活效果進(jìn)行鑒定。從形態(tài)學(xué)上觀察，遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，表現(xiàn)出單倍體綜合癥(參見圖1)。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于3℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為50倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預(yù)冷到1℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.2cm；其中預(yù)冷的稀釋液為按重量體積百分比計(jì)NaCl 0.75％，KCl 0.04％，CaCl20.02％，葡萄糖0.08％；pH7.2；稀釋液預(yù)冷到1℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預(yù)熱8min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射3min，其紫外光源照射劑量為3600erg/mm2。
4.失活效果檢測(cè)將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA相對(duì)含量對(duì)遺傳物質(zhì)失活效果進(jìn)行鑒定。遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，其細(xì)胞內(nèi)DNA含量也只有正常二倍體的一半(參見圖2)。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于1.精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于4℃低溫條件下備用。
2.精液稀釋采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述的大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為80倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入到已預(yù)冷到2℃的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.25cm；其中預(yù)冷的稀釋液為按重量體積百分比計(jì)，NaCl 0.80％，KCl 0.05％，CaCl20.03％，葡萄糖0.10％；pH7.3；稀釋液預(yù)冷到2℃。
3.精子遺傳物質(zhì)失活打開紫外光源預(yù)熱10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，保持紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離為15cm，照射3.5min，其紫外光源照射劑量為4200erg/mm2。
4.失活效果檢測(cè)將照射后的大黃魚精子與正常大黃魚卵子受精，采用外部形態(tài)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA相對(duì)含量對(duì)遺傳物質(zhì)失活效果進(jìn)行鑒定。遺傳物質(zhì)完全失活的精子與卵子受精孵化后全部為單倍體，表現(xiàn)出單倍體綜合癥，其DNA含量也只有正常二倍體的一半。
權(quán)利要求
1.一種大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全滅活的方法，包括精液保存、精液稀釋、精子遺傳物質(zhì)失活，其特征在于①精液保存將人工擠出的未激活的大黃魚成熟精液避光保存于2～4℃低溫條件下備用；②精液稀釋采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，稀釋倍數(shù)為20～100倍，然后將稀釋后的大黃魚成熟精液放入已預(yù)冷到0～5℃的培養(yǎng)皿中，其培養(yǎng)皿中稀釋后的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.3cm；其中按重量體積百分比計(jì)所述預(yù)冷的稀釋液成份為NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl2，0.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH，7.0～7.3；稀釋液預(yù)冷到0～5℃；③精子遺傳物質(zhì)失活紫外光源預(yù)熱5～10min后，將帶有稀釋后的大黃魚成熟精液的培養(yǎng)皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黃魚遺傳物質(zhì)失活；其中紫外光源的照射劑量為1800～6000erg/mm2。
2.按照權(quán)利要求1所述大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活的方法，其特征在于精子遺傳物質(zhì)失活時(shí)所述紫外光源與培養(yǎng)皿底部距離恒定為15cm。
3.按照權(quán)利要求1所述大黃魚精子遺傳物質(zhì)滅活的方法，其特征在于采用預(yù)冷的稀釋液稀釋所述大黃魚成熟精液，其稀釋倍數(shù)為40～80倍；培養(yǎng)皿中稀釋的大黃魚成熟精液液體厚度為0.1～0.25cm；稀釋液與培養(yǎng)皿都預(yù)冷到0～2℃；紫外照射強(qiáng)度劑量為3000～4200erg/mm2；照射時(shí)間為2.5～3.5min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種適用于大黃魚精子遺傳物質(zhì)完全失活的方法，可以用于大黃魚雌核發(fā)育和其全雌苗種誘導(dǎo)的研究和生產(chǎn)。方法為采用預(yù)冷的含有營(yíng)養(yǎng)成分的稀釋液將大黃魚成熟精液稀釋20～100倍后放于平底培養(yǎng)皿中，用紫外光源照射后，與大黃魚卵子受精并孵育，而后對(duì)精子遺傳滅活的效果進(jìn)行鑒定。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單，所需設(shè)備少，便于操作，精子遺傳物質(zhì)滅活率能夠達(dá)到100％，且精子仍具有活力可以正常啟動(dòng)卵子發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模雌核發(fā)育和全雌大黃魚誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/01GK1990857SQ200510136709
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者許建和, 尤鋒, 張培軍, 吳雄飛, 徐永立, 蔣宏雷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所