專利名稱：包含人HSP70 ATPase結(jié)構(gòu)域與哺乳動物p53蛋白的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含熱休克蛋白的三磷酸腺苷酶(以下簡稱ATPase)結(jié)構(gòu)域和抗原肽的融合蛋白，更具體地說，本發(fā)明涉及包含人HSP70ATPase結(jié)構(gòu)域與哺乳動物p53蛋白的融合蛋白。本發(fā)明還涉及包含上述融合蛋白的藥物組合物、編碼上述融合蛋白的基因、包含所述基因的表達(dá)載體及其在制備用于治療或預(yù)防與p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
很久以前就發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)具有促進(jìn)蛋白質(zhì)分子正確折疊的作用。最近又發(fā)現(xiàn)Hsp70、Hsp90及Grp94(也稱gp96)可以將腫瘤抗原肽提交給抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)的MHC分子上，并被T細(xì)胞識別(綜述見Srivastava and Amato，2001；Srivastava，2003)。Hsps通過肽結(jié)合域以非共價形式和腫瘤抗原肽結(jié)合，形成Hsp和抗原肽復(fù)合物，作用于APCs表面的Hsp受體(CD91)后被內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)，然后Hsp和抗原肽復(fù)合物進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，抗原肽從Hsp上釋放出來并和MHC分子結(jié)合，抗原肽被MHC分子呈遞到APC表面。此外，Hsp分子還可通過促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生(van Eden et al，2003)，強(qiáng)烈激活先天免疫。因此，Hsp和腫瘤抗原肽復(fù)合物可通過先天免疫和后天免疫的加強(qiáng)，抵抗癌癥的發(fā)生以及病毒和細(xì)菌感染。
Hsp分子和抗原肽融合蛋白是通過共價鍵將Hsp分子和抗原肽連接在一起。有證據(jù)表明，這種融合蛋白可有效地促進(jìn)針對抗原肽的免疫反應(yīng)(Chu etal，2000)。WO2004/098526A2和RU2229307C1中公開了可將HSP70或其C端活性結(jié)構(gòu)域與HPV的E6或E7蛋白融合構(gòu)建成融合蛋白，用于抗腫瘤或感染性疾病，并且可增強(qiáng)免疫反應(yīng)。WO0049041A1中提及在抗癌或治療感染的融合蛋白中可用熱休克蛋白的ATPase結(jié)構(gòu)域與抗原肽融合。CN1401778A中公開了可將腺病毒載體與人p53基因構(gòu)建成重組體用于治療惡性腫瘤。CN1380392A提供了一種新的共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素2)基因的重組腺病毒。
但是，全長的Hsp70和腫瘤抗原肽或病原體抗原形成的融合蛋白表達(dá)量很低，很難進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的放大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種融合蛋白，包含人Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域以及哺乳動物的p53蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的p53蛋白來源于人。
本發(fā)明還提供了一種用于治療或預(yù)防與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物組合物，包含有效量的本發(fā)明的融合蛋白。
本發(fā)明還提供了一種核酸分子，其編碼本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明還提供了包含所述核酸分子以及必要的基因調(diào)控元件的表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供了所述融合蛋白、核酸分子以及表達(dá)載體在制備用于治療或預(yù)防與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明采用Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合蛋白，使其在E.coli中的表達(dá)水平大幅提高。用Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的融合蛋白仍然保留了ATPase活性，而且對與之結(jié)合的腫瘤抗原或病原體抗原具有強(qiáng)免疫反應(yīng)。
與現(xiàn)有技術(shù)中采用的細(xì)菌熱休克蛋白相比，本發(fā)明采用人源HSP70的ATPase結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合蛋白，使機(jī)體的不良反應(yīng)更小，免疫效果更好。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的融合蛋白取得了特別好的效果，對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著高于對照組。在小鼠中進(jìn)行的試驗(yàn)表明，本發(fā)明的融合蛋白作為疫苗免疫動物，既能產(chǎn)生治療性作用，也能產(chǎn)生預(yù)防性作用。所以，本發(fā)明融合蛋白在抗腫瘤或感染疾病的治療上具有廣闊前景。


附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在于更好地解釋本發(fā)明，以便于讀者理解。將附圖與具體實(shí)施方式
結(jié)合在一起，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1示出了AE7預(yù)防性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用。第2次免疫后10天，在小鼠右側(cè)接種1.3×105TC-1細(xì)胞，觀察38天內(nèi)腫瘤發(fā)生率。第44天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側(cè))5×105TC-1細(xì)胞，同時新取1組未經(jīng)處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細(xì)胞，作為對照組，繼續(xù)觀察40天。
圖2示出了AE7治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用。在小鼠右側(cè)接種1.3×105TC-1細(xì)胞后第5和第19天，用135μg AE7或PBS免疫小鼠，觀察腫瘤發(fā)生率。第49天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側(cè))5×105TC-1細(xì)胞，同時新取1組未經(jīng)處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細(xì)胞，作為對照組，繼續(xù)觀察39天。AE7免疫治療可顯著降低腫瘤發(fā)生率(A)、提高長期存活(B)、抑制腫瘤生長(C)。
圖3示出了AE7誘導(dǎo)的特異性CTL反應(yīng)。C57BL/6(n＝3)分別用PBS、AE7或E7免疫，7天后，取脾細(xì)胞和絲裂霉素C處理的TC-1細(xì)胞孵育5天，分別以TC-1細(xì)胞(A)和Lewis肺癌細(xì)胞(B)作為靶細(xì)胞檢測CTL活性。
圖4示出了AE6預(yù)防性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用。第2次免疫后10天，在小鼠右側(cè)接種1.3×105TC-1細(xì)胞，觀察32天內(nèi)腫瘤發(fā)生率。第36天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側(cè))5×105TC-1細(xì)胞，同時新取1組未經(jīng)處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細(xì)胞，作為對照組，繼續(xù)觀察30天。
圖5示出了AE6治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用。在小鼠右側(cè)接種1.3×105TC-1細(xì)胞后第5和第19天，用127μg AE6或PBS免疫小鼠，觀察腫瘤發(fā)生率。第42天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側(cè))5×105TC-1細(xì)胞，同時新取1組未經(jīng)處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細(xì)胞，作為對照組，繼續(xù)觀察39天。AE6免疫治療可顯著降低腫瘤發(fā)生率(A)，提高長期存活(B)。
圖6示出了hAP53預(yù)防性免疫延長荷瘤小鼠的存活(Kaplan-Meier分析)。
圖7示出了hAP53治療性免疫延長荷瘤小鼠的存活。
圖8示出了hAP53誘導(dǎo)的mp53-p815細(xì)胞特異性的CTL反應(yīng)。其中，Amp53-p815靶細(xì)胞，Bp815靶細(xì)胞；*P＜0.05，**P＜0.01與PBS組比較。
圖9示出了hAP53免疫對NK細(xì)胞殺傷活性的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的融合蛋白中，除了人HSP70的三磷酸腺苷酶結(jié)構(gòu)域以及人乳頭瘤病毒的E7/E6蛋白或者哺乳動物p53蛋白之外，還可以含有其它序列，例如親和純化標(biāo)簽(例如His Tag)等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中包含治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明的藥物組合物中還可以含有合適量的藥學(xué)上可接受的載體，以便提供適于向病人給藥的形式。在一個具體實(shí)施方式
中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指經(jīng)國家藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列在中國藥典或其它公認(rèn)的用于哺乳動物尤其是人的外國藥典上。術(shù)語“載體”是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑等。這樣的藥物載體可以是無菌液體，如水和油的鹽溶液，包括石油，動物，植物或合成的來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物用于靜脈施用時，鹽溶液是優(yōu)選的載體。鹽溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以作為液體載體，特別是作為注射用溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、干粉脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
術(shù)語“有效量的”是指提供臨床醫(yī)師或者其他有資格的觀察人員注意到的客觀上可鑒定的改善的藥物劑量。
編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子可以和必要的基因調(diào)控元件可操作地連接，例如啟動子、增強(qiáng)子、篩選標(biāo)記等。
在本文中，術(shù)語“蛋白”、“蛋白質(zhì)”、“肽”、“多肽”可以互換使用，表示由兩個或更多個氨基酸通過肽鍵連接而形成的聚合物。
本文中所用的術(shù)語“人乳頭瘤病毒相關(guān)腫瘤”是指與人乳頭瘤病毒有關(guān)的腫瘤，包括但不限于宮頸癌(cervical cancer)、肛門上皮內(nèi)瘤(analintraepithelial neoplasia)、子宮頸上皮內(nèi)瘤(cervical intraepithelialneoplasia)、肛門生殖器疣(anogenital warts)、復(fù)發(fā)呼吸道乳頭狀瘤(recurrent respiratory papillomatosis)及陰道上皮內(nèi)腫瘤(vulvalintraepithelial neoplasia)等。
本文中所用的術(shù)語“與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤”是指該腫瘤的發(fā)展與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)。該腫瘤可以發(fā)生在機(jī)體的各個部位，包括肝臟、肺、腎、結(jié)腸、子宮等部位。在該類腫瘤中，p53基因發(fā)生突變從而導(dǎo)致p53蛋白過量表達(dá)，并被提呈至腫瘤細(xì)胞的表面。
為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。這些具體實(shí)施方式
僅僅是出于解釋和說明的目的，不應(yīng)該被理解為是對本發(fā)明范圍的限制。在對這些具體實(shí)施方式
進(jìn)行描述時，沒有對公知的實(shí)驗(yàn)方法、儀器、試劑和材料等進(jìn)行詳細(xì)的描述，以避免喧賓奪主、淡化了本發(fā)明的主要內(nèi)容。
實(shí)施例1、重組人HSP70ATPase結(jié)構(gòu)域與HPV E7融合蛋白(AE7)編碼基因的構(gòu)建及表達(dá)人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的E7和E6蛋白在HPV感染病人的腫瘤發(fā)生方面具有重要作用(Fehrmann and Laimins，2003)，因此，HPV感染病人細(xì)胞表面的E7和E6蛋白作為腫瘤抗原可以被T細(xì)胞識別。Hsp70的ATPase域和E7/E6組成的融合蛋白可以增強(qiáng)人體對HPV病毒及其引發(fā)的宮頸癌的免疫反應(yīng)。我們將Hsp70的ATPase域和E7的融合蛋白稱為AE7，將Hsp70的ATPase域和E6的融合蛋白稱為AE6。
人Hsp70ATPase域基因(氨基酸殘基1-386)從人Hsp70全長基因通過PCR獲得。HPV病毒16型E7基因從該病毒基因組PCR獲得。Hsp70ATPase域PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamH I酶切連接到S28b載體，并命名為S28bA。HPV E7的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切連接到S28bA，命名為S28bAE7，對AE7核酸序列進(jìn)行測序確證。AE7純品的ATPase活性用孔雀綠法檢測，結(jié)果表明重組AE7具有水解ATP的全部功能。
將轉(zhuǎn)化有AE7表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21(DE3)在含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃高密度發(fā)酵，OD600達(dá)45-50時，加入500mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時，離心收菌。用A液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)洗滌3次后，再用A液懸浮沉淀，超聲破碎，1200～1800W功率，每次10秒，間隔10秒，共超破60～80次，超破溫度10度；超破結(jié)束后離心收集沉淀即為包涵體。包涵體依次用B液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，pH7.5)和C液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，1.5％TritonX-100，1.5～2.0M(NH2)2CO，pH7.5)各洗滌3次后，再用B液洗滌1次。將沉淀按重量體積比為1∶1的比例加入B液混勻，再按重量體積比為1∶10～1∶20的比例加入D液(25mM Tris-HCl，50～100mMNaCl，5～10mM DDT，6～8M(NH2)2CO，pH7.5)混勻，室溫攪拌2小時以上，10000～18000rpm離心30分鐘，收集上清即為包涵體變性液G。
緩慢將G液滴加入E液(25mM Tris-HCl，0.1～0.3mM NaCl，1mMDDT，1M(NH2)2CO，5mM EDTA，10mM KCl，0.3M Arg，pH8.0)中，至蛋白終濃度為0.2～0.5mg/ml，即為稀釋復(fù)性液H，然后，將H液灌透析袋和E液按1∶5的體積比例透析過夜。
用I液(25mM Tris-HCl，pH8.0)平衡DEAE層析柱，取透析后的H液上樣，然后用I液沖洗，再依次用J液(25mM Tris-HCl，0.1mM NaCl，pH8.0)和K液(25mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，pH8.0)洗脫，收集洗脫峰，即為AE7DEAE收集峰S。
用N液(25mM Tris-HC，0.2NaCl pH8.0)平衡層析柱，取S液上樣，上樣結(jié)束后依次用N液、O液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，25mM咪唑，pH8.0)和P液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，0.5％Triton，pH8.0)沖洗，用Q液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，500mM咪唑，pH8.0)洗脫收集洗脫峰，即為AE7親和收集峰T。
用R液(10mM檸檬酸鈉，0.2NaCl)平衡層析柱，取T液按柱體積的1～3％上樣，上樣結(jié)束后，用R洗脫，收集洗脫峰，即為AE7純化液。用SDS-PAGE檢驗(yàn)純度＞95％。
實(shí)施例2、重組人HSP70ATPase結(jié)構(gòu)域與HPV E6融合蛋白(AE6)編碼基因的構(gòu)建及表達(dá)HPV病毒16型E6基因從該病毒基因組PCR獲得，PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切連接到S28bA，命名為S28bAE6，對AE6核酸序列進(jìn)行測序確證。
S28bAE6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)。AE6蛋白的表達(dá)方法與AE7相同。AE6蛋白復(fù)性和純化與AE7類似，AE6的ATPase活性用孔雀綠法檢測，結(jié)果表明重組AE6具有水解ATP的全部功能。
實(shí)施例3、重組人HSP70ATPase結(jié)構(gòu)域與人D53融合蛋白(hAP53)編碼基因的構(gòu)建及表達(dá)人p53基因以人肝cDNA文庫為模板通過PCR獲得。人p53基因的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切后連接到S28bA，命名為S28bhAP53，通過DNA測序確證目的基因的核酸序列。
hAP53的蛋白表達(dá)、復(fù)性和純化方法與AE7類似，ATPase活性用孔雀綠法檢測，結(jié)果表明重組hAP53具有水解ATP的全部功能。
實(shí)施例4、本發(fā)明藥物AE7和AE6對C57BL/6小鼠TC-1移植瘤的預(yù)防和治療作用在本實(shí)施例中，所用動物為雌性C57BL/6小鼠，6-8周大小。
瘤株TC-1細(xì)胞株(ATCC)，來自C57BL/6小鼠原代肺上皮細(xì)胞，攜帶HPV-16(人乳頭瘤病毒)的E6/E7及人c-Ha-ras致癌基因。
TC-1細(xì)胞培養(yǎng)以RPMI1640(Gibco)+10％FBS(Hyclone)為培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
TC-1細(xì)胞接種剪去小鼠右側(cè)被毛(或用8％Na2S脫毛)，75％酒精消毒皮膚，取0.2ml TC-1細(xì)胞懸液(約含1.3×105個細(xì)胞)皮下注射，此后每隔3-4天觀察腫瘤生長情況，并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長寬徑，按公式長×寬2÷2計算腫瘤體積，繪制腫瘤體積生長變化圖。
免疫程序1治療作用研究右側(cè)接種1.3×105個TC-1細(xì)胞后5天，取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等體積PBS注射于小鼠頸部皮下(每組10只)，進(jìn)行初次免疫；14天后以相同劑量免疫第2次。接種腫瘤后約40天，在AE7或AE6組無瘤小鼠的左側(cè)接種5×105個TC-1細(xì)胞，繼續(xù)觀察約30天。同時另取一批未接受過任何處理的小鼠，左側(cè)接種5×105個TC-1細(xì)胞作為對照。
2預(yù)防作用研究取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等體積PBS注射于小鼠頸部皮下(每組10只)，進(jìn)行初次免疫，14天后以相同劑量免疫第2次。再10天后，給小鼠接種1.3×105個TC-1細(xì)胞，約30天后，在AE7或AE6組無瘤小鼠的左側(cè)接種5×105個TC-1細(xì)胞，繼續(xù)觀察約30天。同時另取一批未接受過任何處理的小鼠，左側(cè)接種5×105個TC-1細(xì)胞作為對照。
免疫小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對TC-1的體外殺傷活性檢測C57BL/6小鼠(每組3-4只)分別頸部皮下注射AE7(135μg)、E7或PBS，共兩次，間隔7天，末次免疫后7天，將每組分離的小鼠脾細(xì)胞合并后，用淋巴細(xì)胞分離液分離，2×107個脾細(xì)胞和1×106個絲裂霉素C處理的TC-1細(xì)胞在6孔板中混合培養(yǎng)5天，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離出脾細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞；以TC-1作為靶細(xì)胞，每孔10000個，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例分別為11∶1、33∶1、100∶1(重復(fù)3次)，培養(yǎng)4h后，取上清，用非放射性的細(xì)胞毒檢測試劑盒(Promega)檢測乳酸脫氫酶的釋放量。按下述公式計算細(xì)胞裂解百分率 結(jié)果一、AE7免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用1AE7預(yù)防性免疫對接種TC-1腫瘤小鼠的保護(hù)作用經(jīng)兩次AE7免疫后接種TC-1，PBS對照組3-4天后開始形成腫瘤結(jié)節(jié)，在觀察期內(nèi)，腫瘤發(fā)生率為100％；AE7組僅在觀察后期，發(fā)現(xiàn)10只小鼠中的1只有腫瘤，AE7的保護(hù)率為90％。AE7組的無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1后，9只小鼠中仍然有8只無腫瘤，而同期對照組腫瘤發(fā)生率為100％。(Fig1)2AE7治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用接種TC-1后第5天，AE7和PBS對照組均有30％-40％的小鼠形成腫瘤，此時開始免疫，免疫后第9天，對照組腫瘤發(fā)生率達(dá)100％，AE7組為60％，隨后AE7組小鼠腫瘤逐漸消失，至第2次免疫前，AE7組腫瘤發(fā)生率已降至30％，而對照組仍為100％。第2次免疫后，AE7組腫瘤發(fā)生率降至20％。AE7組的8只無瘤小鼠，再次接種更大劑量的TC-1后，最終也未發(fā)現(xiàn)腫瘤(Fig2a)。在88天的觀察期內(nèi)，AE7組小鼠無死亡，對照組死亡90％(Fig2b)。與對照組比較，AE7組兩只小鼠的腫瘤生長速度非常緩慢(Fig2c)。
3AE7免疫可增加TC-1特異性的CTL細(xì)胞的殺傷活性AE7免疫小鼠的脾細(xì)胞中TC-1細(xì)胞特異性的CTL的殺傷活性顯著高于E7對照組和PBS對照組(p＜0.01)，而E7免疫小鼠脾細(xì)胞對TC-1細(xì)胞的的殺傷活性與PBS對照組無明顯差別(p＞0.05)(Fig3)。
二、AE6免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用1AE6預(yù)防性免疫對接種TC-1腫瘤小鼠的保護(hù)作用用與AE7相同劑量(按摩爾數(shù))的AE6免疫后，可提供70％的保護(hù)率，即70％小鼠不出現(xiàn)腫瘤；PBS組的1只無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1后，很快長出腫瘤，而AE6組無瘤小鼠再次接種TC-1后，7只小鼠中仍然有6只無腫瘤(Fig4)。
2AE6治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護(hù)作用先接種TC-1，再用AE6治療，僅50％小鼠不出現(xiàn)腫瘤；該組的無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1后，有1只小鼠一過性出現(xiàn)腫瘤，觀察期末，均未有腫瘤(Fig5)。
結(jié)論AE6和AE7無論是預(yù)防性免疫還是治療性免疫，均對表達(dá)E6/E7抗原的腫瘤細(xì)胞TC-1有顯著的抑制作用，而且AE7對接種TC-1小鼠的保護(hù)作用明顯優(yōu)于AE6。小鼠CTL細(xì)胞對TC-1的特異性裂解實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)可能是AE7/AE6發(fā)揮作用的主要機(jī)制。
實(shí)施例5、本發(fā)明藥物hAP53對Balb/c小鼠mp53-p815移植瘤的預(yù)防和治療作用在本實(shí)施例中，所用動物為雌性Balb/c小鼠，6-8周大小。
腫瘤細(xì)胞系mp53-P815的建立將質(zhì)粒pRC/CMVp53(含135位Cys→Tyr點(diǎn)突變的人p53基因)，采用lipofectamine共轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入P815小鼠肥大瘤細(xì)胞系(mouse mastocytoma cellline，from ATCC)，以含600mg/L G418的培養(yǎng)液選擇抗性克隆，并以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法初檢p53蛋白的表達(dá)，所獲陽性克隆進(jìn)一步用有限稀釋法再克隆化培養(yǎng)，用Westernblot檢測p53蛋白的表達(dá)。挑選p53表達(dá)高、全陽性的克隆作為表達(dá)突變p53蛋白的腫瘤細(xì)胞系mp53-P815，置于含600mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本實(shí)施例中構(gòu)建含135位Cys→Tyr點(diǎn)突變的人p53基因，是因?yàn)榘┌Y患者經(jīng)常伴有該位點(diǎn)基因突變，發(fā)生該突變的人p53基因大量異常表達(dá)有功能缺陷的p53蛋白，并被MHC I類分子提呈至腫瘤細(xì)胞表面。而在正常人體內(nèi)，人p53基因的表達(dá)量很低。
免疫程序1治療作用研究20只小鼠，分兩組(n＝10)hAP53治療組和PBS對照組。分別于小鼠尾靜脈接種致死劑量1×106的mp53-P815細(xì)胞后第3天和第13天，取0.2ml hAP53 200μg或等體積PBS注射于小鼠頸部皮下，進(jìn)行免疫。觀察各免疫組小鼠的存活時間和存活率。
2預(yù)防作用研究20只小鼠，分兩組(n＝10)hAP53組和PBS對照組。取0.2ml hAP53 200μg或等體積PBS注射于小鼠頸部皮下，進(jìn)行首次免疫，間隔10天后，行第2次免疫。此后第10天，給小鼠尾靜脈接種致死劑量(1×106)的P815-mp53細(xì)胞，觀察各免疫組小鼠的存活時間和存活率。
CTL及NK細(xì)胞殺傷活性的測定將合并的各組小鼠的脾細(xì)胞(每組3-4只)，用淋巴細(xì)胞分離液分離，2×107個脾細(xì)胞和2×106個絲裂霉素C處理的mp53-P815細(xì)胞在6孔板中混合培養(yǎng)5天，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離出脾細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞；以mp53-P815細(xì)胞作為靶細(xì)胞，每孔10000個，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例分別為20∶1、40∶1、80∶1(重復(fù)3次)，培養(yǎng)4h后，取上清，用非放射性的細(xì)胞毒檢測試劑盒(Promega)檢測乳酸脫氫酶的釋放量。按下述公式計算細(xì)胞裂解百分率 小鼠脾細(xì)胞分離后可立即進(jìn)行NK細(xì)胞活性檢測，每孔10000個YAC-1靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例及檢測方法同上。
結(jié)果1hAP53預(yù)防性免疫對mp53-P815荷瘤小鼠的保護(hù)作用在接種致死劑量的mp53-P815腫瘤細(xì)胞13天后，對照組小鼠開始陸續(xù)死亡，28天內(nèi)全部死去，平均存活期為22.4±1.33天。而hAP53組在接種腫瘤25天后開始死亡，70天的觀察期內(nèi)僅有4只(40％)小鼠死去，平均存活期為57.1±5.19天，顯著長于對照組(P＜0.001)，表明hAP53的預(yù)防免疫可顯著延長荷瘤小鼠的存活期。(圖6)2hAP53治療性免疫對mp53-P815荷瘤小鼠的保護(hù)作用對照組小鼠在接種mp53-P815腫瘤后35天內(nèi)全部死去，平均存活期為25.7±2.27天。而接種腫瘤3天后開始的hAP53免疫治療，仍然使小鼠的存活期大大延長，觀察結(jié)束時，只有7只小鼠死亡，平均存活期為47.9±2.27天，顯著長于對照組(P＜0.01)(圖7)。
3hAP53免疫可增加特異性CTL細(xì)胞的殺傷活性hAP53或PBS加強(qiáng)免疫后1周，取兩組各3只小鼠的脾細(xì)胞，進(jìn)行mp53-p815細(xì)胞特異性的CTL的殺傷活性檢測，可見hAP53組mp53-p815細(xì)胞特異性的CTL反應(yīng)顯著高于PBS對照組(p＜0.01，或＜0.05)，而hAP53組對p815細(xì)胞的CTL反應(yīng)與PBS組無明顯差別(p＞0.05，圖8)。對NK細(xì)胞的殺傷活性檢測表明，hAP53組和PBS組的NK細(xì)胞對YAC-1靶細(xì)胞的殺傷活性無明顯差別(p＞0.05，圖9)。以上結(jié)果表明，hAP53增強(qiáng)了特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
結(jié)論hAP53無論是預(yù)防性免疫還是治療性免疫，均可顯著延長接種mp53-p815腫瘤小鼠的生存期，特異性CTL殺傷活性的增強(qiáng)是hAP53發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制。
上述實(shí)施例中所涉及的具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考Molecular CloningALABORATORY MANUAL(3rd Edition)(J.Sambrook，P.MacCallum，D.Russell，Cold Spring Harber Laboratory Press，2001)以及黃培堂等(2002)譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
本文中所涉及的參考文獻(xiàn)，包括專利文件、學(xué)術(shù)論文、出版物等，均以引用的方式將其全部內(nèi)容包括在本文中。
應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，如果在文中沒有特別說明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等加以實(shí)施。
本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品(包括但不限于化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中，對于那些特殊的或不易獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說明的，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請日之前，可以通過各種方式(例如購買、自行制備等)很方便地獲得。
應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。例如，根據(jù)密碼子簡并原則或堿基互補(bǔ)原則所獲得的功能基本相同的核酸分子，以及在對蛋白質(zhì)功能不起主要作用的位點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸替換所得到的功能基本相同的蛋白質(zhì)或多肽，均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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1.一種融合蛋白，包含人HSP70的三磷酸腺苷酶結(jié)構(gòu)域以及哺乳動物的p53蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白由人HSP70的三磷酸腺苷酶結(jié)構(gòu)域以及哺乳動物的p53蛋白構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中所述哺乳動物為人。
4.一種用于治療或預(yù)防與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤位于肝臟、肺、腎、結(jié)腸或子宮。
6.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的融合蛋白。
7.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求6的核酸分子以及必要的基因調(diào)控元件。
8.權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的融合蛋白、權(quán)利要求6的核酸分子或權(quán)利要求7的表達(dá)載體在制備用于治療或預(yù)防與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述與突變引起的p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤位于肝臟、肺、腎、結(jié)腸或子宮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含熱休克蛋白的三磷酸腺苷酶結(jié)構(gòu)域和抗原肽的融合蛋白，更具體地說，本發(fā)明涉及包含人HSP70 ATPase結(jié)構(gòu)域與哺乳動物p53蛋白的融合蛋白。本發(fā)明還涉及包含所述融合蛋白的藥物組合物、編碼所述融合蛋白的基因、包含所述基因的表達(dá)載體及其在制備用于治療或預(yù)防p53蛋白過量表達(dá)有關(guān)的腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號C12N15/62GK1919873SQ20051013777
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日
發(fā)明者朱冰 申請人:沙東生物藥業(yè)(天津)有限公司