專利名稱：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1999年7月14日，申請(qǐng)?zhí)枮?9810884.7，發(fā)明名稱為“神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，特別涉及在本文中被稱為“enovin”(EVN)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的GDNF家族的新成員的克隆和表達(dá)。
前言神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子參與神經(jīng)元分化、發(fā)育和維持。這種蛋白能預(yù)防不同類型神經(jīng)元細(xì)胞的變性，并促進(jìn)其存活，因此是治療神經(jīng)變性疾病的潛在治療劑。膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(GDNF)是在結(jié)構(gòu)上不同于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的日益增長(zhǎng)的亞家族的第一個(gè)成員。GDNF是以在氨基酸序列中有7個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基的特殊形式為特征的生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族的一員(Kingsley，1994)。GDNF最初是用一種分析方法根據(jù)其在體外維持胚性前側(cè)小腦多巴胺能的神經(jīng)元的存活和功能的能力純化的(Lin等，1993)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的其他類型的神經(jīng)元細(xì)胞也能對(duì)GDNF的存活作用產(chǎn)生應(yīng)答(Henderson等，1994，Buj-Bello等，1995，Mount等，1995，Oppenheim等，1995)。GDNF是由細(xì)胞以無(wú)活性的前體形式產(chǎn)生的，該前體在RXXR弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)被專一性裂解產(chǎn)生活性的(成熟的)GDNF(Lin等，1993)。外源服用GDNF在帕金森病的動(dòng)物模型上具有有效的神經(jīng)保護(hù)作用，這種病是一種以在大腦的黑質(zhì)中喪失了多達(dá)70％的多巴胺能的細(xì)胞為特征的常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病(Beck等，1995，Tomac等，1995，Gash等，1996，Choi-Lundberg等，1997，Bilang-Bleuel等，1997)。
最近，業(yè)已發(fā)現(xiàn)了GDNF家族的其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。Neurturin(NTN)是從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的環(huán)條件培養(yǎng)基中純化的，是用一種方法根據(jù)其促進(jìn)交感神經(jīng)元在培養(yǎng)物中的存活能力純化的(Kotzbauer等，1996)。成熟的NTN蛋白與成熟的GDNF具有57％的相似性。Persephin(PSP)是通過(guò)以基因組DNA為模板用簡(jiǎn)并引物PCR克隆發(fā)現(xiàn)的。成熟的PSP與成熟的GDNF類似，能促進(jìn)培養(yǎng)物中前側(cè)小腦多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活(Milbrandt等，1998)。成熟的PSP蛋白與成熟的GDNF和NTN的相似性大約為50％。Artemin(ARTN)是通過(guò)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)的，并且是培養(yǎng)物中傳感和交感神經(jīng)元的存活因子(Baloh等，1998b)。
為了完成下游胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，GDNF、NTN、PSP和ARTN需要一種異源二聚體受體復(fù)合體。GDNF結(jié)合于GDNF家族受體α1(GFRα-1；GFRα命名協(xié)會(huì)，1997)亞基上，它是一種糖基磷脂酰-肌醇(糖基PtdIns)錨定的膜蛋白(Jing等，1996，Treanor等，1996，Sanicola等，1997)。GDNF/GFRα-1復(fù)合體隨后結(jié)合并激活一種膜結(jié)合酪氨酸激酶---cRET原癌基因(Durbec等，1996，Trupp等，1996)，導(dǎo)致cRET中的酪氨酸殘基的磷酸化，并隨后激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Worby等，1996)。業(yè)已鑒定了配體結(jié)合受體的GFRα家族的若干其他成員(Baloh等，1997，Sanicor等，1997，Klein等，1997，Buj-Bello等，1997，Suvanto等，1997)。GFRα-2和GFRα-3(Jing等，1997，Masure等，1998，Woby等，1998，Naveilham等，1998，Baloh等，1998a)業(yè)已由若干不同的研究小組所鑒定。GFRα-1和GFRα-2幾乎在所有的組織中廣泛表達(dá)，并且其表達(dá)是受發(fā)育調(diào)控的(Sanicola等，1997，Widenfalk等，1997)。
GFRα-3不在發(fā)育中的或成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，但在外周神經(jīng)系統(tǒng)的若干發(fā)育中的和成熟的傳感和交感神經(jīng)節(jié)中高度表達(dá)(Widenfalk等，1998，Naveilhan等，1998，Baloh等，1998a)。第4個(gè)家族成員GFRα-4是由雞cDNA克隆的(Thompson等，1998)。GFRα-1是GDNF的優(yōu)選受體，而GFRα-2優(yōu)選結(jié)合NTN(Jing等，1996，Treanor等，1996，Klein等，1997)。雞GFRα-4與cRET一起構(gòu)成PSP的功能性受體復(fù)合體(Enokido等，1998)。業(yè)已證實(shí)同時(shí)表達(dá)GFRα-3和cRET的細(xì)胞不能對(duì)GDNF、NTN或PSP應(yīng)答(Worby等，1998，Baloh等，1998a)。最近，業(yè)已證實(shí)ART能用GFRα-3作為優(yōu)選的配體結(jié)合受體通過(guò)cRET傳導(dǎo)信號(hào)(Baloh等，1998b)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和GFRα受體之間在體外進(jìn)行通訊是可能的，因?yàn)镚DNF在存在cRET的條件下能結(jié)合于GFRα-2或GFRα-3上(Sanicola等，1997，Trupp等，1998)，并且NTN能以低親合力結(jié)合于GFRα-1上(Klein等，1997)?？傊珿DNF、NTN、PSP和ART是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)系統(tǒng)的一部分，因此不同的配體結(jié)合亞基(GFRα-1至-4)能與相同的酪氨酸激酶亞基(cRET)相互作用。這些體外發(fā)現(xiàn)的生理學(xué)關(guān)系最近已在基因剔除研究中顯示(由Rosenthal做過(guò)綜述，1999)，該研究清楚地表明，GDNF在體內(nèi)能與GFRα-1相互作用，而NTN是GFRα-2的優(yōu)選配體。
本發(fā)明人業(yè)已對(duì)GDNF家族的第4個(gè)成員enovin(EVN)進(jìn)行了鑒定、克隆、表達(dá)、染色體定位和特征分析。由于不同的功能性和非功能性mRNA剪接變體的發(fā)現(xiàn)，加深了對(duì)成熟EVN蛋白的了解。而且，我們提供了表達(dá)數(shù)據(jù)、EVN與GFRα-3的結(jié)合數(shù)據(jù)和EVN對(duì)軸突派生的體外作用，以及在星形胞菌素分化的SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用。
發(fā)明概述在本申請(qǐng)中，提供了一種編碼新型人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子“enovin”的核酸分子，一種含有所述核酸分子的表達(dá)載體，一種用所述載體轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主細(xì)胞，一種由所述核酸分子編碼的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，分離的enovin，起著enovin的激動(dòng)劑或拮抗劑作用的化合物，以及含有所述核酸或enovin蛋白或其激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物組合物。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼具有圖21所示的氨基酸序列、在本文中被稱為enovin的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，或編碼所述生長(zhǎng)因子的功能性等同物、衍生物或生物前體的核酸分子。所述核酸分子優(yōu)選為DNA，更優(yōu)選為cDNA分子。
本發(fā)明的核酸優(yōu)選包括

圖1所示序列的從81到419號(hào)位置的序列，更優(yōu)選從81到422號(hào)位置，更優(yōu)選圖1所示的完整序列。
從81到419號(hào)的核酸分子被認(rèn)為編碼成熟的enovin蛋白的序列，該成熟蛋白是在對(duì)所述enovin蛋白的穩(wěn)定的前體上所存在的RXXR加工位點(diǎn)進(jìn)行加工以后所得到的。
本發(fā)明還提供了一種能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的高嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的任一種核酸序列雜交的反義分子。
本文所說(shuō)的雜交的嚴(yán)格性是指能使核酸保持穩(wěn)定的條件。雜合體的穩(wěn)定性可以反映在雜合體的熔點(diǎn)溫度(Tm)上。Tm大體上可以通過(guò)以下公式表達(dá)
81.5℃-16.6(log10[Na+]+0.41(％G&C)-600/l其中，l是雜合體的長(zhǎng)度，以核苷酸數(shù)計(jì)。序列同源性每降低1％，Tm降低大約1-1.5℃。
理想的是，可以用合適的表達(dá)載體在宿主細(xì)胞或類似物中用本發(fā)明的核酸分子表達(dá)本發(fā)明人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的表達(dá)載體包括能夠表達(dá)可操作地連接于能影響所述DNA片段表達(dá)的調(diào)控序列如啟動(dòng)子區(qū)的DNA的載體。
表達(dá)所需的調(diào)控元件包括結(jié)合RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列和用于核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體可以包括啟動(dòng)子如lac啟動(dòng)子和用于轉(zhuǎn)錄起始的SD序列，以及起始密碼子AUG。類似地，真核表達(dá)載體可以包括RNA聚合酶II的異源或同源啟動(dòng)子，下游聚腺苷酸化信號(hào)，起始密碼子AUG，用于解離核糖體的終止密碼子。所述載體可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得，或者通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法用公開(kāi)的序列組裝。
因此，表達(dá)載體是指重組DNA或RNA結(jié)構(gòu)，如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或在導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞之后會(huì)導(dǎo)致所述DNA或RNA片段表達(dá)的其他載體。合適的表達(dá)載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并包括能在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中復(fù)制的載體，以及保持其游離體形式的載體或能整合到宿主細(xì)胞基因組上的載體。
可將能與本發(fā)明核酸雜交的反義分子用作探針或藥物或用于藥物組合物中。
可以沿反義方向?qū)⒈景l(fā)明的核酸分子插入所述載體中，以便能產(chǎn)生反義RNA?？梢酝ㄟ^(guò)合成方法生產(chǎn)反義RNA或其他反義核酸。
本發(fā)明的另一方面包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染過(guò)的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞優(yōu)選包括真核細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，將克隆的DNA整合到合適的表達(dá)載體上，并隨后用于轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，再隨后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞是眾所周知的，并且披露于Sambrook等(1989)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社中。
本發(fā)明的另一方面包括具有本發(fā)明核酸分子的至少15個(gè)核苷酸的核酸分子，優(yōu)選15-50個(gè)核苷酸。
所述序列可優(yōu)選用作探針或啟動(dòng)復(fù)制的引物等。所述核酸分子可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)生產(chǎn)，如可以通過(guò)重組或合成方法?？蓪⑵溆糜谠\斷試劑盒或裝置等中，用于檢測(cè)本發(fā)明核酸的存在。所述檢測(cè)通常包括讓所述探針與一種樣品在雜交條件下接觸，并檢測(cè)在所述探針和該樣品中任何核酸之間所形成的任何雙體的存在。
根據(jù)本發(fā)明，所述探針可以錨定在固體支持物上。優(yōu)選將其排成陣列，以便多種探針可以同時(shí)與同一種生物學(xué)樣品雜交?？蓪⑺鎏结樀渭拥剿鲫嚵猩?，或者在所述陣列上原位合成(參見(jiàn)Lockhart等，《自然生物技術(shù)》，14卷，1996年12月，“通過(guò)雜交到高密度寡核苷酸陣列中的監(jiān)測(cè)表達(dá)”)。單獨(dú)一個(gè)陣列可以在不同的位置含有超過(guò)100、500甚至超過(guò)1000種不同的探針。
本發(fā)明的核酸分子還可以用諸如重組或合成的方法生產(chǎn)，例如，使用PCR克隆原理，它總體上涉及生產(chǎn)一對(duì)引物，它可以是來(lái)自需要克隆的基因的大約10-50個(gè)核苷酸的片段，讓所述引物與源于人細(xì)胞的mRNA、cDNA或基因組DNA接觸，在能夠擴(kuò)增所述目標(biāo)區(qū)的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增的區(qū)或片段，并回收擴(kuò)增的DNA。一般，本文中所述技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如由Sambrook等所披露(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，1989)。
本發(fā)明的核酸或寡核苷酸可以攜帶一種顯示標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素如32P或36S、酶標(biāo)記、或其他蛋白標(biāo)記如生物素或熒光標(biāo)記。所述標(biāo)記可以添加到本發(fā)明的核酸或寡核苷酸上，并可以用本身已知的技術(shù)檢測(cè)。
例如，優(yōu)選可以通過(guò)探測(cè)來(lái)自諸如不同群體的多個(gè)個(gè)體的cDNA或基因組文庫(kù)鑒定本發(fā)明DNA分子的人類等位變體或多態(tài)性。另外，本發(fā)明的核酸和探針可用于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)對(duì)來(lái)自患者的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，如Sanger雙脫氧鏈終止方法，該方法可優(yōu)選用于在患者中確定與本發(fā)明的生長(zhǎng)因子相關(guān)的某些疾病的任何誘因。
本發(fā)明還提供了含有能夠表達(dá)本發(fā)明的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子enovin的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或有機(jī)體。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)基因”是指能導(dǎo)致具有本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的相同功能和/或活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的任何合適的核酸序列。例如，所述轉(zhuǎn)基因可以包括從人細(xì)胞中分離的基因組核酸或合成的核酸，包括cDNA，它可整合在染色體中或者保持染色體外的狀態(tài)。
所述轉(zhuǎn)基因優(yōu)選包括本發(fā)明的載體，該載體包括編碼所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸分子或所述核酸分子的功能性片段，所述核酸的“功能性片段”應(yīng)當(dāng)被理解成編碼所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或其功能性等同物的基因或cDNA片段，該片段能夠表達(dá)以便產(chǎn)生本發(fā)明的功能性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。因此，例如，相當(dāng)于能與相應(yīng)的受體相互作用的特定氨基酸殘基的本發(fā)明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的片段也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分，并且該片段可用作激活本發(fā)明生長(zhǎng)因子的相應(yīng)受體的激動(dòng)劑，以便誘導(dǎo)其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)和存活維持作用。本發(fā)明的該方面還包括本發(fā)明核酸的差別剪接的同等型和轉(zhuǎn)錄起始物。
根據(jù)本發(fā)明，一種特定的核酸不僅包括相同的核酸，而且還包括任何小的堿基變化，特別包括會(huì)產(chǎn)生同義密碼子(不同的密碼子編碼相同的氨基酸殘基)的堿基取代，這種現(xiàn)象是由于在保守的氨基酸取代中的簡(jiǎn)并密碼所產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”還包括產(chǎn)生有關(guān)堿基變化的任一種單鏈的互補(bǔ)序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種由本文所定義的核酸分子編碼的分離的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。所述生長(zhǎng)因子優(yōu)選包括圖1的氨基酸序列上從27-139號(hào)位置上的氨基酸序列或其功能性等同物、衍生物或生物前體。
本文所說(shuō)的“功能性等同物”應(yīng)當(dāng)被理解為具有與生長(zhǎng)因子enovin相關(guān)的所有生長(zhǎng)特性和功能的生長(zhǎng)因子。本文所定義的enovin的“衍生物”意在包括這樣的多肽，其中，某些氨基酸業(yè)已改變或缺失或被其他氨基酸所取代，并且該多肽保留了enovin的生物學(xué)活性和/或該多肽能夠與用本發(fā)明的enovin作為刺激抗原產(chǎn)生的抗體起反應(yīng)。
本發(fā)明的范圍包括enovin的雜合體和修飾形式，包括融合蛋白及其片段。例如，所述雜合體和修飾形式包括在通過(guò)諸如點(diǎn)突變的方法對(duì)特定氨基酸進(jìn)行某種修飾或取代時(shí)，所述修飾仍然能產(chǎn)生保留了本發(fā)明的enovin的生物學(xué)活性的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)特定的核酸序列進(jìn)行改變，以便產(chǎn)生具有與enovin相同或大體上相同的特征的生長(zhǎng)因子。
正如本領(lǐng)域所熟知的，許多蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，在該蛋白的N-末端具有一個(gè)(前)信號(hào)序列。另外，所述蛋白可以包括一種進(jìn)一步的原序列，它代表所述成熟蛋白的穩(wěn)定的前體。通常，這種前序列和原序列不是生物學(xué)活性所必需的。本發(fā)明的enovin分子不僅包括圖21所示的完整長(zhǎng)度的序列，而且包括從27到139號(hào)位置的序列，在它后面是這種類型生長(zhǎng)因子上所存在的RXXR蛋白裂解加工位點(diǎn)，并且它被認(rèn)為是enovin的成熟序列。
本發(fā)明的特定的蛋白、多肽或氨基酸序列不僅包括相同的氨基酸序列，而且包括其異構(gòu)體。另外，還包括在天然氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的小的氨基酸改變，包括保守性氨基酸取代(被與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸取代)。還包括與天然氨基酸不同的氨基酸序列，但所產(chǎn)生的多肽與由天然存在的序列所編碼的多肽在免疫學(xué)上相同或相似。
本發(fā)明的蛋白和多肽還包括所述序列的變體，包括天然存在的等位變體(該變體與所述蛋白或多肽基本上同源)。在本文中，基本上同源被視為與由本發(fā)明的核酸分子所編碼的蛋白或多肽具有至少70％、優(yōu)選80％、90％或95％的氨基酸同源性的序列。
由本發(fā)明的宿主細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還涉及通過(guò)使用反義技術(shù)在體內(nèi)抑制本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。反義技術(shù)可用于通過(guò)三螺旋形成或反義DNA或RNA控制基因表達(dá)，這兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的所述成熟蛋白的DNA序列的部分被用于設(shè)計(jì)一種長(zhǎng)度為10-50bp的反義RNA寡核苷酸。將一種DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)成與參與轉(zhuǎn)錄的基因的區(qū)域部分互補(bǔ)(三螺旋-參見(jiàn)Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456(1998)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1990))，以便阻止enovin的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。所述反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，并阻止mRNA分子翻譯成enovin。
由于本文所披露的生長(zhǎng)因子與以前鑒定的GDNF家族的生長(zhǎng)因子的序列相似性，enovin還被認(rèn)為能夠促進(jìn)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)，并用于治療由于所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能或表達(dá)缺陷所導(dǎo)致的疾病。
因此，本發(fā)明的核酸分子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可優(yōu)選用于治療或預(yù)防患者的神經(jīng)疾病，通過(guò)給所述患者服用足于減輕所述疾病的癥狀的濃度的量的本發(fā)明的核酸分子或生長(zhǎng)因子。因此，本發(fā)明的核酸分子可用于促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的維持和存活，并用于治療神經(jīng)元疾病或神經(jīng)變性癥狀，包括帕金森病、阿爾采默病、外周神經(jīng)病、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周和中樞神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷，以及神經(jīng)毒素中毒。
理想的是，業(yè)已觀察到本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子能夠在神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞群體，特別是已經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞程序死亡的神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞群體上產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)或神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的核酸或enovin生長(zhǎng)因子本身還可用于治療神經(jīng)變性疾病，如中風(fēng)、亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷、由于接觸神經(jīng)毒素所造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病，通過(guò)給需要的患者服用足于減輕或預(yù)防本文所述神經(jīng)疾病癥狀的濃度的量的所述核酸或enovin實(shí)現(xiàn)這一目的。
另外，正如在下面的實(shí)施例中更詳細(xì)的披露的，業(yè)已證實(shí)enovin能加速誘導(dǎo)的傳感缺陷的恢復(fù)，證實(shí)enovin是用于治療或減輕由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征的候選藥物，通過(guò)給需要的患者服用足于減輕或預(yù)防所述疾病的癥狀的濃度的這種化合物。
用于治療上述神經(jīng)疾病的另一種方法包括在患者體內(nèi)移植能表達(dá)本發(fā)明的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的細(xì)胞，如本文所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
還可將本發(fā)明的核酸分子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子與可以藥用的載體、稀釋劑或其賦形劑同時(shí)加入藥物組合物中。
本發(fā)明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的抗體可優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備。例如，多克隆抗體可以通過(guò)用所述生長(zhǎng)因子或其表位接種諸如小鼠的宿主動(dòng)物，并從免疫血清中回收制備。單克隆抗體可以按照已知技術(shù)，如由Kohler R.和Milstein C.披露的方法(自然，1975，256，495-497)制備。
本發(fā)明的抗體可優(yōu)選用于檢測(cè)本發(fā)明生長(zhǎng)因子存在的方法中，該方法包括讓所述抗體與一種樣品反應(yīng)，并鑒定結(jié)合于所述抗體上的任何蛋白。還提供了一種完成所述方法的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的抗體，以及讓該抗體與所述樣品反應(yīng)的裝置。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子在一種樣品中存在的試劑盒或裝置，包括一種上述抗體以及用于讓所述抗體與所述樣品起反應(yīng)的裝置。
可以通過(guò)使用分子生物學(xué)家所熟知的雙雜交載體系統(tǒng)研究蛋白-蛋白相互作用來(lái)鑒定能與本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子相互作用的蛋白，如其相應(yīng)的細(xì)胞受體(Fields&Song，自然340245，1989)。該技術(shù)基于一種轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)功能重建，它能激活一種受體基因。更具體地講，該技術(shù)包括提供一種合適的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞具有一種DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括一個(gè)受一種啟動(dòng)子控制的報(bào)導(dǎo)基因，該啟動(dòng)子由一種具有DNA結(jié)合域和活化域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)第一雜合DNA序列，該序列編碼本發(fā)明核酸序列的一個(gè)片段或全部與所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域或活化域的第一融合體，在所述宿主中至少表達(dá)第二種雜合DNA序列，如一種文庫(kù)等，它編碼要與所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合或活化域一起研究的推測(cè)的結(jié)合蛋白，該蛋白沒(méi)有結(jié)合到所述第一種融合體中；通過(guò)檢測(cè)所述宿主細(xì)胞中任何報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物的出現(xiàn)，檢測(cè)要研究的蛋白與本發(fā)明蛋白的所有結(jié)合；可選地分離編碼所述結(jié)合蛋白的第二種雜合DNA序列。
所述技術(shù)的一種例子使用酵母中的GAL4蛋白。GAL4是酵母半乳糖代謝的轉(zhuǎn)錄激活物，并具有一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合在半乳糖代謝基因上游的激活物上，以及一個(gè)蛋白結(jié)合域?？梢詷?gòu)建核苷酸載體，所述載體之一包括編碼所述GAL4DNA結(jié)合域的核苷酸殘基。所述結(jié)合域殘基可以與已知的蛋白編碼序列融合，如本發(fā)明的核酸。其他載體包括編碼GAL4蛋白結(jié)合域的殘基。所述殘基與編碼測(cè)試蛋白的殘基融合，所述測(cè)試蛋白優(yōu)選來(lái)自相關(guān)脊椎動(dòng)物的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。由本發(fā)明的核酸編碼的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子與待測(cè)試的蛋白之間的任何相互作用都會(huì)在轉(zhuǎn)入了載體的GAL-4轉(zhuǎn)錄缺陷型酵母細(xì)胞中導(dǎo)致報(bào)導(dǎo)分子的轉(zhuǎn)錄激活。優(yōu)選的情況是，在恢復(fù)了酵母半乳糖代謝基因的轉(zhuǎn)錄后，一種報(bào)導(dǎo)分子如β-半乳糖苷酶被激活。
由本發(fā)明人鑒定的enovin的受體是GFRα3。因此可以進(jìn)行分析，以便鑒定enovin的激活劑或拮抗化合物。該分析還可用于與其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子及其相應(yīng)的受體結(jié)合。所鑒定的化合物可用于治療或預(yù)防疾病，如帕金森病、阿爾采默病、與擴(kuò)增的聚谷氨酰胺序列相關(guān)的神經(jīng)元疾病，如亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷或由神經(jīng)毒素造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成和家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病、中風(fēng)、主要由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征，通過(guò)給患者服用足于預(yù)防或治療所述神經(jīng)疾病的濃度的量的所述激活劑或拮抗劑而進(jìn)行所述治療。所述化合物還可以與可以藥用的載體、稀釋劑或其賦形劑一起加入藥物組合物中。
在一種實(shí)施方案中，可以通過(guò)如下方式鑒定一種生長(zhǎng)因子(如enovin)的激活劑或拮抗劑在存在所述生長(zhǎng)因子的條件下讓能表達(dá)一種合適的受體和cRET的細(xì)胞組織或生物與候選化合物接觸，并將所述細(xì)胞、組織或生物中的RET激活水平與未接觸過(guò)所述候選化合物的對(duì)照進(jìn)行比較。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案包括一種鑒定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的激活劑或拮抗劑的方法，該方法包括在存在生長(zhǎng)因子的條件下，讓能表達(dá)所述生長(zhǎng)因子和cRET合適受體的細(xì)胞組織或生物與候選化合物接觸，測(cè)定包括所述合適的受體作為其一種成分的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的信號(hào)激酶的激活水平，然后加入對(duì)所述與一種報(bào)導(dǎo)分子接合的信號(hào)激酶專一的抗體，并與未接觸過(guò)所述化合物的細(xì)胞組織或生物進(jìn)行比較。
本發(fā)明的另一方面包括將所鑒定的化合物作為本發(fā)明的拮抗劑用于生產(chǎn)用來(lái)治療胃腸道疾病或由腸蠕動(dòng)增強(qiáng)所介導(dǎo)的癥狀的藥物。
在本發(fā)明的試驗(yàn)中所鑒定的化合物可優(yōu)選用于增強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)，因此可用于治療與有障礙的或受到損傷的胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的癥狀。
因此，所述化合物可用于治療患有與有障礙的或受到損傷的胃排空相關(guān)的癥狀或者更常見(jiàn)的是患有與有障礙的或受到損傷的胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的癥狀的包括人類在內(nèi)的溫血?jiǎng)游?。因此提供了一種用于緩解患者癥狀的治療方法，所述癥狀如胃食管回流、消化不良、胃輕癱、手術(shù)后腸閉塞、和假性腸梗阻。
消化不良是一種消化功能損傷，它可以作為初期胃腸機(jī)能障礙，特別是與較強(qiáng)的肌肉緊張相關(guān)的胃腸機(jī)能障礙的癥狀或作為諸如盲腸炎、galbladder紊亂或營(yíng)養(yǎng)不良的其他疾病的并發(fā)癥出現(xiàn)。消化不良癥狀是諸如缺乏食欲、感覺(jué)飽脹、提前飽滿、惡心、嘔吐和腹脹。
胃輕癱可以由胃的異常引起或者作為諸如糖尿病、進(jìn)行性系統(tǒng)硬化、厭食、神經(jīng)質(zhì)和肌肉緊張性營(yíng)養(yǎng)不良的疾病的并發(fā)癥出現(xiàn)。
手術(shù)后腸閉塞是在手術(shù)之后破壞了肌肉的緊張所造成的腸道的障礙或動(dòng)力損傷。
假性腸梗阻是一種以便秘、腹痛和嘔吐為特征的疾病，但沒(méi)有物理?yè)p傷的癥狀。
因此，本發(fā)明的化合物可用于消除所述疾病的實(shí)際誘因或者減輕所述疾病的癥狀。
另外，某些作為結(jié)腸的動(dòng)力學(xué)活性刺激物的化合物可用于校正或改善患有與紊亂性運(yùn)動(dòng)性相關(guān)癥狀的患者的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)，所述癥狀如單獨(dú)的小腸和大腸蠕動(dòng)減弱或與胃排空延遲的組合。
對(duì)于本發(fā)明化合物的結(jié)腸動(dòng)力學(xué)用途來(lái)說(shuō)，提供了一種治療包括人在內(nèi)的溫血?jiǎng)游锏姆椒ǎ鰟?dòng)物患有腸道系統(tǒng)能動(dòng)性疾病，例如，便秘、假性梗塞、腸無(wú)力、手術(shù)后腸無(wú)力、過(guò)敏性腹部綜合征(IBS)，以及藥物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)延遲。
按照本發(fā)明試驗(yàn)方法所鑒定的拮抗劑化合物還可用于治療或預(yù)防由于腸道蠕動(dòng)加強(qiáng)所導(dǎo)致的胃腸道疾病，如腹瀉(包括分泌性腹瀉、細(xì)菌誘導(dǎo)的腹瀉、膽性腹瀉、旅行者腹瀉和精神性腹瀉)、Crohn’s病、痙攣性結(jié)腸、過(guò)敏性腹部綜合征(IBS)、主要表現(xiàn)為腹瀉的過(guò)敏性腹部胃腸道過(guò)敏。
對(duì)于本發(fā)明化合物的用途來(lái)說(shuō)，本發(fā)明接著又提供了一種治療包括人在內(nèi)的溫血?jiǎng)游锏姆椒?，所述?dòng)物患有諸如過(guò)敏性腹部綜合征(IBS)，特別是IBS腹瀉的胃腸道疾病。因此，提供了一種治療方法，用于減輕患有諸如過(guò)敏性腹部綜合征(IBS)、腹瀉流行過(guò)敏性腹部綜合征(IBS)、腹部過(guò)敏性的患者的癥狀，或者減輕與胃腸過(guò)敏性相關(guān)的痛苦。
本發(fā)明的化合物還可用于諸如與上腹部能動(dòng)性相關(guān)的其他胃腸道疾病，并用作用于治療嘔吐、和細(xì)胞毒性藥物和輻射誘導(dǎo)的嘔吐的止吐藥。
例如，炎性腹部疾病包括潰瘍性腸炎、Crohn’s病等。
本發(fā)明的另一方面還包括一種治療由本發(fā)明的enovin表達(dá)所介導(dǎo)的疾病的方法，通過(guò)給患者服用足于緩解或減輕所述疾病癥狀的濃度的量的本發(fā)明的反義分子或其拮抗劑而實(shí)現(xiàn)。
由enovin表達(dá)的失活或抑制所介導(dǎo)的疾病，還可以通過(guò)給患者服用足于減輕或抑制該疾病癥狀的濃度的被鑒定為enovin的激活劑的化合物來(lái)進(jìn)行治療。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備用來(lái)治療與人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子enovin相關(guān)的疾病的藥用制劑，所述方法包括選擇一種被確定為本發(fā)明enovin的激活劑或拮抗劑的候選化合物，批量生產(chǎn)所述化合物，并將所生產(chǎn)的該化合物配制到可以藥用的載體中。
通過(guò)下面的實(shí)施例可以更清楚地了解到enovin業(yè)已成功地減輕了紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷。因此，enovin可能在主要由外周和中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕疾病所引起的痛苦綜合征以及傳導(dǎo)紊亂中起作用，并且可能在經(jīng)過(guò)表皮、局部、局部中樞(如硬膜外、鞘內(nèi)、ICV、叢內(nèi)、神經(jīng)內(nèi))經(jīng)口腔、直腸和系統(tǒng)服用后在傳感過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。因此，由enovin所介導(dǎo)的其他疾病可以用本文所述的相同方法減輕或預(yù)防，這一目的是通過(guò)服用足于減輕或預(yù)防所述疾病癥狀濃度的量的本發(fā)明的反義分子、核酸、enovin蛋白、藥物組合物、或被確定為激活劑或拮抗劑的化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的治療或藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域所公知的任何合適的途徑服用，包括例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)或顱內(nèi)服用或者在來(lái)自體內(nèi)的治療方案中施加在細(xì)胞上。服用方式可以是快速的，如注射，或者需要一段時(shí)間，如通過(guò)緩慢輸液或服用緩釋劑。為了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織，可以通過(guò)向腦脊液(CSF)中注射或輸液服用。
Enovin還可以與能提供所需的藥理學(xué)或藥效特性的試劑連接或接合。例如，可將其連接于本領(lǐng)域已知的能促進(jìn)穿透或通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的任何物質(zhì)，如運(yùn)鐵蛋白受體抗體，并通過(guò)靜脈內(nèi)注射服用。
本發(fā)明的enovin、反義分子或被確定為enovin的激活劑或拮抗劑的化合物可以藥物組合物形式使用，該組合物可以用本領(lǐng)域公知的方法制備。優(yōu)選的組合物包括可以藥用的載體或稀釋劑或賦形劑，如生理鹽溶液。其他可以藥用的載體包括其他無(wú)毒鹽、無(wú)菌水或類似物質(zhì)也可以使用。還可以存在一種合適的緩沖劑，以便可以將該組合物凍干并以無(wú)菌狀態(tài)保存，或通過(guò)添加無(wú)菌水進(jìn)行重配，以便隨后使用。還可以將enovin摻入固體或半固體生物學(xué)上兼容的基質(zhì)中，可將其置入需要治療的組織中。
所述載體還可以含有其他可以藥用的賦形劑，以便調(diào)節(jié)諸如pH、滲透壓、粘度、無(wú)菌性、親脂性、溶解度之類的其他條件。還可以包括能夠在服用之后持續(xù)或延遲釋放的可以藥用的賦形劑。
本發(fā)明的enovin蛋白或核酸分子或化合物可以口服。在這種實(shí)施方案中，可將其膠囊化并與合適的載體以固體劑型組合，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，特定的劑量方案可以按照患者的身體表面積或身體所占的空間體積，根據(jù)將要使用的服用途徑進(jìn)行計(jì)算。不過(guò)，實(shí)際服用的組合物量是由醫(yī)生根據(jù)與要治療的疾病相關(guān)的情況確定的，如癥狀的嚴(yán)重程度，要服用的組合物，患者的體重和反應(yīng)以及所選擇的服用途徑。
通過(guò)下面的實(shí)施例可以更清楚地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例純粹是解釋性的，并結(jié)合附圖進(jìn)行說(shuō)明，其中圖1是被稱為enovin的本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的部分cDNA序列。共有序列是通過(guò)用位于不同cDNA和基因組DNA上的引物PNHsp3和PNHap1通過(guò)PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行克隆和序列分析，并比較所獲得的序列而獲得的。推測(cè)的氨基酸的單字母密碼表示在DNA序列上方。核苷酸殘基數(shù)表示在DNA序列的右側(cè)，而氨基酸殘基數(shù)表示在翻譯的蛋白序列的右側(cè)。前結(jié)構(gòu)域的推測(cè)的RXXR裂解位點(diǎn)用黑體表示，并在下面劃線。成熟蛋白推測(cè)的起點(diǎn)用箭頭表示。TGF-β家族的所有成員特有的7個(gè)保守的半胱氨酸殘基用黑體表示。在潛在的N-糖基化位點(diǎn)下面加雙劃線，圖2是人GDNF、NTN、PSP和EVN的推測(cè)的成熟蛋白序列的排比。用ClustalW排比程序排列所述序列。將在所有三種蛋白中保守的氨基酸圈在黑色區(qū)域中。將在兩種或三種序列之間保守的殘基涂成灰色。TGF-β家族成員特有的7個(gè)保守的半胱氨酸殘基用星號(hào)在序列上方標(biāo)出。氨基酸殘基數(shù)在右側(cè)標(biāo)出。短線表示為了優(yōu)化該排比而引入所述序列中的缺口，圖3是enovin的部分cDNA序列。共有序列是通過(guò)對(duì)不同的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(初級(jí)PCR使用引物PNHsp1和PNHap1，而巢式PCR用引物PNHsp2和PNHap2)，然后進(jìn)行克隆和序列分析，并比較所獲得的序列而獲得的。核苷酸30-284(讀框A)的翻譯的氨基酸序列的單字母密碼表示在該序列的上方，并在右側(cè)進(jìn)行編號(hào)(A1至A85)。該讀框包括一個(gè)推測(cè)的ATG翻譯起始密碼子。核苷酸334-810(讀框B)的翻譯的氨基酸序列的單字母密碼表示在該序列的上方，并在右側(cè)進(jìn)行編號(hào)(B1至B159)。該讀框包括與GDNF、NTN和PSP同源的區(qū)域。核苷酸殘基數(shù)表示在DNA序列的右側(cè)。前結(jié)構(gòu)域的推測(cè)的RXXR裂解位點(diǎn)用黑體表示，并在下面劃線。推測(cè)的成熟蛋白的起點(diǎn)用箭頭標(biāo)出。TGF-β家族的所有成員特有的7個(gè)保守的半胱氨酸殘基用黑體表示。在潛在的N-糖基化位點(diǎn)下面加雙劃線。
圖4是人enovin染色體定位的說(shuō)明。(A)enovin FISH作圖結(jié)果的示意圖。每一個(gè)點(diǎn)表示在人1號(hào)染色體的p31.3-p32區(qū)域檢測(cè)到的雙FISH信號(hào)。(B)enovin FISH作圖的例子。左側(cè)的照片表示1號(hào)染色體上的FISH信號(hào)。右側(cè)照片表示用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色的相同的有絲分裂圖象，以便確定1號(hào)染色體，圖5表示enovin在不同人組織中的表達(dá)。(A)、(B)、(C)是enovin的組織表達(dá)的Northern印跡分析。用一種相當(dāng)于enovin的編碼區(qū)部分的探針(包括編碼成熟enovin蛋白的區(qū)域)分析人富含poly(A)的RNA的印跡，以便評(píng)價(jià)enovin mRNA在不同人組織中的表達(dá)。(A)多種組織Northern(MTN)印跡；(B)MTN印跡II；(C)胎兒MTN印跡II。圖片(D)表示用相同的enovin cDNA片段探測(cè)的人RNA主印跡的放射性自顯影。圖片(E)表示人組織mRNA樣品在來(lái)自(D)的RNA主印跡上的位置，圖6是表示在用10-6M紫杉醇處理72小時(shí)之后SH-SY5-Y細(xì)胞的總的存活率以及提高enovin的劑量對(duì)該存活率的影響，對(duì)溶劑的條件進(jìn)行規(guī)范化。在添加紫杉醇之前，用25nM星型孢菌素對(duì)SH-SY5-Y細(xì)胞進(jìn)行5天分化。數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的6個(gè)重復(fù)。示出了平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，圖7是在提高enovin濃度48小時(shí)之后對(duì)星型孢菌素的軸突生長(zhǎng)-分化的SH-SY5Y細(xì)胞的影響的曲線圖，相對(duì)溶劑的條件規(guī)范化。在開(kāi)始所述48小時(shí)的實(shí)驗(yàn)之前，用25nM星型孢菌素對(duì)SH-SY5-Y細(xì)胞進(jìn)行5天的分化。作為正對(duì)照，示出了25nM星型孢菌素的分化效果。根據(jù)至少5000個(gè)細(xì)胞計(jì)算軸突長(zhǎng)度，所提供的數(shù)據(jù)來(lái)自重復(fù)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。示出了平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖8-18是enovin對(duì)各種類型細(xì)胞增殖的影響的示意圖，圖19是enovin對(duì)用針刺試驗(yàn)進(jìn)行的紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷的影響的示意圖。給出的是在用紫杉醇處理之后用兩種不同劑量的enovin(23或130微克/克；n＝10大鼠/組)或載劑/鹽水(n＝20只大鼠)處理過(guò)的大鼠隨時(shí)間累計(jì)的平均得分?jǐn)?shù)(±1 SEM)。將體積為75微升的enovin或鹽水/媒介物注射到右側(cè)后爪子的足底下面。
圖20是enovin對(duì)用針刺試驗(yàn)進(jìn)行的紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷的影響的示意圖。給出的是在用紫杉醇處理之前用兩種不同劑量的enovin(23或130微克/克；n＝10大鼠/組)或媒介物/鹽水(n＝20只大鼠)處理過(guò)的大鼠隨時(shí)間累計(jì)的平均得分(±1 SEM)。將體積為75微升的enovin或鹽水/媒介物注射到右側(cè)后爪子的足底下面。
圖21是enovin的DNA序列。其共有序列是通過(guò)用引物PNHsp5和PNHap1對(duì)人前額皮質(zhì)cDNA和人基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行克隆、序列分析，并比較所得到的序列而獲得的。僅將能在翻譯后產(chǎn)生功能性的enovin蛋白的剪接變體的預(yù)測(cè)的氨基酸序列表示在DNA序列上方。核苷酸殘基數(shù)顯示在DNA序列的左側(cè)，而氨基酸殘基數(shù)顯示在翻譯的蛋白序列的右側(cè)。通過(guò)比較測(cè)序的cDNA片段和基因組序列而檢測(cè)出的5’和3’剪接位點(diǎn)，通過(guò)分別向左和向右彎曲的垂直的線條標(biāo)出，并進(jìn)行連續(xù)編號(hào)。前結(jié)構(gòu)域的推測(cè)的RXXR弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)用黑體表示，并在下面劃線。成熟蛋白的推測(cè)起點(diǎn)用箭頭表示。TGF-β家族所有成員特有的7個(gè)保守的半胱氨酸殘基用黑體表示。在潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)下面劃雙線。對(duì)5’和3’剪接位點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)并將其用線條圈起來(lái)。
圖22表示不同的enovin剪接變體在人組織中的表達(dá)。(A)通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定的enovin剪接變體的示意圖，該實(shí)驗(yàn)是用enovin專一性引物在源于不同人組織的RNA上進(jìn)行的，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和序列分析。頂部的一條線表示刻度(以bp為單位)。第二條線表示enovin基因組序列。標(biāo)出了翻譯起點(diǎn)和終止密碼子、成熟的enovin編碼序列的起點(diǎn)位置以及5’和3’剪接位點(diǎn)的位置(參見(jiàn)圖21)。該圖的右部表示對(duì)卵巢和前額皮質(zhì)RNA進(jìn)行RT-PCR所獲得的PCR產(chǎn)物，同時(shí)示出了100bp的DNA梯(ladder)。標(biāo)出了不同mRNA變體的位置及其大小(從起始密碼子到終止密碼子)。將翻譯的蛋白表示在左側(cè)。用方框畫(huà)出的部分表示cDNA。虛線表示剪接出的基因組DNA。陰影部分表示成熟的enovin編碼序列。點(diǎn)劃線表示成熟enovin編碼序列的起點(diǎn)。能夠產(chǎn)生功能性enovin蛋白的兩種轉(zhuǎn)錄物用星號(hào)表示在左側(cè)。(B)主要剪接變體的組織分布。照片表示用enovin專一性引物和不同的人cDNA通過(guò)RT-PCR獲得的PCR片段。四種主要的剪接變體(A-D)在左側(cè)用箭頭標(biāo)出。大小在右側(cè)標(biāo)出，這是根據(jù)凝膠上作為大小參照物的100bp DNA梯衡量的。
圖23enovin的長(zhǎng)剪接變體的預(yù)測(cè)蛋白序列，是通過(guò)剪接去掉圖21所示DNA序列的兩個(gè)內(nèi)含子而獲得的。剪接位點(diǎn)5’-1和3’-1被用于消除第一個(gè)內(nèi)含子，剪接位點(diǎn)5’-2和3’-3被用于消除第二個(gè)內(nèi)含子。由此所得到的cDNA序列具有編碼在上方示出的具有228個(gè)氨基酸殘基的蛋白的開(kāi)放讀框。
圖24enovin的另一種(短的)剪接變體的預(yù)測(cè)的蛋白序列，是通過(guò)從圖21所示的DNA序列上剪切掉兩個(gè)內(nèi)含子而獲得的。剪接位點(diǎn)5’-1和3’-2被用于消除第一個(gè)內(nèi)含子，剪接位點(diǎn)5’-2和3’-3被用于消除第二個(gè)內(nèi)含子。由此所得到的cDNA序列具有編碼在上方示出的具有220個(gè)氨基酸殘基的蛋白的開(kāi)放讀框。該蛋白序列與圖23的序列相比缺少8個(gè)氨基酸殘基。
圖25是由被設(shè)計(jì)用于比較enovin在正常病變組織中的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果的曲線圖。示出了在多發(fā)性硬化和阿爾采默病人的腦組織中enovin和GAPDH的表達(dá)。
圖26是檢測(cè)enovin和GAPDH在帕金森病和癌癥中的表達(dá)水平所獲得結(jié)果的曲線圖。
保藏物業(yè)已于1999年5月6日按照1997年4月28日的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定對(duì)包括編碼enovin的DNA序列的質(zhì)粒EVNmat/pRSETB進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為L(zhǎng)MBP3931，保藏場(chǎng)所是比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)，Laboratorium voor Moleculaire-Plasmidencollectie(LMBP)B9000，Ghent，比利時(shí)。
材料和方法材料所使用的天然Taq聚合酶、氨芐青霉素、IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)、X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)以及所有的限制酶均購(gòu)自Boehringer Mannheim(Mannheim，德國(guó))。10mMdNTP混合物購(gòu)自生命技術(shù)公司(Gaithersburg，MD，美國(guó))。TOPO-TA試劑盒購(gòu)自Invitrogen BV(Leek，荷蘭)。Qiagen質(zhì)粒小量或中量DNA純化試劑盒，Qiaprep Spin微量制備試劑盒以及Qiaquick凝膠提取試劑盒購(gòu)自Qiagen GmbH(杜塞爾多夫，德國(guó))。cDNA文庫(kù)、MarathonTmReady cDNA試劑盒、人多種組織cDNA(MTCTM)I組和II組多組織Northern印跡、Advantage-GC cDNA PCR試劑盒獲自Clontech實(shí)驗(yàn)室(Palo Alto，CA，美國(guó))。所有PCR反應(yīng)是在GeneAmp PCR系統(tǒng)9600循環(huán)儀(Perkin Elmer，F(xiàn)oster市，CA，美國(guó))中進(jìn)行的。LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基包括10克/升的胰蛋白胨、5克/升酵母提取物和10克/升氯化鈉。2×YT/氨芐青霉素平板包括16克/升胰蛋白胨、10克/升酵母提取物、5克/升氯化鈉、15克/升瓊脂和100毫克/升氨芐青霉素。
數(shù)據(jù)庫(kù)同源性檢索和序列比較。
用完整的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF；保藏號(hào)Q99748)、neurturin(NTN；保藏號(hào)P39905)和persephin(PSP；保藏號(hào)AF040962)cDNA衍生的蛋白序列作為查詢序列，對(duì)每天更新的EMBL/GenBank人表達(dá)序列標(biāo)記(EST)和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST(基礎(chǔ)局部排比檢索工具；Altschul等，1990)檢索。
用保藏號(hào)為AC005038的基因組序列和存在于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的若干ESTs進(jìn)行另外的BLAST檢索，并顯示檢測(cè)到的與該基因組序列的同源性。
通過(guò)用BESTFIT程序(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組序列分析軟件包，8.0版，威斯康遜大學(xué)，Madison，WI，美國(guó))對(duì)序列進(jìn)行成對(duì)的比較，計(jì)算GDNF家族成員之間的百分相同性和百分相似性。DNA或蛋白序列的排比用ClustalW排比程序(EMBL，海德堡，德國(guó))進(jìn)行。
用于PCR和DNA測(cè)序的寡核苷酸合成所有的寡核苷酸引物是從Eurogentec(Seraing，比利時(shí))訂購(gòu)的。插入專一性測(cè)序引物(15-和16-聚體)以及用于PCR反應(yīng)的引物是手工設(shè)計(jì)的。DNA是在Qiagen-tip-20或-100陰離子交換柱或Qiaquickspin柱(Qiagen GmbH，杜塞爾多夫，德國(guó))上制備的，并用30微升TE-緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA(鈉鹽)，pH8.0)從所述柱中回收。
用ABI prism BigDye終止循環(huán)測(cè)序試劑盒對(duì)兩股鏈進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，并且在應(yīng)用生物系統(tǒng)377XL測(cè)序儀(Perkin Elmer，ABI分部，F(xiàn)oster市，CA，美國(guó))上運(yùn)行。將SequencherTM軟件用于序列組裝和人工編輯(GeneCodes，AnnArobor，MI，美國(guó))。
新型GDNF同系物的克隆EMBL保藏號(hào)為AC005038的從67411到68343號(hào)核苷酸的DNA片段所翻譯的蛋白序列與成熟的NTN和PSP同源，將該片段用于設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物。在表1中示出了所使用的不同的引物。
表1用于AC005038的片段的PCR擴(kuò)增的引物。
用引物PNHsp3和PNHap1擴(kuò)增源于不同人組織的cDNA(胎兒大腦、全胎兒、前列腺或肺Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech實(shí)驗(yàn)室)、前額皮質(zhì)、海馬體和小腦cDNA)和人基因組DNA上的502bp的片段。根據(jù)來(lái)自EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組序列(保藏號(hào)AC005038)，預(yù)計(jì)要擴(kuò)增的片段的G+C含量為76％。因此，擴(kuò)增是用Advantage-GC cDNAPCR試劑盒(Clontech實(shí)驗(yàn)室，Palo Alto，CA，USA)，該試劑盒對(duì)富含GC的DNA序列的擴(kuò)增進(jìn)行了優(yōu)化。PCR反應(yīng)是在50微升的總體積中進(jìn)行的，其中含有1×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，0.2mM dNTP，1MGC-MELTTM，200nM引物PNHsp3和PNHap1，1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物，以及1-5微升的cDNA或0.5微克的基因組DNA。將樣品加熱到95℃保持5分鐘，并循環(huán)35輪，參數(shù)為，在95℃下45秒，在58℃下1分鐘，在72℃下40秒，最后一個(gè)步驟是在72℃下7分鐘。最后用2.5U的天然Taq DNA聚合酶處理，以便添加A-突出端。在1×TAE緩沖液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(鈉鹽)，pH8.3)中在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。從凝膠上切除預(yù)計(jì)大小(495bp)的PCR片段，并用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化。對(duì)PCR片段進(jìn)行測(cè)序，以便證實(shí)其同一性，并用TOPO TA試劑盒按照生產(chǎn)商的方法克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO上。將大約20ng純化的片段與1微升pCR2.1-TOPO載體混合于5微升的總體積中。在室溫下(20℃)溫育反應(yīng)混合物5分鐘。用熱休克轉(zhuǎn)化方法將2微升的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen BV)中，并鋪平板于補(bǔ)充了10mM IPTG和2％(w/v)X-gal的2×YT/氨芐青霉素平板上，進(jìn)行蘭色-白色篩選。在生長(zhǎng)過(guò)夜之后從所述平板上挑選白色菌落，放入添加了100mg/l氨芐青霉素的5毫升LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并用Qiaprep Spin微量制備試劑盒制備質(zhì)粒DNA。通過(guò)用EcoRI進(jìn)行限制性消化證實(shí)預(yù)期大小的插入片段的存在。對(duì)若干陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒插入片段進(jìn)行測(cè)序，并用ClustalW排比程序?qū)λ@得的序列進(jìn)行比較。
為了獲得新型GDNF同系物的其他編碼序列，用引物PNHsp1和PNHap1通過(guò)PCR擴(kuò)增基于EMBL/GenBank序列(保藏號(hào)AC005038)的具有預(yù)計(jì)的931bp大小的片段。PCR反應(yīng)是在50微升的總體積中進(jìn)行的，其中含有1×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，0.2mM dNTP，1M GC-MELTTM，200nM的引物PNHsp3和PNHap1，1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物，和1-5微升的源于小腦、前額皮質(zhì)或海馬體的cDNA或0.5微克的基因組DNA。將樣品加熱到95℃保持5分鐘，并循環(huán)35輪，參數(shù)為，在95℃下45秒，在58℃下1分鐘，和在72℃下1分30秒，最后一個(gè)步驟是在72℃下7分鐘。在1×TAE緩沖液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(鈉鹽)，pH8.3)中在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。用嵌套引物(PNHsp2和PNHap2)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。將1微升第一輪擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物用于50微升的總體積中，其中含有1×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，0.2mM dNTP，1M GC-MELTTM，200nM的引物PNHsp2和PNHap2，以及1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物。將樣品加熱到95℃保持5分鐘，并循環(huán)35輪，參數(shù)為，在95℃下45秒，在58℃下1分鐘，在72℃下1分30秒，最后一個(gè)步驟是在72℃下7分鐘。在1×TAE緩沖液中在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上分析樣品。將預(yù)計(jì)大小(870bp)的PCR片段從所述凝膠上切除，并用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化。對(duì)PCR片段進(jìn)行測(cè)序以便證實(shí)其同一性，用2.5U Taq聚合酶處理，并用TOPO TA克隆試劑盒按照生產(chǎn)商的說(shuō)明克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO上。將大約20ng的純化片段與1微升pCR2.1-TOPO載體混合于5微升的總體積中。在室溫(20℃)下培養(yǎng)反應(yīng)混合物5分鐘。用熱休克轉(zhuǎn)化方法將2微升的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞中，并鋪平板于補(bǔ)充了10mM IPTG和2％(w/v)X-gal的2×YT/氨芐青霉素平板上，進(jìn)行蘭色-白色篩選。在含有100mg/l氨芐青霉素的5毫升LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并用Qiaprep Spin微量制備試劑盒制備的質(zhì)粒DNA。通過(guò)用EcoRI進(jìn)行限制性消化證實(shí)預(yù)期大小的插入片段的存在。用ClustalW排比程序?qū)λ@得的序列進(jìn)行比較。
通過(guò)RT-PCR分析分析enovin基因表達(dá)將寡核苷酸引物PNHsp3和PNHap1(參見(jiàn)表1)用于專一性PCR擴(kuò)增enovin的502bp的片段。PCR擴(kuò)增是用標(biāo)準(zhǔn)化為六種不同管家基因的mRNA表達(dá)水平的人多種組織cDNA(MTCTM)組進(jìn)行的。用enovin專一性引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增是在50微升的總體積中進(jìn)行的，其中含有5微升的cDNA，1×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，0.2Mm dNTP，1M GC-MELTTM，400nM的引物PNHsp3和PNHap1，以及1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物。將樣品加熱到95℃保持30秒，并循環(huán)35輪，參數(shù)為，在95℃下30秒，以及在68℃下30秒。在1×TAE緩沖液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(鈉鹽)，pH8.3)中在1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠上分析樣品，并用Eagle Eye II攝像系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))獲得溴化乙錠染色凝膠的圖象。
用人neurturin和persephin蛋白序列對(duì)每天更新的EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的相似性檢索，得到了一種編碼推測(cè)的類似于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、NTN和PSP的新型蛋白的基因組DNA序列，它被命名為enovin(EVN)。用編碼enovin的區(qū)域旁側(cè)的基因組DNA序列進(jìn)行的其他數(shù)據(jù)庫(kù)同源性檢索得到了源于不同人組織的若干表達(dá)序列標(biāo)記(EST)克隆(前列腺上皮[保藏號(hào)AA533512(ID1322952)]，肺癌[保藏號(hào)AA931637]以及甲狀旁腺腫瘤[保藏號(hào)AA844072])。這些克隆含有位于與GDNF、PSP或NTN同源的區(qū)域以外的DNA序列，但證實(shí)了enovin mRNA是在正常和腫瘤組織中表達(dá)的。
用基于基因組序列的引物(PNHsp3和PNHap1)進(jìn)行的初始PCR擴(kuò)增得到了來(lái)自胎兒、胎兒大腦、前列腺、前額皮質(zhì)、海馬體、小腦cDNA和來(lái)自基因組DNA的大約500bp的片段，但沒(méi)有得到來(lái)自肺cDNA的該片段。對(duì)所述片段進(jìn)行克隆和序列分析得到了一個(gè)具有474bp的DNA序列，它能被翻譯成具有139個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測(cè)的蛋白序列，其中包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)蛋白家族所有成員特有的7個(gè)保守的半胱氨酸(Kingsley，1994)(圖1)。該序列還含有一個(gè)用于裂解前結(jié)構(gòu)域(RAAR，23-26號(hào)氨基酸位置)的RXXR基序(Barr，1991)，在GDNF、NTN和PSP蛋白序列上前結(jié)構(gòu)域序列的相當(dāng)位置上存在一種類似的裂解位點(diǎn)。推測(cè)enovin前結(jié)構(gòu)域的裂解在體內(nèi)發(fā)生于該位點(diǎn)。成熟的EVN蛋白序列含有113個(gè)氨基酸殘基(圖1中27-139號(hào)殘基)，并具有11965Da的計(jì)算分子量，其等電點(diǎn)為11.8。在成熟序列上存在一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(NST位于121-123號(hào)氨基酸位置上)。而且，在已知的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、NTN和PSP的成熟形式之間保守的若干區(qū)域也存在于enovin中(圖2)。表2歸納了通過(guò)BESTFIT程序比較GDNF家族成員的成熟蛋白序列的結(jié)果。示出了百分相同性和百分相似性。用于該比較的GDNF、NTN、PSP和EVN成熟序列始于RXXR裂解位點(diǎn)后面的第一個(gè)氨基酸。
表2用BESTFIT程序?qū)Τ墒斓娜薌DNF家族成員進(jìn)行成對(duì)的比較。
通過(guò)以上比較可以看出，成熟的enovin蛋白與persephin和neurturin的相關(guān)程度高于與GDNF的相關(guān)程度。
用基于基因組EMBL/GenBank序列(保藏號(hào)AC005038)的引物對(duì)源于前額皮質(zhì)cDNA的enovin DNA序列的較大的片段進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列分析，得到了一個(gè)819bp的序列(圖3)。該序列包括一個(gè)位于30-32號(hào)核苷酸位置上的推測(cè)的ATG起始密碼子，并包括一個(gè)延伸至位于285-287號(hào)核苷酸位置上的終止密碼子的開(kāi)放讀框(圖3中的讀框A)。該區(qū)域的翻譯蛋白序列未表現(xiàn)出與數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何已知蛋白具有相似性。第二個(gè)讀框(圖3中的讀框B)中的cDNA序列的翻譯得到了一種具有159個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測(cè)的蛋白序列。該序列包括RXXR裂解位點(diǎn)(B43-B46號(hào)位置；460-471號(hào)核苷酸位置)，并且該序列相當(dāng)于成熟enovin序列(B47-B159號(hào)位置；472-810號(hào)核苷酸位置)。該開(kāi)放讀框包括RXXR裂解位點(diǎn)，并且成熟的enovin編碼序列從334號(hào)核苷酸位置(其前面是框內(nèi)終止密碼子)延伸到位于811-813號(hào)位置上的終止密碼子，但不包括編碼起始甲硫氨酸殘基的ATG密碼子。與persephin相似(Milbrandt等，1998)，我們假定在源于EVN基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的主要部分中存在一個(gè)未剪接的內(nèi)含子。GDNF和TNT在其相應(yīng)的前結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)也具有一個(gè)內(nèi)含子(Matsushita等，1997，Heuckeroth等，1997)。
為了評(píng)估enovin的不同的mRNA轉(zhuǎn)錄物的存在，用位于可能的上游ATG起始密碼子的5’的enovin編碼序列5’末端引物(引物PNHsp5[5’-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3’]和嵌套引物PNHsp6[5’-GGT GGG GGAACA GCT CAA CAA TGG-3’]以及位于3’末端(引物PNHap1和嵌套引物PNHap2[參見(jiàn)表1]的引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。用人多種組織cDNA組(Clontech MTC組I和II)、胎兒心臟cDNA文庫(kù)(Clontech)和源于人小腦、海馬體或前額皮質(zhì)的cDNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Masure等，1998)。按所述方法用引物PNHsp5和PNHap1在富含GC條件下(advantageGC-PCR試劑盒，Clontech)進(jìn)行30輪(95℃-30秒，60℃-30秒，72℃-1分鐘)初級(jí)PGR反應(yīng)。用引物PNHsp6和PNHap2在相同條件下對(duì)1微升的初級(jí)PCR產(chǎn)物進(jìn)行30輪巢式PCR反應(yīng)。所得到的PCR產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，其大小分布在±350bp至±800bp。對(duì)凝膠上的若干帶進(jìn)行純化，并對(duì)該P(yáng)CR片段進(jìn)行直接測(cè)序。還將某些純化的PCR產(chǎn)物克隆到載體pCR2.1-TOPO(TOPO-TA克隆試劑盒，Invitrogen)然后再測(cè)序。序列分子證實(shí)了含有enovin序列的不同mRNA分子的存在。將所獲得的片段序列與基因組enovin序列進(jìn)行比較，這樣使得我們能夠確定存在于基因組序列上的若干可能的5’和3’剪接位點(diǎn)(圖21)。所有這些剪接位點(diǎn)相當(dāng)于供體和受體剪接位點(diǎn)的共有序列(Senapathy，P.Shapiro，M.B.&Harris，N.L.(1990)剪接接合，分支點(diǎn)位點(diǎn)，和外顯子序列統(tǒng)計(jì)學(xué)、鑒定、和在基因組工程中的應(yīng)用。酶學(xué)方法183，252-278)。所鑒定的不同的enovin剪接變體及其在不同人組織中的存在歸納于圖22中。在五種測(cè)序的轉(zhuǎn)錄物中只有兩種在從ATG起始密碼子開(kāi)始翻譯之后能產(chǎn)生有功能的enovin蛋白。這兩種轉(zhuǎn)錄物編碼具有228或220個(gè)氨基酸的蛋白，分別具有47和39個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，在圖23(長(zhǎng)的變體)和圖24(短的變體)中示出了這兩種變體的預(yù)測(cè)的蛋白序列。所述長(zhǎng)的變體可以根據(jù)圖21的DNA序列通過(guò)切除位于5’-1和3’-1位置上的第一個(gè)內(nèi)含子和位于5’-2和3’-3位置上的第二個(gè)內(nèi)含子而推測(cè)。開(kāi)放讀框翻譯時(shí)，圖23的預(yù)期蛋白序列即可以得到。較短的變體可以根據(jù)圖21的DNA序列通過(guò)切除位于5’-1和3’-2位置上的第一個(gè)內(nèi)含子和位于5’-2和3’-3位置上的第二個(gè)內(nèi)含子而推測(cè)。在翻譯所述開(kāi)放讀框之后，獲得了圖24的預(yù)測(cè)的蛋白序列。
根據(jù)圖22B中帶的強(qiáng)度判斷，最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物似乎在大多數(shù)組織中的含量最豐富。較短的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生移碼，得到了一種缺少與GDNF、NTN和PSP同源的成熟enovin氨基酸序列的翻譯蛋白。兩種最小的轉(zhuǎn)錄物甚至缺少所述成熟編碼序列部分，包括7個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基中的2個(gè)。圖22B表示所述主要剪接變體在不同人組織中的分布。功能性enovin mRNA在幾乎所有實(shí)驗(yàn)過(guò)的組織中表達(dá)，這些組織包括大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、骨骼肌、結(jié)腸、小腸、外周血白細(xì)胞、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤(pán)和胎兒心臟。在某些人組織(例如小腦、海馬體)中，通過(guò)PCR只能擴(kuò)增非功能性轉(zhuǎn)錄物。據(jù)我們所知，以前還沒(méi)有披露過(guò)非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的出現(xiàn)能達(dá)到如此程度。這一發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義尚有待研究。盡管對(duì)NTN和PSP在不同組織中的表達(dá)尚不十分清楚，其表達(dá)水平似乎更低，并且其表達(dá)也在更大程度上局限于某些組織(Kotzbauer等，1996，Milbrandt等，1998)。
Enovin在enovin表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌結(jié)構(gòu)中的重組表達(dá)用引物PNHsp4和PNHap2(表1)對(duì)來(lái)自人基因組DNA的414bp的PCR片段進(jìn)行擴(kuò)增，并用TA-克隆(Invitrogen)將其克隆到載體pCR2.1-TOPO上。通過(guò)序列分析證實(shí)插入片段的序列。將含有具有enovin共有序列的插入片段的克隆(克隆36)用于隨后構(gòu)建一種表達(dá)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)在其5’末端含有合適的限制位點(diǎn)的兩種引物。正向引物PNHexp-sp1(5’-GCG GAT CCGGCT GGG GGC CCG GGC A-3’)含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)(在下面劃線)，而反向引物PNHexp-ap1(5’-GCC TCG AGTCAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3’)含有一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)(也在下面劃線)。使用所述引物擴(kuò)增來(lái)自克隆36的編碼成熟enovin的343bp的片段(在圖1中81-422號(hào)位置)。所述PCR反應(yīng)是在50微升的總體積中進(jìn)行，其中含有1×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，0.2mM dNTP，1MGC-MELTTM，200nM引物PNHexp-sp1和PNHexp-ap1，1微升AdvantageKlenTaq聚合酶混合物，以及10ng來(lái)自克隆36的質(zhì)粒DNA。將樣品加熱到94℃保持5分鐘，并循環(huán)25輪，參數(shù)為，在94℃下45秒，在58℃下1分鐘，在72℃下30秒，最后一個(gè)步驟是在72℃下7分鐘。用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化所得到的50微升產(chǎn)物，并以30微升的體積洗脫DNA。在37℃下，在1×緩沖液B(BoehringerMannheim)中以30微升的反應(yīng)體積用10U BamHI和10U XhoI對(duì)25微升的該純化產(chǎn)物進(jìn)行消化1小時(shí)。在1×TAE緩沖液40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(鈉鹽)，pH8.3)中在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后將預(yù)測(cè)的353bp的片段從所述凝膠上切除，并用Qiaquick凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，將所得到的片段連接到用BamHI和XhoI線性化的載體pRSET B(Invitrogen)上。通過(guò)全序列分析證實(shí)所得質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(Hevnmat/pRSETB)的插入。所得到的結(jié)構(gòu)編碼一種具有146個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)的分子量為15704Da，包括一個(gè)融合到成熟enovin編碼序列框內(nèi)的NH2-末端6×His-標(biāo)記。所得到蛋白的NH2-末端氨基酸序列為MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS(成熟的enovin序列為黑體，在6個(gè)His標(biāo)記下面劃線)。
在BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)enovinenovin蛋白的重組生產(chǎn)基本上是按照由Creedon等(1997)所披露的生產(chǎn)Neurturin的方法生產(chǎn)的，對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)。為了生產(chǎn)重組enovin蛋白，將質(zhì)粒hEVNmat/pRSETB轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen)，并在30℃(225rpm)或37℃(300rpm)條件下在2×YT/氨芐青霉素-培養(yǎng)基(16g/l胰蛋白胨，10克/升酵母提取物，5克/升氯化鈉，和100毫克/升氨芐青霉素)中生長(zhǎng)到OD600大約為0.5，然后添加IPTG達(dá)到0.2mM的最終濃度，以便誘導(dǎo)表達(dá)。在進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的誘導(dǎo)之后，通過(guò)離心收獲細(xì)胞沉淀物，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，離心并冷凍保藏。為了純化和重新折疊，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于超聲處理緩沖液中(20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM氯化鈉，1mM 2-巰基乙醇，蛋白酶抑制劑(CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物片劑(BoehringerMannheim，每50毫升緩沖液1片)和每500毫克細(xì)胞沉淀1毫克溶菌酶)。通過(guò)超聲處理破壞細(xì)胞，并通過(guò)離心收獲包含體。在緩沖液A(8M尿素，20mM Tris-HCl，pH7.6，200mM氯化鈉，1mM 2-巰基乙醇)中溶解包含體，并在37℃下溫育30分鐘。然后添加Ni-NTA樹(shù)脂(鎳次氮基三乙酸，Qiagen)。在37℃下振蕩40分鐘，然后用緩沖液A洗滌樣品1次，并加樣到5毫升NI-NTA柱上。用10×柱體積的緩沖液A、10×柱體積的pH為7.2的緩沖液A和10×柱體積的pH為7.2的緩沖液A+10mM咪唑?qū)λ鲋M(jìn)行連續(xù)洗滌。Enovin以4×柱體積的pH為7.2的緩沖液A+200mM咪唑從柱中洗滌。
Enovin重新折疊是通過(guò)在4℃下在復(fù)性緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.15M氯化鈉，3μM半胱氨酸，0.02％Tween-20，10％甘油，0.01M Tris-HCl，pH8.3)中通過(guò)逐步的過(guò)夜透析進(jìn)行的，在每一步驟中所述緩沖液含有減少量的尿素(6M至4M至3M至2M至1M至0.5M至0M尿素)。將純化的蛋白等分，在-20℃下保存，并進(jìn)一步用于功能性實(shí)驗(yàn)。
Enovin基因的染色體定位用根據(jù)EMBL保藏號(hào)AC005038的序列設(shè)計(jì)的引物EVN(7)-sp1(5’-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3’)和PNHap1(5’-GCA GGAAGA GCC ACC GGT AAG G-3’)擴(kuò)增來(lái)自小腦cDNA的Enovin基因的一個(gè)3.3kb的片段.PCR反應(yīng)是在50微升的總體積中進(jìn)行的，其中含有1×Expand Long Template PCR反應(yīng)緩沖液(Boehringer Mannheim)，0.5mM dNTP，1M GC-MELTTM(Clontech)，400nM的引物EVN(7-sp1)和PNHap1，以及1微升的小腦cDNA。首先，在94℃下反應(yīng)2分鐘之后，加入0.75微升的Expand Long Template聚合酶(BoehringerMannheim)，并循環(huán)10輪，94℃下10秒，58℃下30秒，68℃下3分鐘。然后再進(jìn)行20輪反應(yīng)，每1輪將68℃下的時(shí)間延長(zhǎng)20秒。還包括最后在68℃下7分鐘。在0.8％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳之后純化所得到的3.3kb的片段，用TA-克隆(Invitrogen)克隆到載體pCR2.1-TOPO上。對(duì)一種克隆的3.3kb插入片段進(jìn)行的全序列分析證實(shí)獲得了相當(dāng)于EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組序列(保藏號(hào)AC005038)的cDNA序列。在從小腦cDNA中獲得的cDNA上沒(méi)有內(nèi)含子被剪接掉。
基本上按公開(kāi)的熒光素原位雜交(FISH)分析方法(Heng等，1992，Heng&Tsui，1993)進(jìn)行染色體作圖研究。在0.18毫克/毫升5-溴-2’脫氧尿苷(BrdU)處理之前，在37℃下培養(yǎng)人淋巴細(xì)胞68-72小時(shí)，以便使該細(xì)胞群體中的細(xì)胞周期同步。對(duì)同步化的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并在37℃下再培養(yǎng)6小時(shí)。收獲細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)方法制備載玻片，包括低滲處理，固定和風(fēng)干。將用于Enovin的3.3kb的探針生物素化，并用FISH檢測(cè)。在55℃下烘烤載玻片1小時(shí)，用RNase處理，并在70℃下在用2×氯化鈉/Cit(20×氯化鈉/Cit為3M氯化鈉，0.3M檸檬酸二鈉，pH7.0)中制備的70％甲酰胺中變性2分鐘，然后用乙醇脫水。在加樣到變性的染色體載玻片上之前將探針變性。在雜交過(guò)夜之后洗滌載玻片，并分別在照相膠片上記錄FISH信號(hào)和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚帶形，通過(guò)重疊FISH信號(hào)和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚帶形染色體實(shí)現(xiàn)FISH作圖資料與染色體帶的排比(Heng&Tsui，1993)。在所使用的條件下，該探針的雜交效率大約為72％(在100個(gè)檢查過(guò)的有絲分裂圖片中，有72個(gè)在一對(duì)所述染色體上出現(xiàn)信號(hào))。由于4’，6-二脒基-2-苯基吲哚帶被用于鑒定所述特殊的染色體，對(duì)來(lái)自探針和1號(hào)染色體的短臂之間的信號(hào)進(jìn)行了排比。根據(jù)來(lái)自10張照片的總的結(jié)果進(jìn)一步確定其詳細(xì)的位置(圖4A)。在所使用的條件下，通過(guò)FISH檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)，因此，我們認(rèn)為Enovin位于人的1號(hào)染色體的p31.3-p32.3處。在圖4B中示出了所述作圖結(jié)果的一種例子。
根據(jù)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，http::∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)的基因圖譜數(shù)據(jù)，可以推斷，含有Enovin序列的基因組克隆(EMBL保藏號(hào)AC005038)位于1號(hào)染色體的標(biāo)記D1S2843和D1S417之間。它相當(dāng)于1號(hào)染色體的p31.1-p32.3的區(qū)域，證實(shí)了通過(guò)FISH分析所獲得的數(shù)據(jù)。
通過(guò)Northern印跡和斑點(diǎn)印跡分析確定的Enovin的組織分布按照生產(chǎn)商的說(shuō)明用含有2微克源于不同人組織的富含poly(A)的RNA(Clontech實(shí)驗(yàn)室，Palo Alto，CA，美國(guó)；MTNTM印跡I，MTNTM印跡II和胎兒MTNTM印跡II)的Northern印跡與α32P-dCTP隨機(jī)引物標(biāo)記(High Prime試劑盒，Boehringer Mannheim)的897bp的Enovin片段雜交。該片段是通過(guò)用引物PNHsp1和PNHap1對(duì)前額皮質(zhì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的，然后克隆到載體pCR2.1-TOPO上，該片段含有的Enovin序列的897bp，一直到終止密碼子，并包括成熟的Enovin蛋白的完整的編碼序列。
Enovin mRNA是以大約4.5kb的主轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)到的(圖5A-C)。Enovin mRNA能在多種組織中表達(dá)，最主要的是在心臟、骨骼肌、胰腺和前列腺中表達(dá)。某些較小的轉(zhuǎn)錄物存在于諸如胎盤(pán)(4kb，2.4kb和1.6kb)和前列腺(4kb和1.6kb)之類的組織中。在胎兒組織中，一種主要的2.4kb的轉(zhuǎn)錄物存在于肝臟中，并以較少的含量存在于肺中。其他轉(zhuǎn)錄物還存在于胎兒腎臟、肝臟、肺和大腦中。
另外，讓含有源于不同人組織和發(fā)育階段的富含poly(A)的RNA的RNA主印跡(Clontech實(shí)驗(yàn)室)與897bp的Enovin探針雜交。用于制備該印跡的富含poly(A)的RNA樣品由生產(chǎn)商相對(duì)8種不同的管家基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行過(guò)規(guī)范化。Enovin mRNA是普遍表達(dá)的，不過(guò)最高的mRNA含量出現(xiàn)在前列腺、腦垂體、氣管、胎盤(pán)、胎兒肺、胰腺和腎臟中(圖5D+E)。
構(gòu)建GFRα-IgG-Fc融合載體將不包括編碼信號(hào)肽和參與GPI-錨定的COOH-末端疏水性區(qū)的序列的GFRα-1、GFRα-2和GFRα-3的cDNA區(qū)(分別編碼27-427、20-431和28-371號(hào)氨基酸)以框內(nèi)形式克隆到表達(dá)載體Signal pIg plus(R&D系統(tǒng)歐洲有限公司)上。由這些結(jié)構(gòu)表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白包括17個(gè)氨基酸的NH2-末端CD33信號(hào)肽，GFRα蛋白區(qū)和243個(gè)氨基酸的COOH-末端人IgG1-Fc融合域。用GFRα融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并用500微克G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用抗Fc抗體篩選永久性克隆。為了純化GFRα融合蛋白，在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)胞，并每隔3天之后收集培養(yǎng)基。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行離心，并加樣到蛋白A柱(蛋白A Sepharose，Pharmacia生物技術(shù))。用0.1M檸檬酸鈉pH3.0洗脫結(jié)合的蛋白，并收集到1M Tris緩沖液，pH8.4中。通過(guò)在280nm的吸收值估計(jì)蛋白濃度，使用1.5的消光系數(shù)。將這種純化的可溶性GFRα-1到-3Fc融合蛋白用于隨后的結(jié)合研究。
表面胞質(zhì)共振分析表面胞質(zhì)共振(SPR)實(shí)驗(yàn)是用BIAcore3000儀器在25℃下進(jìn)行的。用enovin和NGF作為固定化配體進(jìn)行分析。首先用400mM N-乙基-N-(二甲基氨基丙基)-碳二亞胺和100mM N-羥基-琥珀酰亞胺的1∶1的混合物對(duì)F1傳感芯片的羧基化基質(zhì)進(jìn)行10分鐘的活化。然后以5微升/分鐘的流速將溶解在10mM乙酸緩沖液，pH4.5中的重組enovin和NGF加樣到所述活化的表面上。用1M鹽酸乙醇胺使未被占據(jù)的活性基團(tuán)失活。為了進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以10微升/分鐘的流速在10-100nM的HEPES緩沖的鹽溶液(150mM氯化鈉，3.5mM EDTA，0.05％P-20，10mM HEPES，pH7.4)中對(duì)濃度為10-100nM的可溶性GFRα1-3-Fc進(jìn)行超融合。檢測(cè)其結(jié)合3分鐘，并檢測(cè)其解離1分鐘，然后用5mM氫氧化鈉再生。解離是用HEPES緩沖鹽溶液超融合啟動(dòng)的。用BIAcore評(píng)估軟件3.0計(jì)算結(jié)合率(ka)，解離率(kd)和平衡解離常數(shù)(KD，以Kd/Ka計(jì)算)。
結(jié)果用SPR測(cè)定可溶性GFRα1-3與固定化enovin的結(jié)合。與enovin的專一性結(jié)合只能用可溶性GFRα3檢測(cè)。GFRα1和GFRα2不能結(jié)合于固定化的enovin。所觀察到的GFRα3的結(jié)合是專一性的，因?yàn)椴荒芘cNGF結(jié)合。在獨(dú)立的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到TrkA-Fc(NGF受體)與固定化的NGF的專一性結(jié)合，而不與固定化的enovin結(jié)合。
根據(jù)用三種不同濃度的GFRα獲得的結(jié)合曲線，推導(dǎo)出了表3中的以下常數(shù)。以上結(jié)果證實(shí)GFRα3能專一性地結(jié)合enovin.
表3
由于GDNF、NTN、PSP都能促進(jìn)不同類型神經(jīng)細(xì)胞的維持和存活，預(yù)測(cè)enovin對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有相同的生物學(xué)作用，并且有可能對(duì)其他類型的細(xì)胞產(chǎn)生類似作用。因此，預(yù)計(jì)enovin蛋白一般可被用于神經(jīng)疾病的治療中，這些疾病包括帕金森病、阿爾采默病、外周神經(jīng)病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷以及接觸神經(jīng)毒素造成的損傷。
Enovin還可用于神經(jīng)保護(hù)的多個(gè)方面?？紤]到它對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞群體存活的影響以及對(duì)在我們的SH-SY5Y細(xì)胞模型上觀察到的對(duì)軸突延伸的影響，我們認(rèn)為該化合物可能具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生用途。
上述結(jié)論基于以下觀察。紫杉醇能在NGF-分化的PC12大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞程序死亡(Nuydens等提出)，因此，紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有通過(guò)DNA片段化、Annexin V標(biāo)記和bcl-2保護(hù)檢測(cè)到的神經(jīng)細(xì)胞程序死亡的特征。因此，推而廣之，可以推測(cè)紫杉醇能在分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡?，F(xiàn)已證實(shí)Enovin能夠減弱這種細(xì)胞死亡，并因此可以在總體上逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞的程序死亡。
因此，所述化合物可用于在其中業(yè)已觀察到細(xì)胞程序死亡的下列神經(jīng)變性疾病的治療中風(fēng)(Hakim1998)，帕金森病(Marsden等，1998)，阿爾采默病(NAGY等，1998)、亨廷頓病病(Wellington等，1997)，神經(jīng)創(chuàng)傷(Smirnova等，1998)，外周神經(jīng)病(Srinivisan等，1998)。
作為最后的臨床證據(jù)的一個(gè)例子，我們業(yè)已證實(shí)這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子確實(shí)能保擴(kuò)分化的SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞不受紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響。
存活性測(cè)定方法通過(guò)向每一個(gè)孔中添加補(bǔ)充了0.02mM吩嗪硫酸甲酯(PMS，Sigma)的100微升溶解在DMEM(37℃)中的1毫克/毫升2，3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-硫代苯基]-2H-四唑-5-carboxanilide(XTT，Sigma)來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活性。然后在37℃下培養(yǎng)所述平板2.5小時(shí)。在450nm下讀出光密度(分子裝置)，用650nm作為對(duì)照。XTT實(shí)驗(yàn)基于四唑鹽XTT向紅色甲臢產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)是用線粒體酶進(jìn)行的。
神經(jīng)分化的方法1.人成神經(jīng)纖維瘤SH-SY5Y細(xì)胞中的分化用25nM星型孢菌素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行5天的分化。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之后72小時(shí)測(cè)定Enovin的作用(參見(jiàn)Jalava等，“蛋白激酶抑制劑星型孢菌素在SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中通過(guò)a、b、z PKC獨(dú)立途徑誘導(dǎo)成熟的神經(jīng)表型”，細(xì)胞生理學(xué)雜志，155，301-312(1993))。
2.測(cè)定軸突延伸通過(guò)以下方法對(duì)神經(jīng)元的形態(tài)改變進(jìn)行自動(dòng)定量。簡(jiǎn)單地講，在適當(dāng)時(shí)間將戊二醛直接加入培養(yǎng)基中，并在室溫下放置30分鐘。這樣能確保在該時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞的形態(tài)能反映真實(shí)的情況。在Axiovert顯微鏡(Zeiss Oberkochen，德國(guó))上通過(guò)透射光模式觀察所述細(xì)胞，在該顯微鏡上裝配有一個(gè)由Indy工作站(Silicon Graphics，Mountain View，美國(guó))驅(qū)動(dòng)的Marzhauser掃描鏡臺(tái)。用一個(gè)MX5攝象機(jī)(HCS)獲取圖象。在64個(gè)并列的圖象中對(duì)大約3000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)，形成8×8的圖象方陣。圖象的實(shí)際排比能確保軸突能夠從一個(gè)圖象視野進(jìn)入另一個(gè)。用具有曲線結(jié)構(gòu)的無(wú)系統(tǒng)誤差的檢測(cè)器對(duì)由多克隆tau抗體標(biāo)記過(guò)的軸突延伸進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)(Steger 1998)。分析軟件能自動(dòng)計(jì)算總的細(xì)胞體面積，細(xì)胞體數(shù)量以及總的軸突長(zhǎng)度。
為了研究Enovin對(duì)不同類型細(xì)胞的影響，進(jìn)行了2個(gè)實(shí)驗(yàn)。一個(gè)是DNA合成實(shí)驗(yàn)，另一個(gè)是趨化性實(shí)驗(yàn)。
DNA合成實(shí)驗(yàn)在37℃下在5％二氧化碳和95％的空氣中在含有10％FBS的DMEM(39-SK、HSMC、大鼠成骨細(xì)胞)或在確定成分的培養(yǎng)基(軟骨細(xì)胞和HUVEC)中維持包括人表皮成纖維細(xì)胞(39SK)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人平滑肌細(xì)胞(HSMC)、人軟骨細(xì)胞、和大鼠成骨細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞。為了進(jìn)行DNA合成實(shí)驗(yàn)，以5000細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到96孔組織培養(yǎng)平板上的含有10％FBS的DMEM中，并培養(yǎng)24小時(shí)。然后用含有各種濃度Enovin和0.1％BSA的DMEM(對(duì)于39-SK、成骨細(xì)胞、HSMC、軟骨細(xì)胞而言)或含有各種濃度Enovin和0.5％FBS的DMEM(對(duì)于HUVEC而言)取代所述培養(yǎng)基，并將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。然后，用100微升含有5％FBS和0.1μi[3H]-胸苷的DMEM 100μl取代所述培養(yǎng)基。在進(jìn)行2小時(shí)的脈沖標(biāo)記之后，在室溫下用甲醇/乙酸(3∶1，體積/體積)固定細(xì)胞。用80％的甲醇洗滌固定的細(xì)胞2次。將所述細(xì)胞在0.05％胰蛋白酶(100微升/孔)中溶解30分鐘，然后在0.5％SDS(100微升/孔)中再溶解30分鐘。將細(xì)胞裂解物的等分試樣(180微升)與2毫升的閃爍混合物合并，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞裂解物的放射活性(Wallac1409)。
趨化性實(shí)驗(yàn)按照在“DNA合成實(shí)驗(yàn)”中所披露的方法維持細(xì)胞。用12孔改進(jìn)的Boyden室分析Enovin的趨化性活性(McQuillan，D.J.，Handley，C.J.，Campbell，M.A.，Bolis，S.，Milway，V.E.，Herington，A.C.，(1986)，“通過(guò)血清和胰島素樣生長(zhǎng)因子-I在培養(yǎng)的牛關(guān)節(jié)軟骨中促進(jìn)蛋白聚糖的合成”，生物化學(xué)雜志240423-430)。用0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，并重新懸浮在DMEM中。向Boyden室的底部孔中加入含有各種濃度Enovin的培養(yǎng)基的150微升的等分試樣。將包被有0.1毫克/毫升I型膠原的聚碳酸酯膜(8微米)放置在所述底部孔的上面，然后組裝頂部孔。向頂部孔中加入細(xì)胞的100微升的等分試樣(70,000細(xì)胞/毫升)。在進(jìn)行6小時(shí)的培養(yǎng)之后，將所述裝置分開(kāi)。去掉保留在所述膜頂部上的細(xì)胞。用10％的甲醛固定所述膜15分鐘，然后用Gill’s強(qiáng)蘇木精染色，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞(250倍的放大倍數(shù))，并使用每一個(gè)孔的5個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量的平均數(shù)。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。結(jié)果以對(duì)照(含有0.1％BSA的DMEM)的倍數(shù)形式表示。
如圖8-18中的結(jié)果所示，Enovin對(duì)所使用的每一種細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，或者對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移沒(méi)有影響(圖14)，如上文所述。Enovin對(duì)SH-SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞有影響。這證實(shí)了Enovin對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的選擇性影響。
業(yè)已證實(shí)GDNF和NTN通過(guò)由配體結(jié)合亞基GFRα-1或GFRα-2以及信號(hào)亞基cRET蛋白酪氨酸激酶組成的信號(hào)復(fù)合體傳導(dǎo)信號(hào)。預(yù)計(jì)Enovin是通過(guò)一種由GFRα結(jié)合配偶體(GFRα-1、GFRα-2、最近鑒定的幼兒受體GFRα-3或其他尚未鑒定的GFRα家族成員)與cRET或其他信號(hào)配偶體組成的類似的信號(hào)復(fù)合體發(fā)揮其生物學(xué)作用。實(shí)際上，我們的結(jié)合資料證實(shí)，Enovin能專一性地結(jié)合于GFRα-3上。
在人類中，在GDNF或cRET上的種系突變能導(dǎo)致若干疾病表型，包括多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成和家族性先天性巨結(jié)腸(SHCR)(Romeo等，1994，Edery等，1994，Angrist等，1996)。這兩種疾病都與腸無(wú)力相關(guān)，其中先天性巨結(jié)腸是嬰兒的先天性腹梗阻的最常見(jiàn)的誘因。有趣的是，GDNF或cRET剔除小鼠表現(xiàn)出與腎發(fā)育不全和腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏癥十分相似的病理學(xué)癥狀(Sanchez等，1996；Moore等，1996；Pichel等，1996)。Enovin可能與腸道或腎臟的類似的疾病相關(guān)，或者由于它是普遍表達(dá)的，因此在身體的其他外周器官的發(fā)育中起著重要作用。
配體及其受體的相互作用通常是通過(guò)來(lái)自這兩種蛋白上的特定的殘基之間的特殊的鍵的相互作用實(shí)現(xiàn)的。一種蛋白的片段可以用作激活劑激活其受體，產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)和存活維持作用。因此，Enovin的部分或根據(jù)Enovin蛋白序列合成的肽可被用作激活劑或拮抗劑來(lái)調(diào)節(jié)其受體GFRα-3。使用肽合成或重組技術(shù)，可以生產(chǎn)出由GDNF、NTN或PSP或任何其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子與Enovin部分組成的雜合生長(zhǎng)因子，以便得到具有新的特征的新型合成生長(zhǎng)因子。
為了檢驗(yàn)Enovin在足底注射到大鼠體內(nèi)后是否能夠改變大鼠的紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷，進(jìn)行了兩個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)了用Enovin進(jìn)行單一的處理是否能夠逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷，而在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)了Enovin是否能夠阻止紫杉醇誘導(dǎo)的缺陷的發(fā)展。
紫杉醇誘導(dǎo)的傳感異常隨時(shí)間的恢復(fù)方法使用體重為300-340克的雄性Sprague-Dawley大鼠。對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行單獨(dú)圈養(yǎng)，讓其自由攝取食物和水。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，將所述動(dòng)物放入標(biāo)準(zhǔn)的觀察籠中，在15分鐘的適應(yīng)期之后，評(píng)估針刺反射。為了達(dá)到這一目的，用針刺激所述動(dòng)物右爪的足底表面，并以有(得分＝1)或無(wú)(得分＝0)統(tǒng)計(jì)對(duì)該針刺的反應(yīng)。每一個(gè)時(shí)期內(nèi)，重復(fù)以上過(guò)程3次，兩個(gè)連續(xù)的針刺反應(yīng)中時(shí)間間隔為1分鐘；因此，所述針刺實(shí)驗(yàn)包括3次測(cè)定對(duì)針刺的反應(yīng)。僅將在3次針刺中都具有正常反應(yīng)的大鼠用于該實(shí)驗(yàn)。
連續(xù)3天在上午每日給所述動(dòng)物右側(cè)后腳的足底注射50微升的紫杉醇(3毫克/毫升paclitaxel，溶解在cremophor和脫水醇加水中)。在次日上午，再次評(píng)價(jià)針刺反應(yīng)，并篩選對(duì)3次針刺沒(méi)有任何反應(yīng)的動(dòng)物。將這些動(dòng)物隨機(jī)分成小組(n＝10/組)，在右側(cè)后腳的足底注射75微升的載體、鹽水或23或130微克/毫升Enovin。由于在用載體和鹽水處理的動(dòng)物之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差別，將這兩組合并(對(duì)照組)，在最后一次處理之后第1、4、5和7天，在上午(上午8-9點(diǎn))和下午(下午3:30-4:30)進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)。在第8天的上午進(jìn)行最后一次針刺實(shí)驗(yàn)。對(duì)每一只動(dòng)物來(lái)說(shuō)，隨時(shí)間測(cè)定對(duì)針刺反應(yīng)的累計(jì)得分。由于總共9次針刺實(shí)驗(yàn)(每次包括3次針刺)是在最后一次藥物處理之后進(jìn)行的，在該實(shí)驗(yàn)的總時(shí)間之后所得到的最大得分為27。
結(jié)果連續(xù)3天在足底反復(fù)注射紫杉醇，會(huì)在大部分動(dòng)物上導(dǎo)致急性炎性反應(yīng)，使其缺乏對(duì)針刺刺激的反應(yīng)。足底注射鹽水或載體不會(huì)影響紫杉醇誘導(dǎo)的缺陷型。在第一次測(cè)定時(shí)，在20個(gè)對(duì)照中僅有4個(gè)表現(xiàn)出對(duì)3次針刺的至少1次反應(yīng)，并且第一次測(cè)定的對(duì)照的平均(±SEM)針刺得分為0.25(±0.12)；這與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的情況不同，那時(shí)平均得分為3.0(±0.0)，因?yàn)樗械膭?dòng)物都對(duì)針刺有反應(yīng)。即使是在測(cè)定之后8天，對(duì)照的反應(yīng)性仍然受到損害，在20只大鼠中有11只至少有1次有反應(yīng)，平均針刺得分為0.75(±0.18)。在該對(duì)照組中，沒(méi)有一只大鼠能對(duì)3次針刺都表現(xiàn)出正常的反應(yīng)。隨時(shí)間發(fā)生的對(duì)照的針刺累計(jì)得分在圖19中給出。由于在為期8天的時(shí)間內(nèi)對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行了9次實(shí)驗(yàn)，在每一次實(shí)驗(yàn)中3次針刺所達(dá)到的最高得分為27。如曲線圖所示，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)足底注射鹽水或載體不能逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的缺陷。在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照的平均總的累計(jì)得分為5.10(±0.87)；它為要達(dá)到的最高得分的18.9％。
在第一次測(cè)定之后，足底注射75微升的23微克/毫升Enovin一次會(huì)導(dǎo)致在10只大鼠中有4只至少有一次有反應(yīng)，平均針刺得分為0.70(±0.33)。在第8天，所有10只動(dòng)物都至少有一次對(duì)針刺有反應(yīng)，并且在10只大鼠中有5只出現(xiàn)了正常反應(yīng)。在第8天時(shí)該組的平均針刺得分為2.20(±0.29)。與對(duì)照相比，在為期8天的測(cè)定結(jié)束時(shí)平均累計(jì)得分明顯提高(Mann-Whitney U-實(shí)驗(yàn)，雙尾，p＜0.01)，達(dá)到了平均針刺得分為14.50(±1.96)(圖19)。這一結(jié)果為所述最高得分的53.7％。
另外，足底注射130微克/毫升Enovin相對(duì)對(duì)照而言具有改善了的效力。在注射130微克/毫升Enovin之后第一次測(cè)定時(shí)，10只大鼠中有6只至少一次有反應(yīng)，平均針刺得分為1.10(±0.35)。在第8天，所有10只動(dòng)物都至少一次對(duì)針刺作出反應(yīng)，平均針刺得分為2.60(±0.22)。在10只大鼠中有8只對(duì)3次針刺都能作出正常反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，該組的平均累計(jì)總的針刺得分為17.20(±1.94)。這一結(jié)果為可能的總得分的63.7％，并且相對(duì)對(duì)照組有顯著改善(p＜0.01)。
隨時(shí)間預(yù)防紫杉醇誘導(dǎo)的傳感缺陷方法使用體重為300-340克的雄性Sprague-Dawley大鼠。對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行單獨(dú)圈養(yǎng)，讓其自由攝取食物和水。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，將所述動(dòng)物放入標(biāo)準(zhǔn)的觀察籠中，在15分鐘的適應(yīng)期之后，評(píng)估針刺反射。為了達(dá)到這一目的，用針刺激所述動(dòng)物右爪的足底表面，并以有(得分＝1)或無(wú)(得分＝0)統(tǒng)計(jì)對(duì)該針刺的反應(yīng)。每一個(gè)時(shí)期內(nèi)，重復(fù)以上過(guò)程3次，兩個(gè)連續(xù)的針刺反應(yīng)中時(shí)間間隔為1分鐘；因此，所述針刺實(shí)驗(yàn)包括3次測(cè)定對(duì)針刺的反應(yīng)。僅將在3次針刺中都具有正常反應(yīng)的大鼠用于該實(shí)驗(yàn)(針刺得分＝3)。在進(jìn)行所述對(duì)照測(cè)定之后，將這些動(dòng)物隨機(jī)分成小組(n＝10/組)，在右側(cè)后腳的足底注射75微升的載體、鹽水或23或130微克/毫升Enovin。由于在用載體和鹽水處理的動(dòng)物之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差別，將這兩組合并(對(duì)照組)，連續(xù)3天每日給所述動(dòng)物右側(cè)后腳的足底注射50微升的紫杉醇(3毫克/毫升paclitaxel，溶解在cremophor和脫水醇加水中)。在紫杉醇處理之后第1、4、5和7天，在上午(上午8-9點(diǎn))和下午(下午3:30-4:30)進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)。在第8天的上午進(jìn)行最后一次針刺實(shí)驗(yàn)。對(duì)每一只動(dòng)物來(lái)說(shuō)，隨時(shí)間測(cè)定對(duì)針刺反應(yīng)的累計(jì)得分。由于總共9次針刺實(shí)驗(yàn)(每次包括3次針刺)是在紫杉醇處理之后進(jìn)行的，在該實(shí)驗(yàn)的總時(shí)間之后所得到的最大得分為27。
結(jié)果在紫杉醇處理之前足底注射鹽水或載體不能在針刺實(shí)驗(yàn)中抑制紫杉醇誘導(dǎo)的缺陷型。在使用紫杉醇之后的第一次檢驗(yàn)時(shí)，在20只大鼠中有8只至少有一次對(duì)針刺有反應(yīng)，平均針刺得分為0.60(±0.18)。在第8天，仍然存在紫杉醇誘導(dǎo)的缺陷，在20只動(dòng)物中僅有8只有反應(yīng)，平均得分為0.8(±0.25)。在2只動(dòng)物上存在標(biāo)準(zhǔn)化的針刺反射。隨著時(shí)間推移，累計(jì)的針刺得分也降低，得到的平均值為6.55(±1.08)，這一結(jié)果為最高得分的24.3％(圖20)。
用23微克/毫升Enovin預(yù)處理能減弱紫杉醇誘導(dǎo)的針刺缺陷。在第1天，10只動(dòng)物中有8只至少有一次有反應(yīng)，并且平均針刺得分為1.70(±0.40)。在第8天，所有動(dòng)物都有反應(yīng)，平均得分為2.50(±0.27)。在這里，7只動(dòng)物對(duì)所有的針刺處理表現(xiàn)出正常反應(yīng)。就隨時(shí)間累計(jì)的反應(yīng)而言(圖20)，平均總的得分相對(duì)對(duì)照水平明顯改善(p＜0.01)，達(dá)到18.40(±1.73)，這一結(jié)果為最大值的68.1％。
在用130微克/毫升Enovin進(jìn)行預(yù)處理之后獲得了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。在這里，10只動(dòng)物中有6只在第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)有反應(yīng)，平均針刺得分為1.70(±0.31)。在第8天，所有動(dòng)物至少一次對(duì)針刺刺激有反應(yīng)，平均得分為2.40(±0.22)，有一半的動(dòng)物3次反應(yīng)都正常。就累計(jì)得分而言，在第8天獲得的平均得分為17.70(±1.92)，占總得分的65.5％。
該實(shí)驗(yàn)系列表明，單一一次足底注射Enovin能夠減弱紫杉醇誘導(dǎo)傳感缺陷，這一結(jié)果是通過(guò)針刺實(shí)驗(yàn)測(cè)定的。當(dāng)在使用紫杉醇之前和之后使用藥物時(shí)，觀察到了活性。
Enovin是主要由外周和中樞神經(jīng)成分、風(fēng)濕性/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征的可能候選物，并能夠在經(jīng)表皮、外部、局部、中樞(如硬膜外、鞘內(nèi)等)和系統(tǒng)使用之后在傳感過(guò)程中起著調(diào)節(jié)作用。
另外，可以用Enovin作為診斷工具篩選在上述部位發(fā)生的生理病理學(xué)變化。
比較Enovin mRNA在正常和病變組織中的表達(dá)。
用ABI Prism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(TaqMan；Perkin Elmer)，使用由英國(guó)的Pharmagene實(shí)驗(yàn)室有限公司(Royston)開(kāi)發(fā)并完成的專利技術(shù)對(duì)Enovin mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析。該系統(tǒng)使用一種發(fā)生熒光的探針，以便在PCR期間產(chǎn)生序列專一性熒光信號(hào)。所述探針是連接了熒光標(biāo)記和猝滅染料的寡核苷酸，它位于正向和反向PCR引物之間。在完整的情況下，所述熒光標(biāo)記的強(qiáng)度被所述猝滅染料所抑制。如果所述探針構(gòu)成復(fù)制復(fù)合體的一部分，所述熒光標(biāo)記會(huì)被Taq聚合酶所固有的從5’到3’的外切核酸酶活性從所述猝滅劑上切除。在反應(yīng)中，熒光標(biāo)記信號(hào)的增強(qiáng)是PCR產(chǎn)物積累的直接證據(jù)。通過(guò)確定PCR產(chǎn)物最初被檢測(cè)的分離PCR輪數(shù)(Ct)，確定mRNA靶序列的起始拷貝數(shù)(Cn)——熒光信號(hào)超過(guò)本底范圍的點(diǎn)。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每一種樣品中靶mRNA的量。
RNA制備和質(zhì)量控制用Tri-Zol試劑(生命技術(shù)，Gaithersburg，MD，美國(guó))按照生產(chǎn)商提供的方法，從完整的和亞解剖的組織中分離總RNA。對(duì)所有RNA樣品的質(zhì)量控制方法包括評(píng)估完整性(完整的18S和28S核糖體RNA)以及確定高豐度(肌動(dòng)蛋白)和低豐度(運(yùn)鐵蛋白受體)轉(zhuǎn)錄物的存在。
引物/探針設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一對(duì)引物和TaqMan探針，用于擴(kuò)增來(lái)自Enovin的特殊序列引物15’ACGGTTCTCCAGGTGCTGT3’引物35’TGCTGCCGACCCACG3’探針55’CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG3’另外，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和TaqMan探針，它們跨越一個(gè)內(nèi)含子，并用于擴(kuò)增人GAPDH基因的一部分引物25’CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT3’引物45’GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC3’探針65’TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT3’探針5用熒光劑FAM標(biāo)記，而探針6用熒光劑VIC標(biāo)記。
總RNA的DNase處理對(duì)于實(shí)驗(yàn)的每一種組織來(lái)說(shuō)，2.2ug總RNA在20微升體積的1×DNase緩沖液(Gibco BRL)中在室溫下用2單位的無(wú)RNase的DNase(Gibco BRL)消化15分鐘。通過(guò)添加2微升的25mM EDTA溶液終止所述反應(yīng)。然后在65℃下溫育所述樣品10分鐘，以便使所述酶失活。
第一條cDNA鏈的合成對(duì)于每一種實(shí)驗(yàn)的組織來(lái)說(shuō)，用100ng總RNA作模板合成第一條cDNA鏈。在4毫升的體積中，在存在50nM引物1和2，1×PCR緩沖液II(Perkin Elmer)和5mM氯化鎂的條件下，將所述RNA加熱到72℃5分鐘，并緩慢冷凍到55℃。在添加所有其他的試劑之后，將6毫升的反應(yīng)物在48℃下培養(yǎng)30分鐘，接下來(lái)的酶失活步驟是在90℃下進(jìn)行5分鐘。最后的反應(yīng)條件如下1×PCR緩沖液II、5mM氯化鎂、1mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP，12.5單位的MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)。
第一條cDNA鏈的PCR擴(kuò)增源于每一種樣品的100ng總RNA的cDNA在一次反應(yīng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以便鑒定靶轉(zhuǎn)錄物和GAPDH轉(zhuǎn)錄物。靶的最終引物/探針濃度為300nM引物1，300nM引物3和200nM探針5，GAPDH為20nM引物2，20nM引物4和100nM探針6。該反應(yīng)物中其他試劑的最終濃度為4.5％甘油，1×TaqMan緩沖液A(Perkin Elmer)，6.25mM氯化鎂，430M dATP，dUTP，dGTP，dCTP，2.5單位的AmpliTaq Gold。所述PCR擴(kuò)增是在ABI7700序列檢測(cè)系統(tǒng)中完成的，最初的酶活化步驟是在94℃下進(jìn)行12分鐘，然后進(jìn)行45輪次的94℃15秒，60℃1分鐘(最低循環(huán)時(shí)間)。
檢測(cè)的疾病和組織比較疾病患者和正常對(duì)照個(gè)體的組織中Enovin mRNA的表達(dá)(圖25和26)。下面的表中給出了業(yè)已研究過(guò)的疾病及相關(guān)組織。對(duì)每一種疾病來(lái)說(shuō)，分析了3個(gè)病變的樣品和3個(gè)對(duì)照樣品。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)于每一組的3個(gè)組織來(lái)說(shuō)，計(jì)算出Ct值(該值是正常分布的)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，然后根據(jù)公式Cn＝10((Ct-40.007)/-3.623)換算成Cn值。對(duì)所述Ct值進(jìn)行誤差分析(ANOVA)，再比較正常和病變組織的平均Enovin mRNA表達(dá)水平。
圖25和26表示在病變和對(duì)照組織中平均Enovin mRNA拷貝數(shù)(±SD；n＝3)。統(tǒng)計(jì)分析表明，多發(fā)性硬化患者的室周白色物質(zhì)中Enovin的表達(dá)水平明顯提高(p＝0.013)。內(nèi)部GAPDH對(duì)照沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差別(p＝0.79)。盡管在正常組織的室周白色物質(zhì)中Enovin的表達(dá)水平很低(平均為每100ng總RNA 270拷貝，而GAPDH為200000拷貝)，在多發(fā)性硬化患者體內(nèi)的表達(dá)水平高出3倍(825)。
只有一種其他的病變組織表現(xiàn)出與正常對(duì)照有明顯差別在乳腺管腺癌中，Enovin mRNA表達(dá)水平高出6倍(6000對(duì)1000；p＝0.007)，不過(guò)GADPH對(duì)照的值也明顯提高(165000對(duì)44000，p＝0.03)，有可能體現(xiàn)了mRNA含量的一種普遍提高。
總之，我們發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化患者的室周白色物質(zhì)中Enovin mRNA的含量得到上調(diào)。
用磷專一性抗體細(xì)胞基ELISA篩選GFRα3/cRET受體復(fù)合體上的Enovin模擬物。
該方法還可用于鑒定諸如GFRα1、GFRα2、GFRα4、TrkA、TrkB、和TrkC的其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的激活劑或拮抗劑。
實(shí)驗(yàn)使用該實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)途徑中活化的關(guān)鍵的信號(hào)激酶的激活或者通過(guò)測(cè)定cRET受體激酶的激活我們可以鑒定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的激活或拮抗化合物。通過(guò)用磷專一性抗體檢測(cè)磷酸化激酶或受體激酶的量確定所述激活。我們使用能瞬時(shí)或永久性表達(dá)TrkA、TrkB、、TrkC、GFRα1/cRET、GFRα2/cRET、GFRα3/cRET或GFRα4/cRET的NIH 3T3細(xì)胞。
用市售磷專一性抗體檢測(cè)p42/p44MAP激酶、PKB激酶、c-jun、CREB、JAN/SAPK激酶和其他激酶的激活。另外，可以用磷專一性cRET抗體消除cRET激活。
所使用的方法如下-NIH3T3細(xì)胞在96孔中在10％牛血清中鋪板，在刺激之前細(xì)胞必須達(dá)到80％的連匯。
-次日，用無(wú)血清培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，并饑餓細(xì)胞18-24小時(shí)。
-在饑餓之后，用化合物和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作正對(duì)照刺激細(xì)胞(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的濃度為10ng/ml)。
-用由PBS制備的4％的甲醛在4℃下固定細(xì)胞20分鐘。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗滌細(xì)胞5分鐘，3次。
-用100微升由PBS配制的0.6％H2O2/0.1％Triton對(duì)細(xì)胞進(jìn)行淬滅20分鐘。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗滌細(xì)胞5分鐘，3次。
-用100微升由PBS制備的10％的胎牛血清/0.1％Triton封閉細(xì)胞60分鐘。
-在4℃下在50微升5％BSA/PBS/0.1％Triton中與磷專一性抗體一起培養(yǎng)所述細(xì)胞過(guò)夜?？贵w稀釋液根據(jù)實(shí)驗(yàn)加以確定，建議的范圍是1∶100-1∶250。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗滌細(xì)胞5分鐘，3次。
-在室溫下在50微升5％BSA/PBS/0.1％Triton中與1∶100稀釋的第二種交聯(lián)HRP的抗體培養(yǎng)1小時(shí)。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗滌細(xì)胞5分鐘，3次。
-將1片OPD(Sigma)溶解在25毫升緩沖液(3.65克檸檬酸-H2O和5.9克磷酸氫二鈉-2H2O，溶解在0.5升水中，pH5.6)，并添加12.5微升H2O2。向每一個(gè)孔中添加50微升，并在搖床上培養(yǎng)15分鐘(200rpm)，用鋁箔覆蓋。
-用25微升硫酸終止反應(yīng)。
-在ELISA讀數(shù)儀上測(cè)定OD490-650。
小腦多巴胺能神經(jīng)培養(yǎng)物神經(jīng)培養(yǎng)物通過(guò)酶解和機(jī)械分散從大鼠胎兒的前側(cè)小腦制備神經(jīng)培養(yǎng)物。收集組織，并在冰鎮(zhèn)的不含鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖的鹽溶液中洗滌，該溶液中含有0.6％葡萄糖(PBSG)，并與含有0.1％胰蛋白酶的PBSG一起在37℃下培養(yǎng)30分鐘。以2.5 105細(xì)胞/平方厘米的密度將該細(xì)胞懸浮液鋪平板到96孔NUNC組織培養(yǎng)平板上。事先，用聚-L-鳥(niǎo)氨酸和含有10％胎牛血清的CDM涂敷培養(yǎng)平板。在化學(xué)組成確定的培養(yǎng)基(CDM)中維持所述培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基包括1∶1的Dulbecco’s改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基和F12營(yíng)養(yǎng)液的混合物，添加了葡萄糖(0.6％)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氫鈉(3mM)，HEPES(5mM)，胰島素(25微克/毫升)，人運(yùn)鐵蛋白(100微克/毫升)，腐胺(60微克/毫升)，硒酸鈉(30nM)，鏈霉素(100微克/毫升)，和青霉素(100IU/毫升)。
用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子溶解在0.5％的牛血清白蛋白中作為母液。在開(kāi)始鋪平板3小時(shí)之后以及在培養(yǎng)5天之后加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。將相同數(shù)量的0.5％的牛血清白蛋白加入對(duì)照孔中。
高親和力多巴胺攝取在10天之后測(cè)定多巴胺的攝取。為了進(jìn)行攝取，用預(yù)熱的補(bǔ)充了葡萄糖(5mM)、抗壞血酸(100mM)、巴吉林(100mM)的PBS洗滌細(xì)胞2次，并與相同的溶液預(yù)培養(yǎng)10分鐘。用含有50nM[3H]DA的相同的溶液更換所述預(yù)培養(yǎng)溶液，并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)15周。通過(guò)用冰鎮(zhèn)的PBS進(jìn)行3次快速洗滌終止攝取。通過(guò)在室溫下與酸化的乙醇培養(yǎng)30分鐘釋放積累的[3H]多巴胺。加入4毫升閃爍液(Packard ultima gold MV)之后，用Packard閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。通過(guò)添加20μM可卡因測(cè)定非專一性攝取。
表4.Enovin對(duì)[3H]多巴胺攝取的影響
在有或沒(méi)有Enovin的情況下讓細(xì)胞生長(zhǎng)10天。將未處理過(guò)的對(duì)照設(shè)定為100％。結(jié)果是在1-5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得的。
參考文獻(xiàn)Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)基礎(chǔ)局部排比檢索工具分子生物學(xué)雜志215，403-410.
Angrist，M.，Bolk，S.，.Halushka，M.，Lapchak，P.A.&Chakravarti，A.(1996)先天性巨結(jié)腸病患者中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和RET的種系突變。自然遺傳學(xué)14，341-344.
Baloh，R.H.，Tansey，M.G.，Golden，J.P.，Creedon，D.J.，Heuckeroth，R.O.，Keck，C.L.，Zimonjic，D.B.，Popescu，N.C.，Johnson，E.M.& Milbrandt，J.(1997)通過(guò)Ret介導(dǎo)neurturin和GDNF信號(hào)傳導(dǎo)的新受體TmR2.神經(jīng)元18，793-802.
Baloh，R.H.，Gorodinsky，A.，Golden，J.P.，Tansey，M.G.，Keck，C.L.，Popescu，N.C.，Johnson，E.M.&Milbrandt，J.(1998)GFRα3是GDNF/neurturin/persephin受體家族的孤兒成員Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5801-5806.
Barr，P.J.(1991)哺乳動(dòng)物枯草桿菌素長(zhǎng)期尋找的二價(jià)加工內(nèi)切蛋白酶。細(xì)胞66，1-3.
Beck，K.D.，Valverde，J.，Alexi，T.，Poulsen，K.，Moffat，B.，Vandlen，RA.，Rosenthal，A.& Hefti，F(xiàn).(1995)成人腦中軸突切開(kāi)術(shù)誘導(dǎo)的退化產(chǎn)生的GDNF保護(hù)的中腦多巴胺能神經(jīng)元。自然373，339-341.
Bilang-Bleuel，A.，Revah，F(xiàn).，Colin，P.，Locquet，I..，Robert J.J.，Mallet，J.& Horellou，P.(1997)在帕金森病大鼠模型中紋狀體內(nèi)注射表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子防止多巴胺能神經(jīng)元退化和行為受損。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，8818-8823.
Buj-Bello，A.，Buchman，V.L.，Horton，A.，Rosenthal，A.& Davies A.M.(1995)GDNF是感覺(jué)和自主性神經(jīng)元的年齡特異性存活因子。神經(jīng)元15，821-828.
Buj-Bello，A.，Adu，J.，Pinón，L.G.P.，Horton，A.，Thompson，J.，Rosenthal，A.，Chinchetru，M.，Buchman，V.L.& Davies，A.M.(1997)Neurturin反應(yīng)性需要GPI連接的受體和Ret受體酪氨酸激酶．自然387，721-724.
Choi-Lundberg，D.L.，Lin，Q.，Chang，Y.N.，Chiang，Y.L.，Hay，C.M.，Mohajeri，H.，Davidson，B.L.& Bohn，M.C.(1997)GDNF基因治療保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免于退化。科學(xué)275，838-841.
Creedon，D.J.，Tansey，M.G.，Baloh，R.H.，Osborne，P.A.，Lampe，P.A.，F(xiàn)ahrner，T.J.，Heuckeroth，R.O.，Milbrandt，J.& Johnson，E.M.(1997)交感神經(jīng)元中Neurturin和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有共同受體和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，7018-7023.
Durbec，P.，Marcos-Gutierrez，C.V.，Kilkenny，C.，Grigoriou，M.，Wartiowaara，K.，Suvanto，P.，Smith，D.，Ponder，B.，Costantini，F(xiàn).，Saarma，M.，Sariola，H.& Pachnis，V.(1996)通過(guò)RET受體酪氨酸激酶的GDNF信號(hào)傳導(dǎo)。自然381，789-793.
Edery，P.，Lyonnet，S.，Mulligan，L.M.，Pelet，A.，Dow，E.，Abel L.，Holder S.，Nihoul-Fekete，C.，Ponder，B.A.& Munnich，A.(1994)先天性巨結(jié)腸中RET原癌基因的突變。自然367，378-380.
Gash，D.M.，Zhang，Z.，Ovadia，A.，Cass，W.A.，Yi，A.，Simmerman，L.，Russell，D.，Martin，D.，Lapchak，P.A.，Collins，F(xiàn).，Hoffer，B.J.& Gerhardt，G.A.(1996)GDNF治療的帕金森病猴的功能恢復(fù)。自然380，252-255.
GFRα Nomenclature Committee(1997)GDNF配體家族的GPI連接受體分類。神經(jīng)元19，485.
Hakim A“局部缺血性半影治療窗口?！鄙窠?jīng)學(xué)1998 Sep；51(3 Suppl 3)S44-6.
Henderson，C.E.，Phillips，H.S.，Pollock，R.A.，Davies，A.M.，Lemeulle，C.，Armanini，M.，Simmons，L.，Moffet，B.，Vandlen，R.A.，Koliatsos，V.E.&Rosenthal，A.(1994)GDNF外周神經(jīng)和肌肉中存在的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的強(qiáng)效存活因子?？茖W(xué)266，1062-1064.
Heng，H.H.Q.，Squire，J.& Tsui，L.-C.(1992)對(duì)游離染色質(zhì)的原位雜交對(duì)哺乳動(dòng)物基因的高分辨率作圖。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，9509-9513.
Heng，H.H.Q.& Tsui，L.-C.(1993)DAPI結(jié)合模式和同時(shí)原位雜交。染色體102，325-332.
Heuckeroth，R.O.，Kotzbauer，P.，Copeland，N.G.，Gilbert，D.J.，Jenkins，N.A.，Zimonjic，D.B.，Popescu，N.C.，Johnson，E.M.& Milbrandt，J.(1997)新神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Neurturin位于小鼠染色體17和人染色體19p13.3上?；蚪M44，137-140.
Jing，S.，Wen，D.，Yu，Y.，Holst，P.L.，Luo，Y.，F(xiàn)ang，M.，Tamir，R.，Antonio，L.，Hu，Z.，Cupples，R.，Louis，J.-C.，Hu，S.，Altrock，B.W.& Fox，G.M.(1996)ret蛋白酪氨酸激酶的GDNF誘導(dǎo)的激活是由GDNF的新受體GDNFR-α介導(dǎo)的。細(xì)胞85，1113-1124.
Jing，S.，Yu，Y.，F(xiàn)ang，M.，Hu，Z.，Holst，P.L.，Boone，T.，Delaney，J.，Schultz，H.，Zhou，R.& Fox，G.M.(1997)GFRα-2和GFRα-3是GDNF家族配體的兩個(gè)新受體。生物化學(xué)雜志272，33111-33117.
Kingsley，D.M.(1994)TGF-β超家族新成員，新受體和不同生物中功能的新遺傳試驗(yàn)。基因和發(fā)育8，133-146.
Klein，R.D.，Sherman，D.，Ho，W.-H.，Stone，D.，Bennett，G.L.，Moffat，B..，Vandlen，R.，Simmons，L.，Gu，Q.，Hongo，J.-A.，Devaux，B.，Poulsen，K.，Armanini，M.，Nozaki，C.，Asai，N.，Goddard，A.，Phillips，H.，Henderson，C.E.，Takahashi，M.&Rosenthal，A.(1997)與Ret反應(yīng)形成候選Neurturin受體的GPI連接的蛋白。自然387，717-721.
Kotzbauer，P.T.，Lampe，P.A.，Heuckeroth，R.O.，Golden，J.P.，Creedon，D.J.，Johnson，E.M.&Milbrandt，J.(1996)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的近親Neurturin。自然384，467-470.
Lin，L.-F.H.，Doherty，D.H.，Lile，J.D.，Bektesh，S.&Collins，F(xiàn).(1993)GDNF中腦多巴胺能神經(jīng)元的膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子?？茖W(xué)260，1130-1132.
Mandel，R.J.，Spratt，S.K.，Snyder ，R.O.& Leff，S.E.(1997)中腦注射編碼大鼠GDNF的重組腺伴隨病毒保護(hù)進(jìn)行性6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的大鼠帕金森病退化模型中的黑質(zhì)神經(jīng)元。Proc.Natl.Acad.Scl.USA 94，14083-14088.
Marsden et al“帕金森病的病因正被揭示，針對(duì)性的神經(jīng)保護(hù)治療趨于現(xiàn)實(shí)?！盇nn Neurol.1998 Sep；44(3Suppl 1)S189-96Masure，S.，Cik，M.，Pangalos，M.N.，Bonaventure，P.，Verhasselt，P.，Lesage，A.S.，Leysen，J.E.& GordonR.D.(1998)GDNF家族受體α-3(GFRα-3)的分子克隆、表達(dá)和組織分布。歐洲生物化學(xué)雜志251，622-630.
Matsushita，N.，F(xiàn)ujita，Y.，Tanaka，M.，Nagatsu，T.&Kiuchi，K.(1997)小鼠GDNF編碼基因的克隆和結(jié)構(gòu)特征?；?03，149-157.
Milbrandt，J.，de Sauvage，F(xiàn).J.，F(xiàn)ahrner，T.J.，Baloh，R.H.，Leitner，M.L.，Tansey，M.G.，Lampe，P.A.，Heuckeroth，R.O.，Kotzbauer，P.T.，Simburger，K.S.，Golden，J.P.，Davies，J.A.，Vejsada，R.，Kato，A.C.，Hynes，M.，Sherman，D.，Nishimura，M.，Wang，L.C.，Vandlen，R.，Moffat，B.，Klein，R.D.，Poulsen，K.，Gray，C.，Garces，A.，Henderson，C.E.，Phillips，H.S.& Johnson，E.M.Jr.(1998)與GDNF和Neurturin相關(guān)的新神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Persephin。神經(jīng)元20，245-253.
Moore，M.W.，Klein，R.D.，F(xiàn)arinas，I.，Sauer，H.，Armanini，M.，Phillips，H.，Reichardt，L.F.，Ryan，A.M.，Carver-Moore，K.& Rosenthal，A.(1996)缺乏GDNF的小鼠中腎和神經(jīng)元異常。
自然382，76-79.
Mount，H.T.，Dean，D.O.，Alberch，J.，Dreyfus，C.F.&Black，I.B.(1995)GDNF促進(jìn)Purkinje細(xì)胞的存活和形態(tài)分化。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，9092-9096.
Nagy Z et al“阿爾采默病的細(xì)胞分裂周期和病理生理學(xué)?！鄙窠?jīng)科學(xué)1998 Dec；87(4)731-9.
Naveilhan，P.，Baudet，C.，Mikaels，A.，Shen，L.，Westphal，H.& Ernfors，P.(199B)GDNF家族受體GFRα3的表達(dá)和調(diào)控。Proc.Natl.Acad.Scl.USA95，1295-1300.
Nuydens R，Dispersyn G，Van den Kieboom G，De Jong M，Connors R，Ramaekers F，Borgers M，Geerts H“Bcl-2通過(guò)誘導(dǎo)多核化保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞抵抗紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡，”已提交Oppenheim，R.W.，Houenou，L.J.，Johnson，J.E.，Lin，L.F.，Li，L.，Lo，A.C.，Newsome，A.L.，Prevette，D.M.& Wang，S.(1995)GDNF使發(fā)育中的神經(jīng)元從程序性和軸突切開(kāi)術(shù)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中恢復(fù)。自然373，344-346.
Pichel，J.G.，Shen，L.，Sheng，H.Z.，Granholm，A.C.，Drago，J.，Grinberg，A.，Lee，E.J.，Huang，S.P.，Saarma，M.，Hoffer，B.J.，Sariola，H.& Westphal，H.(1996)在缺乏GDNF的小鼠中腸神經(jīng)分布和腎發(fā)育缺陷。自然382，73-76.
Romeo，G.，Ronchetto，P.，Luo，Y.，Barone，V.，Seri，M.，Ceccherini，I.，Pasini，B.，Bocciardi，R.，Lerone，M.，Kaariainen，H.et al.(1994)先天性巨結(jié)腸中影響RET原癌基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變。自然367，377378.
Sanchez，M.P.，Silos-Santiago，I.，F(xiàn)risen，J.，He，B.，Lira，S.A.& Barbacid，M.(1996)缺乏GDNF的小鼠中腎發(fā)育不全和腸神經(jīng)元缺乏。自然382，70-73.
Sanicola，M.，Hession，C.，Worley，D.，Carmillo，P.，Ehrenfels，C.，Walus，L.，Robinson，S.，Jaworski，G.，Wei，H.，Tizard，R.，Whitty，A.，Pepinsky，R.B.&Cate，R.L.(1997)GDNF依賴RET激活可以由兩個(gè)不同的細(xì)胞表面伴隨蛋白介導(dǎo)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，6238-6243.
Smirnova et al“凝血酶是模式運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中激活胞內(nèi)死亡蛋白酶途徑誘導(dǎo)的凋亡的胞外信號(hào)”。神經(jīng)生物學(xué)雜志1998 Jul；36(1)64-80.
Srinivisan et al“患有神經(jīng)病的乙型糖尿病患者血清誘導(dǎo)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中補(bǔ)體依賴性鈣依賴凋亡?！迸R床研究雜志1998 Oct1；102(7)1454-62
Steger C“無(wú)系統(tǒng)誤的曲線結(jié)構(gòu)檢測(cè)器”關(guān)于系統(tǒng)分析和機(jī)器智能的IEEE通訊20，2，113-125(1998)Suvanto，P.，Wartiovaara，K.，Lindahl，M.，Arume，U.，Moshnyakov，M.，Horelli-Kuitunen，N.，Airaksinen，M.S.，Palotie，A.，Sariola，H.& Saarma，M.(1997)GDNFRα的同源物GDNF受體β的克隆、mRNA分布和染色體定位。人類分子遺傳學(xué)6，1267-1273.
Tomac，A.，Lindqvist，E.，Lin，L.F.，Ogren，S.O.，Young，D.，Hoffer，B.J.& Olson，L.(1995)在體內(nèi)GDNF對(duì)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)的保護(hù)和修復(fù)。自然373，335-339.
Treanor，J.J.S.，Goodman，L.，de Sauvage，F(xiàn).，Stone，D.M.，Poulsen，K.T.，Beck，C.D.，Gray，C.，Armanini，M.P.，Pollock，R.A.，Hefti，F(xiàn).，Phillips，H.S.，Goddard，A.，Moore，M.W.，Buj-Bello，A.，Davies，A.M.，Asai，N.，Takahashi，M.，Vandlen，R.，Henderson，C.E.& Rosenthal，A.(1996)GDNF多成分受體的鑒定。自然382，80-83.
Trupp，M.，Arenas，E.，F(xiàn)ainzilber，M.，Nilsson，A.S.，Sieber，B.A.，Grigoriou，M.，Kilkenny，C.，SalazarGrueso，E.，Pachnis，V.，Arume，U.，Sariola，H.，Saarma，M.& Ibanez，C.F.(1996)c-ret原癌基因編碼的GDNF的功能受體。自然381，785-788.
Wellington et al“亨廷頓病的分子病理學(xué)的了解?！蹦X病理學(xué)1997Jul；7(3)979-1002.
Widenfalk，J.，Nosrat，C.，Tomac，A.，Westphal，H.，Hoffer，B.& Olson，L.(1997)與GDNF和GDNFR-α相關(guān)的新蛋白Neurturin和GDNFR-β具有特異的細(xì)胞表達(dá)特征表明其在發(fā)育中的和成人神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官中的作用。神經(jīng)科學(xué)雜志17，8506-8519.
Widenfalk，J.，Tomac，A.，Lindqvist，E.，Hoffer，B.&Olson，L.(1998)與GFRd-1相關(guān)的蛋白GFRα-3在發(fā)育中的外周神經(jīng)元和鞘細(xì)胞中表達(dá)。歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志10，1508-1517.
Worby，C.A.，Vega，Q.C.，Zhao，Y.，Chao，H.H.-J.，Seasholtz，A.F.& Dixon，J.E.(1996)GDNF通過(guò)RET受體傳遞信號(hào)并激活氮激活的蛋白激酶。生物化學(xué)雜志271，23619-23622.
Worby，C.A.，Vega，Q.C.，Chao，H.H.J.，Seasholtz，A.F.，Thompson，R.C.& Dixon J.E.(1998)屬于GDNF受體家族的新共有受體GFRα-3的鑒定和表征。生物化學(xué)雜志273，3502-3508.
Yan，Q.，Matheson，C.& Lopez，O.T.(1995)GDNF對(duì)新生兒和成人面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。自然373，341-344.
縮寫(xiě)表BLAST 基礎(chǔ)局部排比檢索工具bp 堿基對(duì)cDNA互補(bǔ)DNACNS 中樞神經(jīng)系統(tǒng)EST 表達(dá)序列標(biāo)記EVN enovinGDNF神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GFRαGDNF家族受體αGPI 糖磷脂酰肌醇MTC 多組織cDNANTN neurturinPCR 聚合酶鏈反應(yīng)PNS 外周神經(jīng)系統(tǒng)PSP persephinRT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCRTGF-β 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βFISH熒光原位雜交MTN 多組織northernNGF 神經(jīng)生長(zhǎng)因子SPR 表面胞質(zhì)共振
權(quán)利要求
1.一種編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白，其特征在于其氨基酸序列根據(jù)圖1中的氨基酸編號(hào)，在第42、69、73、106、107、135和137位具有半胱氨酸殘基；并且具有NST糖基化位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的蛋白，其中根據(jù)圖1中的氨基酸編號(hào)，NST糖基化位點(diǎn)位于第121-123位。
3.權(quán)利要求1的蛋白，它還包含RXXR切割位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求3的蛋白，其中根據(jù)圖1中的氨基酸編號(hào)，所述RXXR切割位點(diǎn)位于第23-26位。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的蛋白，其具有圖2中以ENV表示的氨基酸序列。
6.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的蛋白。
7.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求6的核酸分子。
8.權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其還包含編碼報(bào)導(dǎo)分子的核酸序列。
9.一種宿主細(xì)胞，它被權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
10.如權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
11.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，它包含能夠表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)基因。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因包含權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的載體。
13.權(quán)利要求6的核酸分子在生產(chǎn)用來(lái)治療或預(yù)防患者的神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
14.如權(quán)利要求13的用途，其中所述神經(jīng)疾病選自下列一組中的任一種帕金森病、阿爾采默病、與擴(kuò)增的谷氨酰胺序列相關(guān)的神經(jīng)疾病，如亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷、由神經(jīng)毒素造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病、中風(fēng)、主要由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征。
15.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子在生產(chǎn)用來(lái)治療或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
16.如權(quán)利要求15的用途，其中所述神經(jīng)疾病選自下列一組中的任一種帕金森病、阿爾采默病、與擴(kuò)增的谷氨酰胺序列相關(guān)的神經(jīng)疾病，如亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷、由神經(jīng)毒素造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病、中風(fēng)、主要由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征。
17.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求6的核酸分子及其藥理學(xué)上可以接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
18.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的生長(zhǎng)因子及其藥理學(xué)上可以接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
19.權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在治療或預(yù)防患者的神經(jīng)疾病的方法中的用途。
20.如權(quán)利要求19的用途，其中所述神經(jīng)疾病選自下列一組中的任一種帕金森病、阿爾采默病、與擴(kuò)增的谷氨酰胺序列相關(guān)的神經(jīng)疾病，如亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷、由神經(jīng)毒素造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病、中風(fēng)、主要由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征。
21.一種治療患者神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括給患者施用表達(dá)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其包括給患者施用權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)疾病選自下列一組中的任一種帕金森病、阿爾采默病、與擴(kuò)增的谷氨酰胺序列相關(guān)的神經(jīng)疾病，如亨廷頓病、外周神經(jīng)病、急性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、外周神經(jīng)創(chuàng)傷、由神經(jīng)毒素造成的損傷、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、家族性先天性巨結(jié)腸、朊病毒相關(guān)疾病、Creutzfeld-Jacob病、中風(fēng)、主要由外周性或中樞神經(jīng)發(fā)生成分、風(fēng)濕病/炎性疾病以及傳導(dǎo)紊亂造成的痛苦綜合征。
全文摘要
披露了一種分離的核酸分子，它編碼被稱為enovin、并具有圖1、21、23或24所示的氨基酸序列的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，或者編碼所述生長(zhǎng)因子的功能性等同物、衍生物或生物前體。所述生長(zhǎng)因子優(yōu)選包括圖1所示序列的從27到139號(hào)位置的氨基酸序列，或其功能性等同物、衍生物或生物前體。通過(guò)將編碼enovin的核酸分子包含在合適的載體中，可將其用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、組織或生物。宿主細(xì)胞、組織或有機(jī)體以及載體也是本發(fā)明的組成部分。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1803837SQ200510138188
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期1999年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月14日
發(fā)明者H·A·G·格爾茨, S·L·J·馬素雷, T·F·梅爾特, M·奇克, L·A·L·維爾東克 申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司