專利名稱：一種注射型組織工程骨移植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法構(gòu)建人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種注射型組織工程骨移植物。
背景技術(shù)：
目前，組織工程骨移植物大多構(gòu)建為支架材料負(fù)載細(xì)胞生長因子再復(fù)合種子細(xì)胞的模式。支架材料和生長因子的選擇是組織工程學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。支架材料作為種子細(xì)胞載體，有負(fù)載細(xì)胞和緩釋生長因子的作用，目前常用的支架材料多為固體類材料，其在組織工程骨移植物的構(gòu)建中已取得了令人矚目的效果。但是，也不同程度地存在難以塑形、負(fù)載生長因子和種子細(xì)胞操作復(fù)雜、負(fù)載率不高、細(xì)胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝膠類材料是目前骨組織工程研究的熱點(diǎn)。常用于骨組織工程領(lǐng)域的細(xì)胞生長因子有BMP、TGF-β、bFGF、VEGF等，均為外源性蛋白(異種或異體蛋白因子)。從這些生長因子的構(gòu)建方法分析，包括異體骨提取和基因重組兩種，其構(gòu)建復(fù)雜、價格昂貴。例如，申請?zhí)枮?2114509.1的中國專利申請“以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料”公開了一種以動物纖維蛋白為載體的注射型多種生物因子復(fù)合骨修復(fù)材料，其采用的就是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子和β轉(zhuǎn)化生長因子。從免疫學(xué)角度看，目前常用的各類生長因子均為外源性(非自體)蛋白或多肽類，不同程度存在免疫排斥反應(yīng)。研究開發(fā)構(gòu)建簡單、價格低廉、無免疫排斥的自體生長因子用于組織工程骨移植物的構(gòu)建，是組織工程骨移植物進(jìn)一步臨床應(yīng)用亟待解決的重要問題。
富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)是從全血中分離出來的含高濃度血小板的血漿。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，從自體靜脈血中提取的富血小板血漿(PRP)中含有多種高濃度的有利于促進(jìn)骨再生的生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)等。當(dāng)PRP與氯化鈣及凝血酶混合后，可促使其中血小板α顆粒釋放出這些生長因子。這些生長因子對骨缺損的愈合有明顯的促進(jìn)作用。PRP中各種生長因子濃度比例與體內(nèi)正常濃度比例相似，生長因子之間有最佳協(xié)同作用。但單純應(yīng)用PRP于局部，這些生長因子易因血循環(huán)而流失，只能在較短時間內(nèi)起作用。目前，已有將PRP與固體材料如TCP或同種異體骨等復(fù)合用于口腔頜面外科修復(fù)骨缺損的報導(dǎo)。但將PRP與注射型材料復(fù)合用于組織工程方面則未見報導(dǎo)。
實(shí)用新型內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，為了克服現(xiàn)有的組織工程骨移植物難以塑形及復(fù)合細(xì)胞操作復(fù)雜及昂貴的外源性細(xì)胞因子等不足，本實(shí)用新型提供一種注射型組織工程骨移植物，該組織工程骨移植物為可注射形材料負(fù)載自體PRP再復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細(xì)胞簡便，且使用自體細(xì)胞生長因子，不存在免疫排斥問題。
本實(shí)用新型所述的一種注射型組織工程骨移植物，包括載體支架和種子細(xì)胞，種子細(xì)胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，所述的載體支架為纖維蛋白凝膠，呈纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負(fù)載有自體富血小板血漿即PRP；所述的種子細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
所述的載體支架是由含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶混合溶液以體積比為9∶1～1∶1的比例混合后形成的纖維蛋白凝膠。
所述的含PRP的纖維蛋白原溶液是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合形成的。
所述的PRP優(yōu)選是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
所述纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
所述的氯化鈣-凝血酶混合溶液中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml。
所述的種子細(xì)胞是細(xì)胞密度為5×106～10×107/ml的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
所述的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的來源優(yōu)選是取自自體紅骨髓，經(jīng)體外用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)增殖，細(xì)胞密度達(dá)到108數(shù)量級。
本實(shí)用新型所述的注射型組織工程骨移植物的各組分的濃度及比例都是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索得到的最佳結(jié)果。
本實(shí)用新型的制備簡便，價格低廉。自體PRP中富含多種有利于骨修復(fù)的生長因子如PDGF、TGF-β、VEGF等，均為自體來源，不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播，所構(gòu)建的注射型組織工程骨移植物既符合經(jīng)典的“細(xì)胞因子+支架材料+種子細(xì)胞”的骨組織工程模式，又可靈活應(yīng)用注射型材料和自體生長因子二者的優(yōu)點(diǎn)，操作簡單，使用方便，可塑性好，可在體內(nèi)任意塑型成損傷部位的形狀，使新骨形狀完全恢復(fù)成原有的生理狀態(tài)，成骨效果明確，可適用于各種不規(guī)則骨缺損、骨不連治療，且可在局部注射應(yīng)用，也可用于非手術(shù)方法治療骨折，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為本實(shí)用新型所述的注射型組織工程骨移植物在構(gòu)建后的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型所述的一種注射型組織工程骨移植物，如圖1所示，包括載體支架1和種子細(xì)胞2，種子細(xì)胞2附著于載體支架1上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，所述的載體支架1為纖維蛋白凝膠，呈纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負(fù)載有自體富血小板血漿3即PRP；所述的種子細(xì)胞2為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。圖1為微觀示意圖，其比例不代表實(shí)際產(chǎn)品的比例。圖中，所述的注射型組織工程骨移植物連接于骨斷端4之間。
所述的載體支架1是由含PRP的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶混合溶液以體積比為9∶1～1∶1的比例混合后形成的纖維蛋白凝膠。
所述的含PRP的纖維蛋白原溶液是將自體富血小板血漿即PRP與濃度為80-100mg/ml的纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合形成的。
所述纖維蛋白原溶液是以濃度為2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纖維蛋白原而得到的。
所述的纖維蛋白原為商品化產(chǎn)品，可購自廣州倍繡生物技術(shù)有限公司或同類公司。
所述的PRP優(yōu)選是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
所述的氯化鈣-凝血酶混合溶液中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000U/ml。
所述的種子細(xì)胞3是細(xì)胞密度為5×106～10×107/ml的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
所述的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的來源優(yōu)選是取自自體紅骨髓，經(jīng)體外用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)增殖，細(xì)胞密度達(dá)到108數(shù)量級。
本實(shí)用新型所述的注射型組織工程骨移植物的構(gòu)建方法，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備(1)種子細(xì)胞抽取紅骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法(金丹、裴國獻(xiàn)等，骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)骨發(fā)生潛能及條件研究中華創(chuàng)傷骨科雜志，2000年第一期)分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，所用的培養(yǎng)基為含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至108數(shù)量級；(2)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；以抑肽酶溶液溶解纖維蛋白原，使成溶液態(tài)，配制氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000IU/ml；所述提取自體RPR的二次離心法包括以下步驟將抗凝血于20℃以3000r/min第一次離心10分鐘，吸取上清及白膜層下3mm成分；同樣溫度下以3600r/min第二次離心15分鐘，棄上層3/4上清，剩余部分即為PRP。
(3)纖維蛋白原溶液以抑肽酶溶解纖維蛋白原，使其成溶液態(tài)；(4)氯化鈣-凝血酶混合溶液配置氯化鈣-凝血酶混合溶液，其中，氯化鈣濃度為40mmol/ml，凝血酶濃度為400～1000IU/ml；B.將自體RPR與纖維蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超聲振蕩使混合均勻，得到含PRP的纖維蛋白原溶液；C.取體外增殖培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，以5×106-1×108個/ml細(xì)胞密度加入步驟B所得的含PRP的纖維蛋白原溶液中，輕振蕩使其混勻，得到含PRP及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的纖維蛋白原溶液，置37℃孵箱，待用；D.以雙聯(lián)注射器分別抽取步驟C的含PRP及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的纖維蛋白原溶液以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，通過混合針頭注射，注射時含PRP及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的纖維蛋白原溶液與氯化鈣-凝血酶溶液比例為9∶1～1∶1，形成粘著力較強(qiáng)的凝膠，其中PRP所占的體積比為10～30％，即獲得所述的注射型組織工程骨移植物。
動物骨缺損修復(fù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計取健康新西蘭大白兔，由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))南方醫(yī)院動物所提供，6個月齡，體重2-3kg，采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合液肌注麻醉。無菌條件下，手術(shù)顯露右側(cè)橈骨中段，連同骨膜切除橈骨1.5cm，造成節(jié)段性骨缺損模型。36只橈骨骨缺損模型新西蘭大白兔，隨機(jī)分為A、B、C三組，每組12只。所有動物術(shù)前一周抽取耳背中央動脈血提取自體富血小板血漿(Plate Rich Plasma，PRP)。A組于術(shù)前1～2月制備骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，術(shù)前30分鐘將消化計數(shù)后的MSCs加入制備的注射型骨修復(fù)材料，植入自體橈骨1.5cm節(jié)段性骨缺損，為實(shí)驗(yàn)組。B、C兩組分別植入PRP+FG、FG于同樣骨缺損處為對照組。纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G)是將纖維蛋白原與氯化鈣、凝血酶混合后形成的一種凝膠狀物。A、B、C三組逐層縫合切口，術(shù)后三天肌注青霉素40萬u/日。另取4只橈骨同樣部位和大小骨缺損曠置作為空白組，即D組。
術(shù)后4、8、12周時拍攝橈骨正位X線片。用放射影像學(xué)評分和圖像分析X線阻射影比較骨缺損的修復(fù)情況。
檢測方法(1)大體觀察嚴(yán)密觀察新西蘭大白兔術(shù)后的一般情況。術(shù)后4、8、12周每組各處死2只動物取材，觀察骨修復(fù)材料的表面變化、骨痂形成、骨缺損修復(fù)情況及周圍組織反應(yīng)。
(2)放射學(xué)檢查A、B、C三組動物于術(shù)后4、8、12周均攝右橈骨正位x光片(投照距離1m，投照條件46KV，50mA，曝光時間0.14s)，D組于術(shù)后12、16周攝片，觀察骨缺損愈合情況。所有照片依據(jù)Yang等(Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.The healing of graftscombining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits.Clin Orthop.1994，298289)的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行放射學(xué)評分。骨缺損部位x線阻射密度測定參照文獻(xiàn)(陽富春，楊志明等，獼猴組織工程化骨制備及其修復(fù)異體骨缺損的放射學(xué)評估，中國臨床康復(fù)20048(2)223-225)。
結(jié)果(1)大體觀察術(shù)后所有兔切口未見紅腫、滲血及濃性分泌物，切口均一期愈合。術(shù)后4周，A組、B組骨缺損處為大量淡紅色質(zhì)硬纖維組織充填，切開纖維組織見其內(nèi)仍有少量膠狀物，橈骨遠(yuǎn)近斷端見大量纖維骨痂，A組骨痂多于B組，C組缺損處稍凹陷，為質(zhì)軟纖維組織生長，缺損區(qū)中心部仍有部分FG殘留，未見明顯骨痂。各組骨缺損周圍肌肉均未見水腫。術(shù)后8周，A、B組骨缺損區(qū)均見大量連續(xù)性骨痂，呈膨脹性生長，其直徑超過正常橈骨；兩者無明顯區(qū)別，材料已完全吸收；C組缺損仍為纖維組織充填，見少量散在骨痂生長。各組周圍組織未見異常反應(yīng)。術(shù)后12周，A組兩只兔骨缺損處均完全愈合，局部為正常有骨膜骨組織，塑形良好，難以區(qū)分?jǐn)喽恕組一只兔缺損完全愈合，塑形好，另一只兔缺損處為新生骨痂充填，斷端模糊。C組見遠(yuǎn)近兩斷端各有部分骨痂生長，骨缺損中間部仍為纖維組織。周圍組織正常。D組術(shù)后16周處死時觀察骨缺損大小基本同前，兩骨端硬化，骨髓腔封閉，纖維組織充填髓腔，無明顯骨痂生長。
(2)X片觀測A組術(shù)后4周骨缺損處呈斑片狀阻射影，斷端仍清晰，兩斷端部密度稍高。術(shù)后8周時兩斷端模糊，骨缺損處為連續(xù)性高密度阻射影，橈骨外部骨痂清晰，缺損處內(nèi)側(cè)尺骨皮質(zhì)密度增高。12周時骨缺損處呈均勻一致高密度影，有7只兔橈骨雙側(cè)骨皮質(zhì)連續(xù)，髓腔貫通，說明術(shù)后12周時骨缺損完全愈合。B組術(shù)后4周骨缺損處為連續(xù)性絮狀阻射影，斷端清晰。術(shù)后8周骨缺損區(qū)模糊，為連續(xù)性高密度阻射影，骨痂量增多。12周時骨缺損消失，5只骨皮質(zhì)連續(xù)，塑形好，髓腔復(fù)通。C組術(shù)后4周缺損區(qū)大部呈透光影，僅斷端周圍見絮狀阻射影。8周時見斷端清晰，缺損區(qū)有小片狀阻射影。術(shù)后12周見缺損區(qū)仍清晰，僅見兩端有少量骨痂生長。D組術(shù)后16周骨缺損區(qū)仍呈透亮影，骨斷端硬化、模糊，說明空白組術(shù)后16周骨缺損均無愈合。
(3)X線片影像學(xué)評分結(jié)果A、B、C組正位照片骨缺損修復(fù)評分從表1可看出，A組和B組在4、8、12周均較C組的放射影像學(xué)評分為優(yōu)(P＜0.05)，但A組和B組相比較無明顯差異(P均＞0.05)。正位片骨缺損部位阻射密度測量值從表2可看出，A、B、C組在4、8、12周的骨缺損阻射密度測量值有顯著性差異(P＜0.05)，在新生骨痂形成的多少和密度方面，A＞B＞C。
表1關(guān)于骨缺損修復(fù)的正位照片評分(X±s，n＝8)

表2關(guān)于骨缺損部位阻射密度測量值(X±s，n＝8)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A、B組在Yang氏放射學(xué)評分及缺損區(qū)骨痂阻射密度測量方面均優(yōu)于單純FG組，而A、B兩組間雖在放射學(xué)評分上無明顯差別，但在骨痂形成質(zhì)量上，A組優(yōu)于B組。從該結(jié)果分析，PRP有明顯的促進(jìn)骨缺損修復(fù)作用，而種子細(xì)胞的添加對增進(jìn)骨痂形成起重要作用。
組織學(xué)切片觀察見實(shí)驗(yàn)組為正常骨組織結(jié)構(gòu)，并有髓腔形成，對照組為纖維組織結(jié)構(gòu)，無明顯成骨。
結(jié)論P(yáng)RP對骨缺損愈合有明顯促進(jìn)作用，復(fù)合PRP的注射型材料與MSCs制備骨修復(fù)材料可修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損。
權(quán)利要求1.一種注射型組織工程骨移植物，包括載體支架(1)和種子細(xì)胞(2)，種子細(xì)胞(2)附著于載體支架(1)上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，其特征在于所述的載體支架(1)為纖維蛋白凝膠，呈纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負(fù)載有自體富血小板血漿即PRP(3)；所述的種子細(xì)胞(2)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種注射型組織工程骨移植物。本實(shí)用新型所述的一種注射型組織工程骨移植物，包括載體支架和種子細(xì)胞，種子細(xì)胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，所述的載體支架為纖維蛋白凝膠，呈纖維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，其上負(fù)載有自體富血小板血漿即PRP；所述的種子細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。本實(shí)用新型既符合經(jīng)典的“細(xì)胞因子+支架材料+種子細(xì)胞”的骨組織工程模式，又可靈活應(yīng)用注射型材料和自體生長因子二者的優(yōu)點(diǎn)，操作簡單，使用方便，可塑性好，可在體內(nèi)任意塑型成損傷部位的形狀，使新骨形狀完全恢復(fù)成原有的生理狀態(tài)，成骨效果明確，可適用于各種不規(guī)則骨缺損、骨不連治療。
文檔編號C12N5/06GK2824875SQ2005200570
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者裴國獻(xiàn), 黃愛文, 金丹, 曾憲利, 胡稷杰, 陳書軍, 張元平 申請人:南方醫(yī)院