專利名稱：用于檢測hiv的引物和探針的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)。本發(fā)明尤其涉及用于檢測HIV-1的寡聚核苷酸和方法。
相關(guān)技術(shù)的描述歸類為HIV的病毒含有RNA作為它們的遺傳信息，并且HIV的傳染力依賴病毒將其遺傳信息插入宿主DNA的能力。為了插入它的遺傳信息并因此成功地感染宿主，HIV病毒必須將其遺傳物質(zhì)(RNA)轉(zhuǎn)化為DNA，這樣HIV遺傳信息能夠與宿主的遺傳信息相容?？紤]到艾滋病(AIDS)的流行，顯而易見的是HIV在將其RNA轉(zhuǎn)化為DNA上是成功的。然而，盡管病毒可以將RNA成功地轉(zhuǎn)化為DNA，該轉(zhuǎn)化很少是精確的。換句話說，病毒RNA的DNA復(fù)制并不是一直準(zhǔn)確的，DNA拷貝與病毒RNA有幾個堿基對的不同。因此，當(dāng)宿主最初被單一病毒顆粒感染時，經(jīng)過幾輪的復(fù)制后，宿主可被遺傳上不同的病毒種群感染。
在每種HIV-1的病毒分類中的是一些種群或亞型。由于高頻率的突變，HIV-1有三個主要的遺傳種群O、N和M。在M種群中，存在亞型A、B、C、D、E、F和G。在每種種群和亞型中，在不同的位置發(fā)現(xiàn)許多突變。由于大多數(shù)美國病例是M種群B亞型，因此通用引物和探針可廣泛應(yīng)用于B亞型。然而，該系統(tǒng)并不適用于其它種群和亞型，并且取決于特定的流行頻率，應(yīng)在世界不同的地方使用不同的系統(tǒng)。這意味著現(xiàn)在還沒有可利用的通用HIV檢測體系。此外，甚至在美國，陰性測試結(jié)果并不能排除非B亞型HIV-1感染的可能性。這對輸血是尤其重要的。值得提及的是，所有這些不一致是基于病毒之間的遺傳變化，以及根據(jù)分類學(xué)理論，許多這些病毒是單一病毒的后代。HIV-1的亞型甚至可進一步分成很多種類。因此，大量的HIV型和亞型證明了HIV的高突變性和HIV基因組的遺傳可變性。
如上面提及的，病毒的遺傳可變性可歸因于病毒將其RNA轉(zhuǎn)化DNA的低效率。關(guān)于病毒遺傳可變性的另一個理論是宿主可被多種不同的HIV種群感染(如上面提及的，可由單一病毒的感染引起)，并且通過病毒遺傳信息的復(fù)制和包裝過程，一種病毒基因組的片斷可與其它病毒基因組的片斷重組。因此，重組基因組包裝后，形成遺傳上不同的病毒。不管病毒突變的方式，清楚的是稱作HIV的病毒具有高易變并因此不斷變化的基因組。這為尋找基于其遺傳信息檢測病毒方法的人提供了不斷改變的靶標(biāo)。
因此，基于HIV的遺傳信息來開發(fā)用于HIV檢測的試劑和方法成為持續(xù)的挑戰(zhàn)。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了基于這些病毒遺傳信息用于檢測HIV(特別是，HIV-1的多種亞型)的試劑。尤其是，試劑形式為引物和探針裝置，該裝置根據(jù)特異和敏感地檢測多種HIV-1亞型的核酸擴增程序來使用。優(yōu)選，此處所提供的引物/探針組包含兩個引物序列和一個探針序列，并且按照反轉(zhuǎn)錄(RT)RCR形式來使用。尤其優(yōu)選的實施方案按照TaqMan PCR形式來使用。
本發(fā)明包含兩個通用引物(HIV-通用-F(正向)和HIV-通用-R(反向))和一個探針(HIV-通用-探針)的多種實施方案，其在HXB2基因組的pol區(qū)域得到鑒別。
檢測HIV的方法通常包含的步驟(a)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴增試劑、至少一種上文提及的引物/探針組和含有HIV靶序列的測試樣本；(b)對混合物采用擴增條件，產(chǎn)生至少一種與靶序列互補的核酸序列拷貝；(c)為了形成包含探針和與靶序列互補的核酸序列的雜交體，將探針與同靶序列互補的核酸序列雜交；以及(d)檢測雜交體，作為測試樣本中HIV存在的指征。
優(yōu)選的RT PCR形式包含與上文提及的相同的步驟，但擴增試劑將包含具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶。另外，根據(jù)此處提供的任意方法，能夠多次重復(fù)步驟(b)以增加靶序列的拷貝數(shù)目。對本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以理解得是通過對反應(yīng)混合物進行熱循環(huán)，可重復(fù)步驟(b)。
尤其優(yōu)選的TaqMan方式包含與上文描述相同的步驟，但引物/探針將包含用報告染料(如FAM、6-羧基熒光素)和猝滅劑染料(如TAMRA、6-羧基-四甲基-羅丹明)標(biāo)記的探針，并且擴增試劑將包含TaqMan聚合酶，其為具有5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。探針被設(shè)計為不能夠延伸，例如通過出現(xiàn)3′磷酸基。當(dāng)TaqMan聚合酶遇到與單鏈DNA雜交的被標(biāo)記探針時，其切割探針并從與猝滅劑染料臨近的空間去除報告染料。這消除了報告染料發(fā)射光譜的猝滅，并能夠測定報告染料的熒光活性。探針的切割和生成物熒光的增加與PCR產(chǎn)物形成量成比例。熒光的變化可相對于循環(huán)數(shù)目來繪圖，以產(chǎn)生擴增圖，如

圖1所顯示的。擴增圖與閾值(定義為在3和15輪循環(huán)之間測量的背景熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍)的交點已知是循環(huán)閾(Ct)。
也可使用其它的實時PCR形式。一種形式使用嵌入染料，如SYBR Green。該染料在結(jié)合雙鏈DNA時提供了強熒光信號，這種信號可定量擴增的DNA。盡管這種方式不允許擴增的序列特異性監(jiān)視，但其能夠不使用任何標(biāo)記探針即可直接定量擴增DNA(參見，如Ponchel等人(2003)Real-time PCR based onSYBR-Green I fluorescenceAn alternative to the TaqMan assay for a relativequantification of gene rearrangements，gene amplifications and micro genedeletions.BMC Biotechnology 318)。也可使用的其它這類熒光染料是SYBRGold、YO-PRO染料和Yo Yo染料。
另一種可以采用的實時RCR形式使用報告探針，探針與擴增子雜交以產(chǎn)生熒光信號。雜交事件不是在探針上分離報告和猝滅部分，就是使它們達(dá)到更接近的位置。探針本身并不降解，并且報告子熒光信號本身并不在反應(yīng)中累積。當(dāng)探針與擴增子雜交時，PCR期間的產(chǎn)物累積通過報告熒光信號的增加來監(jiān)測。該類型的形式包括分子指示標(biāo)(molecular beacons)(Sanjay，T和Russell，IL(1996)Molecular BeaconsProbes that Fluoresce upon Hybridization.NatureBiotech.Vol.14，March，pp303-308)，雙雜交(dual-hybe)探針(Cardullo等人(1988)Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescenceresonance energy transfer.PNAS USA 858790-8794)，曙光(Sunrise)或擴增熒光(Amplifluor)(Nazarenko等人(1997)A closed tube format for amplificationand detection of DNA based on energy transfer.Nucleic Acid Res.252516-2521)，和蝎子(Scorpion)(Whitcombe等人(1999)Detection of PCR productsusing self quenching probing amplicons and fluorescence.NatureBiotech.17804-807)實時PCR分析。
另一種可以采用的實時RCR形式是所謂的“警察(Policeman)”系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，引物包含熒光部分(例如FAM)和可猝滅熒光部分熒光的猝滅劑部分(如TAMRA，其共價結(jié)合到引物3′末端的至少一個核苷酸堿基)。在3味端，引物具有至少一個錯配堿基，并因此在堿基上與核酸樣本不互補。通過使用具有3′→5′核酸外切酶活性聚合酶(例如Pfu酶)的PCR，擴增模板核酸序列以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。通過3′→5′核酸外切酶活性從PCR產(chǎn)物3′末端切割結(jié)合于猝滅部分的錯配堿基。當(dāng)用聚合酶切割共價結(jié)合于猝滅部分的錯配堿基，因此去除猝滅部分對熒光部分的猝滅作用時，在PCR期間的至少一個時間點檢測和/或定量所得熒光。高于背景的熒光顯示合成核酸樣本的存在。該PCR方式詳細(xì)描述于美國專利申請第10/309,691號，其在此引入作為參考。
附圖簡述圖1-2顯示了使用18個模板寡聚核苷酸的TaqMan實時PCR。
圖3顯示了來自HIV血液的擴增。
優(yōu)選實施方案的詳述此處提供的引物/探針組包含兩個引物和至少一個探針。這些引物/探針組可根據(jù)核酸擴增技術(shù)來使用。因此，任何特定引物/探針組中的引物可用于擴增靶序列。在多數(shù)情況下，探針與通過引物之一產(chǎn)生的多拷貝靶序列雜交，并且通常有助于檢測在擴增反應(yīng)期間產(chǎn)生任意拷貝的靶序列。根據(jù)核酸擴增程序檢測HIV-1的M、N和O種群和多種HIV-1亞型的特異性和敏感性，可使用所有的引物/探針序列。在下面的表1中提供了檢測HIV-1亞型的引物和探針。在本發(fā)明中也優(yōu)選使用與表1中列出的序列互補的寡聚核苷酸。
表1模板寡聚核苷酸引物和探針。
如上面所暗示，表1所包含(例如SEQ ID NO1和3)引物可用于引導(dǎo)合成多拷貝的HIV-1靶序列拷貝。剩下的SEQ ID NO2可與表1中出現(xiàn)的引物序列的任何一個或兩個的擴增產(chǎn)物雜交。因此，探針序列也對多種HIV-1亞型具有特異性。優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQ ID NO1、2和3所組成組的序列所包含的至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自SEQ ID NO1、2和3序列的所包含的至少16個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQ IDNO1、2和3所組成組的序列所包含的至少17個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQ ID NO1、2和3所組成組的序列所包含的至少18個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQ ID NO1、2和3所組成組的序列所包含的至少19個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQID NO1、2和3所組成組的序列所包含的至少20個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的實施方案包括從選自由SEQ ID NO1、2和3所組成組的序列所包含的至少21個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
引物序列一般包含脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在另一方面探針序列可包含DNA、RNA或核酸類似物例如不帶電的核酸類似物包括但不限于肽核酸(PNAs)(其公開于國際專利申請WO92/20702)或嗎啉代類似物，其描述于美國專利第5,185,444、5,034,506和5,142,047號，全部在此引入作為參考。這些序列可通過使用多種目前可用的技術(shù)來常規(guī)合成。例如，可使用常規(guī)核苷酸亞磷酰胺化學(xué)和可從Applied Biosystems，Inc，(FosterCity，Calif.)；DuPont(Wilmington，Del.)；或Milligen(Bedford，Mass.)獲得的儀器合成DNA序列。同樣地，當(dāng)期望時，使用本領(lǐng)域公知的方法來標(biāo)記序列，例如描述于美國專利申請第5,464,746、5,424,414和4,948,882號，全部在此引入作為參考。
此處所用的術(shù)語“標(biāo)記”是指具有能被檢測的性質(zhì)或特征的分子或部分。標(biāo)記可被直接檢測，如使用例如放射性同位素、熒光基團、化學(xué)發(fā)光體、酶、膠體顆粒、熒光微粒等；或標(biāo)記可被間接檢測到，如使用例如特定結(jié)合成分?？梢岳斫獾氖?，可直接檢測的標(biāo)記要求另外的組分，例如底物、觸發(fā)劑、光等，使得能夠檢測標(biāo)記。當(dāng)使用可間接檢測標(biāo)記時，他們通常以與“結(jié)合物”的組合來使用。通常結(jié)合物是特定結(jié)合成分，其可附著或偶聯(lián)于可直接檢測的標(biāo)記。用于合成結(jié)合物的偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)是本領(lǐng)域公知的，并且包括例如任何不破壞特定結(jié)合成分的特定結(jié)合性質(zhì)或標(biāo)記的可檢測性質(zhì)的化學(xué)方法和/或物理方法。如此處所用的“特定結(jié)合成分”是指結(jié)合對的成員，即兩種不同的分子，其中一個分子例如通過化學(xué)或物理方法，特定地結(jié)合于另一個分子。除抗原和抗體特定結(jié)合對之外，其它的特定結(jié)合對包括但不意味限于親和素和生物素、半抗原和半抗原的特異性抗體、互補的核酸序列、酶輔助因子或底物與酶等。
如此處所用的術(shù)語“測試樣本”是指懷疑含有HIV靶序列的任何物品。測試樣本是或能得自任意生物來源，如血液、接目鏡液體、腦脊液、奶、腹水、滑液、腹膜液、羊水、組織、發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物等。測試樣本可(i)從來源得到后直接使用或(ii)經(jīng)預(yù)處理改變樣本特征后使用。因此，可以在使用前對測試樣本進行預(yù)處理，如從血液制備血漿、分散細(xì)胞或病毒顆粒、從固體材料制備液體、稀釋粘性液體、過濾液體、蒸餾液體、濃縮液體、滅活感染組分、添加試劑、純化核酸等。
如此處所用的術(shù)語“靶序列”是指使用此處提供的引物/探針組進行檢測、擴增或檢測并擴增的核酸序列。另外，在某些情況下術(shù)語靶序列是指單鏈的時候，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到靶序列實際上是雙鏈的。因此，在靶標(biāo)是雙鏈情形下，本發(fā)明的引物序列將擴增靶序列的雙鏈。
如早先提及的，按照本領(lǐng)域公知的核酸擴增方法，任何特定引物/探針組的引物序列(以其自身或與另外的寡聚核苷酸)可用作擴增引物。這些反應(yīng)包括，但不意味著限定，描述于美國專利第4,683,195和4,683,202號的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、描述于EP-A-320 308的連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和描述于美國專利第5,427,930，號的缺口LCR(GLCR)，在此引入其全部作為參考。一般地，這些示范的擴增反應(yīng)產(chǎn)生多重拷貝的DNA靶序列。
根據(jù)本發(fā)明，靶序列可的確是DNA，在另一方面根據(jù)HIV基因組RNA屬性，按照描述于美國專利第5,322,770和5,310,652號(兩專利在此引入作為參考)的“RT-PCR”形式，可使用引物/探針組。簡單地說，RT-PCR方式提供了從RNA靶序列轉(zhuǎn)錄為DNA鏈的方法。從RNA靶轉(zhuǎn)錄的DNA拷貝鏈通常稱作“cDNA”，其然后可用任何上面提及的方法作為擴增的模板。產(chǎn)生cDNA的方法與其它擴增方法(例如PCR)分享了很多雜交和延伸的原理，但其所使用的酶應(yīng)具有反轉(zhuǎn)錄活性。具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶和RT PCR方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。另外，合成cDNA的其它方法也是公知的，其包括美國專利第5,686,272號，其在此引入作為參考。
根據(jù)優(yōu)選實施方案，在“寡聚核苷酸雜交PCR”(在此處有時稱作“OHPCR”)擴增反應(yīng)中使用引物/探針組。在優(yōu)選方法中所使用的試劑包含至少一種引物/探針組(此處指定為引物/探針組1-8)，和用于進行擴增反應(yīng)的其它試劑。“用于進行擴增反應(yīng)的其它試劑”或“核酸擴增試劑”包括眾所周知的試劑，可包括但不限于具有聚合酶活性的酶、酶輔助因子(如鎂)、鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和三磷酸脫氧核糖核苷(dNTPs)如脫氧三磷酸腺苷、脫氧三磷酸鳥苷、脫氧三磷酸胞苷和脫氧三磷酸胸苷。
一個優(yōu)選的方法通常包含步驟(a)形成反應(yīng)混合物，該混合物包含核酸擴增試劑、至少一種本發(fā)明的引物/探針組和懷疑含有靶序列的測試樣本；(b)對混合物采用擴增條件，以產(chǎn)生至少一種與靶序列互補的核酸序列拷貝；(c)為了形成包含探針和與靶序列互補的核酸序列的雜交體，將探針與同靶序列互補的核酸序列雜交；以及(d)檢測雜交體，作為測試樣本中HIV存在的指征?？梢岳斫獾氖?，先于步驟(c)通過對反應(yīng)混合物進行熱循環(huán)來重復(fù)上面方法中的步驟(b)10-100次，更典型的是20-60次，這是本領(lǐng)域公知的。
擴增條件一般定義為促進一個或多個核酸序列退火和延伸的條件。本領(lǐng)域眾所周知的是這種退火以可預(yù)見的方式依賴于一些參數(shù)，其包括溫度、離子強度、序列長度、互補性和序列的G:C含量。例如，降低與核酸互補環(huán)境中的溫度會促進退火。對任何給定的序列、解鏈溫度或Tm，可利用任何一些公知的方法進行估計。一般，診斷應(yīng)用使用雜交溫度，該雜交溫度接近于解鏈溫度(即10℃之內(nèi))。離子強度或“鹽”濃度也影響解鏈溫度，因為小的陽離子通過在磷酸二酯骨架上抵消負(fù)電荷，進而傾向于穩(wěn)定雙鏈體的形成。通常鹽濃度取決于陽離子的性質(zhì)和化合價，但其易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。同樣地，高G:C含量和增加的序列長度也已知能夠穩(wěn)定雙鏈體的形成，因為G:C對包含3個氫鍵，而A:T對僅有2個，以及由于較長的序列具有更多的氫鍵將序列保持在一起。因此，通過升高解鏈溫度，高G:C含量和較長序列長度會影響雜交條件。
一旦序列被選擇用于給定的診斷應(yīng)用，G:C含量和長度將是已知的，并且解決精確測量將包括的雜交條件。由于離子強度一般根據(jù)酶活性進行優(yōu)選，因此所剩唯一可變化參數(shù)是溫度。一般，雜交溫度選擇接近引物或探針的Tm或者選擇引物或探針的Tm。因此，獲得合適的用于特定引物/探針組的雜交條件是在本領(lǐng)域技術(shù)人員普通技能范圍內(nèi)。
根據(jù)OH PCR方法，優(yōu)選選擇引物、探針和反應(yīng)條件，使得探針序列具有比引物序列更低的解鏈溫度，這樣通過將反應(yīng)混合物置于擴增條件下，在高于探針Tm的溫度下生成多拷貝的靶序列或其互補物(有時稱作擴增子)。合成這些拷貝后，將其變性，混合物冷卻以能夠在探針和靶標(biāo)或其互補拷貝之間形成雜交體。優(yōu)選，從變性溫度降至探針與單鏈拷貝結(jié)合的溫度的降溫速率為相當(dāng)快，例如約8分鐘至約15分鐘，優(yōu)選少于2分鐘。這樣快速的冷卻有助于多拷貝的靶序列與探針之間形成雜交體，而不是例如擴增子互補鏈之間形成雜交體。
倘若使用探針來檢測引物序列產(chǎn)物，則用捕獲標(biāo)記或檢測標(biāo)記來標(biāo)記引物。探針序列用于與引物序列所產(chǎn)生的序列進行雜交，并且通常與不包括引物序列的序列雜交。與引物序列類似，探針序列也用捕獲標(biāo)記或檢測標(biāo)記來標(biāo)記，需說明的是當(dāng)引物用捕獲標(biāo)記來標(biāo)記時，用檢測標(biāo)記來標(biāo)記探針，反之亦然。檢測標(biāo)記具有與前面所定義的“標(biāo)記”相同的定義，“捕獲標(biāo)記”通常用于從其它擴增試劑中分離延伸產(chǎn)物以及與任意這些產(chǎn)物相關(guān)的探針。特定的結(jié)合成分(如前面所定義)尤其適合于該目的。優(yōu)選根據(jù)本方法所用探針也封閉于3′末端，使得在雜交條件下他們不能延伸。阻止探針延伸的方法是公知的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員的選擇依據(jù)。通常，在探針的3′末端加上磷酸基對阻斷探針的3′末端的延伸是足夠的。
復(fù)制序列/探針雜交體形成之后，在拷貝序列和探針序列上的不同標(biāo)記(即捕獲和檢測標(biāo)記)可用于分離和檢測這些雜交體。優(yōu)選，根據(jù)商業(yè)上可獲得的Abbott LCx.RTM instrumentation(Abbott Laboratories；Abbott Park，111.)所使用的方案來進行檢測。
如前面所討論的，靶序列可以是DNA或靶序列包含于HIV基因組中，因此靶序列可以是RNA形式。在靶序列是部分HIV基因組的情況下，優(yōu)選包含具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶作為部分所謂的核酸擴增試劑，以能夠生成cDNA用于隨后的擴增。根據(jù)該實施方案，引物序列也作為cDNA合成的引物。盡管本發(fā)明考慮了生成cDNA和然后經(jīng)擴增cDNA序列的擴增和檢測的不同步驟，可以理解的是這些步驟可同時在單獨的擴增反應(yīng)混合物中發(fā)生。
可通過常規(guī)的方法分離或去除cDNA產(chǎn)物或者產(chǎn)物。優(yōu)選擴增cDNA產(chǎn)物或者產(chǎn)物?？墒褂糜糜跀U增的任何方法，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈替代擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增和核酸單堿基擴增。優(yōu)選使用PCR。通常，含有用于PCR所有必需成分的反應(yīng)混合物直接加于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。然后使用所用堿基對的特定條件來進行擴增。
擴增后，可使用任意本領(lǐng)域公知的方法來檢測擴增產(chǎn)物，包括，但不限于，瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、比色檢測后在固體支撐物上的捕獲擴增產(chǎn)物、Eci檢測、熒光、放射性同位素檢測和化學(xué)發(fā)光。用于這些檢測方法的試劑為商業(yè)可獲得的如從Molecular Probes、Eugene、Oregon和Ortho ClinicalDiagnostics，Rochester，N.Y.。
本發(fā)明尤其優(yōu)選的一個實施方案包含用本發(fā)明的寡聚核苷酸進行實時定量PCR(TaqMan)。已知的TaqMan分析法描述于Holland等人，PNAS887276-7280(1991)。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物檢測體系中使用具有5′→3′核酸外切酶活性Taq聚合酶，以產(chǎn)生與擴增相伴的特異性檢測信號。將寡聚核苷酸探針引入聚合酶鏈反應(yīng)分析，該探針在3′端無延展性，在5′端標(biāo)記，并設(shè)計為與靶序列雜交。在擴增期間探針對一種聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物鏈的退火產(chǎn)生適合外切酶活性的底物。在擴增期間，具有5′→3′核酸外切酶活性Taq聚合酶降解探針為更小的片斷，使其不同于未降解探針。該方法是敏感和特異的，相比于更繁瑣的方法，其有顯著提高。該方法的方案也描述于Gelfand等人的美國專利第5,210,015號。在此引入Gelfand等人的美國專利第5,210,015號和Holland等人的PNAS 887276-7280(1991)作為參考。
進一步，F(xiàn)isher等人的美國專利第5,491,063號提供了Taqman型分析法。Fisher等人的方法提供了導(dǎo)致用發(fā)光標(biāo)記來標(biāo)記的單鏈寡聚核苷酸探針分解的反應(yīng)，其中在DNA結(jié)合化合物存在下進行反應(yīng)，結(jié)合化合物與標(biāo)記相互作用修正標(biāo)記的發(fā)光。合適的標(biāo)記包括例如FAM、HEM、TET和JOE；羅丹明及其衍生物如Texas Red，ROX和TAMRA；、Lucifer Yellow和香豆素衍生物如7-Me2-N-香豆素-4-乙酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酯和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酯(AMCA)。合適的DNA結(jié)合化合物包括，例如溴化乙錠、吖啶橙、proravine、吖黃素、氟代香豆素(fluorcoumarin)、玫瑰樹堿、道諾霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、二胺乙基苯菲啶、光輝霉素、多吡咯釕、氨茴霉素和所謂的“槽溝結(jié)合劑(groove binder)”如孔雀石綠。本方法利用標(biāo)記探針發(fā)光的變化，該探針由降解的探針產(chǎn)生。本方法應(yīng)用于一般的分析，該分析利用了導(dǎo)致寡聚核苷酸探針分解的反應(yīng)，尤其是應(yīng)用于同類的擴增/檢測方法，其雜交探針伴隨引物延伸而被分解。提供了同類的擴增/檢測方法，其允許同時檢測擴增靶的累積和靶序列的序列特異性檢測。Fisher等人的美國專利第5,491,063號在此引入作為參考。
相對于經(jīng)典的PCR分析法，TaqMan檢測分析法呈現(xiàn)一些優(yōu)點。首先，Taqman分析結(jié)合了PCR的敏感性以及HIV序列中所出現(xiàn)的內(nèi)部寡聚核苷酸序列的雜交。PCR后，不一定在瓊脂糖凝膠上分離樣本，并刪除了隨后的DNA印跡和雜交步驟，這些步驟是驗證PCR產(chǎn)物同一性所必需的?？梢栽趲滋旌笕菀准尤脒@些額外的PCR后確認(rèn)步驟，以進行精確的鑒別。通過使用TaqMan系統(tǒng)，可以在2.5小時內(nèi)完成分析。進一步，在分析步驟中的方法使得能夠有效處理大量樣本并且沒有交叉污染，因此適合于自動操作取樣。結(jié)果是，使用TaqMan分析可在非常短的時間內(nèi)處理大量測試樣本。TaqMan系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是由多元化(multiplexing)的潛力。由于不同的熒光報告染料可用于構(gòu)建探針，因此一些不同的HIV系統(tǒng)可與相同的PCR反應(yīng)聯(lián)合，因此降低了人力成本，如果每個測試單獨進行，將招致這些費用。快速、結(jié)論性數(shù)據(jù)連同標(biāo)記和費用效率的優(yōu)點使得利用本發(fā)明特定引物的TaqMan檢測系統(tǒng)成為監(jiān)測HIV存在高度有益的系統(tǒng)。
本發(fā)明的寡聚核苷酸也能作為用于檢測HIV-1試劑盒的一部分得到提供。該試劑盒包括一種或多種合適的含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的引物/探針組的容器、具有聚合酶活性的酶、三磷酸脫氧核苷酸、以及任選地具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶。通常，至少一種序列含有標(biāo)記，但檢測可能不用它。
下面的實施例將提供對本發(fā)明的進一步說明，但并為了限制本發(fā)明。
實施例1在本研究中，2個通用引物(HIV-通用-F(正向)和HIV-通用-R(反向))和1個探針(HIV-通用-探針)在HXB2基因組中的pol區(qū)域(下文，表3)得到鑒別(下文，表2)。
解凍來自5名HIV患者的400μL冷凍肝素化血液，并應(yīng)用于Leukosorb膜吸附濾板。然后在膜上應(yīng)用在37℃孵育1小時的60μL裂解緩沖液。然后將濾板置于GenePlate的頂端，并以300rpm離心5分鐘來將溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至GenePlate。然后將GenePlate于4℃下孵育過夜。使用裂解緩沖液清洗GenePlate三次后，接著應(yīng)用三次清洗緩沖液，在在GenePlate的孔中合成cDNA。利用上面描述的通用引物或探針，所得cDNA用于TaqMan分析。
使用260個完整的HIV-1和SIVcpz基因組序列來分析所得數(shù)據(jù)。從GenBank、BLAST、PrimerAligner、PrimerExpress和HYBsimulator下載病毒序列數(shù)據(jù)庫(GBVRL)。
表II通用引物和探針
表3HXB2基因組信息(下劃線的序列是通用引物和探針)部位HIVHXB2CG 9719個堿基雙鏈RNA 線性VRL 1999-AUG-19定義I型人類免疫缺陷病毒(HXB2)，完整基因組；HIV1/HTLV-III/LAV相關(guān)基因組登記K03455M38432版本K03455.1 GI1906382關(guān)鍵詞 TAR蛋白；獲得性免疫缺陷綜合癥；完整基因組；env蛋白；gag蛋白；長末端重復(fù)(LTR)，pol蛋白；多聚蛋白；前病毒基因；反轉(zhuǎn)錄酶；反式作用因子來源I型人類免疫缺陷病毒生物I型人類免疫缺陷病毒病毒；類逆轉(zhuǎn)錄病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬，靈長類慢病毒屬組堿基數(shù) 3411a 1772c 2373g 2163t起始1 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca61 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac121 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca181 acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg241 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag301 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg361 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat421 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga481 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct541 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc601 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag661 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg721 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga
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表4用于錯配分析的模板寡聚核苷酸
如圖1-2所顯示，除了第3和17外所有的模板在10fM濃度時均顯示了相似的擴增曲線，其中PCR條件為95℃30秒，50℃退火1分鐘隨后60℃延伸1分鐘，共45個循環(huán)。第3和17模板也得到擴增，盡管這兩個模板顯示微弱的傾斜(圖1)和高Ct值(圖2)。如圖3所顯示，這些引物-探針系統(tǒng)對HIV患者工作良好。
此外，如上面描述的，盡管所提供數(shù)據(jù)得自TaqMan PCR，但這些寡聚核苷酸序列可用于上面描述的其它實時PCR技術(shù)，包括使用嵌入染料(如SYBR Green)的系統(tǒng)、探針與擴增子雜交以產(chǎn)生熒光信號的系統(tǒng)，如分子指示標(biāo)、雙染料探針(dual-hybe probes)、Sunrise或Amplifluor和Scorpion以及Policeman系統(tǒng)。此外這些寡聚核苷酸也可用于其它基因擴增技術(shù)(NASBA和bDNA)。
當(dāng)詳細(xì)和參考具體實施方案來描述本發(fā)明時，顯而易見的是本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下，將對這些實施方案進行多種變化和修飾。
序列表<110>日立化成研究中心公司日立化成工業(yè)株式會社<120>用于檢測HIV的引物和探針<130>HITACHI.062VPC<150>60/534,754<151>2004-01-07<160>27<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>3，10，24<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>6<223>n＝A，G，C，T，or U<221>misc_feature<222>7，9<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>8<223>n＝A，T，or U<221>misc_feature<222>12<223>n＝A，C，T，or U<400>1gcngtnnnnn tncacaattt taanagaa28<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列
<221>misc_feature<222>17，19，22<223>n＝G or C<221>misc_feature<222>8，11<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>12，21<223>n＝A，G，T，or U<221>misc_feature<222>15<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>16，18<223>n＝A，T，or U<400>2gggattgngg nntannnnnc nng23<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6，18<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>8<223>n＝A，G，or C<221>misc_feature<222>11<223>n＝A，T，or U<221>misc_feature<222>15，17，20<223>n＝A or G<400>3cgggtntntt ncagngnnan c21<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T<400>4gcagtattna tncacaattt taaaagaa 28<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T<400>5gcagtgttna tncacaattt taaaagaa 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T<400>6gcagtattna tncacaattt taagagaa28<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T<400>9gcagtcttng tncacaattt taaaagaa 28<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T<400>10gcagtattng tncacaattt taaaagaa 28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>9，12<223>n＝C or T
<400>11gcagtgcana tncacaattt taaaagaa28<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<221>misc_feature<222>12<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>17<223>n＝G or C<400>14gggattgggg gntatantgc agg 23
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<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<221>misc_feature<222>12<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>17<223>n＝G or C<400>16gggattgggg gntacantgc ggg 23<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<221>misc_feature<222>12<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>17<223>n＝G or C<400>17gggattgggg antacantgc agg 23
<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<221>misc_feature<222>12<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>17<223>n＝G or C<400>18gggattgagg gntacantgc agg 23<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G<400>19cgggtntatt acagngacag c 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G
<400>20cgggtntgtt acagngacag c21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G<400>21cgggtntatt acagngacaa c 21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G<400>22cgggtntatt acagnggcag c21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G
<400>23cgggtntatt tcagngacag c21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G<400>24cgggtntatt acagngatag c21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<221>misc_feature<222>6<223>n＝C or T<221>misc_feature<222>15<223>n＝A or G<400>25cgggtncatt acagngatag c21<210>26<211>9719<212>DNA<213>I型人類免疫缺陷病毒<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>26tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg 240agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag 660cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa 840aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca 900agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt 960agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca 1020ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc 1080aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa 1140gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac 1200atccaggggc aaatggtaca tcaggccata tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa 1260gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa gtgataccca tgttttcagc attatcagaa 1320ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc 1380atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatag agtgcatcca 1440gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagca 1500ggaactacta gtacccttca ggaacaaata ggatggatga caaataatcc acctatccca 1560gtaggagaaa tttataaaag atggataatc ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat 1620agccctacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgta 1680gaccggttct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg 1740acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcattg 1800ggaccagcgg ctacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtagg aggacccggc 1860cataaggcaa gagttttggc tgaagcaatg agccaagtaa caaattcagc taccataatg 1920atgcagagag gcaattttag gaaccaaaga aagattgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa 1980gaagggcaca cagccagaaa ttgcagggcc cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga 2040aaggaaggac accaaatgaa agattgtact gagagacagg ctaatttttt agggaagatc 2100tggccttcct acaagggaag gccagggaat tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc 2160ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2220ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2280tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2340atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2400ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2460aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2520tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2580aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa 2640taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaga tggaaaagga agggaaaatt tcaaaaattg 2700ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat 2760ggagaaaatt agtagatttc agagaactta ataagagaac tcaagacttc tgggaagttc 2820aattaggaat accacatccc gcagggttaa aaaagaaaaa atcagtaaca gtactggatg 2880tgggtgatgc atatttttca gttcccttag atgaagactt caggaagtat actgcattta 2940ccatacctag tataaacaat gagacaccag ggattagata tcagtacaat gtgcttccac 3000agggatggaa aggatcacca gcaatattcc aaagtagcat gacaaaaatc ttagagcctt 3060ttagaaaaca aaatccagac atagttatct atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat 3120ctgacttaga aatagggcag catagaacaa aaatagagga gctgagacaa catctgttga 3180ggtggggact taccacacca gacaaaaaac atcagaaaga acctccattc ctttggatgg 3240gttatgaact ccatcctgat aaatggacag tacagcctat agtgctgcca gaaaaagaca 3300gctggactgt caatgacata cagaagttag tggggaaatt gaattgggca agtcagattt 3360acccagggat taaagtaagg caattatgta aactccttag aggaaccaaa gcactaacag 3420aagtaatacc actaacagaa gaagcagagc tagaactggc agaaaacaga gagattctaa 3480aagaaccagt acatggagtg tattatgacc catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga 3540agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa 3600caggaaaata tgcaagaatg aggggtgccc acactaatga tgtaaaacaa ttaacagagg 3660
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<223>合成的寡聚核苷酸探針序列
<221>misc_feature<222>12<223>n＝A or G<221>misc_feature<222>17<223>n＝G or C<400>27gggattgggg gntacanacc tgg 2權(quán)利要求
1.一種分離出的寡聚核苷酸，其具有來自SEQ ID NO1、2或3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的序列。
2.一種用于檢測存在HIV的方法，所述的方法包括a)提供核酸樣本；b)使用至少1種權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸作為引物，在所述的核酸樣本中擴增HIV的靶核酸序列；c)檢測HIV靶序列擴增產(chǎn)物的存在以作為HIV存在的指標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述的擴增步驟使用至少1種具有來自SEQ ID NO1或其互補序列至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸，和至少1種具有來自SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸，作為引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述的檢測步驟包含與靶核酸序列雜交，其中所述靶核酸序列為至少一種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中的至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包含提供PCR反應(yīng)混合物，其中所述混合物含有所述的核酸樣本；一對寡核酸引物，其為至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸探針，其能夠與所述靶核酸序列的區(qū)域雜交；其中所述寡聚核苷酸探針與同所述寡聚核苷酸引物結(jié)合的所述靶核苷酸序列雜交，所述的寡聚核苷酸探針被發(fā)光標(biāo)記共價標(biāo)記，所述的核酸結(jié)合化合物能夠修改所述標(biāo)記的發(fā)光，并且在所述反應(yīng)混合物中測量所述標(biāo)記的發(fā)光。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包含提供PCR反應(yīng)混合物，混合物包含所述的核酸樣本；一對寡聚核苷酸引物，其為至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸探針，其能夠與所述靶核苷酸序列的區(qū)域雜交；其中在PCR條件下處理PCR反應(yīng)混合物，并且具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶切割與靶核苷酸序列雜交的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進一步包含提供PCR反應(yīng)混合物，混合物包含所述的核酸樣本；一對寡聚核苷酸引物，其為至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；核酸聚合酶；和與雙鏈DNA結(jié)合時會發(fā)光的標(biāo)記；其中在PCR條件下處理PCR反應(yīng)混合物，并在所述反應(yīng)混合物中測量所述標(biāo)記的發(fā)光。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包含提供PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含所述的核酸樣本；一對寡聚核苷酸引物，其位至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；和具有3′→5′核酸酶活性的核酸聚合酶；其中在PCR條件下處理PCR反應(yīng)混合物，并且具有3′→5′核酸酶活性的核酸聚合酶切割至少一個所述寡聚核苷酸引物3′末端的核苷酸。
9.一種使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在樣本中檢測HIV核苷酸序列的方法，其中該工藝包括(a)提供PCR反應(yīng)混合物，其包含所述的核酸樣本；一對寡聚核苷酸引物，其為至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸探針，其能與所述靶核苷酸的區(qū)域雜交；其中所述寡聚核苷酸探針與同所述寡聚核苷酸引物結(jié)合的所述靶核苷酸序列雜交，并且所述的寡聚核苷酸探針被發(fā)光標(biāo)記共價標(biāo)記；(b)在所述的反應(yīng)混合物中測量所述標(biāo)記的發(fā)光；(c)在PCR條件下處理PCR反應(yīng)混合物，其中具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶切割與靶序列雜交的探針；(d)在所述的反應(yīng)混合物中測量所述標(biāo)記的發(fā)光；和(e)測量是否所述的靶序列在步驟(b)中測量的發(fā)光與步驟(d)中測量的發(fā)光之間存在差別。
10.一種試劑盒，其包含a)至少1種具有來自SEQ ID NO1、2或3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；和b)用于擴增靶序列核苷酸的試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其包含至少1種具有來自SEQID NO1或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；至少1種具有來自SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其包含至少1種具有來自SEQID NO1或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；至少1種具有來自SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其包含至少1種具有來自SEQID NO1或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其包含至少1種具有來自SEQID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸；至少1種具有來自SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其還包含(a)PCR反應(yīng)混合物，其包含核酸樣本，其為一對至少1種具有來自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸引物；(b)具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和(c)至少1種具有來自SEQ ID NO2或其互補序列中至少15個連續(xù)核苷酸的寡聚核苷酸探針，其能與靶核苷酸的區(qū)域雜交。
全文摘要
此處提供了在測試樣本中用于檢測HIV(HIV－1)的引物/探針組。根據(jù)核酸擴增法，包括PCR、實時定量PCR或RT－PCR，使用該引物/探針組。該引物/探針組也可以試劑盒和其它試劑一起的形式提供，以用于核酸擴增反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/68GK1910289SQ200580002132
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月7日
發(fā)明者三橋?qū)⑷?申請人:日立化成研究中心公司, 日立化成工業(yè)株式會社