專利名稱：生產(chǎn)1,2－丙二醇的進(jìn)化微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備用來(lái)生產(chǎn)1，2-丙二醇的進(jìn)化微生物的新方法，由此獲得的進(jìn)化微生物和其用于制備1，2-丙二醇的用途。
背景技術(shù)：
1，2-丙二醇或者丙二醇，是一種三碳二元醇，一種廣泛應(yīng)用的化學(xué)制品。它是不飽和聚酯樹脂、液態(tài)去污劑、冷卻劑、防凍劑和用于航空器的去冰流質(zhì)中的組分。自從1993-1994年以來(lái)，作為比丙烯衍生物更具毒性的乙烯衍生物的替代品，丙二醇的使用量逐漸增加。
目前，1，2-丙二醇主要通過(guò)使用氧化丙烯水合工藝的化學(xué)方法來(lái)生產(chǎn)，這種方法消耗大量的水。氧化丙烯可以通過(guò)兩種方法生產(chǎn)，一種方法使用表氯醇，另一種方法使用氫過(guò)氧化物。兩種途徑都使用毒性大的物質(zhì)。另外，氫過(guò)氧化物途徑產(chǎn)生副產(chǎn)物，如叔丁醇和1-苯乙醇。為了使丙烯的生產(chǎn)更有利，必須找到使用這些副產(chǎn)物的方法?；瘜W(xué)途徑通常產(chǎn)生外消旋的1，2-丙二醇，然而，兩種立體異構(gòu)體(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中的每一種對(duì)于特定應(yīng)用都是值得關(guān)注的。
化學(xué)合成1，2-丙二醇的這些缺點(diǎn)使得生物合成的替代方法變得有吸引力。幾種微生物能夠從諸如葡萄糖或木糖的糖通過(guò)糖酵解途徑自然代謝產(chǎn)生(S)或(R)1，2-丙二醇，或者從脫氧己糖產(chǎn)生(S)1，2-丙二醇(Cameron D.C.et al.(1998)Biotechnol.Prog.)。具有最好表現(xiàn)的微生物包括楔形梭菌(Tran Din K.et al.1986)和熱解糖梭菌(Altaras N.E & Cameron D.C.2001)。后者能夠發(fā)酵幾種類型的糖生成(R)1，2-丙二醇，產(chǎn)量為每消耗一克葡萄糖生成0.13-0.28克1，2-丙二醇。尚未鑒定到這兩種微生物中負(fù)責(zé)合成1，2-丙二醇的酶，可用基因工具的缺乏限制了對(duì)它們性能的改良。另外，盡管大腸桿菌不能天然產(chǎn)生1，2-丙二醇，但是它擁有產(chǎn)生1，2-丙二醇所必需的所有基因。當(dāng)前，1，2-丙二醇必須從甲基乙二醛合成，甲基乙二醛是一種即使在低濃度也對(duì)細(xì)胞高度有毒的物質(zhì)。另外，使用遺傳修飾過(guò)的大腸桿菌菌株來(lái)生產(chǎn)1，2-丙二醇的方法已經(jīng)被介紹過(guò)，特別是在US 6 303 352，US 6 087 140和WO 98/37204中。具體而言，這些方法通過(guò)將基因克隆到質(zhì)粒中來(lái)超表達(dá)一種或幾種參與代謝產(chǎn)生1，2-丙二醇途徑的酶，因此需要抗生素作為一種選擇壓力。為了改善菌株的性能，還刪除某些內(nèi)源基因(例如見Altaras N.E.&Cameron D.C.(2002)Biotechnol.Prog.16，940-946Altaras N.E.&Cameron D.(1999)Appl.Env.Microb.，65，1180-1185)。
直到今天，還沒有描述過(guò)使用進(jìn)化的微生物去共合成兩種有用產(chǎn)物1，2-丙二醇和丙酮的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種制備一種進(jìn)化微生物菌株的方法，這種微生物用于通過(guò)代謝簡(jiǎn)單的碳源來(lái)生產(chǎn)1，2-丙二醇，這種方法包括在選擇壓力下在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)起始細(xì)菌菌株，所述起始細(xì)菌菌株缺失tpiA基因并缺失參與甲基乙二醛(丙醛)向乳酸轉(zhuǎn)化的至少一個(gè)基因，以使所述起始菌株中負(fù)責(zé)DHAP向甲基乙二醛、隨后向1，2-丙二醇生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)基因向具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的修飾基因進(jìn)化，然后選擇和分離具有所述改良“1，2-丙二醇合酶”活性的該進(jìn)化微生物菌株。
tpiA基因編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶，該酶催化DHAP轉(zhuǎn)化成3-磷酸甘油醛。刪除該基因的目的是為了確保合成足夠量的甲基乙二醛。理論上，tpiA基因的刪除必將保證細(xì)胞代謝的50％的葡萄糖碳被分配用于從二羥基丙酮磷酸制備甲基乙二醛。
刪除參與甲基乙二醛向乳酸轉(zhuǎn)化的至少一個(gè)基因的目的是為了抑制甲基乙二醛轉(zhuǎn)化成乳酸，以至于現(xiàn)存的和起始菌株產(chǎn)生的、以及所得進(jìn)化菌株產(chǎn)生的甲基乙二醛被所述菌株的細(xì)胞機(jī)構(gòu)基本上用來(lái)制備1，2-丙二醇。
參與甲基乙二醛向乳酸轉(zhuǎn)化的基因可以是編碼乙二醛酶I的gloA基因(催化從甲基乙二醛合成乳酰谷胱甘肽)，或者是編碼呋喃葡烯糖(lactaldehyde)脫氫酶的aldA和aldB基因(催化從(S)呋喃葡烯糖合成(S)乳酸)。優(yōu)選從起始菌株中刪除所有三個(gè)基因gloA、aldA和aldB。
對(duì)起始菌株進(jìn)行的另外一種有益修飾包括抑制消耗NADH作為還原當(dāng)量的天然葡萄糖發(fā)酵途徑，以消除與1，2-丙二醇生成競(jìng)爭(zhēng)的代謝路徑。
具體而言，有益的是刪除編碼乳酸脫氫酶(催化從丙酮酸合成乳酸)的基因ldhA，和編碼乙醇乙醛脫氫酶(催化從乙酰-CoA合成乙醇)的基因adhE。
相似的，有可能使微生物厭氧使用丙酮酸脫氫酶復(fù)合物從丙酮酸生成乙酰-CoA和NADH。這能夠通過(guò)刪除編碼丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB來(lái)實(shí)現(xiàn)。
因此在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，起始菌株還缺失ldhA、pflA、pflB和adhE基因中的一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選缺失ldhA、pflA、pflB和adhE所有四個(gè)基因。
更有益的是，根據(jù)本發(fā)明的起始菌株也將包含編碼有利于將丙酮酸厭氧代謝為乙酸的酶的至少一個(gè)基因。
優(yōu)先的是，所述酶有利于將丙酮酸厭氧代謝生成乙酰-CoA和NADH。更優(yōu)選的是，這種酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物。
有益的是，所述的編碼有利于將丙酮酸厭氧代謝成乙酸的酶的基因?qū)ADH的抑制作用的敏感性降低。
這種基因可以是編碼內(nèi)源蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因，或者是編碼內(nèi)源或外源酶的外源或異源基因。
對(duì)于編碼對(duì)NADH的抑制作用敏感的內(nèi)源蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化方法使得可以選擇具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的菌株，其中所述的編碼有利于將丙酮酸厭氧代謝成乙酸的酶的基因編碼一種進(jìn)化酶，它對(duì)NADH的抑制作用的敏感性降低。
根據(jù)發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，可以將異源基因?qū)肫鹗季?，該基因編碼對(duì)對(duì)NADH的抑制作用的敏感性降低的酶，或者編碼敏感性酶，然后通過(guò)實(shí)施根據(jù)發(fā)明的進(jìn)化方法使得其不那么敏感。
此外，同樣有益的是刪除編碼參與ED途徑的第一個(gè)酶即6-磷酸葡萄糖酸脫水酶的基因edd，以阻止葡萄糖直接代謝生成3-磷酸甘油醛和丙酮酸，從而誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)化生成1，2-丙二醇和乙酸。
有利的是，將編碼一個(gè)或更多參與乙酰-CoA和乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的酶的一個(gè)或更多異源基因?qū)胂惹案鶕?jù)發(fā)明的進(jìn)化方法獲得的進(jìn)化菌株中，來(lái)獲得經(jīng)修飾的進(jìn)化菌株。
該新的修飾方法使得生產(chǎn)1，2-丙二醇和有用的副產(chǎn)物丙酮變得可能。此外，這種修飾方法具有改善1，2-丙二醇生產(chǎn)性能的優(yōu)點(diǎn)。乙酸在低濃度條件下(15g/l)是細(xì)菌生長(zhǎng)抑制物，在厭氧條件下快速的阻止恒化生長(zhǎng)菌株性能的進(jìn)化。
在恒化生長(zhǎng)期間，向進(jìn)化菌株導(dǎo)入編碼催化乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的酶的基因使殘留乙酸濃度降低。產(chǎn)生丙酮，與乙酸相比沒有不那么抑制生長(zhǎng)。因此有利于菌株的生長(zhǎng)和1，2-丙二醇的產(chǎn)生。
有益的是，編碼一個(gè)或多個(gè)參與乙酰-CoA和乙酸轉(zhuǎn)化的酶的異源基因來(lái)源于丙酮丁酸羧桿菌。編碼一個(gè)或多個(gè)參與乙酰-CoA和乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的酶的基因能以染色體的或染色體外的方式表達(dá)。對(duì)于染色體方式，借助本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組方法將一個(gè)或多個(gè)拷貝引入基因組。對(duì)于染色體外的方式，基因能被不同類型的質(zhì)粒攜帶，這些質(zhì)粒在復(fù)制起源、拷貝數(shù)和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面有所不同。它們能以1-5個(gè)拷貝、或20個(gè)拷貝或者超過(guò)500個(gè)拷貝存在，對(duì)應(yīng)于低拷貝數(shù)和嚴(yán)緊復(fù)制型質(zhì)粒(pSC101、RK2)，低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pACYC、pRSF1010)或高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSKbluescript II)?；蚰軌蛲ㄟ^(guò)使用不同強(qiáng)度的可誘導(dǎo)或不可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)。這些可以作為例子使用的啟動(dòng)子有Ptrc、Ptac或者Plac，或者其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的啟動(dòng)子。穩(wěn)定或者去穩(wěn)定mRNA(Carrier&Keasling(1998)Biotechnol.Prog.，15，58-64)或者蛋白質(zhì)(例如GSTtags，Amersham Biosciences)的元件可以增加或者降低目的基因的表達(dá)，。
在一個(gè)發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，先前獲得的修飾進(jìn)化的菌株在選擇壓力條件下，在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以使所述修飾進(jìn)化菌株中參與乙酰-CoA和乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的一個(gè)或更多基因向改良“丙酮合酶活性”進(jìn)化。然后，選擇和分離具有改良“1，2-丙二醇合酶活性”和改良“丙酮合酶活性”的第二代進(jìn)化菌株。
本發(fā)明還涉及根據(jù)發(fā)明上面、下面和實(shí)施例中描述的起始菌株。
發(fā)明也涉及具有改良“1，2-丙二醇合酶活性”的進(jìn)化菌株，它能夠使用發(fā)明中上面、下面和實(shí)施例中描述的方法獲得，包括額外具有“改良丙酮合酶活性”的第二代進(jìn)化菌株。
最后，發(fā)明涉及制備1，2-丙二醇的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化菌株在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后回收生成的1，2-丙二醇和丙酮共產(chǎn)物，如果需要進(jìn)行純化。
根據(jù)本發(fā)明的起始修飾和進(jìn)化菌株可以是原核生物或者真核生物，它們能夠被轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，以使它們生成1，2-丙二醇和可能的丙酮。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠基于細(xì)胞和分子生物學(xué)的公知常識(shí)選擇所述的微生物，如果必要的話可以鑒定這些微生物中對(duì)應(yīng)于上述提及的大腸桿菌基因的基因。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“微生物菌株”是表示一類屬于同一物種的微生物，包括該物種的至少一種微生物。因此，所描述的菌株特征適用于該菌株的每一微生物。相呼應(yīng)的是，所描述的該菌株的任何一個(gè)微生物的特征適用于該菌株的所有微生物。
根據(jù)本發(fā)明方法修飾的微生物可以是細(xì)菌、酵母菌或真菌，尤其是以下任何菌種曲霉屬、桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏桿菌屬、葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、釀酒酵母屬(Saccharomycessp.)、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、念珠菌屬。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌菌株是埃希氏桿菌屬菌株，具體是大腸桿菌菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌菌株是棒狀桿菌屬菌株，具體是谷氨酸棒狀桿菌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株是釀酒酵母屬，具體是釀酒酵母。
在發(fā)明的上面、下面和在實(shí)施例中描述的菌株都是大腸桿菌。因此，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化菌株中可以被刪除或過(guò)表達(dá)的基因主要使用大腸桿菌的基因命名。然而，根據(jù)本發(fā)明，這種命名具有更通常的含義，涵蓋其它微生物中的相應(yīng)基因。使用GenBank中大腸桿菌基因的參考序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠判定大腸桿菌以外的細(xì)菌菌株的等同基因。
確定同源序列和它們的同源百分率的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的，具體包括BLAST程序，它可以在網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov./BLAST/中按照網(wǎng)站中指示的缺省系數(shù)使用?？梢员葘?duì)獲得的序列，例如按照網(wǎng)站中指示的缺省系數(shù)使用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或者M(jìn)ULTALIN程序(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin/pl)進(jìn)行。
使用GenBank給出的已知基因的參考序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定在其它生物如細(xì)菌菌株、酵母、真菌、哺乳動(dòng)物和植物等中的等同基因。使用通過(guò)和來(lái)源于其他微生物的基因進(jìn)行序列比對(duì)確定的共有序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，這種慣常的工作可以容易的進(jìn)行，其中通過(guò)所述簡(jiǎn)并探針可以克隆另一種生物中的相應(yīng)基因。這些慣常的分子生物學(xué)技術(shù)在技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知，例如描述于Sambrook et al.(1989 Molecular cloninga laboratory manual.2ndEd.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York)。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“刪除”表示對(duì)基因活性的抑制，因此被稱為‘刪掉’。這種活性的抑制可以是通過(guò)合適的方法對(duì)相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的鈍化，或者可以是對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的抑制，或者可以是相關(guān)基因的至少一部份被刪除(例如刪除其表達(dá)所必需的部分或全部的啟動(dòng)子區(qū)域)以至于它不能被表達(dá)，或者使表達(dá)產(chǎn)物喪失其功能(例如刪除相關(guān)基因的編碼部分)。優(yōu)選的是，基因的刪除基本上是抑制該基因，該基因可以被選擇標(biāo)記基因置換，所述選擇標(biāo)記基因有利于鑒定、分離和純化根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化菌株。
優(yōu)選通過(guò)同源重組使基因失活(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.(2000)One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，滅活步驟可以如下所述將線性DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞。該片段是從體外獲得，包含基因旁側(cè)的兩個(gè)區(qū)域，和位于這兩個(gè)區(qū)域之間的至少一個(gè)選擇基因(通常是抗生素抗性基因)。因此該片段代表失活基因。已經(jīng)發(fā)生重組事件和整合所導(dǎo)入片段的細(xì)胞通過(guò)鋪在選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來(lái)選擇。選擇發(fā)生雙重重組事件的細(xì)胞，該細(xì)胞中天然基因已經(jīng)被失活基因所置換?？梢允褂藐?yáng)性和陰性選擇系統(tǒng)來(lái)改進(jìn)該方法，以加快雙重重組事件的檢測(cè)。
優(yōu)選用于將這些基因?qū)刖甑姆椒ㄊ请姶┛追?，它是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法。簡(jiǎn)要的說(shuō)，電穿孔步驟可以如下所述將感興趣異源基因克隆到表達(dá)載體中啟動(dòng)子和終止子之間。該載體也具有用來(lái)選擇含有它的細(xì)胞的抗生素抗性基因和在宿主菌株中維持其存在的功能復(fù)制起點(diǎn)。該方法需要制備電感受態(tài)宿主細(xì)胞，然后通過(guò)電穿孔法用載體轉(zhuǎn)化。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)電穿孔法引入的基因優(yōu)選是基因adc、ctfA和B，thl，其分別編碼丙酮丁酸羧桿菌天然丙酮生成途徑的乙酰乙酸羧化酶，輔酶A轉(zhuǎn)移酶和硫解酶。丙酮丁酸羧桿菌被認(rèn)為是一種非常高效的用生物法生產(chǎn)丙酮的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化方法是一種制備進(jìn)化微生物的方法，由此可能用來(lái)修飾代謝途徑，優(yōu)選包括以下步驟a)修飾微生物以獲得起始微生物，使得這種修飾抑制起始微生物在設(shè)定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)所生成或消耗的代謝物的生成或消耗，b)使上述獲得的起始修飾微生物生長(zhǎng)在所述設(shè)定培養(yǎng)基上以使之進(jìn)化，其中設(shè)定培養(yǎng)基也可以含有進(jìn)化所必需的共底物，c)選擇能夠在設(shè)定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的修飾微生物細(xì)胞，如果需要培養(yǎng)基加入共底物。
這類進(jìn)化方法具體描述在專利申請(qǐng)WO 04/076659中，其內(nèi)容并入本文作為參考。
被進(jìn)化的代謝途徑具體是1，2-丙二醇合成途徑，合適時(shí)是丙酮合成途徑。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“設(shè)定培養(yǎng)基”表示含有已知的適于微生物生長(zhǎng)的分子組分的培養(yǎng)基。設(shè)定培養(yǎng)基基本上不含有其生成或消耗被修飾所抑制的代謝物根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“共底物”表示一種物質(zhì)，其可以是有機(jī)的或者無(wú)機(jī)的，和底物不同，參加反應(yīng)并在反應(yīng)中向底物提供其一個(gè)或多個(gè)原子以形成終產(chǎn)物。共底物沒有已知的誘變特征。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“選擇”表示一種培養(yǎng)方法，它可以是持續(xù)的過(guò)程，它以通過(guò)逐漸增加稀釋率的方式實(shí)施，以這種方式，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中只保存那些顯示出與施加的稀釋率相等或更高生長(zhǎng)率的微生物。在這種方法中，被保存的微生物是那些經(jīng)過(guò)修飾不再影響其生長(zhǎng)的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“進(jìn)化基因”表示連接有起始密碼子和終止密碼子的核酸序列，其在選擇后與起始序列至少有一個(gè)核苷酸不同。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“進(jìn)化蛋白質(zhì)”表示選擇后與起始序列至少有一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列(蛋白質(zhì)序列)。
基因和蛋白質(zhì)可以通過(guò)它們的一級(jí)序列鑒定，也可以通過(guò)序列同源性或者限定蛋白質(zhì)類別的序列比對(duì)來(lái)確定。
PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)(序列比對(duì)的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)和內(nèi)部的馬爾可夫模型http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是一個(gè)大規(guī)模的收集蛋白質(zhì)比對(duì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。每個(gè)PFAM可以實(shí)現(xiàn)多重序列比對(duì)，評(píng)估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，估計(jì)蛋白質(zhì)在生物中的分布，鏈接其它數(shù)據(jù)庫(kù)并顯示已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
COGs(蛋白質(zhì)的正向同源組的進(jìn)化簇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)可以通過(guò)比較來(lái)源于代表30個(gè)主要系統(tǒng)進(jìn)化系的43個(gè)全序列基因組的蛋白質(zhì)序列獲得。每個(gè)COG至少?gòu)?個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化系確定，這使得鑒定古老的保守結(jié)構(gòu)域變得可能。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”、“生長(zhǎng)”和“發(fā)酵”可以互換使用，表示細(xì)菌在含有簡(jiǎn)單碳源的合適培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)單碳源”表示可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的可以維持微生物、特別是細(xì)菌正常生長(zhǎng)的任意碳源，它可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。尤其優(yōu)選的簡(jiǎn)單碳源是葡萄糖。
根據(jù)本發(fā)明(發(fā)酵)的微生物培養(yǎng)條件可以很容易由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。具體而言，細(xì)菌發(fā)酵的溫度在20℃到55℃之間，優(yōu)選在25℃到40℃之間，對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌和釀酒酵母優(yōu)選是大約30℃，對(duì)于大腸桿菌是大約34℃。
發(fā)酵通常在具有已知設(shè)定組成的、適于細(xì)菌使用的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的發(fā)酵器中進(jìn)行，所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)基含有至少一種簡(jiǎn)單碳源，如果需要的話還含有產(chǎn)生代謝物所必需的協(xié)同因子。
具體而言，大腸桿菌的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基可以是與以下培養(yǎng)基同樣的或相似的培養(yǎng)基M9培養(yǎng)基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32120-128)、M63培養(yǎng)基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial GeneticsA Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)或例如由Schaefer等(1999，Anal.Biochem.27088-96)定義的培養(yǎng)基一種培養(yǎng)基，具體是下述的基本培養(yǎng)基

用氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到7.4。
*微量元素溶液檸檬酸4g/L，MnSO43g/L，NaCL 1g/L，CoCL20.1g/L，ZnSO40.10g/L，CuSO410mg/L，H3BO310mg/L，NaMoO410mg/L.
近似的，谷氨酸棒狀桿菌的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基也可以是與BMCG培養(yǎng)基(Liebl et al.，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32205-210)或者Riedel等定義的培養(yǎng)基(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3573-583)相同或相似的培養(yǎng)基。
發(fā)酵優(yōu)選在厭氧和恒化條件下進(jìn)行，也就是以固定的稀釋率持續(xù)補(bǔ)料，所說(shuō)的基本生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有固定濃度的碳源，并用氮?dú)饷摎狻?br> 只有當(dāng)殘留碳源的濃度達(dá)到穩(wěn)定并維持穩(wěn)定數(shù)天限制了發(fā)酵的時(shí)候，增加發(fā)酵給料培養(yǎng)基中的碳源濃度。
優(yōu)選的培養(yǎng)模式是恒化培養(yǎng)模式，因?yàn)樗欣谔岣咝揎椌甑纳L(zhǎng)和產(chǎn)生1，2-丙二醇的性能，并允許微生物的分離。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)改良“1，2-丙二醇合酶活性”是表示所有參與DHAP向1，2-丙二醇轉(zhuǎn)化途徑的酶活性得以改良。與相同培養(yǎng)條件下相應(yīng)起始微生物的1，2-丙二醇的產(chǎn)量，進(jìn)化微生物中的改良酶活性導(dǎo)致進(jìn)化微生物產(chǎn)生1，2-丙二醇的量增加。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)改良“丙酮合酶活性”是表示所有參與乙酸和乙酰-CoA向丙酮轉(zhuǎn)化途徑的酶活性得以改良。與相同培養(yǎng)條件下相應(yīng)修飾進(jìn)化微生物相比，第二代進(jìn)化微生物中進(jìn)化的酶活性導(dǎo)致第二代進(jìn)化微生物產(chǎn)生丙酮的量增加。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明方法獲得的進(jìn)化菌株中進(jìn)化基因以及所述進(jìn)化基因所編碼的進(jìn)化蛋白質(zhì)的分離和表征。然后，可以將這些進(jìn)化基因?qū)胨拗魃铮诤线m的調(diào)節(jié)元件控制下，在上述生物中表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的進(jìn)化蛋白質(zhì)。
恒化培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)化微生物尤其是菌株E.coli MG16555 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB性能的改善表明這些生長(zhǎng)條件使得在厭氧條件下選擇功能性內(nèi)源丙酮酸脫氫酶復(fù)合物變得可能，在此條件下可以產(chǎn)生大量的NADH。已知的是，催化丙酮酸生成乙酰-CoA并釋放NADH的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物只在有氧條件下起作用，而在厭氧條件下丙酮酸甲酸裂合酶有功能，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA和甲酸(Snoep J.L.，De Graef M.R.，Westphal A.H.，De Kok A.Teixeira de Mattos M.J.and Neijssel O.M.(1993))。通過(guò)丙酮酸脫羧基產(chǎn)生NADH來(lái)生成1，2-丙二醇的大腸桿菌修飾菌株中，一種修飾是刪除編碼丙酮酸甲酸裂合酶活性的基因pflA和pflB。對(duì)修飾細(xì)胞的唯一可能性是通過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物將丙酮酸代謝為乙酰-CoA，并產(chǎn)生一個(gè)當(dāng)量的NADH。已經(jīng)表征了修飾進(jìn)化菌株的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物，其與野生型菌株的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物相比對(duì)NADH敏感性降低。
本發(fā)明使得選擇在厭氧條件下有功能并通過(guò)將3-磷酸甘油醛氧化為乙酸而產(chǎn)生兩當(dāng)量NADH的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物變成可能。這些NADH當(dāng)量只有通過(guò)將磷酸二羥基丙酮還原生成1，2-丙二醇的途徑才可以被再氧化。對(duì)具有NADH低敏感性的酶復(fù)合物的選擇有利于實(shí)現(xiàn)1，2-丙二醇的高生產(chǎn)率。
本發(fā)明有利于編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中硫辛酰氨脫氫酶的基因lpd突變的選擇(其野生型序列見http://genolist.pasteur.fr/Colibri)。具體而言，已經(jīng)鑒定到使丙氨酸55替換為纈氨酸的點(diǎn)突變的存在。已知該酶與NADH對(duì)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的抑制相關(guān)。這種修飾酶也是本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)。
本發(fā)明可以改善修飾微生物尤其是菌株E.coli MG1655 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的性能，并通過(guò)厭氧恒化培養(yǎng)過(guò)程中的進(jìn)化，改善參與DHAP向1，2-丙二醇的轉(zhuǎn)化途徑的內(nèi)源酶。這些酶的進(jìn)化導(dǎo)致更高的生長(zhǎng)率和更高的1，2-丙二醇終濃度。
優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)化菌株不包括基因gldA的進(jìn)化。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，基因gldA從進(jìn)化菌株中被刪除。


圖1根據(jù)本發(fā)明修飾用來(lái)生產(chǎn)1，2-丙二醇和丙酮的大腸桿菌菌株代謝的圖示文字說(shuō)明LDH乳酸脫氫酶ADH乙醛乙醇脫氫酶PFL丙酮酸甲酸裂合酶PDHc丙酮酸脫氫酶復(fù)合物圖2在葡萄糖上恒化培養(yǎng)過(guò)程中菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的進(jìn)化葡萄糖濃度(圖2A和其它物質(zhì)(圖2B)。
圖3隨NADH濃度濃度增加，野生型菌株和根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化菌株中丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的酶活性的比較。
以下給出的實(shí)施方案的實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但并不限制它的范圍。
實(shí)施例1構(gòu)建經(jīng)葡萄糖發(fā)酵只能產(chǎn)生1，2-丙二醇和乙酸的修飾菌株E.coliMG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
a)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA::cm通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒和刪除大部分相關(guān)基因使基因tpiA失活。所用的這項(xiàng)技術(shù)描述于Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645.
使用兩個(gè)寡核苷酸置換基因tpiA1.DtpiAr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 1)atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCTTAG具有—與基因tpiA(序列4108320-4109087)的序列(4109007-4109087)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://www.genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645)。
2.DtpiAf，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 2)cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與tpiA的序列(4108320-4108400)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
用寡核苷酸DtpiAr和DtpiAf來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒。然后，將得到的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的系統(tǒng)λRed(γ，β，exo)極有利于同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并用寡核苷酸cdh和YIIQ進(jìn)行PCR分析來(lái)檢查抗性盒的插入。
cdh(SEQ ID NO 3)ggtgatgatagttatcgccg(與4107536-4107555序列同源)YIID(SEQ ID NO 4)cgtgccatcgacagcagtcc(與4109599-4109580序列同源)然后除去(eliminate)氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株中，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)處起作用(Cheperanov P.P.&Wackernagel W.(1995)Gene disruption in Escherichia coli.TcRand KmRcassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistancedeterminant，gene，158，9-14)。在42℃連續(xù)培養(yǎng)之后，通過(guò)用前面所用的相同寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢查抗生素抗性盒的缺失。
b)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655 ΔpflAB::cm通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒和刪除大部分相關(guān)基因使基因plfA和plfB失活。所用的這項(xiàng)技術(shù)描述于Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)。
使用兩個(gè)寡核苷酸置換基因plfA和plfB1.DplfB r，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 5)ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG具有—與基因plfB(序列950495-952777)的序列(952235-952315)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645)。
2.DplfA，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 6)gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG具有—與定位在基因plfA(序列949563-950303)上的序列(949470-949550)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)，。
用寡核苷酸pflAB1和pflAB2來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許進(jìn)行同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)用寡核苷酸pflAB1和pflAB2進(jìn)行PCR分析來(lái)檢查抗性盒的插入。
pflAB1(SEQ ID NO 7)agacattaaaaatatacgtgcagctacccg(與948462-948491序列同源)。
pflAB2(SEQ ID NO 8)gtgaaagctgacaacccttttgatctttta(與953660-983689序列同源)。
c)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655 ΔtpiA，ΔplfAB通過(guò)用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)，通過(guò)在菌株MG1655 ΔtpiA中用氯霉素抗性盒置換基因的方法來(lái)刪除基因plfA和plfB。方法有兩步(i)制備菌株MG1655ΔplfAB::cm的噬菌體裂解物；(ii)用該噬菌體裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655 ΔtpiA。
制備噬菌體裂解物—接種100μl的菌株MG1655(ΔplfAB::c)的過(guò)夜培養(yǎng)物到10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
—37℃搖培30分鐘。
—加入100μl在野生菌株MG1655上制備的噬菌體裂解物P1(大約1×109噬菌體/ml)。
—37℃搖動(dòng)3小時(shí)直到所有細(xì)胞被裂解。
—加入200μl氯仿，并渦旋。
—以4500g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片。
—轉(zhuǎn)移上清液到無(wú)菌管中，并加入200μl氯仿。
—在4℃保存裂解物。
轉(zhuǎn)導(dǎo)—將菌株MG1655(ΔtpiA)的5ml LB過(guò)夜培養(yǎng)液以1500g離心10分鐘。
—將細(xì)胞沉淀懸浮在2.5ml的MgSO410mM，CaCl25mM中。
—對(duì)照管100μl細(xì)胞
100μl菌株MG1655(ΔpflAB::cm)的噬菌體P1。
—測(cè)試管100μl細(xì)胞+100μl菌株MG1655(ΔpflAB::cm)的噬菌體P1。
—在30℃培養(yǎng)30分鐘，不振蕩—在每個(gè)試管中加入100μl 1M的檸檬酸鈉，渦旋—加入1ml的LB—在37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)—以7000rpm將管離心3分鐘后，鋪到LB+Cm30μg/ml的皿中。
—37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
菌株的鑒定隨后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，用(i)寡核苷酸pflAB1和pflAB2與(ii)cdh和YIIQ進(jìn)行PCR分析來(lái)檢查含有區(qū)域(pflAB::cm)的插入，并檢測(cè)菌株ΔpflAB::cm中基因tpiA的缺失。所得菌株命名為MG1655Δ(pflAB::cm，ΔtpiA)。
如上所述，隨后去除氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)起作用。連續(xù)在42℃培養(yǎng)之后，用前面所用的相同寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗生素抗性盒的丟失。獲得的菌株命名為MG16555ΔtpiA，ΔpflAB。
d)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔadhE::cm正如前面所示，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)介紹的技術(shù)，通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒和刪除大部分相關(guān)基因使基因adhE失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.DadhEr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 9)atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG具有—與基因adhE(序列1294669-1297344)的序列(1297263-1297343)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.DadhEf，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 10)caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因adhE的序列(1294694-1294774)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸DadhEr和DadhEf從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并用寡核苷酸ychGf和adhECr進(jìn)行PCR分析來(lái)檢查抗性盒的插入。
ychGf(SEQ ID NO 11)ggctcattgcaccaccatccag(與1294357-1294378的序列同源)adhECr(SEQ ID NO 12)gaaaagacgcgctgacaatacgcc(與1297772-1297749的序列同源)e)構(gòu)建菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE如上所述使用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(見步驟c))刪除菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB中的基因adhE。獲得菌株MG1655ΔadhE::cm的噬菌體P1裂解物，并使用該裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA ΔpflAB。使用寡核苷酸ychCf和adhECr檢測(cè)基因adhE的突變，也使用(i)寡核苷酸pflAB1和pflAB2和(ii)cdh和YIIQ檢測(cè)菌株ΔadhE::cm中基因pflA和B以及tpiA的刪除，以檢測(cè)抗生素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子。
如前所述，隨后去除氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)處起作用。連續(xù)在42℃培養(yǎng)之后，使用前面同樣的寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗生素抗性盒的丟失。獲得的菌株命名為MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE。
f)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana如上所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE中的基因ldhA(對(duì)應(yīng)于1439878-1440867)失活。用Clark D.P.(Bunch P.K.，Mat-Jan F.and Clark D.P.(1997)The ldhA gene encoding the fermentative lactatedehydrogenase of Escherichia coli.Microbiology，143，187-195.)提供的菌株E.coliK12NZN11 Δpfl::cam，ldhA::kana獲得噬菌體裂解物。使用菌株E.coli K12 NZN11Δpfl::cam，ldhA::kana的噬菌體裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE。用卡那霉素選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)子，使用寡核苷酸hslJC和ldhAC2檢測(cè)基因ldhA中卡那霉素盒的插入。
HslJC(SEQ ID NO 13)gccatcagcaggcttagccg(與1439345-1439767序列同源)ldhAC2(SEQ ID NO 14)gggtattgtggcatgtttaaccg(與1441007-1441029序列同源)獲得的菌株命名為MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana.
g)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔgloA::cm按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)介紹的技術(shù)，插入氯霉素抗生素抗性盒并刪除大部分相關(guān)基因使基因gloA失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.GLOAD f，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 15)atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因gloA(序列1725861-1726268)的序列(1725861-1725941)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.GLOAD R(SEQ ID NO 16)ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG—與基因gloA(序列1725861-1726268)的序列(1726188-1726268)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸GLOADr和GLOADf從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，用寡核苷酸Nem AC d和RntCr進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗性盒的插入。
NemAQd(SEQ ID NO 17)gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg(與1725331-1725361序列同源)Rnt Cr(SEQ ID NO 18)gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg(與1726765-1726795序列同源)h)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA如上所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana中的基因gloA失活。獲得菌株MG1655ΔgloA::cm的噬菌體P1裂解物，并使用這種裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana。通過(guò)使用寡核苷酸NemAQd和RntCr檢測(cè)基因gloA的突變，也使用寡核苷酸pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr以及hslJC和ldhAC2檢測(cè)菌株ΔgloA::cm的基因pflA與B、tpiA、adhE和ldhA的刪除的方法來(lái)驗(yàn)證氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)株。
如上所述，隨后去除氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒FRT位點(diǎn)處起作用。在42℃連續(xù)培養(yǎng)之后，使用前面同樣的寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗生素抗性盒的丟失。獲得的菌株命名為MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA。
i)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655 ΔaldA::cm按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，插入氯霉素抗生素抗性盒并刪除大部分相關(guān)基因使基因aldA失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.AldA Df，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 19)atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因aldA(序列1486256-1487695)的序列(1486256-1486336)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.aldADr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 20)ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG—與基因aldA(序列1486256-1487695)的序列(1487615-1487695)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸AldA Dr和aldADf從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，用寡核苷酸Ydc FCf和gapCCr進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗性盒的插入。
Ydc FCf(SEQ ID NO 21)tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg(與1485722-1485752序列同源)
gapCCr(SEQ ID NO 22)cacgatgacgaccattcatgcctatactggc(與1488195-1488225序列同源)h)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA如上所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA中的基因aldA失活。獲得菌株MG1655ΔaldA::cm的噬菌體P1裂解物，并使用這種裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA。使用寡核苷酸Ydc FCf和gapCCr檢測(cè)基因aldA的突變，也使用寡核苷酸NemAQd和Rnt Cr，pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr，以及hslJC和ldhAC2分別檢測(cè)菌株ΔaldA::cm的基因gloA、plfA和B、tpiA、adhE的刪除的方法來(lái)驗(yàn)證氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)株。
如上所述，隨后去除氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒FRT位點(diǎn)處起作用。在42℃連續(xù)培養(yǎng)之后，使用前面同樣的寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗生素抗性盒的丟失。獲得的菌株命名為MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。
g)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔaldB::cm按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，插入氯霉素抗生素抗性盒并刪除大部分相關(guān)基因使基因aldB失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.AldB Df，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 23)tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因aldB(序列3752603-3754141)的序列(3752603-3752683)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.AldBDr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 24)atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTCCTTAG具有—與基因aldB(序列3752603-3754141)的序列(3754061-3754141)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸AldB Dr和aldBDf從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)用寡核苷酸aldB Cf和YiaYCr進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗性盒的插入。
aldB Cf(SEQ ID NO 25)catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc(與3752057-3752095序列同源)YiaYCr(SEQ ID NO 26)tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg(與3754644-3754674序列同源)h)構(gòu)建修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB如上所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，aldA中的基因aldB失活。獲得菌株MG1655ΔaldB::cm的噬菌體P1裂解物，并使用這種裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。使用寡核苷酸aldB Cf和YiaYCr檢測(cè)基因aldA的突變，也使用寡核苷酸NemAQd和Rnt Cr，pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr，hslJC和ldhAC2以及Ydc FCf和gapCCr分別檢測(cè)菌株ΔaldBA::cm的基因gloA、pflA和B、tpiA、adhE、aldA的刪除的方法來(lái)驗(yàn)證氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)株。
如上所述，隨后去除氯霉素抗性盒。然后，將攜帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入重組菌株，所述FLP重組酶在氯霉素抗性盒FRT位點(diǎn)處起作用。在42℃連續(xù)培養(yǎng)之后，使用前面同樣的寡核苷酸進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗生素抗性盒的丟失。獲得的菌株命名為MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
實(shí)施例2恒化培養(yǎng)下修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的培養(yǎng)和進(jìn)化為了優(yōu)化菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB代謝葡萄糖生成1，2-丙二醇的產(chǎn)出，菌株在補(bǔ)充有硝酸鈉和酵母提取物的基本培養(yǎng)基中在厭氧條件下恒化培養(yǎng)數(shù)周。
在培養(yǎng)起始階段，在給料培養(yǎng)箱中，葡萄糖的起始濃度是20g/l，稀釋率是0.04h-1，維持持續(xù)的氮?dú)饬鱽?lái)確保厭氧條件。細(xì)胞濃度和1，2-丙二醇以及乙酸的產(chǎn)量低。在培養(yǎng)數(shù)周后，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物濃度增加，殘余葡萄糖濃度和穩(wěn)定的產(chǎn)物濃度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(圖2)實(shí)施例3表征對(duì)NADH低敏感性的進(jìn)化丙酮酸脫氫酶復(fù)合物通過(guò)在體外對(duì)進(jìn)化丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDHc)進(jìn)行活性分析，和通過(guò)對(duì)進(jìn)化的PDHc中和野生型PDHc中的編碼硫辛酰胺脫氫酶的基因(lpd)序列進(jìn)行比較，來(lái)驗(yàn)證這種酶向NADH低敏感性的進(jìn)化。
a)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的酶活性分析使用Schwartz和Reed描述的方法(Schwartz E.R.& Reed L.J.(1970)Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli，Biochemistry，6，1434-1439)在體外對(duì)菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的PDHc酶活性進(jìn)行分析。
從恒化發(fā)酵物中取出100ml等份的細(xì)胞培養(yǎng)物放入事先在厭氧罩中脫氣的瓶中。將細(xì)胞懸浮液以6000rpm離心10分鐘。將沉淀重懸在含有50mM磷酸鉀緩沖液、pH7.9，0.5mM焦磷酸硫胺素的大約100ml的溶液中，再次以6000rpm離心10分鐘。在相同的條件再洗滌一次。將細(xì)胞沉淀重懸在800μl緩沖液中。使用超聲波儀通過(guò)四次處理循環(huán)(以30％處理30秒)破碎細(xì)胞懸浮液，每次循環(huán)間隔兩分鐘冰浴。以13,400rpm離心5分鐘去除細(xì)胞碎片。上清液是無(wú)細(xì)胞粗提物。在無(wú)細(xì)胞提取物中存在的鹽可能干擾對(duì)酶的分析，通過(guò)跑用磷酸鉀緩沖液pH7.9、0.5mM焦磷酸硫胺素平衡的PD10柱去除。用3.5ml的上述緩沖液洗脫提取液。重新獲得的洗脫液是無(wú)細(xì)胞粗提物。
首先，在無(wú)NADH條件下測(cè)定無(wú)細(xì)胞粗提物的酶活性，然后在NADH濃度從0.14mM增加到2.7mM的條件下測(cè)定酶活性。在表3中，獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的野生型大腸桿菌的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(Snoep J.L.，De Graef M.R.，Westphal A.H.，DeKok A.Teixeira de Mattos M.J.and Neijssel O.M.(1993)Differences in sensitivity toNADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis，Lactococcus lactis，Azotobacter vinelandii and Escherichia coliimplications for theiractivity in vivo，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，114，279-284)。
獲得的結(jié)果顯示進(jìn)化修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB對(duì)NADH的敏感性比野生型大腸桿菌菌株低。在[NAD+]/[NADH]≌33時(shí)，野生型菌株的PDHc活性完全被抑制，而進(jìn)化型PDHc還有80％的活性。
b)對(duì)進(jìn)化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中編碼硫辛酰胺脫氫酶的基因lpd序列的鑒定從1ml在LB中過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)物中提取菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，δpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的染色體DNA。離心后，用無(wú)菌水洗滌細(xì)胞并通過(guò)94℃熱激5分鐘破碎細(xì)胞。再次離心后回收上清液中的染色體DNA。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中編碼硫辛酰胺脫氫酶(E3)的基因lpd(序列127912-129336)通過(guò)使用以下兩種寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增
AceEf(SEQ ID NO 27)cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg(與127504-127532序列同源)YacH r(SEQ ID NO 28)aagttcaggagagccgccc(與127513-129531序列同源)獲得并測(cè)序含有2000個(gè)堿基對(duì)的與基因lpd相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。所得結(jié)果顯示存在使丙氨酸55替換為纈氨酸的點(diǎn)突變。
例4進(jìn)化修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中甲基乙二醛向1，2-丙二醇的轉(zhuǎn)化路徑中不涉及甘油脫氫酶。
為了顯示進(jìn)化修飾菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的性能改善并不是由于基因gldA編碼的甘油脫氫酶的進(jìn)化而引起的，構(gòu)建刪除基因gldA的菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
a)構(gòu)建修飾菌株MG1655ΔgldA::cm如實(shí)施例1所述，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒并刪除大部分相關(guān)基因使基因gldA失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.gldA Df，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 29)gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因gldA(序列4135512-4136615)的序列(4135512-4135592)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.GldA Dr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 30)atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG—與基因gldA(序列4135512-4136615)的序列(4136535-4136615)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗生素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸gldA Dr和gldA Df從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并用寡核苷酸YijF D和TalCr進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗性盒的插入。
YijF D(SEQ ID NO 31)gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg(與4135140-4135174序列同源)TalCr(SEQ ID NO 32)cacgcatattccccattgccgggg(與4137216-4137239序列同源)從野生型基因和被氯霉素抗性基因置換的刪除基因分別獲得具有2100個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。然后，將獲得的PCR產(chǎn)物用SalI限制酶消化。野生型PCR產(chǎn)物獲得兩個(gè)大約1000個(gè)堿基對(duì)的片段，然而含有氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物沒有被酶消化。
b)構(gòu)建進(jìn)化修飾菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldBΔgldA::cm如實(shí)施例1所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))，使進(jìn)化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中的基因gldA失活。獲得菌株MG1655ΔgldA::cm的噬菌體P1裂解物，并使用這種裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。使用寡核苷酸YijF D和TalCr檢測(cè)基因gldA的突變，來(lái)確認(rèn)氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)株。
c)培養(yǎng)進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB在沒有調(diào)節(jié)PH值、補(bǔ)充有鈉和酵母提取物、葡萄糖起始濃度為20g/l的基本培養(yǎng)基中，在厭氧條件下對(duì)兩個(gè)進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB ΔgldA::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培養(yǎng)10天。獲得的發(fā)酵產(chǎn)物譜顯示刪除基因gldA并沒有引起任何1，2-丙二醇產(chǎn)量的降低(表1)。
表1進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB ΔgldA::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培養(yǎng)10天后，對(duì)底物和發(fā)酵產(chǎn)物濃度的比較。

實(shí)施例5通過(guò)刪除進(jìn)化菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因edd，改善轉(zhuǎn)化葡萄糖生成1，2-丙二醇的產(chǎn)量a)構(gòu)建修飾菌株MG1655Δedd::cm如實(shí)施例1所述，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒并刪除大部分相關(guān)基因使基因edd失活。
使用兩個(gè)寡核苷酸進(jìn)行刪除1.edd Df，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 33)ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有—與基因edd(序列1930817-1932628)的序列(1930817-4)同源的區(qū)域(小寫字母)，參考序列見網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.edd Dr，由100個(gè)堿基組成(SEQ ID NO 34)atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG—與基因edd(序列1930817-1932628)的序列(1932548-1932628)同源的區(qū)域(小寫字母)，和—用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3攜帶的氯霉素抗生素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)。
使用寡核苷酸edd Dr和edd Df從粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒。然后，將得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入菌株MG1655(pKD46)，其中表達(dá)的酶Red重組酶允許同源重組。然后，選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化子，并用寡核苷酸eda d和zwf r進(jìn)行PCR分析來(lái)檢測(cè)抗性盒的插入。
eda d(SEQ ID NO 35)
CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC(與1930439-1930462序列同源)zwf r(SEQ ID NO 36)GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG(與1932968-1932996序列同源)b)構(gòu)建進(jìn)化修飾菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm如實(shí)施例1所述使用噬菌體P1技術(shù)(見步驟c))使進(jìn)化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中的基因edd失活。獲得菌株MG1655Δedd::cm的噬菌體P1裂解物，并使用這種裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。使用寡核苷酸eda d和zwf r檢測(cè)基因edd的突變，來(lái)確認(rèn)氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)株。
c)培養(yǎng)進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB在沒有調(diào)節(jié)PH值的、補(bǔ)充有硝酸鈉和酵母提取物的、葡萄糖起始濃度為20g/l的基本培養(yǎng)基中，在厭氧條件下對(duì)兩個(gè)進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培養(yǎng)10天。獲得的發(fā)酵產(chǎn)物譜顯示刪除基因edd引起轉(zhuǎn)化葡萄糖生成1，2-丙二醇的產(chǎn)量從0.13g/g增加到0.35g/g(表2)。因此，在進(jìn)化菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中刪除基因edd改善了菌株的性能。
表2進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培養(yǎng)10天后，對(duì)底物和發(fā)酵產(chǎn)物濃度的比較。

例6構(gòu)建能夠產(chǎn)生1，2-丙二醇和丙酮的修飾菌株E.coli*MG1655 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(pSOS95T)質(zhì)粒pSOS95T是大腸桿菌/丙酮丁酸羧桿菌穿梭表達(dá)載體，攜帶有丙酮丁酸羧桿菌的丙酮操縱子，其由依賴硫解酶啟動(dòng)子的分別編碼乙酰乙酸羧化酶、輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫解酶的四個(gè)基因adc、ctfA與B、thl組成。這三個(gè)酶催化乙酰-CoA和乙酸轉(zhuǎn)化為丙酮和二氧化碳。通過(guò)在質(zhì)粒pSOS95(Gene bank accession number AY187686)中插入丙酮丁酸羧桿菌的編碼硫解酶的基因thl，獲得質(zhì)粒pSOS95T，插入位點(diǎn)介于硫解酶啟動(dòng)子和基因ctfA之間的BamH1位點(diǎn)。將質(zhì)粒pSOS95T通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入進(jìn)化菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm。
在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)菌株，制備菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm的電感受態(tài)細(xì)胞。接種(1/100)錐形瓶中的LB過(guò)夜培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的550nm光密度值達(dá)到0.4到0.6之間時(shí)，取出1ml培養(yǎng)物并離心。用水和10％的甘油溶液洗滌細(xì)胞，然后重新懸浮在0.05ml 10％的甘油溶液中。立即用5μl的質(zhì)粒制備物pSOS95T(Qiagen，Hilden，Germany)經(jīng)電穿孔法(25μF，200Ω，2.5kV)(Gene Pulser，Biorad)處理細(xì)胞。在SOC培養(yǎng)基(Sambrook J.，F(xiàn)ristch E.F.& Maniatis T.(1989)Molecular CloningaLaboratory Manual，2nded Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中于37℃表型表達(dá)一小時(shí)之后，在37℃含有100μg/ml羧芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)化子。
使轉(zhuǎn)化子返還到含有羧芐青霉素的液體培養(yǎng)基中過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA(Qiagen，Hilden，Germany)來(lái)檢查質(zhì)粒pSOS95T的存在，并保證能夠滿足酶消化的要求。
例7培養(yǎng)能夠產(chǎn)生1，2-丙二醇和丙酮的進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(pSOS95T)在沒有調(diào)節(jié)PH值的、補(bǔ)充有硝酸鈉和酵母提取物的、葡萄糖起始濃度為20g/l的基本培養(yǎng)基中，在厭氧條件下對(duì)進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pSOS95T)進(jìn)行培養(yǎng)(表3)。分析發(fā)酵產(chǎn)物顯示，進(jìn)化菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pSOS95T)產(chǎn)生1，2-丙二醇、乙酸和丙酮的混合物。
表3進(jìn)化修飾菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pOS95T)和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm培養(yǎng)10天后，對(duì)底物和發(fā)酵產(chǎn)物濃度的比較。

參考文獻(xiàn)√Altaras N.E.and Cameron D.(1999)Metabolic engineering of a 1，2-propanediol pathway in Escherichia coliAppl.Env.Microb.，65，1180-1185.
√Altaras N.E.and Cameron D.C.(2000)Enhanced production of(R)1，2-propanediol by metabolically engineered Escherichia coliBiotechnol.Prog.16，940-946√Altaras NE，Etzel MR and Cameron DC.(2001)Conversion of sugars to1，2-propanediol by Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HG-8Biotechnol.Prog.17，52-56√Bunch P.K.，Mat-Jan F.and Clark D.P.(1997)The /dhA gene encodingthe fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia colimicrobiology，143，187-195.
√Cameron D.C.，Altaras N.E.，Hoffman M.L and Shaw A.J.(1998)Metabolic engineering of propanediol pathwaysBiotechnol.Prog.，14，116-125.
√Cameron D.C.，Shaw A.J.and Altaras N.E.(1998)Microbial production of1，2-propanediol from sugar WO 98/37204√Cameron D.C.，Shaw A.J.and Altaras N.E.(2000)Microbial production of1，2-propanediol from sugar US 6 087 140√Cameron D.C.，Shaw A.J.and Altaras N.E.(2001)Microbial production of1，2-propanediol from sugar US 6 303 352√Carrier T A and Keasling J.D.(1999)Library of synthetic 5′secondarystructures to manipulate mRNA stability in Escherichia coli.Biotechnol.prog.，15，58-64√Cheperanov P.P.and Wackernagel W.(1995)Gene disruption inEscherichia coliTcRand KmRcassettes with option of Flp-catalyzedexcision of the antibiotic-resistance determinant，gene，158，9-14√Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645
√Sambrook J.，F(xiàn)ristch E.F.and Maniatis T.(1989)MolecularCloninga Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.
√Schwartz E.R.and Reed L.J.(1970)Regulation of the activity of thepyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli，Biochemistry，6，1434-1439√Snoep J.L.，De Graef M.R.，Westphal A.H.，De Kok A.Teixeira de MattosM.J.and Neijssel O.M.(1993) Differences in sensitivity to NADH ofpurified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis，Lactococcus lactis，Azotobacter vinelandii and Escherichia coliimplications for their activity in vivo，F(xiàn)EMS microbiology letters，114，279-284)).
√Tran Din K.and Gottschalk G.(1985)Formation of D(-)-1，2-propanedioland D(-)-lactate from glucose by Clostridium sphenoides under phosphatelimitationArch.Microbiol.142，87-92.
序列表<110>代謝探索者公司<120>生產(chǎn)1，2內(nèi)二醇的進(jìn)化微生物<130>347276<150>FR 0400214<151>2004-01-12<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>102<212>DNA<213>人工的<400>1atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac 60gagctggttt ctaacctgcg tacatatgaa tatcctcctt ag 102<210>2<211>100<212>DNA<213>人工的<400>2cttaagcctg tttagccgct tctgcagctt taacgattac tgcgaaggcg tcagctttca 60gagaagcacc accaaccagc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>3<211>20<212>DNA
<213>人工的<400>3ggtgatgata gttatcgccg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<400>4cgtgccatcg acagcagtcc 20<210>5<211>100<212>DNA<213>人工的<400>5ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc 60cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag 100<210>6<211>94<212>DNA<213>人工的<400>6gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg 60gcaactcaat aaagttgccg ctggagctgc ttcg 94<210>7<211>30<212>DNA<213>人工的<400>7agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30
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<400>12gaaaagacgc gctgacaata cgcc24<210>13<211>20<212>DNA<213>人工的<400>13gccatcagca ggcttagccg 20<210>14<211>23<212>DNA<213>人工的<400>14gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23<210>15<211>101<212>DNA<213>人工的<400>15atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g101<210>16<211>100<212>DNA<213>人工的<400>16ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc 60cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 100<210>17
<211>31<212>DNA<213>人工的<400>17gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g31<210>18<211>31<212>DNA<213>人工的<400>18gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g31<210>19<211>102<212>DNA<213>人工的<400>19atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga 60gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg 102<210>20<211>101<212>DNA<213>人工的<400>20ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc 60tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g101<210>21<211>31<212>DNA<213>人工的
<400>21tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g31<210>22<211>31<212>DNA<213>人工的<400>22cacgatgacg accattcatg cctatactgg c31<210>23<211>101<212>DNA<213>人工的<400>23tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta 60atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g101<210>24<211>100<212>DNA<213>人工的<400>24atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag 60ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag 100<210>25<211>40<212>DNA<213>人工的<400>25catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40<210>26<211>31
<212>DNA<213>人工的<400>26tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g31<210>27<211>29<212>DNA<213>人工的<400>27cgcgtgatcg acggtgctga tggtgcccg 29<210>28<211>19<212>DNA<213>人工的<400>28aagttcagga gagccgccc 19<210>29<211>101<212>DNA<213>人工的<400>29gttattccca ctcttgcagg aaacgctgac cgtactggtc ggctaccagc agagcggcgt 60aaacctgatc tggcgtcgcg gtgtaggctg gagctgcttc g101<210>30<211>100<212>DNA<213>人工的<400>30atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60ctgggcgaat acctgaagcc catatgaata tcctccttag 100
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<213>人工的<400>35ccccggaatc agaggaatag tccc24<210>36<211>29<212>DNA<213>人工的<400>36gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29
權(quán)利要求
1.一種制備經(jīng)代謝簡(jiǎn)單碳源生產(chǎn)1，2-丙二醇的進(jìn)化微生物菌株的方法，這種方法包括在選擇壓力下在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)起始細(xì)菌菌株，所述起始細(xì)菌菌株缺失基因tpiA并缺失參與甲基乙二醛(丙醛)向乳酸轉(zhuǎn)化的至少一個(gè)基因，以使所述菌株中參與從DHAP向甲基乙二醛、繼爾向1，2-丙二醇生物合成路徑的一個(gè)或多個(gè)基因向具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的進(jìn)化基因進(jìn)化，然后選擇和分離所得的具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的進(jìn)化微生物菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于參與甲基乙二醛向乳酸轉(zhuǎn)化的基因是golA、aldA或aldB。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述起始菌株缺失基因golA、aldA、aldB和tpiA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所述起始菌株缺失基因ldhA、pflA、pflB、adhE和edd。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所述起始菌株還含有至少一個(gè)編碼有利于將丙酮酸代謝為乙酸的酶的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于有利于將丙酮酸代謝為乙酸的酶對(duì)NADH的抑制作用有低敏感性。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于所述的酶有利于將丙酮酸代謝生成乙酰-CoA和NADH。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于有利于將丙酮酸代謝為乙酸的酶是內(nèi)源酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于將編碼一個(gè)或多個(gè)參與乙酰-CoA和乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的酶的一個(gè)或多個(gè)異源基因?qū)脒M(jìn)化菌株中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于編碼一個(gè)或多個(gè)參與乙酰-CoA和乙酸轉(zhuǎn)化的酶的異源基因來(lái)自丙酮丁酸羧桿菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法獲得的進(jìn)化修飾菌株在選擇壓力下在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以使所述進(jìn)化修飾菌株中參與乙酰-CoA和乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)基因向改良“丙酮合酶”活性進(jìn)化；然后選擇和分離具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性和改良“丙酮合酶”活性的第二代所得進(jìn)化微生物。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所述菌株是細(xì)菌、酵母或真菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述菌株是埃希氏桿菌屬，具體是大腸桿菌；和棒狀桿菌屬，具體是谷氨酸棒狀桿菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)所限定的起始菌株。
16.能夠用根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的方法獲得的進(jìn)化菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的菌株，其中基因lpd具有使丙氨酸55替換為纈氨酸的點(diǎn)突變。
18.制備1，2-丙二醇的方法，其中使根據(jù)權(quán)利要求16或17的進(jìn)化菌株在含有簡(jiǎn)單碳源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并回收生成的1，2-丙二醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于回收1，2-丙二醇和丙酮。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其特征在于純化1，2-丙二醇和/或丙酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備經(jīng)代謝簡(jiǎn)單碳源生產(chǎn)1，2－丙二醇的進(jìn)化微生物菌株的新方法，這種方法包括在選擇壓力下在含有簡(jiǎn)單碳源的合適培養(yǎng)基中制備起始細(xì)菌菌株培養(yǎng)物，所述起始細(xì)菌菌株中tpiA基因缺失并且參與將甲基乙二醛(丙醛)轉(zhuǎn)化為乳酸的至少一個(gè)基因缺失，以使所述起始菌株中參與DHPA向甲基乙二醛、繼而向1，2－丙二醇生物合成的一個(gè)或多個(gè)基因向表現(xiàn)出改良1，2－丙二醇合酶活性的基因進(jìn)化，該方法還包括隨后選擇表現(xiàn)出改良1，2－丙二醇合酶活性的進(jìn)化微生物菌株。還公開了起始菌株、如此獲得的進(jìn)化微生物和由進(jìn)化微生物培養(yǎng)物制備1，2－丙二醇和可能的丙酮的方法。
文檔編號(hào)C12P7/18GK1910278SQ200580002311
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月12日
發(fā)明者伊莎貝爾·梅尼亞爾-薩勒, 邦雅曼·岡薩雷斯, 菲利普·蘇卡耶 申請(qǐng)人:代謝探索者公司