專(zhuān)利名稱(chēng)：在熒光假單胞菌中表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是通過(guò)在假單胞菌中，特別是在熒光假單胞菌生物體中表達(dá)，而改良重組哺乳動(dòng)物蛋白的產(chǎn)量的方法。與已知表達(dá)系統(tǒng)相比，該方法提高了哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
超過(guò)3億2千5百萬(wàn)的全世界的人們受到了美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的超過(guò)155種生物技術(shù)的藥物和疫苗的益處。另外，有超過(guò)370種瞄準(zhǔn)200多種疾病的生物技術(shù)藥物產(chǎn)品和疫苗正在臨床試驗(yàn)階段，其中多種疾病包括各種癌癥，阿姆次病，心臟病，糖尿病，多發(fā)硬化，AIDS和關(guān)節(jié)炎。與傳統(tǒng)的通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)合成的小分子治療劑不同，在活細(xì)胞中通常低效、高造價(jià)地產(chǎn)生蛋白質(zhì)。由于高造價(jià)和復(fù)雜性，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療劑的生產(chǎn)能力有缺陷。
使用微生物細(xì)胞生產(chǎn)產(chǎn)品有很長(zhǎng)的歷史了。早在1897年，Buchner發(fā)現(xiàn)酵母中提取的酶可有效地將糖轉(zhuǎn)化為酒精，從而產(chǎn)生了使用微生物進(jìn)行主要的工業(yè)化學(xué)生產(chǎn)。到了20世紀(jì)40年代，發(fā)展了通過(guò)發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)青霉素。在20世紀(jì)70年代早期第一次發(fā)展了詳細(xì)菌中插入異源基因的技術(shù)。細(xì)菌生產(chǎn)商業(yè)的大量的重組哺乳動(dòng)物蛋白第一次在生產(chǎn)人類(lèi)胰島素中開(kāi)發(fā)(Goeddel等，1979a；Wong，1997)。今天，發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)在大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)的酒精、抗生素、生物化學(xué)和治療蛋白質(zhì)起作用。可是，開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)治療上有效的仍受到阻礙，一大部分原因是用于表達(dá)這些外源性蛋白質(zhì)的現(xiàn)有有機(jī)物的局限性。
原核和真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)盡管常常使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組的真核蛋白，典型地產(chǎn)生的蛋白質(zhì)根據(jù)其來(lái)源的部分不同有顯著的不同。通常，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中再生真核的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)具有挑戰(zhàn)性。同時(shí)，盡管真核表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)在可更好地形成重組蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這些系統(tǒng)大量產(chǎn)生重組蛋白的能力是有限的。
翻譯后修飾代表了原核和真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)的最顯著的不同。原核細(xì)胞(即，細(xì)菌)具有非常簡(jiǎn)單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，沒(méi)有膜包裹的細(xì)胞器。在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)在經(jīng)初期產(chǎn)生后常常被修飾。這些修飾，在許多情況下，是將多肽轉(zhuǎn)化為其功能形式所必需的。因此，即使當(dāng)存在的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生具有正確初級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可能沒(méi)被翻譯后修飾因而常常不具功能。一般的修飾包括形成二硫鍵、糖基化、乙酰化、?；?、磷酸化和γ羧化，所有這些都可以調(diào)節(jié)蛋白折疊和生物活性。通常細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)不能正確地糖基化、乙?；?、?；?、磷酸化或γ羧化真核蛋白。
細(xì)菌，例如大腸桿菌可形成二硫鍵，但該鍵通常不能以生物學(xué)活性所需的正確的構(gòu)象形成。在原核和真核細(xì)胞中均存在分子伙伴蛋白，其有助于其他蛋白的折疊。在缺少這種分子伙伴蛋白時(shí)，細(xì)胞中的不折疊或部分折疊的多肽鏈不穩(wěn)定，通常不正確地折疊或聚集成不溶的復(fù)合體。與伙伴結(jié)合穩(wěn)定了這些未折疊的多肽，從而防止不正確的折疊或聚集，使得多肽鏈折疊成正確的構(gòu)象?？墒牵?xì)胞類(lèi)型不同，伙伴也不同，而且其可根據(jù)細(xì)胞外的條件發(fā)生不同的表達(dá)。
現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題埃希氏大腸桿菌(E.coli)是最廣泛最常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。在埃希氏大腸桿菌中的生產(chǎn)是廉價(jià)的、快速的、易于鑒別的。而且，大規(guī)模生產(chǎn)和回收是可能的，可以完善的建立起cGMP生產(chǎn)?？梢裕褂冒ＯＪ洗竽c桿菌具有常常證明是難以克服的顯著的局限性，特別是當(dāng)表達(dá)重組哺乳動(dòng)物蛋白時(shí)。
與上述的局限性一起，在埃希氏大腸桿菌中高水平表達(dá)重組基因產(chǎn)物常常導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，繼而使其被細(xì)胞的蛋白酶降解或沉積成如所知的包涵體的生物學(xué)上無(wú)活性的聚集物。典型地包涵體中的蛋白質(zhì)必須被提取、重新恢復(fù)其活性，此過(guò)程需要時(shí)間和金錢(qián)。典型的復(fù)性的方法包括將聚集體溶解在濃縮的變性劑中，繼而通過(guò)稀釋除去變性劑。一些曾被指出涉及包涵體形成的因子包括高局部濃度的蛋白；細(xì)胞質(zhì)中降低的環(huán)境(埃希氏大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)具有高水平的谷胱甘肽)防止二硫鍵形成；缺少翻譯后的修飾，該修飾可增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；與伙伴和其他涉及體內(nèi)折疊的酶的不正確的相互反應(yīng)；通過(guò)二硫鍵或其它鍵發(fā)生的分子間鉸鏈反應(yīng)；由于其有限的溶解性而導(dǎo)致的折疊鉸鏈間的聚集?？赡苁沁@些因子的結(jié)合，以及伙伴的有限性，常常導(dǎo)致包涵體的形成。
酵母表達(dá)系統(tǒng)，如塞里維辛酵母或畢赤酵母(pichia pastoris)也常被用于生產(chǎn)蛋白。這些系統(tǒng)被很好的鑒別的，與其他真核表達(dá)系統(tǒng)性比，提供了良好的表達(dá)水平及相對(duì)快和廉價(jià)?？墒牵湍竷H能完成有限的翻譯后蛋白質(zhì)修飾，蛋白質(zhì)也許需要再折疊，而且由于存在細(xì)胞壁這一特性，收獲蛋白質(zhì)有問(wèn)題。
昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)作為有吸引力的但是昂貴的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)出現(xiàn)了。有時(shí)候能夠產(chǎn)生通常被翻譯后修飾的正確的折疊蛋白質(zhì)并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外表達(dá)?？墒?，其沒(méi)有細(xì)菌和酵母快，大規(guī)模生產(chǎn)常常是挑戰(zhàn)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞，通常被用于復(fù)雜蛋白質(zhì)的表達(dá)。此系統(tǒng)通常產(chǎn)生具有正確的翻譯后修飾的正確折疊的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)能被細(xì)胞外表達(dá)?？墒?，該系統(tǒng)非常昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)很慢常常不可行，蛋白產(chǎn)量比其它系統(tǒng)低。
熒光假單胞菌(P.fluorescent)熒光假單胞菌包括一組普通的、非致病的腐生物，其靠土壤、水和植物表面環(huán)境生存。熒光假單胞菌被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)，包括商業(yè)生產(chǎn)非哺乳動(dòng)物的工業(yè)和農(nóng)業(yè)蛋白。衍生于熒光假單胞菌的非哺乳動(dòng)物酶被用于降低環(huán)境污染，如去垢添加劑和用于立體選擇的水解。在20世紀(jì)80年代中期Mycogen開(kāi)始在熒光假單胞菌中表達(dá)重組細(xì)菌蛋白，在1985年1月22日提交了第一份關(guān)于在熒光假單胞菌中表達(dá)蘇蕓金桿菌毒素的專(zhuān)利申請(qǐng)(“生物殺蟲(chóng)劑的細(xì)胞包裝”)。在1985-2004年間，Mycogen，后來(lái)是Dow Agro Sciences以及其它公司投資于熒光假單胞菌的農(nóng)業(yè)應(yīng)用，在專(zhuān)利申請(qǐng)中申請(qǐng)關(guān)于殺蟲(chóng)的、除蟲(chóng)的和殺線(xiàn)蟲(chóng)的毒素，以及特異的毒素序列和基因操縱以增強(qiáng)其表達(dá)。在熒光假單胞菌中表達(dá)重組的細(xì)菌蛋白的專(zhuān)利申請(qǐng)的例子包括美國(guó)專(zhuān)利Nos.3,844,893；3,878,093，4,169,010；5,292,507；5,558,862；5,559,015；5,610,044；5,622,846；5,643,774；5,662,898；5,677,127；5,686,282；3,844,893；3,878,093；4,169,010；5,232,840；5,292,507；5,558,862；5,559,015；5,610,044；5,622,846；5,643,774；5,662,898；5,677,127；5,686,282；5,686,283；5,698,425；5,710,031；5,728,574；5,731,280；5,741,663；5,756,087；5,766,926；5,824,472；5,869,038；5,891,688；5,952,208；5,955,348；6,051,383；6,117,670；6,184,440；6,194,194；6,268,549；6,277,625；6,329,172；6,447,770；以及PCT公開(kāi)Nos.WO 00/15761；WO 00/29604；WO 01/27258；WO 02/068660；WO02/14551；WO 02/16940；WO 03/089455；WO 04/006657；WO 04/011628；WO 87/05937；WO 87/05938；WO 95/03395；WO 98/24919；WO 99/09834和WO 99/53035。
在2003年10月8日，Dow AgroScience提交的PCT公開(kāi)No.04/087864，題目為“Amended Recombinant Cells(ARCs)for theProduction and Delivery of Antiviral Agents，Adjuvants andVaccine Accelerants″。該申請(qǐng)描述了包括至少一個(gè)編碼化學(xué)因子或細(xì)胞因子的異源基因的重組細(xì)胞和向宿主投藥這樣的細(xì)胞以加速免疫反應(yīng)。該申請(qǐng)論證了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)小牛干擾素α和干擾素γ。
現(xiàn)在陶氏環(huán)球技術(shù)公司(Dow Global Technologies)有一些在應(yīng)用熒光假單胞菌產(chǎn)生重組蛋白的領(lǐng)域中的正在進(jìn)行的專(zhuān)利申請(qǐng)。2003年2月13日提交的題目為“Over-Expression of Extremozyme Genesin假單胞菌and Closely Related Bacteria”的陶氏環(huán)球技術(shù)公司的PCT申請(qǐng)WO 03/068926描述了假單胞菌，特別是熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可被用作宿主細(xì)胞生產(chǎn)極端酶。這些酶典型地是遠(yuǎn)古的，發(fā)現(xiàn)于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞包括真菌、酵母、苔蘚、原生生物和原生動(dòng)物、藻類(lèi)和蘚、節(jié)肢動(dòng)物和魚(yú)。該專(zhuān)利公開(kāi)了酶可衍生自某種極端的真菌和酵母，但是典型地衍生自極端的細(xì)菌。
2003年4月22日提交的題目為“Low-Cost Production ofPeptides”的陶氏環(huán)球技術(shù)公司的PCT公開(kāi)No.WO 03/089455描述了在假單胞菌，特別是熒光假單胞菌中生產(chǎn)小肽、初級(jí)抗微生物肽如concatameric前體的方法。
陶氏環(huán)球技術(shù)公司的題目為“Benzoate and AntranilateInducible Promoters”的PCT公開(kāi)No.WO 04/005221提供了用于商業(yè)的原核發(fā)酵系統(tǒng)中的新的來(lái)源于熒光假單胞菌的安息香酸鹽-或氨基苯甲酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，以及新的前后啟動(dòng)子，其變異和改良的突變。
Monsanto Co的美國(guó)專(zhuān)利No.5,232,840描述了新的核糖體結(jié)合位點(diǎn)在原核細(xì)胞中增強(qiáng)某種蛋白的表達(dá)中的應(yīng)用。在一個(gè)例子中，該細(xì)胞被用于在多種有機(jī)體中表達(dá)豬生長(zhǎng)激素，包括埃希氏大腸桿菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌。數(shù)據(jù)表明與埃希氏大腸桿菌相比，熒光假單胞菌在表達(dá)生長(zhǎng)激素中的效率低。相反地，當(dāng)表達(dá)細(xì)菌蛋白時(shí)，在可比較的條件下熒光假單胞菌比埃希氏大腸桿菌更有效地產(chǎn)生蛋白。事實(shí)上，在本專(zhuān)利中描述的熒光假單胞菌比埃希氏大腸桿菌多產(chǎn)生幾倍的細(xì)菌衍生的β半乳糖(將表4與表1和2比較)。
在生產(chǎn)商業(yè)上感興趣的蛋白產(chǎn)生進(jìn)展時(shí)，仍強(qiáng)烈需要改良生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物特別是人的蛋白質(zhì)的能力和水品。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)用于治療的可分離的和純化的重組哺乳動(dòng)物，特別是人的蛋白質(zhì)的方法，以及能完成該方法的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)活性重組哺乳動(dòng)物蛋白，包括復(fù)雜的哺乳動(dòng)物蛋白的改良的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)高水平的重組哺乳動(dòng)物，特別是人的蛋白的改良的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可提供高表達(dá)水平的可溶或不可溶的哺乳動(dòng)物重組蛋白的轉(zhuǎn)化的生物體。

發(fā)明內(nèi)容
已近發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌是生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)良的生物體，特別是重組的哺乳動(dòng)物蛋白，如重組的人蛋白?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物衍生的蛋白的方法。另外，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)重組的哺乳動(dòng)物，包括人的蛋白的熒光假單胞菌。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在熒光假單胞菌生物體中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的方法，其中在可比較的條件下比埃希氏大腸桿菌發(fā)酵反應(yīng)的每個(gè)細(xì)胞或每升中產(chǎn)生更高水平或濃度的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在熒光假單胞菌生物體中在批量培養(yǎng)中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的方法，與相應(yīng)的重組埃希氏大腸桿菌的批量培養(yǎng)相比，其每升可產(chǎn)生更大量的蛋白質(zhì)。
可比較的條件或基本上可比較的條件特別地指在不同的生物體中使用相同的可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并使用相同的起始誘導(dǎo)條件表達(dá)重組蛋白?？杀容^的條件可進(jìn)一步包括使用相同的載體和相關(guān)的調(diào)節(jié)元件，包括但不局限于，增強(qiáng)子序列、終止序列和起始或復(fù)制序列。可比較的條件還可以包括相同的細(xì)胞發(fā)酵反應(yīng)總體積?？杀容^的條件還可以包括每升反應(yīng)液中相同濃度的總細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，條件還可以包括總的誘導(dǎo)時(shí)間(在測(cè)量前)相似或相同?？墒?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)時(shí)間可依據(jù)生物體而不同。特別地，熒光假單胞菌比大腸桿菌具有增加生長(zhǎng)時(shí)間的能力，而并不降低蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從而使在熒光假單胞菌中可測(cè)得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的時(shí)間點(diǎn)在大腸桿菌中是大部分測(cè)不到的。一個(gè)測(cè)量可比較的條件的方法是比較每一個(gè)總細(xì)胞蛋白中重組蛋白的百分比?？杀容^的條件不包括相同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基?？烧{(diào)整培養(yǎng)基以保證每種生物體的最佳產(chǎn)量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)在熒光假單胞菌中生產(chǎn)蛋白并分離生產(chǎn)的蛋白而生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法。在一個(gè)在下的實(shí)施方案中，方法包括基本上純化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白衍生自人蛋白，或人源化的。
本發(fā)明還提供了在至少一個(gè)下面的實(shí)施方案中熒光假單胞菌的應(yīng)用(ii)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物，包括人重組蛋白，該蛋白存在于細(xì)胞中，占總細(xì)胞蛋白的范圍是1-75％(％tcp)之間，或特別地，至少大于大約5％tcp，10％tcp，至少15％tcp，至少20％tcp或更多。
(iii)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物，包括人重組蛋白，該蛋白是可溶的并存在于細(xì)胞質(zhì)中，范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp，10％tcp，至少15％tcp，至少20％tcp或更多。
(ii i)不溶于細(xì)胞質(zhì)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)的生產(chǎn)范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(iv)溶于細(xì)胞周質(zhì)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)的生產(chǎn)范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(v)不溶于細(xì)胞周質(zhì)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)的生產(chǎn)范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vi)當(dāng)細(xì)胞以密度至少為40g/L生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)的生產(chǎn)范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vii)重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)以活性形式生產(chǎn)；(viii)多亞基的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)以活性形式生產(chǎn)；(ix)生產(chǎn)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)而后被分離和純化；(x)生產(chǎn)的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白質(zhì)而后被復(fù)性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物蛋白選自多亞基蛋白、血運(yùn)載蛋白、酶、全長(zhǎng)(full length)抗體、抗體片段或轉(zhuǎn)錄因子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括(i)在基本上相應(yīng)的條件下生長(zhǎng)時(shí)，熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化生產(chǎn)比相應(yīng)埃希氏大腸桿菌更高水平或濃度的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白；(ii)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白和肽的范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(iii)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞內(nèi)以活性形式生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白；(iv)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)可溶的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白的范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(v)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)不可溶的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白的范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vi)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)可溶的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白的范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vii)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)不溶的重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白的范圍是介于1-75％tcp之間，或特別地，至少大于大約5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(viii)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化生產(chǎn)多亞基重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白；(ix)熒光假單胞菌被轉(zhuǎn)化在細(xì)胞內(nèi)以活性形式生產(chǎn)多亞基重組哺乳動(dòng)物，包括人蛋白。
在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，假單胞菌和與其密切相關(guān)的其他非熒光假單胞細(xì)菌在本發(fā)明中被用作宿主細(xì)胞，如以下更詳細(xì)的描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞通常選自假單胞菌屬，特別地選自非致病性假單胞菌種。同樣地，完成所需的發(fā)明目的任何熒光假單胞菌株可被應(yīng)用，包括但不局限于MB101株，或被修飾成包括至少一個(gè)宿主細(xì)胞可表達(dá)的，至少一個(gè)編碼Lac抑制子蛋白的lacI轉(zhuǎn)基因的插入拷貝的菌株，如MB214和MB217。假單胞菌還可被可選擇地基因修飾以添加或缺失一個(gè)或多個(gè)基因而用于改良性能、工藝或其他特性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌生物體被編碼重組哺乳動(dòng)物蛋白的核苷酸轉(zhuǎn)化，該重組哺乳動(dòng)物蛋白選自多亞基蛋白、血運(yùn)載蛋白、酶、全長(zhǎng)抗體、抗體片段或轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光假單胞菌表達(dá)選自多亞基蛋白、血運(yùn)載蛋白、酶、全長(zhǎng)抗體、抗體片段或轉(zhuǎn)錄因子的重組哺乳動(dòng)物蛋白。
被表達(dá)重組哺乳動(dòng)物或人蛋白典型地具有至少大約1kD、至大約100、200、300、400、或500kD的質(zhì)量，通常在大約10kD到大約100kD之間，通常大于大約30kD。


圖1表明從熒光假單胞菌可溶部分樣本純化的hu-γ-IFN的圖譜，顯示與商售可供的標(biāo)準(zhǔn)相比的活性。
圖2是表明在熒光假單胞菌和埃希氏大腸桿菌中純化的Gal13的活性的ELISA圖。
圖3代表人生長(zhǎng)激素表達(dá)構(gòu)建。A中表示缺乏其天然分泌信號(hào)序列的人生長(zhǎng)激素的氨基酸序列。B中表示在熒光假單胞菌(pDOW2400)和埃希氏大腸桿菌(412-001.hGH)中表達(dá)的質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖4是在熒光假單胞菌和埃希氏大腸桿菌中表達(dá)的hGH的可溶和不可溶部分的SDS-PAGE分析圖。誘導(dǎo)后時(shí)間用I0、I24、I48、0或3表示。大箭頭表示21kDa hGH蛋白的位置。
圖5表示埃希氏大腸桿菌對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)的γ-IFN的SDS-PAGE分析。采自誘導(dǎo)后(I0，等)0、3、24和48小時(shí)的可溶(S)和不可溶的(I)樣品被溶解。表達(dá)γ-IFN的埃希氏大腸桿菌在A圖中表示，表達(dá)γ-IFN的熒光假單胞菌在B圖中表示。5ul的A575-20樣品被加樣到10％ Bis-Tris NuPAGE凝膠上，溶于1×MES。箭頭表示重圖蛋白的位置。蛋白印記雜交在圖C(埃希氏大腸桿菌)和D(熒光假單胞菌)中表示。
圖6表示在pMYC1803的SpeI和Xhol位點(diǎn)用BGI基因取代BuiBui毒性基因。
圖7表示所有選擇的轉(zhuǎn)化株具有所需的干擾素插入，如通過(guò)測(cè)序插入的DNA所證實(shí)的。
圖8代表磷酸結(jié)合蛋白(phosphate binding protein)-gal2單鏈抗體融和蛋白的核苷酸序列。
圖9代表磷酸結(jié)合蛋白-gal2單鏈抗體融和蛋白的氨基酸序列。
圖10代表磷酸結(jié)合蛋白-人生長(zhǎng)激素融合蛋白的核苷酸序列。
圖11代表磷酸結(jié)合蛋白-人生長(zhǎng)激素融合蛋白的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法和轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的熒光假單胞菌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法，該方法通過(guò)在熒光假單胞菌中生產(chǎn)蛋白質(zhì)及分離所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。表達(dá)后通過(guò)本領(lǐng)域的公知技術(shù)分離蛋白，包括但不局限于親和性色譜法、離子交換色譜法、抗體親和性、大小排除法或其他任何可從蛋白中消除大部分的細(xì)胞碎片的方法。在一個(gè)下級(jí)實(shí)施方案中(sub-embodiment)，方法提供了基本上純的蛋白。被分離的蛋白可具有與其衍生自的天然蛋白相似的活性。蛋白可以在接近天然蛋白的正確的折疊狀態(tài)下或構(gòu)象下被分離，或可被進(jìn)一步復(fù)性或修飾成正確折疊構(gòu)象。在一個(gè)下級(jí)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)衍生自人蛋白或被人源化?！氨蝗嗽椿钡牡鞍椎湫偷厥乔逗系牟溉閯?dòng)物蛋白，其部分由衍生自人的蛋白序列組成。人源化被特別地用于抗體生產(chǎn)，人源化抗體的發(fā)展曾被廣泛的描述，例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No6,800,738。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白后分離蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽的蛋白被純化。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，蛋白分離后被純化?？蛇x擇地被分離或純化的蛋白可被復(fù)性或再折疊以生產(chǎn)活性蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的方法，其中生產(chǎn)蛋白的水平或濃度高于埃希氏大腸桿菌中的水平或濃度。用于高水平生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的熒光假單胞菌的適合性是意想不到，理由是在現(xiàn)有技術(shù)中缺乏在這樣的生物體中成功地生產(chǎn)這樣的蛋白質(zhì)的例子。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些生物體確實(shí)能夠高水平地生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白，典型地當(dāng)在相應(yīng)的分析中檢測(cè)時(shí)比埃希氏大腸桿菌表達(dá)更高產(chǎn)量或更高水平的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在批量培養(yǎng)的熒光假單胞菌中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的方法，其比相應(yīng)的批量重組埃希氏大腸桿菌每升蛋白中生產(chǎn)更大量的蛋白。
在一些實(shí)施方案中，所提供的方法包括在熒光假單胞菌中以活性形式生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物，包括人多亞基蛋白；在熒光假單胞菌中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物血運(yùn)載蛋白，包括人血運(yùn)載蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白；在熒光假單胞菌中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物酶，包括以活性形式存在的重組哺乳動(dòng)物酶；在熒光假單胞菌中生產(chǎn)抗體和抗原片段，包括單鏈抗體和Fab片段；在熒光假單胞菌中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物包括人的轉(zhuǎn)錄因子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物蛋白以多聚體或連接體前體形式(concatameric precursors)生產(chǎn)，例如，以至少兩個(gè)小肽(1-15個(gè)氨基酸)單位串連的形式。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物蛋白不以多聚體或連接體前體被生產(chǎn)，而是作為單鏈多肽被生產(chǎn)。
生物分子的篩選本發(fā)明一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案提供了在篩選哺乳動(dòng)物生物分子文庫(kù)的方法中的熒光假單胞菌，該篩選可鑒別至少一個(gè)展現(xiàn)所需活性或性能?？梢杂靡恍y(cè)試所需的哺乳動(dòng)物衍生的核苷酸轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌，生成轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞文庫(kù)。通過(guò)表達(dá)，至少一些核苷酸編碼的多肽被生產(chǎn)，在細(xì)胞質(zhì)或隨后從細(xì)胞中回收用于測(cè)試。測(cè)試的活性或特性的例子可以包括多肽表達(dá)水平；多肽穩(wěn)定性；和生物催化活性和特性。生物催化活性和特性的描述的例子包括酶活性；蛋白香相互作用/結(jié)合；蛋白穩(wěn)定性；底物使用；產(chǎn)物形成；反應(yīng)條件，如pH，鹽分或反應(yīng)溫度；特定催化反應(yīng)的生物催化參數(shù)，如Km和Vmax；穩(wěn)定性，如熱穩(wěn)定性和生物催化的半衰期。得到的測(cè)試結(jié)果可被用于選擇文庫(kù)成員的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
蛋白表達(dá)本發(fā)明的一個(gè)主要方面是在熒光假單胞菌中重組哺乳動(dòng)物，例如人蛋白的高水平表達(dá)，范圍介于總細(xì)胞蛋白(％tcp)的1-75％之間。被表達(dá)的蛋白在熒光假單胞菌細(xì)胞中可以是可溶或不溶的。如此高水平的可溶或不溶重組哺乳動(dòng)物蛋白與先前已知的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比是改良的。特別是，在大規(guī)模發(fā)酵反應(yīng)中高水平的回收的哺乳動(dòng)物蛋白典型地在已知技術(shù)中是不可能的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了超過(guò)在埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，每一個(gè)細(xì)胞中重組蛋白的濃度比可比較條件下埃希氏大腸桿菌中的高。在一個(gè)實(shí)施方案中，在熒光假單胞菌中測(cè)定的與總細(xì)胞蛋白相比的重組蛋白水平高于在埃希氏大腸桿菌中表達(dá)的相同的重組蛋白水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此處描述的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶蛋白的水平或數(shù)量高于在可比較的埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶蛋白的水平或數(shù)量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，活性蛋白總量高于來(lái)自埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的量。在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)例中，在熒光假單胞菌中測(cè)定的與總細(xì)胞蛋白相比的重組活性蛋白水平高于在埃希氏大腸桿菌中表達(dá)的相同的重組蛋白水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，在熒光假單胞菌中表達(dá)的蛋白的水平、濃度或數(shù)量至少是在可比較分析中的埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白表達(dá)的水平、濃度或數(shù)量的2X、至少3X、至少4X、至少5X、至少6X、至少7X、至少8X、至少9X、至少10X或更高。
作為表達(dá)系統(tǒng)熒光假單胞菌的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞可在大規(guī)模的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而對(duì)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)沒(méi)有負(fù)面影響。此能力勝過(guò)其他細(xì)菌系統(tǒng)，如埃希氏大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括在批量培養(yǎng)中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白，其中熒光假單胞菌中生產(chǎn)的重組蛋白水平比埃希氏大腸桿菌的批量培養(yǎng)中生產(chǎn)的重組蛋白有更高的整體水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在在批量培養(yǎng)的熒光假單胞菌中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白的方法，其比相應(yīng)的埃希氏大腸桿菌的批量培養(yǎng)每升生產(chǎn)更大量的蛋白。
通常本發(fā)明提供了表達(dá)水平占總細(xì)胞蛋白(tcp)的1-75％的可溶或不可溶重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法和轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌。在細(xì)胞中被表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白可以以活性形式表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光假單胞菌提供了至少1、5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70或75％tcp的重組哺乳動(dòng)物蛋白。
這些蛋白可以是可溶的，當(dāng)可溶時(shí)，可在生產(chǎn)過(guò)程中存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)中。通過(guò)下述方法，可溶的蛋白很容易從細(xì)胞中被釋放出來(lái)，該方法包括但不局限于，用壓力破壞細(xì)胞膜(即“French”壓力法)，或通過(guò)溶解酶降解細(xì)胞膜。典型地細(xì)胞還可被去污劑裂解，如非離子去污劑?？扇艿牡鞍卓蛇M(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液成分如緩沖液pH、鹽濃度或額外的蛋白質(zhì)成分(例如，在多亞基復(fù)合物中)來(lái)穩(wěn)定?？蓮钠渌鞍缀图?xì)胞碎片中分離或純化可溶的蛋白，例如通過(guò)離心和/或色譜，如尺寸排阻色譜(size exclusion)，陰離子或陽(yáng)離子交換，或親和性色譜。
蛋白也可以是不溶的。不溶的蛋白典型地存在于細(xì)胞質(zhì)的包涵體中，但通常也在細(xì)胞周質(zhì)中。不是所有的不溶蛋白都在包涵體中，也可以存在膜聚集物，如小蛋白聚集物或以任何不溶的形式存在于細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)。不溶的蛋白可典型地通過(guò)使用例如如尿素或鹽酸胍的還原劑而復(fù)性。不溶的蛋白或蛋白聚集物可被分離，例如通過(guò)離心和/或色譜如尺寸排阻色譜。不溶聚集物中的蛋白典型地可被通過(guò)使用例如Vinogradov，等(2003)Anal Biochem 15；320(2)234-8中描述的膠束或逆膠束(micelles or reverse micelles)可溶聚集物分離。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)生長(zhǎng)(即，溫度范圍大約為4-55℃，包括的)在礦物鹽培養(yǎng)基時(shí)，假單胞菌宿主細(xì)胞的重組哺乳動(dòng)物肽、多肽、蛋白或其片段的表達(dá)水平至少1％tcp，細(xì)胞密度至少40g/L。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)生長(zhǎng)(即，溫度范圍大約為4-55℃，并包括4和55℃)在礦物鹽培養(yǎng)基中，在至少10L的發(fā)酵規(guī)模下，表達(dá)系統(tǒng)的重組肽蛋白，包括重組哺乳動(dòng)物蛋白的表達(dá)水平至少為5％tcp，細(xì)胞密度至少為40g/L。
可通過(guò)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，給定樣本中蛋白的量(以克計(jì))與以克計(jì)的總細(xì)胞蛋白的量相比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量每升中重組蛋白的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)得的水平或量可以與已知的標(biāo)準(zhǔn)如BSA對(duì)照相比較?？赏ㄟ^(guò)例如分析被純化蛋白的吸光度、通過(guò)測(cè)量該蛋白的標(biāo)記親和性(如抗體親和性)和通過(guò)與已知標(biāo)準(zhǔn)比較，或通過(guò)測(cè)量與已知標(biāo)準(zhǔn)相比較的活性水平(如已知的純的活性蛋白的量)測(cè)量重組蛋白的水平或量。
已發(fā)現(xiàn)在某些情況下，當(dāng)熒光假單胞菌用作表達(dá)宿主細(xì)胞時(shí)，為了恢復(fù)含二硫鍵的目標(biāo)多肽的活性和可溶性，不需要額外的二硫鍵促進(jìn)條件或試劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的肽、多肽、蛋白質(zhì)或片段在其天然狀態(tài)在下，含有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在其天然狀態(tài)時(shí)可含有至2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多二硫鍵。
在一些實(shí)施方案中，在生產(chǎn)過(guò)程中的純化或分離前蛋白質(zhì)在細(xì)胞周質(zhì)中被表達(dá)或發(fā)現(xiàn)。通過(guò)與恰當(dāng)?shù)男盘?hào)分泌序列融合，蛋白質(zhì)可被分泌到細(xì)胞周質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)序列是熒光假單胞菌的天然信號(hào)序列。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，信號(hào)序列是磷酸結(jié)合蛋白，Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號(hào)肽，外膜蛋白E(OpreE)分泌信號(hào)肽，銅藍(lán)蛋白分泌信號(hào)肽，鐵(III)結(jié)合蛋白(Fe(III)bp)分泌信號(hào)肽或脂蛋白B(LprB)分泌信號(hào)肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重組肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段在其活性狀態(tài)下具有折疊的分子內(nèi)構(gòu)象。熒光假單胞菌典型地以正確的折疊構(gòu)象更有效地生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，超過(guò)50％的被生產(chǎn)的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段可作為可溶的活性形式的單肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段被生產(chǎn)，或以不可溶的但在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中可被復(fù)性的形式被生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大約可以活性形式或可被復(fù)性成活性形式得到60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的表達(dá)的蛋白。
定義在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”用于包括任何氨基酸連接體(concatamers)或聚合體。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可被互相交換使用，其包括氨基酸聚合體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然發(fā)生的氨基酸以及天然發(fā)生的氨基酸聚合體的人工的化學(xué)類(lèi)似物。
術(shù)語(yǔ)“分離的”指，核苷酸、蛋白質(zhì)或肽基本上或主要地與其他當(dāng)在一個(gè)細(xì)胞中時(shí)在天然狀態(tài)下通常與其在一起的物質(zhì)成分分離，例如，其他細(xì)胞成分。
術(shù)語(yǔ)“純的”或“基本上純的”用來(lái)指蛋白質(zhì)從其他細(xì)胞成分分離并從細(xì)胞中的不是與蛋白存在于天然復(fù)合物其他蛋白和肽分離。在一個(gè)特別的實(shí)施方案，純的蛋白是被標(biāo)準(zhǔn)cGMP指南定義而被許可用于治療或獸醫(yī)的或被FDA許可的。
術(shù)語(yǔ)“總細(xì)胞蛋白百分?jǐn)?shù)”(“tcp”)指宿主細(xì)胞中作為聚集物細(xì)胞蛋白的百分比的蛋白量?？商鎿Q的，術(shù)語(yǔ)指總細(xì)胞蛋白該組分的測(cè)量，其可代表通過(guò)細(xì)胞表達(dá)的給定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。
術(shù)語(yǔ)“可操縱地黏附”指任何構(gòu)建，其中轉(zhuǎn)錄和任何翻譯調(diào)節(jié)元件共價(jià)地連接到編碼序列中，在相對(duì)于編碼序列這樣的位置連接，使得在和通過(guò)宿主細(xì)胞的活動(dòng)，調(diào)節(jié)元件可指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
如此處所述的，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指在包括人或非人的哺乳動(dòng)物綱中包含的或指定的任何動(dòng)物，例如，但布局限于豬、綿羊、牛、嚙齒動(dòng)物、有蹄類(lèi)動(dòng)物、豬、豬(swine)、綿羊、小羊、山羊、牛、鹿、騾、馬、猴子、猿、狗、貓、大鼠和小鼠。
如此處所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“重組哺乳動(dòng)物蛋白”或肽指包括來(lái)自天然哺乳動(dòng)物蛋白序列或衍生的或生產(chǎn)于天然哺乳動(dòng)物核苷酸序列的蛋白。此種重組蛋白可從基本上對(duì)應(yīng)于天然哺乳動(dòng)物mRNA或基本上對(duì)應(yīng)于cDNA的核苷酸或其片段生產(chǎn)。序列可根據(jù)本領(lǐng)域已知的宿主細(xì)胞密碼子使用頻率相應(yīng)地調(diào)節(jié)。
在兩個(gè)核苷酸或多肽的上下文中的詞組“基本上相應(yīng)的”指使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算法算法，當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域最大對(duì)應(yīng)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，在兩個(gè)序列中的殘基具有至少50％、60％、70％、80％、90％或更高的同一性?？蛇x擇的用于比較的序列比對(duì)可以通過(guò)如本領(lǐng)域已知的計(jì)算算法實(shí)施(如，Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482；Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443；Pearson & Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444；Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-410(BLAST))，通過(guò)這些計(jì)算算法的電腦實(shí)施(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，and TFASTA in the WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wis.)，或通過(guò)調(diào)查。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件在National Center for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公開(kāi)獲得。
術(shù)語(yǔ)“片段”指核酸、蛋白或肽序列的部分或局部序列。
如此處所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“可溶的”指在生理?xiàng)l件下的緩沖液中在大約5,000-20,000x引力下離心10-30分鐘蛋白質(zhì)不沉淀?？扇艿牡鞍踪|(zhì)不是包涵體或其他被沉淀塊的一部分。
如此處所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“不可溶的”指蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的緩沖液中在大約5,000-20,000x離心力下離心10-30分鐘蛋白質(zhì)可沉淀。不可溶的蛋白質(zhì)是包涵體或其他被沉淀塊的一部分。
術(shù)語(yǔ)“包涵體”指包括在細(xì)胞內(nèi)的任何細(xì)胞內(nèi)小體，其中蛋白質(zhì)的聚集物被隔絕。
如此處所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“同源的”指i)具有與指定原始蛋白質(zhì)的序列至少70、75、80、85、90、95或98％相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其保留了原始蛋白質(zhì)所需的功能或ii)具有與指定原始核苷酸的序列至少70、75、80、85、90、95或98％相似的序列的核苷酸，其保留了原始核苷酸序列所需的功能。在本發(fā)明和公開(kāi)的所有實(shí)施方案中，任何公開(kāi)的蛋白、肽或核酸可被保留其所需功能的同源的或基本同源的蛋白、肽或核苷酸替代。在本發(fā)明和公開(kāi)的所有實(shí)施方案中，當(dāng)任何核苷酸被公開(kāi)時(shí)，它應(yīng)當(dāng)被假定本發(fā)明也包含所有與公開(kāi)的核苷酸雜交的核苷酸。
在一個(gè)非限制的實(shí)施方案中，同源的多肽的非同一的氨基酸序列可以是表1所示的15個(gè)保守的或半保守的組中的任何一個(gè)氨基酸。
表1相似的氨基酸替代組群

生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物蛋白的類(lèi)型一般而言，重組哺乳動(dòng)物蛋白可以是任何哺乳動(dòng)物蛋白，其氨基酸序列是已知的或任何被推定的哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物衍生的蛋白，其氨基酸序列是推定的。蛋白質(zhì)可以選自多亞基蛋白、血運(yùn)載蛋白、酶、全長(zhǎng)抗體、抗體片段或轉(zhuǎn)錄因子。
蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以被改變以適應(yīng)所需特性作調(diào)節(jié)，例如以確保某種相互反應(yīng)類(lèi)型。例如，這些序列可被調(diào)節(jié)以降低免疫反應(yīng)，或增加吸收，降低分泌，或增強(qiáng)在生物體如哺乳動(dòng)物內(nèi)的生物利用度。蛋白質(zhì)的氨基酸序列從而可被調(diào)節(jié)為確保某些翻譯后修飾或蛋白質(zhì)構(gòu)象。
在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物蛋白是化學(xué)因子或細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物蛋白是下列之一IL-1，IL-1a，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-12彈性的，IL-13，IL-15，IL-16，IL-18，IL-18BPa，IL-23，IL-24，VIP，促紅細(xì)胞生產(chǎn)素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，MSF，F(xiàn)LT-3配體，EGF，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF；如，aFGF(FGF-1)，bFGF(FGF-2)，F(xiàn)GF-3，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，orFGF-7)，類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(如，IGF-1，IGF-2)；腫瘤壞死因子(如TNF，淋巴毒素)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如NGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；干擾素(如，IFN-a，IFN-β，IFN-γ)；白血病抑制因子(LIF)；纖毛神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNTF)；制瘤素M；干細(xì)胞因子(SCF)；轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子(如，TGF-a，TGF-pl，TGF-pl，TGF-pl)；TNF超家族(如，LIGHT/TNFSF14，STALL-1/TNFSF13B(BLy5，BAFF，THANK)，TNF α/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12)；或化學(xué)因子(BCA-1/BLC-1，BRAK/Kec，CXCL16，CXCR3，ENA-78/LIX，Eotaxin-1，Eotaxin-2/MPIF-2，Exodus-2/SLC，F(xiàn)ractalkine/Neurotactin，GROalpha/MGSA，HCC-1，I-TAC，Lymphotactin/ATAC/SCM，MCP-1/MCAF，MCP-3，MCP-4，MDC/STCP-1/ABCD-1，MIP-1a，MIP-1β，MIP-2a/GRO β，MIP-3a/Exodus/LARC，MIP-3a/Exodus-3/ELC，MIP-4/PARC/DC-CK1，PF-4，RANTES，SDFla，TARC，or TECK)。
可替換的，蛋白質(zhì)可以不是化學(xué)因子或細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物蛋白可以不是下列蛋白之一IL-1，IL-1a，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-12彈性的，IL-13，IL-15，IL-16，IL-18，IL-18BPa，IL-23，IL-24，VIP，促紅細(xì)胞生產(chǎn)素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，MSF，F(xiàn)LT-3配體，EGF，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF；如，aFGF(FGF-1)，bFGF(FGF-2)，F(xiàn)GF-3，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，orFGF-7)，類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(如，IGF-1，IGF-2)；腫瘤壞死因子(如，TNF，淋巴毒素)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如，NGF)，血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；干擾素(如，IFN-a，IF’N-β，IFN-y)；白血病抑制因子(LIF)；纖毛神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNTF)；制瘤素M；干細(xì)胞因子(SCF)；轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子(如，TGF-a，TGF-β，TGF-β，TGF-β)；TNF超家族(如LIGHT/TNFSF14，STALL-l/TNFSF13B (BLy5，BAFF，THANK)，TNF α/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12)；或化學(xué)因子(BCA-1/BLC-1，BRAK/Kec，CXCL16，CXCR3，ENA-78/LIX，Eotaxin-1，Eotaxin-2/MPIF-2，Exodus-2/SLC，F(xiàn)ractalkine/Neurotactin，GROalpha/MGSA，HCC-1，I-TAC，Lymphotactin/ATAC/SCM，MCP-1/MCAF，MCP-3，MCP-4，MDC/STCP-1/ABCD-1，MIP-1α，MIP-1β，MIP-2a/GRO β，MIP-3a/Exodus/LARC，MIP-3a/Exodus-3/ELC，MIP-4/PARC/DC-CK1，PF-4，RANTES，SDFla，TARC，或TECK)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白不是豬的蛋白，特別不是豬生長(zhǎng)因子。
在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物蛋白，他們的片段或其他衍生物或其類(lèi)似物可以是抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面還包括嵌合體、單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。
多亞基文庫(kù)的生產(chǎn)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物多亞基蛋白的產(chǎn)物通過(guò)假單胞菌種的宿主細(xì)胞提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，假單胞菌種宿主細(xì)胞被提供，其被轉(zhuǎn)化表達(dá)重組哺乳動(dòng)物多亞基蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，多亞基蛋白，包括重組哺乳動(dòng)物或人蛋白，在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)的多亞基蛋白質(zhì)隨后被進(jìn)行多亞基蛋白的分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽的多亞基蛋白被純化。在純化或分離前蛋白可被細(xì)胞組裝，或在分離或純化中或后進(jìn)一步組裝蛋白。可選擇地，蛋白或其部分可被復(fù)性或折疊以生產(chǎn)活性蛋白。
各種載體或表達(dá)系統(tǒng)的任何一個(gè)可被用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)多亞基蛋白。多亞基可位于單個(gè)載體上，可選擇地被可操作地連接到不同的啟動(dòng)子，可選擇地在多順?lè)醋拥男蛄兄小Ｃ恳粋€(gè)亞單位可以在不同的載體上?？梢允褂枚鄠€(gè)載體。每一個(gè)亞單位可在一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記的控制下。調(diào)節(jié)元件可被包含于載體上，包括周質(zhì)分泌信號(hào)序列，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，激活子序列，啟動(dòng)子和終止信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多亞基蛋白在假單胞菌中表達(dá)，其使用如陶氏環(huán)球技術(shù)公司在2004年11月19日提交的美國(guó)申請(qǐng)10/994,138中描述的具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的表達(dá)系統(tǒng)，其中，對(duì)每一個(gè)編碼亞單位的核苷酸的控制是在營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的控制下的?？杀槐磉_(dá)的多亞基蛋白質(zhì)包括同數(shù)的和異數(shù)的蛋白質(zhì)。多亞基蛋白質(zhì)可以包括兩個(gè)或多個(gè)亞單位，可以相同或不同。例如，蛋白質(zhì)可以是包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的同數(shù)蛋白。蛋白質(zhì)也可以是包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的異數(shù)蛋白。
多亞基哺乳動(dòng)物蛋白的例子包括包括離子通道受體的受體；信號(hào)蛋白，如激酶，GTPases，ATPases；跨膜蛋白；包括軟骨素的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix)；膠原質(zhì)；包括MHC蛋白，全長(zhǎng)抗體和抗體片段的免疫調(diào)節(jié)子；包括RNA聚合酶和DNA聚合酶的酶；以及膜蛋白。
血蛋白的生產(chǎn)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組哺乳動(dòng)物血蛋白的生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞的血蛋白表達(dá)后被分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血蛋白被純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血蛋白被分離后，被純化?？蛇x擇地，蛋白可被復(fù)性或折疊以生產(chǎn)活性蛋白。通常的，通過(guò)用編碼血蛋白的核苷酸構(gòu)建轉(zhuǎn)化恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組哺乳血蛋白，如熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合表達(dá)條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可選擇的，分離，或分離并純化細(xì)胞表達(dá)的重組血?jiǎng)游锏鞍住?br> 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了假單胞菌種宿主細(xì)胞，其被含有恰當(dāng)?shù)幕蚝陀糜诒磉_(dá)感興趣的血蛋白的調(diào)節(jié)元件的載體轉(zhuǎn)化以表達(dá)重組哺乳動(dòng)物血蛋白。
能夠表達(dá)的血蛋白可以包括但不局限于運(yùn)載蛋白，如白蛋白，包括人白蛋白(Seq ID NO.1，表2)和牛白蛋白；轉(zhuǎn)鐵蛋白，包括人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Seq ID No.2，表2)，牛轉(zhuǎn)鐵蛋白，大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白半分子，具有改變的特性的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白半分子；觸珠蛋白；纖維蛋白原和其他凝血因子；補(bǔ)體成分；免疫球蛋白；酶抑制劑；底物前體，如血管緊張素和緩激肽；胰島素；內(nèi)皮素(endothelin)；球蛋白包括α、β和γ球蛋白；其他類(lèi)型的主要在哺乳動(dòng)物血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白、肽及其片段。這些血蛋白的氨基酸序列已被報(bào)道(見(jiàn)S.S.Baldwin(1993)Comp.Biochem Physiol.106b203-218)，包括人血清白蛋白的氨基酸序列(Lawn，L.M.，et al.(1981)NucleicAcids Research 922；pp 6103-6114)和人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Yang，F(xiàn).el al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81；pp.2752-2756)。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)白蛋白，包括用含有用于表達(dá)白蛋白的核苷酸序列和調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合白蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，回收熒光假單胞菌表達(dá)的白蛋白。根據(jù)本實(shí)施方案，表達(dá)的白蛋白選自人白蛋白、牛白蛋白、兔子白蛋白、雞白蛋白、大鼠白蛋白和小鼠白蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白與治療活性的多肽融合，該多肽可以是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物來(lái)源。
在進(jìn)一步的特別的實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白，包括用含有用于表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白的核苷酸序列和調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白被表達(dá)后，在一個(gè)實(shí)施方案中，分離蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離后可純化轉(zhuǎn)鐵蛋白。被表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白選自人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，糖基化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，非糖基化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的N端半分子，牛轉(zhuǎn)鐵蛋白，大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白，小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白，猿轉(zhuǎn)鐵蛋白，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白半分子，具有改變特性的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白半分子，轉(zhuǎn)鐵蛋白多聚核苷酸，由轉(zhuǎn)鐵蛋白多聚核苷酸編碼的轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽，轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體，轉(zhuǎn)鐵蛋白片段，和融合至治療活性多肽的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)球蛋白，包括用含有用于表達(dá)球蛋白的核苷酸序列和調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合球蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，可選擇地分離蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，表達(dá)后，從宿主細(xì)胞中分離和純化球蛋白。被表達(dá)的球蛋白選自人球蛋白，牛球蛋白，兔子球蛋白，大鼠球蛋白，小鼠球蛋白，羊球蛋白，猴子球蛋白，膽固醇結(jié)合球蛋白，和融合至治療活性多肽的球蛋白。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)胰島素，包括用含有用于表達(dá)胰島素的核苷酸序列和調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合胰島素表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞生產(chǎn)胰島素后可分離和純化胰島素。表達(dá)的胰島素選自人胰島素，牛胰島素，小鼠胰島素，大鼠胰島素，豬胰島素，猴子胰島素，和融合至治療活性多肽的胰島素。人胰島素基因的登陸號(hào)是J00265，合成的人胰島素基因的登陸號(hào)是J02547。
用于生產(chǎn)重組血蛋白的全長(zhǎng)DNA或編碼血蛋白或其部分的氨基端或羧基端的截?cái)郉NA可以從已知來(lái)源或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法根據(jù)已知序列合成。
表2本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)血蛋白的序列



酶的生產(chǎn)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌種宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物酶或聯(lián)合因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了被轉(zhuǎn)化的表達(dá)重組哺乳動(dòng)物酶或聯(lián)合因子的假單胞菌株宿主細(xì)胞。
本實(shí)施方案中被表達(dá)的酶和聯(lián)合因子包括但不局限于醛縮酶，胺氧化酶，氨基酸氧化酶，天冬氨酸酶，B12依賴(lài)的酶，羧肽酶，羧酯酶(carboxyesterases)，羧裂解酶(carboxylyases)，胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)，需要CoA的酶，氰醇合成酶，胱氨酸合成酶(cystathione synthases)，脫羧酶，脫氫酶，乙醇脫氫酶，脫水酶，心肌黃梅，加雙氧酶，enoate還原酶，環(huán)氧化物水化酶，fumerases，半乳糖氧化酶，葡萄糖異構(gòu)酶，葡萄糖氧化酶，糖基轉(zhuǎn)化酶(glycosyltrasferases)，轉(zhuǎn)甲基酶，腈水化酶，核苷磷酸化酶，氧化還原酶，oxynitilases，肽酶，糖基轉(zhuǎn)化酶，過(guò)氧化物酶，以及融合至治療活性多肽的酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶可以是嗜溫酶多肽，例如是人和/或獸醫(yī)治療和/或診斷用所需的酶。此種治療的嗜溫酶包括，如組織血漿酶原激活劑；尿激酶，reptilase，鏈激酶；過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化物歧化酶；DNAse，氨基酸水解酶(如，天冬酰胺酶，氨基水解酶)；羧基肽酶；蛋白酶；胰蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠羅蛋白酶，膠原蛋白酶；唾液酸苷酶；乳糖分解酶；麥芽糖酶，蔗糖酶和樹(shù)膠醛呋喃配糖酶(arabinofuranosidases)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了在熒光假單胞菌中生產(chǎn)重組酶替代，其通過(guò)用含有用于表達(dá)重組酶替代的核苷酸序列和調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，在適合重組酶替代表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組酶替代選自半乳糖苷酶β，laronidase和融合至治療活性多肽的重組酶替代。
哺乳動(dòng)物抗體和抗體片段的生產(chǎn)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌株的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物單鏈，F(xiàn)ab片段和/或全長(zhǎng)抗體或片段或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白表達(dá)后，分離并可選擇地純化蛋白?？蛇x擇地，蛋白可被復(fù)性以生產(chǎn)活性蛋白。抗體或抗體片段可選擇地被連接到生產(chǎn)過(guò)程中用于瞄準(zhǔn)細(xì)胞的分泌信號(hào)序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了假單胞菌株的宿主細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)化以表達(dá)重組哺乳動(dòng)物單鏈，F(xiàn)ab片段和/或全長(zhǎng)抗體或片段或其部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光假單胞菌細(xì)胞可以生產(chǎn)單鏈抗體或其片段或部分。單鏈抗體可包括在單個(gè)穩(wěn)定折疊的多肽上的抗體的抗原結(jié)合區(qū)域。單鏈抗體比傳統(tǒng)的免疫球蛋白小，但是保留了抗體的抗原特異性結(jié)合特性。單鏈抗體可被用于治療，如“裸”單鏈抗體，雙特異的抗體結(jié)合，放射結(jié)合劑或與有效結(jié)構(gòu)域的融合，如腫瘤圖像或體內(nèi)或活體外的腫瘤標(biāo)記分析的診斷學(xué)，研究工具，如蛋白純化和檢測(cè)，包括新的治療靶子的鑒別和定性，抗體微陣列，展示技術(shù)和/或基因或藥物傳送的媒介物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，熒光假單胞菌細(xì)胞生產(chǎn)Fab片段或其部分。Fab片段可以是特定抗體的一片。Fab片段可以保留抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段可以含有兩個(gè)鏈一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈片段。這些片段可通過(guò)連接子或二硫鍵連接。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可在熒光假單胞菌和其他假單胞菌株中表達(dá)全長(zhǎng)抗體。含有Fc區(qū)的完整的抗體可以對(duì)體內(nèi)的降解和清除更具抗性，因此在循環(huán)中具有更長(zhǎng)的半衰期。這些抗體可被用作需要持續(xù)治療的疾病的治療劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在假單胞菌株中生產(chǎn)功能的抗體或其片段，通過(guò)提供一個(gè)含有獨(dú)立的順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋有蛄械谋磉_(dá)載體。獨(dú)立的順?lè)醋颖磉_(dá)載體可以含有用于表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的第一啟動(dòng)子順?lè)醋訉?duì)和用于表達(dá)免疫球蛋白重鏈的第二啟動(dòng)子順?lè)醋訉?duì)，從而使得輕鏈和重鏈的表達(dá)獨(dú)立地分別被不同的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。表達(dá)盒多聚核苷酸中的每一個(gè)順?lè)醋涌梢园刹倏v地連接到編碼全長(zhǎng)抗體的輕鏈或重鏈的核苷酸序列的翻譯啟動(dòng)區(qū)(TIR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TIR序列可被操作以為輕鏈和重鏈提供不同翻譯強(qiáng)度的組合。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，重鏈編碼序列可以如輕鏈編碼序列位于相同的質(zhì)粒上。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈序列可位于同一質(zhì)粒的多順?lè)醋有蛄?，或被編碼到宿主基因組。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)功能抗體或其片段的方法，該宿主細(xì)胞被分別編碼抗體重鏈和輕鏈的兩個(gè)獨(dú)立的翻譯單位轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括a)在合適的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以使得輕鏈和重鏈有續(xù)的表達(dá)，從而暫時(shí)分開(kāi)輕鏈和重鏈產(chǎn)物；b)允許輕鏈和重鏈組裝以形成功能抗體或其片段。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)人治療的單鏈，F(xiàn)ab片段或全長(zhǎng)抗體或其部分，包括但不局限于Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)(ab’)2-亮氨酸拉鏈，F(xiàn)v，dsFv，抗-CD18抗體，嵌合的抗體，人抗體，人源化的抗體，或以下表3描述的那些。
表3抗體及抗體片段





轉(zhuǎn)錄因子的生產(chǎn)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在熒光假單胞菌株宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白表達(dá)后，可被分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白可被純化?？蛇x擇的，蛋白可被復(fù)性以生產(chǎn)活性蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種熒光假單胞菌株宿主細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)化以表達(dá)重組哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子。
適合于插入本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子包括那些螺旋旋轉(zhuǎn)螺旋家族和Pac家族成員，以及本領(lǐng)域中已知的其他轉(zhuǎn)錄因子家族。適合本發(fā)明應(yīng)用的這些家家族的成員包括哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物同源的和類(lèi)似物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、ASNC家家族的轉(zhuǎn)錄因子，如ASNC_trans_reg，被推定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，luxR家家族的細(xì)菌調(diào)節(jié)蛋白；細(xì)菌調(diào)節(jié)的螺旋旋轉(zhuǎn)螺旋轉(zhuǎn)錄因子；arsR家家族的細(xì)菌調(diào)節(jié)蛋白；螺旋旋轉(zhuǎn)螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，特別是rpiR家家族；細(xì)菌調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)菌調(diào)節(jié)的螺旋旋轉(zhuǎn)螺旋轉(zhuǎn)錄因子；DNA結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄因子的MarR家家族；轉(zhuǎn)錄因子的ROK家家族；調(diào)節(jié)蛋白的MerR家家族；精氨酸抑制子轉(zhuǎn)錄因子；firmicute轉(zhuǎn)錄因子；鐵攝取調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子；sigma轉(zhuǎn)錄因子；反應(yīng)調(diào)節(jié)接受轉(zhuǎn)錄因子；色氨酸RNA結(jié)合衰減子蛋白轉(zhuǎn)錄因子；推定的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子；PRD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子；氮調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子；遺傳能力的負(fù)調(diào)節(jié)，如MecA；負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄因子；甘油-3-磷酸反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子；鐵依賴(lài)的抑制子的轉(zhuǎn)錄因子；多種種屬特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄因子。
假單胞菌株表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可被用于診斷、治療或研究應(yīng)用。
載體的制備多聚核苷酸重組哺乳動(dòng)物蛋白和肽可從多聚核苷酸表達(dá)，其中靶肽編碼序列被可操縱地連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)元件，以形成功能基因，宿主細(xì)胞從其表達(dá)蛋白。如果可能，編碼序列可以是靶多肽的天然編碼序列，但也可以是被選擇的，改良的或最佳的用于在選擇的表達(dá)宿主細(xì)胞中的編碼序列例如，通過(guò)合成基因以反映假單胞菌種，如熒光假單胞菌的密碼子使用偏好。所得的基因在一個(gè)或多個(gè)載體內(nèi)被構(gòu)建或?qū)⒈徊迦胼d體，然后被轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞。所說(shuō)的核苷酸或多核苷酸以表達(dá)形式被提供指的是含有至少一個(gè)基因的核苷酸或多核苷酸可以在被選擇表達(dá)宿主細(xì)胞中表達(dá)。
調(diào)節(jié)元件此處所用的調(diào)節(jié)元件可以被可操縱地連接到靶重組哺乳動(dòng)物蛋白編碼基因。此處所用的蛋白編碼基因的編碼序列除了成熟多肽編碼序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件外，可以含有近一步的編碼成分，如，多肽標(biāo)記、前肽(pre-peptide)、前肽(pro-peptide)、前前肽或本領(lǐng)域中其他常用的已知的編碼成分的一個(gè)或多個(gè)編碼序列，排除在選定的表達(dá)宿主細(xì)胞中的分泌信號(hào)肽功能。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”指的是任何構(gòu)建，其中轉(zhuǎn)錄和任何翻譯調(diào)節(jié)元件被共價(jià)鍵地連接到編碼序列，在相對(duì)于編碼序列的位置，使得調(diào)節(jié)元件可以指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)元件在轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞前是整個(gè)基因的部分；可是，在其他實(shí)施方案中，調(diào)解成分是其他基因的部分，其可以是宿主基因組的部分或可以是其他生物體基因組的部分，或可以從其衍生而來(lái)。
啟動(dòng)子和輔助(accessory)成分根據(jù)本發(fā)明所使用的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。有用的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的常用的例子包括衍生自lac啟動(dòng)子的家家族的那些(即，lacZ啟動(dòng)子)，特別地，Deboer的美國(guó)專(zhuān)利No.4,551,433描述的tac和trc啟動(dòng)子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac啟動(dòng)子。
用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中的非-lac型啟動(dòng)子的常用例子包括，例如，那些表4所列出的。
表4非-lac啟動(dòng)子的例子

見(jiàn)，例如J.Sanchez-Romero & V.De Lorenzo(1999)Manual ofIndustrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain & J.Davies，eds.)pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)Current Opinion in Biotechnology 12439-445；and R.Slater & R.Williams(2000)Molecular Biology and Biotechnology(J.Walker & R.Rapley，eds.)pp.125-54。具有選定的細(xì)菌宿主細(xì)胞天然啟動(dòng)子核酸序列的啟動(dòng)子也可以被用于控制編碼靶多肽的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，如假單胞菌氨基苯甲酸鹽或安息香酸鹽操縱子啟動(dòng)子(Pant，Pben)。串連啟動(dòng)子可以被應(yīng)用，其中超過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子可以被共價(jià)連接到另一個(gè)或者相同或不同序列的啟動(dòng)子，如Pant-Pben串連啟動(dòng)子(啟動(dòng)子間雜交(interpromoter hybrid))或Plac-Plac串連啟動(dòng)子。
調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子利用啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白，為了控制其啟動(dòng)子是部分的基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)此處的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子被應(yīng)用時(shí)，相應(yīng)的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白也可以是根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的一部分。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白的例子包括激活子蛋白，如埃希式大腸桿菌代謝產(chǎn)物激活蛋白，MalT蛋白；AraC家家族轉(zhuǎn)錄激活子；抑制蛋白，如埃希式大腸桿菌LacI蛋白；和雙功能調(diào)節(jié)蛋白，如埃希式大腸桿菌NagC蛋白。許多調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白對(duì)是本領(lǐng)域已知的。
啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白與效應(yīng)子(effector)化合物相互作用，即，可逆或不可逆地與調(diào)節(jié)蛋白相連的化合物，從而使蛋白或能釋放或結(jié)合至少一個(gè)在啟動(dòng)子控制下的基因的DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，從而允許或阻止起始基因轉(zhuǎn)錄中的轉(zhuǎn)錄酶的作用。效應(yīng)子化合物可被分類(lèi)為誘導(dǎo)子或共抑制子，這些化合物包括天然效應(yīng)子化合物和安慰誘導(dǎo)的化合物。許多調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白/效應(yīng)子化合物三聯(lián)體(trios)是本領(lǐng)域公知的。盡管有效化合物可在細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵的全程使用，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中使用調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，生長(zhǎng)所需數(shù)量或密度的宿主細(xì)胞生物量后，向培養(yǎng)基中加入恰當(dāng)?shù)挠行Щ衔?，從而使得直接或間接地導(dǎo)致所需靶基因的表達(dá)。
通過(guò)例子，其中使用了lac家族的啟動(dòng)子，lacI基因也可以出現(xiàn)在系統(tǒng)中。lacI基因，其(通常)是組成型的表達(dá)基因，編碼Lac抑制蛋白(LacI蛋白)，該蛋白連接到這些啟動(dòng)子的lac操縱基因上。因此，當(dāng)使用lac家家族啟動(dòng)子時(shí)，lacI基因也可以被包括和表達(dá)在表達(dá)系統(tǒng)中。在lac啟動(dòng)子家族成員的情況下，如，tac啟動(dòng)子，效應(yīng)子化合物是誘導(dǎo)子，如安慰誘導(dǎo)子如IPTG(異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，也稱(chēng)異丙基硫代半乳糖苷)。
其他成分其他調(diào)節(jié)元件也可以包括在表達(dá)構(gòu)建中。這些成分包括但不局限于例如，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列，翻譯增強(qiáng)子序列，其他啟動(dòng)子，激活子，翻譯起始或終止信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止子，順?lè)醋诱{(diào)節(jié)子，多順?lè)醋诱{(diào)節(jié)子，標(biāo)記序列，如核苷酸序列“標(biāo)記”和“標(biāo)記”肽編碼序列，其有助于鑒別，分離，純化，或分離表達(dá)的多肽。
最小的，根據(jù)本發(fā)明的蛋白編碼基因可以包括，除哺乳動(dòng)物蛋白編碼序列外，以下的可操縱地連接于其的調(diào)節(jié)元件啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，轉(zhuǎn)錄終止子，翻譯起始和終止信號(hào)。有用的RBS可以從表達(dá)系統(tǒng)中作為宿主細(xì)胞的任何株獲得，如從選定的宿主細(xì)胞獲得。知道許多特定的和保守的RBS，如那些在D.Frishman et al.(1999)Gene 234(2)257-65；and B.E.Suzek et al.(2001)Bioinformatics17(12)1123-30種描述的。另外，可以使用天然或合成的RBS，如，那些在EP 0207459(synthetic RBSs)；O.Ikehata et al.(1989)Eur.J.Biochem.181(3)563-70(native RBS sequenceof AAGGAAG)中描述的。本發(fā)明中使用的方法，載體和翻譯和轉(zhuǎn)錄成分和其他成分的例子在Gilroy等的美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,055,294和5,128,130；Rammler等的5,281,532；Barnes等的4,695,455和4,861,595；Gray等的4,755,465；和Wilcox的5,169,760中描述。
載體通過(guò)假單胞菌的本發(fā)明的DNA編碼酶的轉(zhuǎn)錄通過(guò)向載體或質(zhì)粒插入增強(qiáng)子序列而被增強(qiáng)。典型的增強(qiáng)子是DNA順式作用元件，通常大小約為10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。例子包括多種假單胞菌增強(qiáng)子，如本文其他處所描述的。
一般地，重組表達(dá)載體將包括復(fù)制原點(diǎn)和允許假單胞菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記，如熒光假單胞菌的非抗生素抗性基因，和從高表達(dá)基因衍生來(lái)的啟動(dòng)子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。此種啟動(dòng)子可衍生自編碼酶的操縱子，該酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)，酸性磷酸酶，或熱休克蛋白，及其它。異源結(jié)構(gòu)序列可以與起始和終止序列以正確的方式比對(duì)，在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠指導(dǎo)翻譯酶分泌的指導(dǎo)序列?？蛇x擇地，異源序列可以編碼融合酶包括給予所需特性的N端識(shí)別肽，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定或簡(jiǎn)單的純化。
在表達(dá)酶中與熒光假單胞菌使用的有用的表達(dá)載體通過(guò)插入編碼所需蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列被構(gòu)建，該DNA序列與適合翻譯起始和終止信號(hào)一起編碼所需蛋白質(zhì)，該翻譯起始和終止信號(hào)位于具有功能的啟動(dòng)子的可操縱的開(kāi)框區(qū)。載體將包含一個(gè)或多個(gè)表型可選擇的標(biāo)記和復(fù)制起始，以確保載體的維持和如果需要，在宿主中提供擴(kuò)增。
作為宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的載體是本領(lǐng)域中已知的，其中任何一個(gè)可被用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的基因。此種載體包括，例如質(zhì)粒、粘粒和噬菌體表達(dá)系統(tǒng)。有用的質(zhì)粒載體的例子包括但不局限于表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS，pDSK519，pKT240，pML122，pPSlO，RK2，RK6，pRO1600，和RSF1010。此種有用的載體的其他的例子包括那些在如N.Hayase(1994)Appl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42；A.A.Lushnikovet al.(1985)Basic Life Sci.30657-62；S.Graupner & W.Wackernagel(2000)Biomolec.Eng.17(1)11-16.；H.P.Schweizer(2001)Curr.Opin.Biotech.12(5)439-45；M.Bagdasarian & K.N.Timmis(1982)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.9647-67；T.Ishii等(1994)FEMS Microbiol.Lett.116(3)307-13；I.N.Olekhnovich & Y.K.Fomichev(1994)Gene 140(1)63-65；M.Tsuda & T.Nakazawa(1993)Gene 136(1-2)257-62；C.Nieto etal.(1990)Gene 87(1)145-49；J.D.Jones & N.Gutterson(1987)Gene61(3)299-306；M.Bagdasarian等(1981)Gene 16(1-3)237-47；H.P.Schweizer等(2001)Genet.Eng.(NY)2369-81；P.Mukhopadhyay等(1990)J.Bact.172(1)477-80；D.O.Wood等(1981)J.Bact.145(3)1448-51；and R.Holtwick等(2001)Microbiology 147(Pt 2)337-44中描述的。
可用于假單胞菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體的進(jìn)一步的例子包括那些在表5種列出的衍生自顯示復(fù)制子的載體。
表5有用的表達(dá)載體的一些例子

表達(dá)質(zhì)粒，RSF1010在F.Heffron等(1975)Proc.Nat’l Acad.Sci.UNA 72(9)3623-27，和K.Nagahari & K.Sakaguchi(1978)J.Bact.133(3)1527-29中被描述。質(zhì)粒RSF1010及其衍生物是本發(fā)明中特別有用的載體。例如，本領(lǐng)域已知的RSF1010有用的衍生物包括如pKT212，pKT214，pKT231和相關(guān)的質(zhì)粒，以及pMYC1050和相關(guān)的質(zhì)粒(見(jiàn)如Thompson等的美國(guó)專(zhuān)利5,527,883和5,840,554)，如pMYC1803。質(zhì)粒pMYC1803衍生自RSF1010為基礎(chǔ)的質(zhì)粒pTJS260(見(jiàn)Wilcox的美國(guó)專(zhuān)利5,169,760)，其采用了調(diào)節(jié)的四環(huán)素抗性標(biāo)記和來(lái)自RSF1010質(zhì)粒的復(fù)制和活動(dòng)位點(diǎn)。其他有用載體的例子包括那些在Puhler等的美國(guó)專(zhuān)利4,680,264中描述的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)質(zhì)粒被用作表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RSF1010或其衍生物被用作表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC1803或其衍生物被用作表達(dá)載體。
通過(guò)使用存在于質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記基因，質(zhì)?？杀槐３衷谒拗骷?xì)胞中。其可是抗生素抗性基因，其中將相應(yīng)的抗生素加入到發(fā)酵培養(yǎng)基上，或任何其他的已知的用于本領(lǐng)域中的選擇標(biāo)記，如原養(yǎng)型(prototrophy-restoring)恢復(fù)基因，其中質(zhì)粒用于宿主細(xì)胞中的是相應(yīng)性狀的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，如生物催化特性如氨基酸生物合成或核苷生物合成特性或碳源利用特性。
分子遺傳學(xué)和基因操縱技術(shù)中所需的廣泛的序列信息是公眾可獲得的。完整的哺乳動(dòng)物核苷酸序列，以及人基因，cDNA序列，氨基酸序列和基因組可從GenBank中獲得，網(wǎng)址URL http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。另外的信息也可以從GeneCard，一個(gè)關(guān)于基因及其產(chǎn)物和生物醫(yī)療應(yīng)用完整信息的電子百科全書(shū)，其來(lái)源于WeizmannInstitute of Science Genome and Bioinformatics(http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)，核苷酸序列信息也可以從EMBL Nucleotide Sequence Database(http//www.ebi.ac.uk/embl/)或the DNA Databank或Japan(DDBJ，http//www.ddbj.nig.acjp/獲得；其他的氨基酸序列信息的網(wǎng)址其它包括Georgetown’s蛋白信息來(lái)源網(wǎng)址(http//www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和Swiss-Prot(http//au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。
轉(zhuǎn)化用載體向假單胞菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域中已知的任何轉(zhuǎn)化方法，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以作為完整的細(xì)胞或原生質(zhì)被轉(zhuǎn)化(即，包括細(xì)胞質(zhì))。轉(zhuǎn)化方法的例子包括穿孔方法，如電穿孔，原生質(zhì)融合，細(xì)菌整合和二價(jià)離子處理如氯化鈣處理或CaCl/Mg2+處理，或其他的本領(lǐng)域公知的方法。見(jiàn)，如Morrison(1977)J.Bact.132349-351；Clark-Curtiss & Curtiss(1983)Methods in Enzymology 101347-362，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2nd ed.)；Kriegler(1990)Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual；和Ausubel et al.，eds.(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology。
假單胞菌生物體盡管此處本發(fā)明主要使用熒光假單胞菌，其他的假單胞菌和密切相關(guān)的細(xì)菌生物體也可以被使用。假單胞菌和密切相關(guān)的細(xì)菌通常是被定義為“革蘭氏(-)變形菌綱亞群1”或“革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌”(Buchanan和Gibbons(eds.)(1974)Bergey’sManual ofDetennifaative Bacteriology，pp.217-289)的部分。
表6“革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌”(Bergey(1974))


“革蘭氏(-)變形菌綱亞群1”也可以包括根據(jù)本分類(lèi)中的標(biāo)準(zhǔn)被分類(lèi)到此標(biāo)題處的變形菌綱。標(biāo)題還可以包括先前但不不在分類(lèi)到此類(lèi)的組群，如噬酸菌屬(Acidovorax)，短波單胞菌屬(Brevundimonas)，伯克氏菌屬(Burkholderia)，噬氫菌屬(Hydrogenophaga)，海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)，勞爾氏菌屬(Ralstonia)，和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)屬(和芽生單胞菌(Blastomonas)屬，源自它們的)是由于重新分組生物體產(chǎn)生的屬于(和先前所稱(chēng)作的種)黃單胞菌(Xanthomonas)屬的重組生物體產(chǎn)生，酸單胞菌(Acidomonas)屬是由于重新分組生物體產(chǎn)生的屬于(和先前所稱(chēng)作的種)醋菌(Acetobacter)屬如Bergey(1974)所定義的醋酸桿菌種的重組生物體產(chǎn)生。另外宿主細(xì)胞可以包括來(lái)自Pseudomonas enalia(ATCC 14393)，生黑假單胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)，和腐敗假單胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)曾經(jīng)被分別重新分類(lèi)為假交替單胞菌(Alteromonas haloplanktis)，生黑交替單胞菌(Alteromonasnigrifaciens)，和腐敗交替單胞菌(Alteromonas putrefaciens)。相似地，例如，噬酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睪丸酮假單胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)曾經(jīng)被分別重新分類(lèi)為叢毛酸單胞菌(Comanonas acidovorans)和睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)；以及生黑假單胞菌(Pseudomonasnigrifaciens)(ATCC 19375)和殺魚(yú)假單胞菌(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)曾經(jīng)被分別重新分類(lèi)為生黑交替假單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和殺魚(yú)交替假單胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群1”還包括分類(lèi)為屬于任意的科的變形桿菌(Proteobacteria)，假單胞菌(Pseudomonadaceae)，固氮菌科(Azotobacteraceae)(目前通常稱(chēng)為同義的，假單胞菌(Pseudomonadaceae)的“固氮菌群”)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，和甲基單胞菌科(Methylomonadaceae)(目前通常稱(chēng)為同義的，“甲基球菌科(Methylococcaceae)”)。因此，除了這里所提到的那些屬，進(jìn)一步變形桿菌屬落入“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群1”中的包括1)固氮菌群細(xì)菌中的固氮根瘤菌(Azorhizophilus)屬；2)假單胞菌科的纖維弧菌屬(Cellvibrio)，Oligella和Teredinibacter屬的細(xì)菌；3)根瘤菌科的Chelatobacter屬，劍菌屬(Ensifer)，Liberibacter屬(也稱(chēng)為″Candidatus Liberibacter″)，和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的細(xì)菌；和4)甲基球菌科的甲基桿菌屬(Methylobacter)，甲基暖菌屬(Methylocaldum)，甲基微菌屬(Methylomicrobium)，甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)和甲基球形菌屬(Methylosphaera)屬的細(xì)菌。另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群2”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群2”被定義成下面的屬的變形桿菌群(group)(這里在括號(hào)中給出了保藏的菌株的目錄號(hào)的總數(shù)，公眾可以獲得的，除非另外說(shuō)明，都保藏在ATCC)酸單胞菌(Acidomonas)(2)；醋菌(Acetobacter)(93)；葡糖桿菌(Gluconobacter)(37)；短波單胞菌(Brevundimonas)(23)；拜葉林克氏菌(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌(Derxia)(2)；布魯氏菌(Brucella)(4)；土壤桿菌(Agrobacterium)(79)；Chelatobacter(2)；劍菌屬(Ensifer)(3)；根瘤菌(Rhizobium)(144)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)(24)；芽生單胞菌(Blastomonas)(1)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)(27)；產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌(Bordetella)(43)；伯克氏菌(Burkholderia)(73)；勞爾氏菌(Ralstonia)(33)；噬酸菌(Acidovorax)(20)；噬氫菌(Hydrogenophaga)(9)；動(dòng)膠菌(Zoogloea)(9)；甲基桿菌屬(Methylobacter)(2)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)(1在NCIMB)；甲基球菌屬(Methylococcus)(2)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)(2)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)(9)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌(Azomonas)(9)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)(5)；固氮菌(Azotobacter)(64)；纖維弧菌(Cellvibrio)(3)；Oligella(5)；假單胞桿菌(Pseudomonas)(1139)；弗蘭西氏菌屬(Francisella)(4)；黃單胞菌(Xanthomonas)(229)；寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)(50)；和海洋假單胞菌(Oceanimonas)(4)。
“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群2”中的典型的宿主細(xì)胞種類(lèi)包括，但是不限于下面的細(xì)菌(在括號(hào)中顯示的ATCC或者其它機(jī)構(gòu)的典型菌株的保藏號(hào))甲醇酸單胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；紋膜醋酸桿菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；Gluconobacteroxydans(ATCC 19357)；短波單胞菌(Brevundimonas diminua)(ATCC11568)；印度貝氏固氮菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC19361)；Derxia gummosa(ATCC 15994)；Brucella melitensis(ATCC23456)，牛種布魯氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)，放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)(ATCC 19358)，發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325)；Chelatobacterheintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；Sinorhizobium fredii(ATCC35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 29837)；糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)(ATCC 8750)；百日咳桿菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；Ralstoniapickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；氫噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667)；生枝動(dòng)膠菌(Zoogloea ramigera)(ATCC 19544)；甲基細(xì)菌(Methylobacter luteus)(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 1912)；甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069)；Methylomicrobiumagile(ATCC 35068)；甲烷甲基單胞菌(Methylononas methanica)(ATCC35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；氮單胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；Azorhizophilus paspali(ATCC 23833)；圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)(ATCC 9043)；對(duì)褐纖維弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM2601)；尿道寡源桿菌(Oligella urethralis)(ATCC 17960)；綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)(ATCC 6223)；嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637)；Xanthomonascampestris(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。
另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群3”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群3”被定義為下面屬中的變形桿菌的群短波單胞菌屬(Brevundimonas)；土壤桿菌屬(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；酸單胞菌(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌屬(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群4”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群4”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群5”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群5”被定義為下面屬中的變形桿菌的組甲基桿菌屬(Methylobacter)；甲基暖菌屬(Methylocaldum)；甲基球菌屬(Methylococcus)；甲基微菌屬(Methylomicrobium)；甲基單胞菌屬(Methylomonas)；甲基八疊球菌屬(Methylosarcina)；甲基球形菌屬(Methylosphaera)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗蘭西氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群6”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群6”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群7”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群7”被定義為下面屬中的變形桿菌的組氮單胞菌屬(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌屬(Azotobacter)；纖維弧菌屬(Cellvibrio)；Oligella；假單胞桿菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群8”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群8”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；芽生單胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；黃單胞菌(Xanthomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群9”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群9”被定義為下面屬中的變形桿菌的組短波單胞菌屬(Brevundimonas)；伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；噬酸菌屬(Acidovorax)；噬氫菌屬(Hydrogenophaga)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和海洋假單胞菌屬(Oceanimonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群10”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群10”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和黃單胞菌(Xanthomonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群11”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群11”被定義為下面屬中的變形桿菌的組假單胞桿菌(Pseudomonas)；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；和黃單胞菌(Xanthomonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群12”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群12”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群13”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群13”被定義為下面屬中的變形桿菌的組伯克氏菌屬(Burkholderia)；勞爾氏菌屬(Ralstonia)；假單胞桿菌(Pseudomonas)和黃單胞菌(Xanthomonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群14”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群14”被定義為下面屬中的變形桿菌的組假單胞桿菌(Pseudomonas)和黃單胞菌(Xanthomonas)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群15”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群15”被定義為假單胞桿菌(Pseudomonas)屬中的變形桿菌的組。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群16”?！案锾m氏(-)變形桿菌綱亞群16”被定義為下面假單胞桿菌(Pseudomonas)種的變形桿菌的組(括號(hào)中顯示的ATCC或其它機(jī)構(gòu)中的典型菌株的保藏號(hào))Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC 10145)；產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；Pseudomonas anguilliseptica(ATCC 33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC 51555)；門(mén)多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC25411)；Pseudomonas nitroreducens(ATCC 33634)；解油極毛桿菌(Pseudomonas oleovorars)(ATCC 8062)；假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligeres)(ATCC 17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC 33636)；蘑菇假單胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；Pseudomonasalcaliphila；Pseudomonas alginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonas asplenii(ATCC 23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC27162)；Pseudomofaas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC 33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora(ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；草莓假單胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；腐臭假單胞菌(Pseudomonastaetrolens)(ATCC 4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC 33616)；Pseudomonas coronfaciens；Pseudomonas diterpeniphila；Pseudomonaselongata(ATCC 10144)；Pseudomonas flectens(ATCC 12775)；氮芽孢桿菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonascedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonasextremorientalis；Pseudomonas fluorescens(ATCC 35858)；Pseudomonasgessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC700871)；邊緣假單胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientais；Pseudomonas rhodesiae；Pseudomonassynxantha(ATCC 9890)；托拉斯假單胞桿(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；威隆氣單胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474)；Pseudomonas frederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonas gingers；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonas halodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudornonashibiscicola(ATCC 19867)；Pseudomonas huttiensis(ATCC 14670)；噬氫假單胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；Pseudomonas jessenii(ATCC700870)；Pseudomonas kilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC 33665)；脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrificans)(ATCC 19244)；Pseudomonas pertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonas oryzihabitans(ATCC43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)；Pseudomonas reactants；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；巴利阿里假單胞菌(Pseudomonasbalearica)；Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonascaricapapayae(ATCC 33615)；菊苣假單孢菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC 35104)；Pseudomonasfuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；丁香假單胞菌(Pseudomonas syringe)(ATCC 19310)；Pseudoinoizas viridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC 35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群17”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群17”被定義為現(xiàn)有技術(shù)中被認(rèn)為是“熒光假單胞菌”的變形桿菌的組包括那些屬于例如下面的假單胞菌的種Pseudomonasazotoformans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皺紋假單胞菌(Pseudomonas corrugata)；Pseudomonas extremorientalis；熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonas mandelii；邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginalis)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)；抗假單胞菌(Pseudomonas tolaasii)和威隆氣單胞菌(Pseudomonas veronii)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群18”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群18”被定義為熒光假單胞菌種的所有亞種，變體，菌株，和其它的亞種單元，包括那些屬于例如下面的(括號(hào)中顯示的是ATCC或其它機(jī)構(gòu)中的典型菌株的保藏號(hào))熒光假單胞菌生物型A，也稱(chēng)為生物變體(biovar)1或者生物變體I(ATCC13525)；熒光假單胞菌生物型B，也稱(chēng)為生物變體2或者生物變體II(ATCC 17816)；熒光假單胞菌生物型C，也稱(chēng)為生物變體3或者生物變體III(ATCC 17400)；熒光假單胞菌生物型F，也稱(chēng)為生物變體4或者生物變體IV(ATCC12983)；熒光假單胞菌生物型G，也稱(chēng)為生物變體5或者生物變體V(ATCC17518)；熒光假單胞菌生物變體VI；熒光假單胞菌PfO-1；熒光假單胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；熒光假單胞菌SBW25和熒光假單胞菌subsp.cellulosa(NCIMB 10462)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群19”。“革蘭氏(-)變形桿菌綱亞群19”被定義為熒光假單胞菌生物型A的所有菌株的組。這種生物型的特別優(yōu)選的菌株是熒光假單胞菌菌株MB101(參考美國(guó)專(zhuān)利No.5,169,760(see US Patent No.5,169,760 to Wilcox))，及其衍生物。其衍生物的一個(gè)例子是熒光假單胞菌MB214，通過(guò)插入被構(gòu)建到MB 101染色體asd(天冬氨酸脫氫酶基因)位點(diǎn)，一個(gè)天然的E.coliPlacI-lacI-lacZYA構(gòu)建(即，其中PlacZ被刪除)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是假單胞菌目的任意變形菌。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是假單胞菌科的任何變形菌。
其他的熒光假單胞菌也可被用在本發(fā)明，包括Migula熒光假單胞菌和Loitokitok熒光假單胞菌，具有以下的ATCC指定(NCIB 8286)；NRRL B-1244；NCIB8865 strain C01；NCIB8866 strain C02；1291(ATCC 17458；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；pyrrolidine；PW2(ICMP 3966；NCPPB 967；NRRL B-899)；13475；NCTC 10038；NRRLB-1603(6；IFO 15840)；52-1C；CCEB488-A(BU 140)；CCEB 553(IEM15/47)；IAM 1008(AHH-27)；IAM 1055(AHH-23)；1(IFO 15842)；12(ATCC 25323；NIH 11；den Dooren de Jong 216)；18(IFO 15833；WRRL P-7)；93(TR-10)；108(52-22；IFO15832)；143(IFO 15836；PL)；149(2-40-40；IFO 15838)；182(IFO 3081；PJ 73)；184(IFO15830)；185(W2L-1)；186(IFO 15829；PJ 79)；187(NCPPB 263)；188(NCPPB 316)；189(PJ227；1208)；191(IFO 15834；PJ 236；22/1)；194(Klinge R-60；PJ 253)；196(PJ288)；197(PJ 290)；198(PJ302)；201(PJ368)；202(PJ 372)；203(PJ 376)；204(IFO15835；PJ682)；205(PJ686)；206(PJ 692)；207(PJ 693)；208(PJ 722)；212(PJ 832)；215(PJ849)；216(PJ 885)；267(B-9)；271(B-1612)；401(C71A；IFO 15831；PJ 187)；NRRL B-3178(4；IFO 15841)；KY8521；3081；30-21；(IFO3081)；N；PYR；PW；D946-B83(BU 2183；FERM-P3328)；P-2563(FERM-P 2894；IFO 13658)；IAM-1126(43F)；M-1；A506(A5-06)；A505(A5-05-1)；A526(A5-26)；B69；72；NRRLB-4290；PMW6(NCIB 11615)；SC 12936；A1(IFO 15839)；F 1847(CDC-EB)；F 1848(CDC 93)；NCIB10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC2583(NCIB 8194)；H13；1013(ATCC 11251；CCEB 295)；IFO 3903；1062；或Pf-5。
發(fā)酵術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”即包括文字上使用發(fā)酵的實(shí)施方案，也包括其他使用非發(fā)酵培養(yǎng)方式的實(shí)施方案。發(fā)酵可以以任何規(guī)模進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以選自豐富的培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和礦物鹽培養(yǎng)基；可以使用豐富的培養(yǎng)基，但典型地應(yīng)該避免。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇基本培養(yǎng)基和礦物鹽培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以選用基本培養(yǎng)基。
礦物鹽培養(yǎng)基包括礦物鹽和碳源，如葡萄糖、蔗糖或甘油。礦物鹽培養(yǎng)基的例子包括，如M9培養(yǎng)基，假單胞菌培養(yǎng)基(ATCC 179)，Davis和Mingioli培養(yǎng)基(見(jiàn)，BD Davis & ES Mingioli(1950)J.Bact6017-28)。用于制備礦物鹽培養(yǎng)基的礦物鹽包括，如磷酸鉀，氯化銨或硫酸銨，氯化鎂或硫酸鎂，和微量礦物質(zhì)如氯化鈣，硼酸鹽，鐵、銅、鎂和鋅的硫酸鹽。典型地，沒(méi)有有機(jī)氮源，如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物包括在礦物鹽培養(yǎng)基中。相反，使用無(wú)機(jī)氮源，其可以選自如，銨鹽，氨水和氨氣。礦物鹽培養(yǎng)基典型地含有葡萄糖作碳源。與礦物鹽培養(yǎng)基比較，基本培養(yǎng)基可以含有礦物鹽和碳源，但也可以補(bǔ)充有如低水平氨基酸，維生素，蛋白胨，或其他成分，盡管這些成分的量是微小的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用下列表7中列出的成分制備培養(yǎng)基。可以以下列的順序加入成分首先(NH4)HPO4，KH2PO4和檸檬酸可以溶于大約30升蒸餾水中；然后加入微量成分溶液，隨后加入除泡沫試劑，如Ucolub N115。然后，熱消毒后(如大約在121℃)，加入消毒的葡萄糖MgSO4和硫胺-HCL?？墒褂冒彼刂苝H在大約6.8。然后可加入消毒的蒸餾水以調(diào)節(jié)初始容量至371減去甘油儲(chǔ)存液(123ml)。化學(xué)物可從多個(gè)供應(yīng)商得到，如Merck。此培養(yǎng)基可允許高細(xì)胞密度的培養(yǎng)(HCDC)以使假單胞菌種和相關(guān)的細(xì)菌生長(zhǎng)。HCDC可以以批量方式起始，隨后使用雙向反饋(two-phase fed-batch)批量培養(yǎng)。在批量部分的最終生長(zhǎng)后，可以降低的特定培養(yǎng)速率控制生長(zhǎng)，在3倍的時(shí)間內(nèi)，生物量濃度可增加幾倍。此培養(yǎng)方法的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在Riesenberg，D等(1991)″High cell density cultivation of Escherichia coli atcontrolled specific growth rate″J Biotechnol 20(1)17-27中描述了。
表7培養(yǎng)基成分




根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可以在任何發(fā)酵形式中培養(yǎng)。例如，此處可應(yīng)用批量，反饋批量，半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵模式。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可用于任何發(fā)酵規(guī)模(即，容積)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，可以使用如微升規(guī)模，厘升規(guī)模和1/10公升規(guī)模的發(fā)酵容積，可用1升或更大發(fā)酵體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵容積是或超過(guò)1升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵容積可以是或超過(guò)5、10、15、20、25、50、75、100、200、500、1000、2000、5000、10000或50000升。
在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)、培養(yǎng)和/或發(fā)酵在允許宿主細(xì)胞存活的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，此溫度范圍為包括大約4℃至55℃。另外，“生長(zhǎng)”用于指活細(xì)胞分裂和/或增大的生物狀態(tài)以及維持新陳代謝的非分裂和/或非增大的細(xì)胞任生物狀態(tài)，后一種應(yīng)用的同義詞是“維持”。
細(xì)胞密度在表達(dá)重組哺乳動(dòng)物蛋白中應(yīng)用熒光假單胞菌的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括與大腸桿菌和其他細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比，熒光假單胞菌能夠以高細(xì)胞密度生長(zhǎng)。由于此，根據(jù)本發(fā)明的熒光假變形菌綱表達(dá)系統(tǒng)可以提供大約20g/L或更多的細(xì)胞密度。根據(jù)本發(fā)明的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)還可以提供至少大約70g/L的細(xì)胞密度，當(dāng)術(shù)語(yǔ)以每體積中的生物量考慮時(shí)，其中測(cè)量的生物量是干細(xì)胞的重量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞密度至少是20g/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞密度至少是25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、或至少150g/L。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度是介于20-150g/L之間，介于20-120g/L之間、介于20-80g/L之間、介于25-80g/L之間、介于30-80g/L之間、介于35-80g/L之間、介于40-80g/L之間、介于45-80g/L之間、介于50-80g/L之間、介于50-75g/L之間、介于50-70g/L之間、介于40-80g/L之間。
分離和純化通過(guò)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，本發(fā)明的蛋白可被分離純化為基本純，已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不局限于硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水反應(yīng)色譜，親和性色譜，鎳色譜，羥磷灰石色譜，反向色譜，血凝素色譜，預(yù)備電泳，去垢劑可溶，用諸如色譜柱、免疫純化方法和其他方法進(jìn)行的選擇性沉淀。例如，具有設(shè)定分子黏附特性的蛋白質(zhì)可以被可逆地結(jié)合與配體。與適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合，蛋白可選擇性地吸附于純化柱上，然后以相對(duì)純的形式從柱上游離。然后通過(guò)酶反應(yīng)除去融合蛋白。另外，可使用免疫親和柱或Ni-NTA柱純化蛋白。一般的技術(shù)進(jìn)一步在如R.Scopes(1982)Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-VerlagN.Y.；Deutscher(1990)Guide to ProteinPurification，Academic Press；U.S.Patent No.4,511,503；S.Roe(2001)Protein Purification TechniquesA PracticalApproach，Oxford Press；D.Bollag，et al.(1996)Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.；AK Patra et al.(2000)Protein Expr Purif，18(2)182-92；和R.Mukhija，et al.(1995)Gene 165(2)303-6中描述。也可見(jiàn)，例如，Deutscher(1990)″Guide to ProteinPurification，″Methods in Enzymology vol.182，一次系列中的其他；Coligan，et al.(1996 and periodic Supplements)CurrentProtocols in Protein Science，Wiley/Greene，NY；和使用蛋白純化產(chǎn)物的操作手冊(cè)，如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。結(jié)合重組技術(shù)可以融合適當(dāng)?shù)钠?，如通過(guò)蛋白酶除去的序列可融合至FLAg序列或相應(yīng)的序列。也見(jiàn)，例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)″Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent″in Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle andMethods 1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe，et al.(1992)QIAexpressThe High Level Expression & ProteinPurification System QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。
通過(guò)本領(lǐng)域的已知方法檢測(cè)表達(dá)的蛋白，包括，例如放射免疫分析，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或免疫沉淀。
可以通過(guò)多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化重組生產(chǎn)的和表達(dá)的酶，例如，如果需要，可以使用高效液相色譜(HPLC)作為最終的純化步驟。
在本發(fā)明中表達(dá)的某種蛋白可形成不溶的聚集物(“包涵體”)。一些方法適合于從包涵體中純化蛋白。例如，包涵體的純化典型地包括通過(guò)破壞宿主細(xì)胞提取、分離和/或純化包涵體，例如，在50mMTRIS/HCl pH 7.5，50mMNaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF緩沖液中孵育。典型地通過(guò)使用French Press通過(guò)2-3次裂解細(xì)胞懸濁液。也可以使用Polytron(Brinkrnan Instruments)或在冰上超生波降解來(lái)使細(xì)胞懸濁液均一化。可選擇的裂解細(xì)菌的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的(見(jiàn)，例如，Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniatis eds.(1989)″Molecular CloningALaboratory Manual″，2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel et al.，eds.(1994)Current Protocols in MolecularBiology)。
如果必要，包涵體可被可溶，被裂解的細(xì)胞懸濁液典型地被離心以除去不想要的不溶性物質(zhì)。形成包涵體的蛋白質(zhì)可被相容的緩沖液稀釋或透析以復(fù)性。適合的溶劑包括但不局限于尿素(從大約4M到8M)，甲酰胺(至少大約80％，容積/容積)，和鹽酸胍(從大約4M到8M)。盡管鹽酸胍和同源的試劑是變性劑，這種變性不是不可逆的，可通過(guò)除去(例如通過(guò)透析)或稀釋變性劑來(lái)復(fù)性，從而允許再形成免疫和/或生物活性蛋白。其他合適的緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
可替換的，還可以從宿主周質(zhì)中純化重組蛋白。裂解宿主細(xì)胞后，當(dāng)重組蛋白被向外輸送到宿主細(xì)胞周質(zhì)時(shí)，除本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法外，可用冷的滲透沖擊分離細(xì)菌的周質(zhì)部分。例如，為了從周質(zhì)中分離重組蛋白，可離心細(xì)菌細(xì)胞以形成沉淀?？捎煤?0％的蔗糖緩沖液再次可溶沉淀。為了裂解細(xì)胞，可離心細(xì)菌并在冰冷的5mMMgSO4中再次懸浮沉淀，在冰上保持大約10分鐘。離心細(xì)胞懸浮液，倒出上清保存。存在于上清中的重組蛋白可用本領(lǐng)域已知的方法從宿主蛋白中分離出來(lái)。
初始的鹽分餾法可從感性趣的重組蛋白中分離許多不想要的宿主細(xì)胞蛋白(或從細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的蛋白)。一個(gè)例子是硫酸銨。通過(guò)有效地降低蛋白混合物中的水的量，硫酸銨沉淀蛋白。然后蛋白質(zhì)根據(jù)其可溶度沉淀。蛋白質(zhì)越是疏水，越可能被低濃度的硫酸氨沉淀。典型的方法包括向蛋白溶液中加入飽和硫酸銨，以使得硫酸銨濃度在20-30％之間。此濃度可以使多數(shù)疏水蛋白沉淀。然后去除沉淀物(除非感興趣的蛋白質(zhì)是疏水的)，硫酸銨加入到上清中的濃度是已知沉淀感興趣蛋白的濃度。然后將沉淀溶于緩沖液，如果必要，通過(guò)透析或雙過(guò)濾除去過(guò)量的鹽。也可以使用依賴(lài)蛋白可溶度的其他方法分離復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，如乙醇沉淀，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
重組蛋白分子量可被用于從大或小分子的蛋白中分離其，通過(guò)不同孔尺寸的膜的超過(guò)濾(如，Amicon或Millipore膜)。作為第一步，通過(guò)一個(gè)膜來(lái)超過(guò)濾，該膜的孔尺寸可使比感興趣蛋白分子量小的分離。保留的過(guò)濾液可再進(jìn)行超過(guò)濾，通過(guò)一個(gè)膜使鼻感興趣蛋白的分子量大的分子分離。重組蛋白通過(guò)膜進(jìn)入過(guò)濾液中。然后將過(guò)濾液如下所述進(jìn)行色譜分析。
也可以根據(jù)其尺寸、表面凈電荷、疏水性和與配體的親和性將重組蛋白從其他蛋白分離。另外，抗蛋白的抗體可以與柱矩陣結(jié)合，從而使蛋白被免疫純化。所有的方法是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，色譜技術(shù)可以在任何規(guī)模下進(jìn)行，且可以使用許多不同廠家的設(shè)備(如，Pharmacia Biotech)是顯而易見(jiàn)的。
復(fù)性和折疊不可溶的蛋白能夠被復(fù)性和折疊以生產(chǎn)二級(jí)和三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象。如果必要，在完成重組產(chǎn)物的構(gòu)象中可以使用蛋白折疊步驟。可以使用本領(lǐng)域中已知的試劑完成折疊和復(fù)性，以促進(jìn)蛋白的分離/結(jié)合。例如，蛋白可與二硫化物共同培養(yǎng)，隨后與氧化谷胱甘肽二鈉鹽培養(yǎng)，隨后與含有折疊試劑如尿素的緩沖液培養(yǎng)。
重組蛋白也可以被復(fù)性，例如磷酸緩沖液鈉(PBS)或50mM醋酸鈉，pH6的緩沖液加200mM NaCl將其透析?？商鎿Q地，當(dāng)固定在柱上蛋白可被折疊，如Ni-NTA柱，通過(guò)使用在500mM NaCl，20％甘油，20mMTris/HClpH7.4含有蛋白抑制劑的6M-1M尿素梯度?？捎?.5小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行復(fù)性。蛋白復(fù)性后可通過(guò)加入250mM的咪唑(immidazole)洗脫。最后可用PBS或50mM醋酸鈉，pH6的緩沖液加200mMNaCl的透析步驟除去咪唑。被純化的蛋白在4℃或-80℃冰凍保存。
其他方法包括，例如那些在MH Lee et al.(2002)ProteinExpr.Purif.25(1)166-73；W.K.Cho et al.(2000)J.Biotechnology 77(2-3)169-78；Deutscher(1990)″Guide toProtein Purification，″Methods in Enzymology vol.182，和此系列的其他卷；Coligan，et al.(1996and periodic Supplements)Current Protocols in Protein Science，Wiley/Greene，NY；S.Roe(2001)Protein Purification TechniquesA Practical Approach，Oxford Press；D.Bollag，et al.(1996)Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.中描述了。
活性蛋白或肽的分析典型地，“活性蛋白”包括與相應(yīng)的天然蛋白相比具有生物功能或生物作用的蛋白。在蛋白質(zhì)的上下文中，典型地指包括生物功能或生物作用至少是具有標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的天然蛋白的大約20％、大約50％、大約60％、大約70％、大約75％、大約80％、大約85％、大約90％、大約95％、大約98％、或100％的多核苷酸或多肽。蛋白活性的確定可使用特定蛋白的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的靶的比較生物方法。重組蛋白生物功能或作用的一個(gè)指標(biāo)是重組多肽與天然蛋白有交叉免疫反應(yīng)性。
活性蛋白典型地具有天然哺乳動(dòng)物蛋白特異的活性的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。進(jìn)一步，底物特異性(Kcat/Km)可選擇地基本上與天然哺乳動(dòng)物蛋白相似。典型地，Kcat/Km至少是天然蛋白的30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。分析和定量測(cè)量蛋白、肽活性和底物特異性(Kcat/Km)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可通過(guò)任何本領(lǐng)域中已知的蛋白質(zhì)特異的傳統(tǒng)或標(biāo)準(zhǔn)的體外或體內(nèi)分析來(lái)測(cè)量重組哺乳動(dòng)物蛋白的活性。假單胞菌生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的活性可以與相應(yīng)的天然哺乳動(dòng)物蛋白活性相比較，以確定重組哺乳動(dòng)物蛋白在相同或相似的生理?xiàng)l件下是否與一般情況下觀察到的天然蛋白的活性基本上相同或相似。
重組蛋白的活性可以與事先建立起來(lái)的天然蛋白的標(biāo)準(zhǔn)活性相比較?？蛇x擇地，重組蛋白的活性可以用于天然蛋白同時(shí)的，或基本上同時(shí)的比較分析確定。例如，可以使用體外分析確定重組蛋白與靶子之間任何可測(cè)得的相互作用，如表達(dá)的酶和底物之間，表達(dá)的激素和激素受體之間，表達(dá)的抗體和抗原之間等。此種檢測(cè)可以包括如凝膠電泳和/或凝膠排除方法、磷酸化能力、抗體特異性分析如ELISA分析等方法測(cè)量的比色度的變化、增殖的變化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞排斥、放射活性改變、溶解度改變，分子量改變等。另外，體內(nèi)分析包括但不局限于與天然蛋白的生理作用相比較分析測(cè)量假單胞菌生產(chǎn)的蛋白的生理作用，如，重量的獲得、電解平衡的變化、血凝時(shí)間的變化、凝塊可溶和誘導(dǎo)抗原反應(yīng)的變化。一般而言，只要該活性是可分析的，就可使用任何體內(nèi)或體外方法確定假單胞菌生產(chǎn)的重組哺乳動(dòng)物蛋白的活性以允許其與天然蛋白比較?？蛇x擇的，可以分析本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白的刺激或抑制蛋白或通常與該蛋白相互作用的的分子間的相互反應(yīng)的能力，如，天然蛋白通常與之作用的底物或信號(hào)路徑的成分。此種分析典型地可以包括在允許蛋白與靶分子相互作用的條件下，使蛋白與底物分子結(jié)合，檢測(cè)蛋白與靶分子相互作用的生化結(jié)果。
可以用來(lái)確定蛋白活性的分析，在例如Ralph，P.J.，etal.(1984)J.Immunol.1321858；Saiki et al.(1981)J.Immunol.1271044；Steward，W.E.II(1980)The Interferon Systems.Springer-Verlag，Vienna and New York；Broxmeyer，H.E.，et al.(1982)Blood 60595；Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniaiseds.(1989)″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Berger，S.L.and A.R.Kimmel eds.(1987)″Methods in EnzymologyGuide to MolecularCloning Techniques″，Academic Press；AK Patra et al.(2000)Protein Expr Purif 18(2)182-92；Kodama et al.(1986)J.Biochem.991465-1472；Stewart et al.(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA905209-5213；Lombillo et al.(1995)J.Cell Biol.128107-115；Vale et al.(1985)Cell 4239-50中描述了。
實(shí)施例菌株和生長(zhǎng)條件除非特別指出，所有用于假單胞菌表達(dá)試驗(yàn)的菌株都是基于熒光假單胞菌株MB101。埃希氏大腸桿菌株JM109(Promega)，X12蘭(Stratagene)或Top10(Invitrogen)用于一般的克隆。為了進(jìn)行埃希氏大腸桿菌表達(dá)的研究，使用BL21(DE3)Gold。熒光假單胞菌在LB或如需要在30℃補(bǔ)充有15ug/ml四環(huán)素和30ug/ml卡那霉素基本鹽培養(yǎng)基。埃希氏大腸桿菌株如需要在37℃在補(bǔ)充有30ug/ml卡那霉素和/或15ug/ml氯霉素或15ug/ml四環(huán)素的LB上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)期后，細(xì)胞用0.3mM的IPTG誘導(dǎo)。
蛋白活性檢測(cè)(ELISA分析)向微量(microtiter)平板的每個(gè)孔中加入200ul的PBS(pH7.6)中的10ug/ml的β-半乳糖溶液，包被平板。在室溫下?lián)嵊桨?6小時(shí)，然后用200L PBS+0.1％Tween-20(PBS-T)洗3次。用具有2％脫脂干牛奶(w/v)的PBS稀釋一級(jí)抗體。將200uL稀釋抗體加入每孔，室溫下?lián)嵊?小時(shí)。然后用200μL PBS-T沖洗平板4次。用具有2％脫脂干牛奶(w/v)的PBS稀釋二級(jí)抗體，向每孔加入200μL，室溫?fù)嵊?.5-2小時(shí)。然后用PBS-T沖洗平板4次。用3級(jí)抗體檢測(cè)scFv抗體堿性磷酸酶連接的羊抗鼠抗體(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA商品號(hào)#A5324)。向每一孔中加入200μL稀釋的抗體溶液(或PBS-T)，室溫?fù)嵊?.5小時(shí)。然后用PBS-T沖洗平板4次。向每孔中加入200μL新制備的Sigma Fast pNPP底物(Sigma商品號(hào)#R-2770)。30分鐘后，向每孔中加入50μL 3M NaOH終止反應(yīng)，在405nm下測(cè)量吸光度。
發(fā)酵熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)的接種是通過(guò)接種含有600mL補(bǔ)充有酵母提取物和葡萄糖的化學(xué)限定的培養(yǎng)基的搖瓶接種完成的。典型地加入四環(huán)素以確保在過(guò)夜培養(yǎng)以及在發(fā)酵罐中重組質(zhì)粒在起始培養(yǎng)中的維持。然后無(wú)菌地將搖瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有化學(xué)定義培養(yǎng)基的20升發(fā)酵罐中，該培養(yǎng)基支持高生物量，沒(méi)有酵母提取物的培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)中通過(guò)調(diào)節(jié)流向發(fā)酵罐的氣流和攪拌混合率使氧氣維持于高水平；通過(guò)加入氨水使pH保持在6以上。反饋批次高密度發(fā)酵方法分為大約24小時(shí)的起始(initiation)生長(zhǎng)期和基因表達(dá)(誘導(dǎo))期，其中加入誘導(dǎo)劑啟動(dòng)重組基因表達(dá)。以谷物漿形式存在的葡萄糖，以被限制的濃度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中被加入。用于啟動(dòng)誘導(dǎo)期的靶細(xì)胞密度典型地在575nm下是150OD。典型地發(fā)酵誘導(dǎo)期進(jìn)行大約45-55小時(shí)。在此期間，從發(fā)酵罐中提取樣本，用于各種分析，以確定靶基因表達(dá)，細(xì)胞密度等水平。
對(duì)于埃希氏大腸桿菌的每次發(fā)酵試驗(yàn)，從-80℃取出冰凍的甘油保存液，在接種到含有600ml LB的補(bǔ)充有卡那霉素的培養(yǎng)基前溶化并稀釋。搖瓶培養(yǎng)在300rpm下，37℃孵育一夜，然后無(wú)菌地轉(zhuǎn)移到含有復(fù)合培養(yǎng)基的20L的發(fā)酵罐中。通過(guò)加入氨水和磷酸，發(fā)酵罐的溫度維持在37℃，pH在7，可溶的氧大于20％。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的起始階段，以逐漸增加的步驟加入甘油以維持過(guò)多的碳。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到600nm下24-28OD時(shí)，加入誘導(dǎo)劑，如異丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)影響表達(dá)。典型地，發(fā)酵的誘導(dǎo)期持續(xù)大約3-5小時(shí)當(dāng)發(fā)酵罐達(dá)到容積能力或當(dāng)生長(zhǎng)率開(kāi)始顯著下降時(shí)。在此期間，從發(fā)酵罐中提取樣本進(jìn)行各種分析，以確定靶基因表達(dá)、細(xì)胞密度等的水平。
細(xì)胞分餾和SDS-PAGE分析樣本被標(biāo)準(zhǔn)化至A575＝30，沉淀1mL標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)液。在ImL裂解緩沖液中(50mM Tris base；200mM NaCI；5％ v/v甘油；20mM EDTA二鈉鹽；0.5％ v/v Triton X-100；1mM DTT)再懸浮細(xì)胞。將細(xì)菌裂解液特異的蛋白酶抑制劑溶液(Sigma#P8465)加入至1X濃度。將再懸浮的細(xì)胞加入到有0.1mm玻璃珠的2ml的有旋轉(zhuǎn)蓋子的離心管中，大約至3/4飽和，用4，1分鐘培養(yǎng)機(jī)在BioSpec珠壓榨機(jī)(beedmill)的最高設(shè)定下，機(jī)械地裂解細(xì)胞。孵育期間在冰上放置細(xì)胞。從小珠中除去大約100uL裂解的細(xì)胞液，轉(zhuǎn)移到新試管并離心。將上清(可溶部分)移至新的試管。沉淀(不溶部分)在裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑中以相等體積再懸浮(100uL)。5uL每種樣本加入到5uL的2×LDS裝載緩沖液(Invitrogen)，向4-12％或10％ Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上加樣，并在1×MES或1×MOPS緩沖液中電泳，如所示。
實(shí)施例1scFV在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)作為診斷和治療試劑，單鏈抗體片段(scFV)被發(fā)現(xiàn)有更多的用途。這些相對(duì)小的蛋白通過(guò)融合編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)的基因制得。
Gal13 scFv克隆Gal13 scFv基因(Genbank進(jìn)入號(hào)AF238290)))))))，被克隆到噬菌體表達(dá)載體pCANTAB6，(見(jiàn)P Martineau等(1998)J.Mol.Biol.280(1)117-27)被用作模板來(lái)擴(kuò)增774堿基對(duì)的產(chǎn)物，其隨后被克隆到pCR2.1 TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。用SpeI和SalI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)從TOPO載體中提取scFv基因，并克隆到熒光假單胞菌載體pMYC1803的SpeI和XhoI位點(diǎn)，Ptac啟動(dòng)子的下游，以生產(chǎn)pDOW1117。得到的質(zhì)粒被電穿孔至熒光假單胞菌。將Gal13克隆到pET24d+表達(dá)載體(Novagen，Madison，WI，USA)，隨后擴(kuò)增使得Sail和NcoI位點(diǎn)位于編碼序列兩端。用SalI和NcoI消化PCR產(chǎn)物，并克隆到pET24d+載體相同的位點(diǎn)，T7啟動(dòng)子的下游。然后用新形成的構(gòu)建轉(zhuǎn)化XL2 Blue感受態(tài)細(xì)胞。確定序列后，用DNA構(gòu)建轉(zhuǎn)化BL21(DE3)Gold(Stratagene，San Diego，CA，USA)以用于表達(dá)。
在埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌中表達(dá)單鏈抗體片段(scFv)scFv分子在埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌中表達(dá)，其中scFv具有與埃希氏大腸桿菌蛋白β-半乳糖苷酶單鏈抗體gall3的結(jié)合活性(P.Martineau等，″Expression of an antibody fragment at highlevels in the bacterial cytoplasm，″J.Mol.Biol.280(1)117-27(1998))。在20L發(fā)酵期間，熒光假單胞菌表達(dá)比埃希氏大腸桿菌多6倍的蛋白，通過(guò)SDS-PAGE和密度計(jì)量學(xué)檢測(cè)到熒光假單胞菌中的產(chǎn)量為3.1g/L，而埃希氏大腸桿菌中的產(chǎn)量為0.5g/L(見(jiàn)表8)。熒光假單胞菌表達(dá)大約96％的可溶蛋白，而埃希氏大腸桿菌僅表達(dá)48％的可溶蛋白。
表8Gal13發(fā)酵分析(*與BSA標(biāo)準(zhǔn)比較)

如表2所示從兩種表達(dá)系統(tǒng)中純化的物質(zhì)在酶聯(lián)免疫反應(yīng)中(ELISA)均發(fā)現(xiàn)有活性。使用親和性色譜法物質(zhì)也被從兩株的裂解液等量的裂解容積的可溶部分純化。最后，從熒光假單胞菌的方法中回收的體積比大腸桿菌大約有效20倍，分別為1.34g/L和0.07g/L。
實(shí)施例2在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)人γ-IFN人γ干擾素的克隆人γ干擾素(人γ-IFN，Genbank進(jìn)入號(hào)X13274)被從人脾cDNA文庫(kù)中(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；商品號(hào)#10425-015)擴(kuò)增，從而使其缺乏天然分泌信號(hào)，具有如PW Gray等(1982)Nature298859-63種描述的以Met-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro開(kāi)始的重組γ-IFN的N端。將得到的產(chǎn)物克隆到pCR2.1 TOPO載體，并測(cè)序。人γ-IFN基因從具有SpeI和XhoI限制酶位點(diǎn)的TOPO載體中切下，并被克隆到pMYC1803相同的位點(diǎn)。在一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中，γ-IFN被擴(kuò)增以使得AflIII和XhoI位點(diǎn)位于編碼序列兩端。將得到的片段克隆到TOPO-TA載體(Invitrogen)，并轉(zhuǎn)化到化學(xué)上感受態(tài)的E.coli JM109細(xì)胞(Promega，Madison，WI，USA)。用AflIII和XhoI消化分離基因(NewEngland Biolabs)，克隆到pET24d+(Novagen，Madison，WI，USA)的NcoI和XhoI位點(diǎn)，位于T7啟動(dòng)子下游，并轉(zhuǎn)化至JM109。陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen)用于表達(dá)測(cè)試。
人γ干擾素的純化將來(lái)自于熒光假單胞菌培養(yǎng)物的冰凍細(xì)胞糊融解，在裂解緩沖液(50mM磷酸鉀，pH 7.2含有50mMNaCl，10mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，商品號(hào)BPII8-500，F(xiàn)isherScientific，Springfield，NJ，USA)，1mM PMSF(phenylmethylsul fonyl fluoride，商品號(hào)P-7626，Sigma，St.Louis，MO)，1mM二硫代蘇糖醇(商品號(hào)D-0632，Sigma)，和1mM苯甲脒(商品號(hào)B-6506，Sigma))以每2mL裂解緩沖液1g細(xì)胞糊的比率再懸浮。將細(xì)胞三次通過(guò)一個(gè)微液化器(model 110Y，MicrofluidicsCorporation，Newton，MA，USA)打碎。通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片和未碎的細(xì)胞(23,708xg，60分鐘，4℃，并使用Beckman Coultercentrifuge；model JA 25.50，Beckman Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA，USA)。通過(guò)加入10％ w/v硅藻土(Celite product，World Minerals，Inc.，Goleta，CA，USA)澄清(clarify)得到的上清(無(wú)細(xì)胞提取物)，并通過(guò)真空過(guò)濾的紙濾紙(Whatmanl，商品號(hào)1001-150，WhatmanPaper Ltd.，Maidstone，Kent，UK))。
將澄清的細(xì)胞提取物時(shí)加到3.2cm×13.5cm SP-Sepharose FASTFLOW(6％交聯(lián)瓊脂糖珠物質(zhì)；商品號(hào)17-0709-10，AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA)的色譜柱上，以0.5mL/min流速用緩沖液A平衡。緩沖液A的組分是50mM HEPES，pH 7.8(即N-(2-羥基乙基)哌嗪)N’-(2-磺乙酸)，來(lái)自Fisher Scientific，商品號(hào)BP-310-100)，50mM NaCl，ImM EDTA，和0.02％疊氮化鈉(商品號(hào)71289，Sigma Chemical Co.)。加樣后，用3倍柱容積的緩沖液A(柱容積＝108mL)和5倍柱容積的含有0.4M NaCl的緩沖液A清洗柱。在相同的緩沖液以流率2mL/min用7倍柱容積進(jìn)一步向柱加一個(gè)0.4M到1MNaCl的梯度。然后收集含有純的IFN-γ的部分，并用1×PBS(磷酸緩沖液鈉鹽，pH 7.2)在4℃透析。通過(guò)超濾濃縮蛋白(使用YM30超濾膜；商品號(hào)13722，來(lái)自Millipore，Bedford，MA USA)，然后在液氮中冷凍，保存在-80℃。
在埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌中表達(dá)人γ-干擾素通過(guò)發(fā)酵表達(dá)γ-IFN基因的埃希氏大腸桿菌商業(yè)地生產(chǎn)人γ-干擾素。蛋白質(zhì)以不可溶及非活性形式在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。為了生產(chǎn)作為活性藥學(xué)成份的重組多肽，必須回收、可溶、折疊和純化干擾素。所有這些單元操作大大增加此蛋白的了產(chǎn)品成本(COGs)。人脾cDNA文庫(kù)被用作模板，擴(kuò)增γ-IFN cDNA，而不需要天然信號(hào)序列和克隆到埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌表達(dá)載體中。在典型的20L發(fā)酵反應(yīng)中熒光假單胞菌生產(chǎn)約4g/Lγ-IFN蛋白?？扇芎筒豢扇懿糠值腟DS-PAGE和Western分析表明大多數(shù)蛋白(95％)存在于可溶部分。圖1表明從熒光假單胞菌可溶部分純化的γ-IFN呈現(xiàn)與商售標(biāo)準(zhǔn)可比較的活性。圖5和圖9表明埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)間γ-IFN表達(dá)的比較。
表9γ-IFN發(fā)酵總結(jié)(*與BSA標(biāo)準(zhǔn)比較)


人γ干擾素活性分析細(xì)胞系和培養(yǎng)基Hela細(xì)胞(商品號(hào)CCL-2)和腦心肌炎病毒(ECMV，商品號(hào)VR-129B)從American Type Culture Collection(Manassas，VA)得到。HeLa細(xì)胞在37℃，5％的CO2的條件下，在Eagles修飾的重要培養(yǎng)基中保持(Cellgro EMEM，Mediatech，Herdon，VA，USA)，該培養(yǎng)基具有10％胎牛血清(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。
純化的hu-γIFN被如前所述的病毒抑制分析法分析(JA Lewis(1987)in Lymphokines and InterferonsA Practical Approach MJClemens et al.(eds.)(IRL Press Ltd，Oxford，England)。簡(jiǎn)言之，在96-孔微平板上以3×104每孔鋪HeLa細(xì)胞。24小時(shí)后，將從熒光假單胞菌或埃希氏大腸桿菌重組hu-γIFN(from R & D Systems，Minneapolis，MN，USA)中分離的純化的hu-γIFN以每孔0，0.01或0.05ng加入到三孔。用hu-γIFN予培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，向每三孔以不同的稀釋度加入ECMV。將細(xì)胞孵育5天，然后使用監(jiān)控5-溴-2’-脫氧尿苷結(jié)合(catalogue no.1647229，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN，USA)的細(xì)胞增殖ELISA檢測(cè)細(xì)胞生存能力。結(jié)果以吸光度表示，吸光度越大，有分裂活性的細(xì)胞越多。
實(shí)施例3在細(xì)胞質(zhì)中hGH的表達(dá)設(shè)計(jì)引物從人cDNA文庫(kù)擴(kuò)增人生長(zhǎng)激素(hGH)。為了此研究，根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，使用AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer)擴(kuò)增hGH，使用上述質(zhì)粒做模板，并使用引物ELVIrev和hgh-sig，PCR循環(huán)程序?yàn)?5℃ 2分鐘(95℃ 60秒，42℃ 120秒，72℃ 3分鐘)25X。用Wizard PCR DNA純化試劑盒(Promega)純化得到的產(chǎn)物，用SpeI和XhoI限制酶(New England Biolabs)消化并克隆到pMYC1803相同的位點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。使用hgh-sigcorr引物和ELVIrev糾正在hGH擴(kuò)增中發(fā)現(xiàn)的突變，重復(fù)PCR和克隆步驟。
用于克隆hGH的引物。

hGH的純化20L發(fā)酵后，從埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌細(xì)胞不可溶的部分純化hGH，除在DEAE FF洗脫梯度使用0到0.5MnaCl而不是0.25MNaCl的步驟。
埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌中人生長(zhǎng)激素的表達(dá)從人垂體cDNA文庫(kù)擴(kuò)增cDNA編碼的人生長(zhǎng)激素。除去天然分泌信號(hào)序列，且N-端的蛋氨酸被連接到構(gòu)建中用于微生物表達(dá)。對(duì)于埃希氏大腸桿菌的表達(dá)，含有hGH基因的pET25載體被轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，其含有hGH轉(zhuǎn)錄所需的整合的T7聚合酶基因。熒光假單胞菌表達(dá)的研究在MB214株上進(jìn)行，其含有整合的lad基因以控制從Ptac啟動(dòng)子的表達(dá)。兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)均在20L發(fā)酵規(guī)模下分析。如表10所示，熒光假單胞菌(Pf)比埃希氏大腸桿菌(EC)每克干生物量生產(chǎn)更多的蛋白質(zhì)(是其1.6X)。
表10hGH發(fā)酵總結(jié)(*與BSA標(biāo)準(zhǔn)比較)

細(xì)胞分餾法和SDS-PAGE分析表明hGH在兩種表達(dá)系統(tǒng)的不溶部分存在(圖4)。令人驚奇地，與埃希氏大腸桿菌相比，從熒光假單胞菌中純化出大約7倍更多的hGH單體，盡管每克干生物量的蛋白產(chǎn)物僅有1.6倍的差別。
表11從埃希氏大腸桿菌和熒光假單胞菌中純化的hGH的比較


實(shí)施例4周質(zhì)中蛋白的表達(dá)分泌信號(hào)肽的特征通過(guò)形成和表達(dá)堿性磷酸酶(phoA)編碼的序列基因組DNA融合發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的分泌信號(hào)肽，在2004年11月22日提交的美國(guó)申請(qǐng)No.10/996,007中描述了。如下進(jìn)一步定性了6種表達(dá)融合。
鑒別為phoA融合的分泌基因信號(hào)序列的切點(diǎn)通過(guò)與來(lái)自其他假單胞菌的相同的蛋白比較導(dǎo)出，使用SPScan程序(Menne等2000)。公認(rèn)的脂蛋白的切點(diǎn)通過(guò)與信號(hào)肽酶II基序比較導(dǎo)出；信號(hào)肽酶II特異地切斷脂蛋白酶的信號(hào)序列。使用SignaIP(用于分析公認(rèn)信號(hào)肽的軟件程序；可從丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心獲得，網(wǎng)址http//www.cbs.dtu.dklservices/SignalP/.)分析所有6個(gè)信號(hào)肽。也見(jiàn)，Nielson等(1997)Protein Engineering 101-6。在一些情況下，用補(bǔ)充的來(lái)源進(jìn)一步定性信號(hào)肽的鑒別。此信息在表12中列出。
表12分泌信號(hào)肽的鑒別

為檢測(cè)融合蛋白的phoA融合蛋白的蛋白印跡分析為了分析是否生產(chǎn)融合蛋白，用抗堿性磷酸酶抗體的蛋白印跡分析通過(guò)離心的全細(xì)胞部分(細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì))和沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基部分。在確定插入位點(diǎn)的5個(gè)菌株中，四個(gè)(公認(rèn)的銅藍(lán)蛋白，公認(rèn)的堿性磷酸酶結(jié)合蛋白，公認(rèn)的周質(zhì)脂蛋白B，公認(rèn)的Fe(III)結(jié)合蛋白)生產(chǎn)了具有預(yù)期大小的融合蛋白，一個(gè)(公認(rèn)的oprE蛋白)生產(chǎn)了比預(yù)期小大約40kD的蛋白，一個(gè)(公認(rèn)的Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白)生產(chǎn)了比預(yù)期小大約20kD的蛋白。
用SDS-PAGE分離蛋白并使用Xcell SureLockTM Mini-Cell和XCell II TM Blot Module(Invitrogen)，在40V，1小時(shí)的條件下轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。使用SuperSignal West HisProbeTM試劑盒(Pierce)提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白印跡分析。
Pbp-hGH融合的構(gòu)建、表達(dá)和定性將熒光假單胞菌磷酸結(jié)合蛋白分泌引導(dǎo)子融合至人生長(zhǎng)激素(hGH)基因成熟結(jié)構(gòu)域的N端，并檢測(cè)表達(dá)和分泌。
從熒光假單胞菌一個(gè)克隆的pbp信號(hào)序列做模板用PCR擴(kuò)增Pbp信號(hào)序列編碼區(qū)，使用sig～pbp(gctctagaggaggtaacttatgaaactgaaacg)和pbp～hgh(gggaatggttgggaaggocacogcgttggc)引物，然后純化凝膠。這使得生產(chǎn)含有pbp信號(hào)肽CDS和編碼hGH成熟結(jié)構(gòu)域5’端的編碼序列的寡核苷酸片段。
從人垂體cDNA文庫(kù)(Clontech，Palo Alto CA)PCR擴(kuò)增cDNA編碼的人生長(zhǎng)激素，使用引物ELVlfor(agagaactagtaaaaaggagaaatccatggctacaggctcccggacgtcc)和ELVlrev(agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccac)，其被設(shè)計(jì)成僅擴(kuò)增hGH的成熟區(qū)，并克隆到pMYCl 803/Spel Xhol，形成pDOW2400。pDOW2400擴(kuò)增成熟hGH基因，使用引物pbp_hgh_revcomp(gccaacgcggtggccttcccaaccattccc)和hgh-_rev(agagactcgagtcattagaagc cacagctgccctccacagagcggcac)，然后用Strataprep columns(Stratagene)純化，除去引物和其他反應(yīng)成分。為合成編碼pbp-hGH融合的多聚核苷酸，聯(lián)合兩個(gè)PCR反應(yīng)，用sig_pbp和hug_rev擴(kuò)增以連接兩個(gè)片段。用如上所述的Strataprep純化預(yù)期的681bp的片段，Xbal和Xhol限制性消化，并連接至脫磷酸的pDOW1269/XholSpel以形成pDOW 1323-10，將pbp-hGH放置在與pMYC1803相同的載體的tac啟動(dòng)子的控制下，但是用pyrF選擇性標(biāo)記替代tetR四環(huán)素抗性標(biāo)記基因。連接的混合物轉(zhuǎn)化至MB101 pyrF proc laclQ′。使用上述方法通過(guò)Dow Chemical Company測(cè)序插入物。此融合的DNA和氨基酸序列分別在(表10)和(表11)表示。
首先在搖瓶規(guī)模下檢測(cè)得到的菌株。用SDS-PAGE檢測(cè)出預(yù)期大小的誘導(dǎo)帶用于處理(processed)和未處理的(unprocessed)(分別為22.2kDa和24.5kDa)。大約一半的蛋白被處理(指定向周質(zhì)的位置)，在處理的中有一半在可溶的部分，另一半在不可溶的部分。表達(dá)研究被放大到20-L規(guī)模的生物反應(yīng)器中。庫(kù)馬斯染色的SDS-PAGE凝膠的密度學(xué)表明總hGH的18％是處理的和可溶的。菌株生產(chǎn)所有形式的hGH 3.2g/L；處理的及可溶的為0.6g/L。
pbp-scFv融合的構(gòu)建、表達(dá)和定性磷酸結(jié)合蛋白的公認(rèn)的24個(gè)氨基酸信號(hào)序列(例，包括Metl)被融合到gal2 scFv基因(gal2)的開(kāi)框區(qū)，在+2氨基酸的(Ala)位置。見(jiàn)圖8和圖9。信號(hào)序列看起來(lái)是被處理的，顯示出分泌到周質(zhì)。而且，有分泌到培養(yǎng)基的，其中在不含細(xì)胞的培養(yǎng)上清中檢測(cè)到蛋白。令人驚奇的是，融合到磷酸結(jié)合蛋白信號(hào)序列看起來(lái)改良了gal2 scFv在熒光假單胞菌中的表達(dá)。沒(méi)有融合在氨基末端的分泌信號(hào)，就檢測(cè)不到gal2scFv的表達(dá)。
Gal2的克隆用引物sig_pbp(上述)和pbp_gal2SOE rev(ctgcacctgggcggccaccgcgtt)進(jìn)行PCR，其含有pbp_gal2SOE的反向互補(bǔ)(aaccgcggtggccgcccaggtgcag)，用編碼熒光假單胞菌pbp分泌信號(hào)肽的質(zhì)粒作模板。這得到了寡居核苷酸片段含有pbp信號(hào)肽編碼序列(CDS)和gal2單鏈抗體(scAb or scFv)5′端的CDS。
用引物pbp_gal2SOE和scFv2rev(acgcgtcgacttattaatggtgatgatggtgatgtgcggccgcacgtttgatc)進(jìn)行PCR，用gal2-編碼的多核苷酸作模板。這得到了含有編碼pbp信號(hào)肽3′端的CDS和編碼gal2開(kāi)框區(qū)(ORE)的多核苷酸片段。
純化反應(yīng)產(chǎn)物。用大約15ng每種產(chǎn)物作″模板″DNA，在進(jìn)一步的PCR反應(yīng)中使用引物sig_pbp_for和scFv2rev。這得到了一個(gè)具有融合至gal2編碼序列的pbp信號(hào)肽CDS的核苷酸片段。信號(hào)序列的預(yù)期的-1氨基酸(即在計(jì)劃切點(diǎn)前的最后一個(gè)氨基酸)被融合到gal2 scFv(Ala)的+2氨基酸。將得到的融合克隆至熒光假單胞菌載體pMYC1803，使其在Ptac啟動(dòng)子的控制下生產(chǎn)質(zhì)粒和pDOW1123(pbpgal2)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到攜帶質(zhì)粒pCN51-lacl的熒光假單胞菌株MB101(如2004年11月19日提交的美國(guó)申請(qǐng)No.10/994,138種所述的)。
的磷酸結(jié)合蛋白信號(hào)序列與gal2 scFv的融合磷酸結(jié)合蛋白信號(hào)序列被融合到單鏈抗體基因，并檢測(cè)其分泌到周質(zhì)和/或培養(yǎng)上清。
表13分泌的Gal2發(fā)酵總結(jié)(*與BSA標(biāo)準(zhǔn)比較)

首先在搖瓶規(guī)模檢測(cè)發(fā)酵的菌株。通過(guò)在不溶的蛋白部分的SDS-PAGE檢測(cè)未處理的和處理的gal2誘導(dǎo)帶的預(yù)期大小(29kDa和27kDa)(數(shù)據(jù)末顯示)。表達(dá)研究放大到20L發(fā)酵的規(guī)模。再次，SDS-PAGE分析表明大部分誘導(dǎo)的蛋白存在于不溶的蛋白質(zhì)部分。
蛋白印跡分析也表明一些處理的gal2存在于pbpgal2(pDOW1123)的可溶蛋白部分。從攜帶pDOW 1123的菌株制備的周質(zhì)部分的蛋白印跡分析(使用Epicentre periplast kit)表明存在可溶的gal2蛋白。
使用Qiagen Ni-NTA方法，重組gal2 scFv被從搖瓶實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞提取液中分離，然后如P.Martineau et al.，J Mol.Biol.280117-127(1998)種所述折疊。發(fā)現(xiàn)此抗體在ELISA分析中有抗β-半乳糖苷酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種增加重組哺乳動(dòng)蛋白表達(dá)的方法，包括a.用編碼重組哺乳動(dòng)物蛋白的核苷酸轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌宿主細(xì)胞；和b.在允許重組哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的條件下生長(zhǎng)該細(xì)胞；其中，當(dāng)在基本上可比較的條件下與埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的該蛋白的表達(dá)水平比較時(shí)，該蛋白在一個(gè)增加的水平上被表達(dá)。
2.如權(quán)力要求1的方法，其進(jìn)一步包括分離重組哺乳動(dòng)物蛋白。
3.如權(quán)力要求2的方法，其進(jìn)一步包括基本上提純?cè)撝亟M哺乳動(dòng)物蛋白。
4.如權(quán)力要求1的方法，其中所述重組哺乳動(dòng)物蛋白以可溶的形式存在于該宿主細(xì)胞中。
5.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以不可溶的形式存在于宿主細(xì)胞中。
6.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以活性形式存在于該宿主細(xì)胞中。
7.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白是人的肽。
8.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以超過(guò)總細(xì)胞蛋白的大約5％被生產(chǎn)。
9.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以超過(guò)總細(xì)胞蛋白的大約10％被生產(chǎn)。
10.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少10g/L的濃度被生產(chǎn)。
11.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少20g/L的濃度被生產(chǎn)。
12.如權(quán)力要求1的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少40g/L的濃度被生產(chǎn)。
13.一種在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的方法，其包括a.用編碼重組哺乳動(dòng)物蛋白的核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；b.在允許一種重組哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的條件下生長(zhǎng)一種細(xì)胞；c.分離該重組哺乳動(dòng)物蛋白。
14.如權(quán)力要求13的方法，其進(jìn)一步包括基本上提純的該重組哺乳動(dòng)物蛋白。
15.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以可溶形式存在于該宿主細(xì)胞中。
16.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以不可溶形式存在于該宿主細(xì)胞中。
17.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以活性形式存在于該宿主細(xì)胞中。
18.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白是人的肽。
19.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白的質(zhì)量介于至少為1kD至大約500kD之間。
20.如權(quán)力要求19的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白的質(zhì)量大于大約30kD。
21.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以大于細(xì)胞總蛋白的大約5％被生產(chǎn)。
22.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以大于細(xì)胞總蛋白的大約10％被生產(chǎn)。
23.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少10g/L的濃度被生產(chǎn)。
24.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少20g/L的濃度被生產(chǎn)。
25.如權(quán)力要求13的方法，其中該重組哺乳動(dòng)物蛋白以至少40g/L的濃度被生產(chǎn)。
26.在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組人蛋白的方法，其包括a.用編碼重組人肽的核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；b.在允許重組人肽表達(dá)的條件下生長(zhǎng)該細(xì)胞；其中該宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。
27.如權(quán)力要求26的方法，其中該重組人蛋白以可溶的形式存在于該宿主細(xì)胞。
28.如權(quán)力要求26的方法，其中該重組人蛋白以活性形式存在于該宿主細(xì)胞。
29.一種含有編碼重組人肽的核苷酸的熒光假單胞菌細(xì)胞。
30.如權(quán)力要求29的細(xì)胞，其中該重組人肽被表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明是在假單胞菌中表達(dá)重組哺乳動(dòng)物蛋白的產(chǎn)量的改良方法，特別是在熒光假單胞菌生物體中。該方法在可比較的環(huán)境下，比已知的表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌提高了哺乳動(dòng)物蛋白的產(chǎn)量，特別是人或人衍生蛋白的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)分離的哺乳動(dòng)物，特別是人蛋白質(zhì)的改良的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1910281SQ200580002645
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月16日
發(fā)明者D·M·雷托拉克, C·H·斯夸爾斯, D·C·沃特金斯, F·H·格特納, S·L·李, R·舒特爾 申請(qǐng)人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司