專利名稱：維生素c的微生物生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對L-抗壞血酸(維生素C)進(jìn)行的微生物生產(chǎn)。
維生素C對人來說是非常重要且不可缺少的營養(yǎng)因子之一，通過所謂的“Reichstein方法”已能對其進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)，該方法作為技術(shù)上成熟的方法已被人們所熟知。但是該方法包含大量復(fù)雜的步驟，并且難于獲得總產(chǎn)量的任何提高。因此，已有大量建議，企圖用于減少步驟數(shù)量和/或提高總產(chǎn)量。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中，使用屬于Ketogulonicigenium屬的微生物將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。
底物到維生素C的轉(zhuǎn)化指，導(dǎo)致產(chǎn)生維生素C的底物轉(zhuǎn)化是通過屬于Ketogulonicigenium屬的微生物來進(jìn)行的，即，底物可被直接轉(zhuǎn)化為維生素C。在允許上文定義的此類底物轉(zhuǎn)化進(jìn)行的條件下，對所述微生物進(jìn)行培養(yǎng)，例如，將微生物與底物直接接觸。還可以使用例如靜止細(xì)胞、丙酮處理過的細(xì)胞、被凍干的細(xì)胞、被固定的細(xì)胞等形式的微生物，以在底物上直接發(fā)揮作用。通過使用通氣，可使用本身已知能作為用于微生物的培養(yǎng)技術(shù)的方法的任何手段，優(yōu)選地，攪拌深浸式發(fā)酵罐。進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)選細(xì)胞濃度范圍為每ml大約10mg至大約700mg濕細(xì)胞，更優(yōu)選地，每ml大約30mg至大約500mg濕細(xì)胞。
本文中使用的培養(yǎng)基可以是用于生產(chǎn)維生素C的任何合適的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是水性培養(yǎng)基，其中包含，例如，鹽、底物并且具有一定的pH。
碳源可以作為底物使用，例如D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、L-葡萄糖或L-古洛糖-γ-內(nèi)酯。優(yōu)選地，底物選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更優(yōu)選地，L-山梨糖酮。
屬于Ketogulonicigenium屬的合適的微生物可以例如，選自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其能夠進(jìn)行本發(fā)明的底物到維生素C轉(zhuǎn)化的突變體。在本發(fā)明的一個方面，屬于Ketogulonicigenium屬的微生物選自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其突變體，但排除Ketogulonicigenium vulgareDSM 4025或其突變體。
在一種實施方式中，本發(fā)明提供了從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括將選自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其突變體的微生物與L-山梨糖酮在反應(yīng)混合物中接觸，以及從反應(yīng)混合物中對維生素C進(jìn)行分離和純化。
應(yīng)當(dāng)理解，“Ketogulonicigenium robustum”和“Ketogulonicigeniumvulgare”還包括上述物種的具有同樣的生理屬性的異名(synonym)或基源異名(basonym)，如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義的。
在本文中，上文提到的微生物的“突變體”指其基因組序列發(fā)生了改變的、但仍能進(jìn)行本發(fā)明的方法所提供的從底物(例如，L-山梨糖酮)到維生素C的轉(zhuǎn)化的微生物?？梢酝ㄟ^任何傳統(tǒng)方法來獲得突變體，包括，例如，化學(xué)和UV誘變接著針對目標(biāo)表型進(jìn)行篩選或選擇，體外構(gòu)建功能缺陷基因，這可以通過下述方法來進(jìn)行，所述方法包括用于對微生物基因組中完整基因段進(jìn)行替換的重組技術(shù)，單雙交叉重組以及其它已知技術(shù)。見，Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Harwood and Cutting，Molecular Biology Methods For Bacillus，John Wiley and Sons(1990)，pp.27-74。合適的誘變劑包括但不限于，紫外射線、X-射線、γ-射線和化學(xué)誘變劑，例如，氮芥或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍。此外，可以通過本身為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于此目的的任何方法，對通過自發(fā)突變產(chǎn)生的克隆進(jìn)行分離來獲得突變體。
在一種優(yōu)選的實施方式中，用于本發(fā)明方法的微生物選自由K.robustum NRRL B-21627、K.vulgare NRRL B-30035、K.vulgare NRRL B-30036、1. vulgare NRRL B-30037N及其各自的突變體所構(gòu)成的組。
K.robustum NRRL B-21627被描述于US 5,834,231中。菌株K.vulgareNRRL B-30035、K.vulgare NRRL B-30036和K.vulgare NRRL B-30037N被描述于US 6,316,231 B1中。公眾可從Agricultural Research CultureCollection(NRRL)，1815N.University Street，Peoria，Illinois 61604，USA獲得這些菌株。
在一種實施方式中，本發(fā)明提供了從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括將屬于Ketogulonicigenium屬的微生物與L-山梨糖酮在反應(yīng)混合物中接觸，以及從反應(yīng)混合物中對維生素C進(jìn)行分離和純化。
本文中使用的“將微生物與L-山梨糖酮在反應(yīng)混合物中接觸”包括在含有L-山梨糖酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。還可以使用例如靜止細(xì)胞、丙酮處理過的細(xì)胞、被凍干的細(xì)胞、被固定的細(xì)胞等形式的微生物，以在底物(即L-山梨糖酮)上直接發(fā)揮作用。通過使用通氣，可使用本身已知能作為與用于微生物的培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)的方法的任何手段，優(yōu)選地，攪拌深浸式發(fā)酵罐。開展反應(yīng)的優(yōu)選細(xì)胞濃度范圍為每ml大約10mg至大約700mg濕細(xì)胞，更優(yōu)選地，每ml大約30mg至大約500mg濕細(xì)胞。
合適的“反應(yīng)混合物”可以是水或本領(lǐng)域內(nèi)已知用于培養(yǎng)微生物的任何營養(yǎng)培養(yǎng)基。此類營養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源和其它無機(jī)鹽，其可被微生物所利用。通常用于使微生物更好地生長的多種營養(yǎng)物質(zhì)可能被適當(dāng)?shù)匕ㄟM(jìn)培養(yǎng)基。
此類營養(yǎng)物的例子，例如可吸收的碳源包括但不限于，甘油、D-甘露醇、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、衛(wèi)矛醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖?？上牡矗缬袡C(jī)物質(zhì)，包括但不限于，蛋白胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液。多種無機(jī)物質(zhì)也可作為氮源使用，例如硝酸鹽和銨鹽。此外，培養(yǎng)基通常含有無機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、磷酸鉀和碳酸鈣。
對本發(fā)明微生物的培養(yǎng)可在大約4.0至大約9.0的pH下進(jìn)行，其中，可以優(yōu)選保持為大約5.0至大約8.0的pH。培養(yǎng)期隨pH、溫度和所用的營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其優(yōu)選為大約1至5天，最優(yōu)選為大約1至3天。優(yōu)選用于開展本發(fā)明方法的溫度是大約13至大約36℃之間的溫度，更優(yōu)選的是大約18至大約33℃之間的溫度。
雖然底物例如L-山梨糖酮的濃度可以隨反應(yīng)條件變化，但是反應(yīng)優(yōu)選在底物濃度為大約2至大約120mg/ml的條件下進(jìn)行，更優(yōu)選地，濃度為大約4至大約100mg/ml。在一種實施方式中，本發(fā)明的方法在L-山梨糖酮濃度為大約2至大約120mg/ml的條件下進(jìn)行，更優(yōu)選地，濃度為大約4至大約100mg/ml。
可通過可適于利用產(chǎn)物性質(zhì)的任何已知的傳統(tǒng)方法，來分離和純化由此產(chǎn)生并積聚在反應(yīng)混合物中的維生素C，維生素C可被分離為游離的酸或鈉、鉀、鈣、銨等鹽。
特別地，分離可以通過下述步驟的任何合適的組合或重復(fù)來進(jìn)行通過形成鹽，通過利用產(chǎn)物和周圍雜質(zhì)間屬性(例如，溶解度、可吸收性和溶劑間的分配系數(shù))的差異，通過吸收(例如在離子交換樹脂上)進(jìn)行。上述任何過程單獨或組合使用，就構(gòu)成了用于分離產(chǎn)物的傳統(tǒng)方法。由此獲得的產(chǎn)物可用傳統(tǒng)手段進(jìn)行進(jìn)一步分離，例如，通過重結(jié)晶或色譜。
根據(jù)本發(fā)明，在減少步驟數(shù)量方面的改進(jìn)是明顯的，因為其獲得了用于從底物(例如，L-山梨糖酮)生產(chǎn)維生素C的單步驟途徑。
在下述實施例中，將對本發(fā)明的方法進(jìn)行更為詳細(xì)的闡述。
實施例1用靜止細(xì)胞系統(tǒng)從L-山梨糖酮來生產(chǎn)維生素C于30℃在Triptic Soy Agar(Difco，Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)上對K.robustum NRRL B-21627和K.vulgare菌株NRRL B-30035、NRRL B-30036和NRRL B-30037N進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從平板收獲細(xì)胞，將其懸浮到1ml 50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中，用同樣的緩沖液洗兩次。對菌株NRRL B-21627、NRRL B-30035、NRRL B-30036和NRRL B-30037N而言，在600nm處測得的細(xì)胞懸浮液光學(xué)密度分別為12.2、12.5、16.2和11.2。這些數(shù)字分別對應(yīng)于每ml 31.7、32.5、42.1和29.1mg的濕細(xì)胞重量。
反應(yīng)混合物(試管中，5ml)含有0.9ml的細(xì)胞懸浮液和0.1ml的50mg/ml L-山梨糖酮，其處于50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)。通過加入細(xì)胞懸浮液來開始反應(yīng)。在30℃，于顛倒式振蕩器上180rpm下對反應(yīng)混合物進(jìn)行3小時的培養(yǎng)。反應(yīng)之后，在8000×g下對反應(yīng)混合物進(jìn)行10分鐘的離心，以獲得上清液。用HPLC來測量上清液中的維生素C含量。
柱YMC-Pack Polyamine II(150×4.6mm i.d.)，YMC Co.Ltd，Kyoto，Japan洗脫劑50mM NH4H2PO4/乙腈＝30/70流速1ml/分鐘檢測在250nm處的UV吸收在上述HPLC條件下，維生素C的駐留時間為7.7分鐘。用該HPLC分析，所有被測試菌株的反應(yīng)產(chǎn)物都被證實為維生素C。
表1顯示了菌株NRRL B-21627、NRRL B-30035、NRRL B-30036和NRRL B-30037N產(chǎn)生的維生素C的量。
表1從L-山梨糖酮進(jìn)行的維生素C生產(chǎn)
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中，用屬于Ketogulonicigenium屬的微生物將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述底物選自由D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、L-葡萄糖和L-古洛糖-γ-內(nèi)酯所構(gòu)成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括將屬于Ketogulonicigenium屬的微生物與所述底物在反應(yīng)混合物中接觸，以及從所述反應(yīng)混合物中對維生素C進(jìn)行分離和純化。
4.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括將屬于Ketogulonicigenium屬的微生物與L-山梨糖酮在反應(yīng)混合物中接觸，以及從所述反應(yīng)混合物中對維生素C進(jìn)行分離和純化。
5.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中，所述微生物選自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其突變體。
6.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中，所述微生物選自由Ketogulonicigenium robustum NRRL B-21627、Ketogulonicigenium vulgareNRRL B-30035、Ketogulonicigenium vulgare NRRL B-30036、Ketogulonicigenium vulgare NRRL B-30037N所構(gòu)成的組。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中，所述方法在大約4.0至大約9.0的pH下和大約13至大約36℃的溫度下進(jìn)行。
8.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中，所述方法在大約5.0至大約8.0的pH下和大約18至大約33℃的溫度下進(jìn)行。
9.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中，所述方法在L-山梨糖酮濃度為大約2至大約120mg/ml的條件下進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述方法在L-山梨糖酮濃度為大約4至大約100mg/ml的條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從底物，例如L－山梨糖酮，來生產(chǎn)維生素C的方法，其中使用屬于Ketogulonicigenium屬的微生物。
文檔編號C12P17/04GK1914326SQ200580003669
公開日2007年2月14日 申請日期2005年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者星野龍男, 杉澤輝秀 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司