專利名稱：具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性的蛋白,編碼該蛋白的基因 ...的制作方法
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及了能夠水解葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖的酶，該酶的基因，表達(dá)該酶的細(xì)胞及其生產(chǎn)方法。更具體來說，本發(fā)明涉及了一種酶，它不僅由于其抑制牙菌斑的形成和降解以前形成的牙菌斑的能力而可以用在抗牙菌斑組合物或漱口液中，而且由于其水解葡聚糖的良好能力而可以用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖，此外還涉及了編碼該酶的基因，表達(dá)該酶的細(xì)胞以及生產(chǎn)該酶的方法。
2、相關(guān)技術(shù)描述牙菌斑是在牙齒上沉積的生物膜，來自于牙齒表面的微生物定居。牙菌斑的主體由被稱為葡聚糖(不溶性葡聚糖)的細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖構(gòu)成，它也被稱為齒斑葡聚糖，能夠增強(qiáng)定居。該多糖總數(shù)達(dá)到牙菌斑干重的大約20％，是導(dǎo)致齲齒的重要因素。對變體鏈球菌(Streptococcus mutans)產(chǎn)生的葡聚糖進(jìn)行的結(jié)構(gòu)研究表明，不溶性葡聚糖中的葡萄糖部分彼此之間主要通過α-1，3-、α-1，4-、和α-1，6-D-糖苷鍵連接。因此，有效地消除牙菌斑需要齒斑葡聚糖、淀粉和葡聚糖水解活性。
按照常規(guī)，防止牙菌斑和齲齒的形成主要依靠抑制口腔中的變體鏈球菌的生長。由于這一點(diǎn)，具有抗變體鏈球菌生長活性的化合物例如抗菌劑或氟，被包含在口腔產(chǎn)品例如牙膏或漱口液中。氟是一種流行的抗齲洞化合物，因?yàn)樗軌蛞种谱凅w鏈球菌的生長，但是它也能夠引起牙齒氟中毒(在牙釉質(zhì)中形成色斑)以及副作用例如強(qiáng)烈的毒性和空氣污染。已經(jīng)進(jìn)行了另一種預(yù)防齲齒的嘗試，就是使用酶例如葡聚糖酶；但是，它的效果還沒有得到證實(shí)。
美國專利No.5,741,773提供了含有具有抗牙菌斑和抗齲齒活性的配糖巨肽的牙粉組合物。這種常規(guī)技術(shù)目的在于抑制引起齲齒的細(xì)菌的生長。但是，還沒有建議防止牙菌斑的形成或水解以前形成的牙菌斑。
授權(quán)于本發(fā)明人的美國專利No.6,485,953(對應(yīng)于韓國專利No.10-0358376)提出使用能夠水解多種結(jié)構(gòu)多糖的DXAMase來抑制牙菌斑的形成并降解以前形成的牙菌斑。除了能夠水解多種多糖的酶之外，生產(chǎn)該酶的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)和含有該酶的組合物也被公開了。
然而，對于能夠更有效地抑制牙菌斑的形成并水解以前形成的牙菌斑的新酶的需求仍然存在。
在韓國專利申請No.10-2001-48442中，本發(fā)明人還提出由韓國專利No.10-0358376的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)產(chǎn)生的酶DXAMase，由于其高度的葡聚糖降解活性，可以用于除去葡聚糖。
因此，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)存在著明顯的需求，開發(fā)具有葡聚糖降解活性的新酶，其活性足夠用于在糖生產(chǎn)過程中除去葡聚糖。
發(fā)明概述因此，在本發(fā)明的形成過程中一直考慮著現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，并且本發(fā)明的目的是提供新的酶，它具有防止牙菌斑的形成和降解以前形成的牙菌斑的活性以及良好的葡聚糖水解活性，以及提供編碼該酶的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供帶有該基因的菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)該酶和該基因的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有該酶的可以在工業(yè)中使用的組合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性的蛋白，該蛋白的衍生物或片段。
本發(fā)明的另一方面提供了具有SEQ.ID.No.2序列，編碼該蛋白、該蛋白的衍生物或片段的基因，該基因的衍生物或片段。
本發(fā)明的另一方面提供了表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性的酶的方法，包括培養(yǎng)細(xì)胞；在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)該酶；以及純化表達(dá)的酶。
附圖簡述根據(jù)下面的詳細(xì)描述以及附圖，將會(huì)更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1顯示了本發(fā)明的從斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)(LSD1)中獲得的糖水解酶的氨基酸序列以及編碼該氨基酸序列的2052bp的核苷酸序列，其中下劃線的是用于在載體中克隆蛋白的PCR引物；圖2是將本發(fā)明的LSD的活性和穩(wěn)定性對pH值制作的圖；圖3是將本發(fā)明的LSD的活性和穩(wěn)定性對溫度制作的圖4是TLC結(jié)果的照片，顯示了在進(jìn)行酶失活之前和之后本發(fā)明的LSD的酶活性(分別為1-5道和6-10道)，其中分析的樣品是淀粉(1道和6道)、葡聚糖(2道和7道)、齒斑葡聚糖(3道和8道)、呋喃果聚糖(4道和9道)和菊糖(5道和10道)，以及將酶提取物與樣品反應(yīng)后的一系列麥芽糖糊精(Mn道)和一系列異麥芽糖糊精(IMn道)；以及圖5顯示了本發(fā)明的酶以及青霉菌(penicillium)葡聚糖酶與羥基磷灰石的結(jié)合能力。
優(yōu)選實(shí)施方案描述編碼本發(fā)明的糖水解酶(即聚糖酶(LSD))的基因的獲取是從在含有葡聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，并從該微生物中分離poly(A)+RNA開始的。接著，從目前已知的葡聚糖酶編碼的基因中獲得共同的氨基酸序列，在此序列信息的基礎(chǔ)上構(gòu)建了含有預(yù)計(jì)的保守區(qū)的引物，然后用這些引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物大約1.1kb長，被用于5’RACE和3’RACE以獲得完整的葡聚糖酶基因。在通過PCR擴(kuò)增后，將該基因克隆到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)載體pYES2，并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含有藍(lán)色葡聚糖和半乳糖的培養(yǎng)基中生長。在藍(lán)色背景上周圍形成透明暈圈的菌落被選取(釀酒酵母INVSc1)，從該釀酒酵母轉(zhuǎn)化子獲得了帶有所需基因的重組克隆(pYLSD1)。
已知斯氏油脂酵母能夠產(chǎn)生降解葡聚糖的內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.11)和降解淀粉的α-淀粉酶。該微生物已經(jīng)被應(yīng)用于食品中，尚未報(bào)道能產(chǎn)生抗生素或其它有毒代謝物。
已知大多數(shù)由微生物產(chǎn)生的葡聚糖酶，除了幾種來自細(xì)菌的之外，都是誘導(dǎo)酶。在美國專利No.5,229,277中首先報(bào)道的斯氏油脂酵母ATCC7 4054產(chǎn)生葡聚糖酶和淀粉酶，其性質(zhì)已經(jīng)被公開。此外也已經(jīng)報(bào)道了該菌從蔗糖和淀粉產(chǎn)生低分子量的葡聚糖。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人在2002年10月11日獲得了韓國專利No.10-0358376(對應(yīng)于日期為2002年11月26日的美國專利No.6,485,953)，該專利涉及能夠水解葡聚糖和淀粉兩者的DXAMase酶，生產(chǎn)該酶的微生物(鑒定為斯氏油脂酵母KFCC-11077)，以及含有該酶的組合物。
本發(fā)明從基因(lsd1)表達(dá)的酶能夠水解淀粉和齒斑葡聚糖(不溶性葡聚糖)以及葡聚糖。此外，本發(fā)明的聚糖酶被發(fā)現(xiàn)主要將葡聚糖降解為葡萄糖、異麥芽糖和異麥芽三糖，同時(shí)還產(chǎn)生少量的分枝戊糖和己糖。
作為牙菌斑組成成分的呋喃果聚糖和菊糖類型的果聚糖可以被本發(fā)明的聚糖酶降解。
因此，通過本發(fā)明的聚糖酶可以完成葡聚糖的有效降解，不論它是可溶的還是不溶性的。因?yàn)榭梢酝ㄟ^抑制細(xì)菌的定居和葡聚糖的聚集而防止牙菌斑的形成和除去以前形成的牙菌斑，聚糖酶可以用于預(yù)防齲齒。據(jù)推斷，聚糖酶具有保持在牙齒上的能力，正如在關(guān)于該酶是否能夠結(jié)合與牙釉質(zhì)成分相似的羥基磷灰石的試驗(yàn)中所證實(shí)的那樣。
此外，本發(fā)明還涉及了帶有編碼聚糖酶基因的新的微生物。該微生物是一株釀酒酵母，保藏在位于韓國Daejeon市Yusung Gu的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，登記號(hào)KCTC10574BP，保藏日期是2003年12月24日。
此外，本發(fā)明涉及了生產(chǎn)聚糖酶的方法。首先，通過細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增pYLSD1克隆。在從培養(yǎng)物中收獲后，將細(xì)胞用玻璃珠破碎，從其中分離聚糖酶。pYLSD1編碼的聚糖酶的性質(zhì)基本上與斯氏油脂酵母KFCC-11077中的相同。
用作RNA分離和聚糖酶基因篩選的DNA供體的斯氏油脂酵母KFCC-11077，產(chǎn)生的聚糖酶具有葡聚糖酶和淀粉酶活性。
為了提供所需的DNA，將斯氏油脂酵母KFCC-11077在LMD培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有1％(w/w)葡聚糖、1％(v/v)無機(jī)鹽溶液和0.3％(w/v)酵母提取物。無機(jī)鹽溶液含有2％(w/v)MgSO4·7H2O、0.1％(w/v)NaCl、0.1％(w/v)FeSO4·7H2O、0.1％(w/v)MnSO4·H2O和0.13％(w/v)CaCl2·2H2O。在本發(fā)明中，通用DNA操作和DNA測序是用大腸桿菌DH5α和pGEM-T easy載體(Promega，USA)進(jìn)行的。
作為pYLSD1的宿主細(xì)胞，釀酒酵母INVSc1被培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基中(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)以便表達(dá)聚糖酶。用于釀酒酵母培養(yǎng)的YPG培養(yǎng)基中添加了合成的右旋糖(SD)和合成的補(bǔ)充物。
含有本發(fā)明的酶的組合物可以廣泛用于各種口腔護(hù)理領(lǐng)域，包括抗牙菌斑組合物、漱口液、牙膏等。由于其降解多糖例如葡聚糖和淀粉的能力，本發(fā)明的酶也可以有效地用于在糖生產(chǎn)過程中除去葡聚糖。此外，含有本發(fā)明的酶的組合物可以應(yīng)用于食品中，例如口香糖、飲料、牛奶等，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以容易地確定其成分。
通過下面的實(shí)施例可以獲得對本發(fā)明更好的理解，提出這些實(shí)施例是為了說明的目的，而不對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實(shí)施例1從斯氏油脂酵母中分離poly A+RNA將斯氏油脂酵母接種到LMD培養(yǎng)基中。在28℃培養(yǎng)36小時(shí)后(達(dá)到指數(shù)生長期中期)，將培養(yǎng)物于6500xg離心，得到細(xì)胞沉淀。將該沉淀懸浮在GIT緩沖液(4M異硫檸檬酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％月桂基肌氨酸的0.1％DEPC處理的水，0.1M 2-巰基乙醇)中，并與酸洗過的玻璃珠和等體積的苯酚(pH4.0)混合。將混合物振蕩2分鐘，然后離心。在上清液中加入異丙醇沉淀總RNA。通過使用oligotex樹脂(Oligotex mRNA試劑盒，Quiagen)形成oligotex-mRNA復(fù)合物，從總RNA制備物中純化mRNA。
實(shí)施例2LSD1的RT-PCR擴(kuò)增為了合成第一鏈cDNA，使用0.5g從斯氏油脂酵母分離的總RNA，在存在修飾的寡聚脫氧胸苷引物T18NN(5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)的情況下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。10μl第一鏈cDNA用于擴(kuò)增一部分編碼聚糖酶的堿基序列。參考在葡聚糖酶中已知的7個(gè)保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對簡并引物DC-F和DC-R。引物DC-F(5’-ACCTGGCA(T/C)AG(A/G)(A/T/G)(A/C)(C/A)-3’)和DC-R(5’-G(G/C)(C/T)(T/G)CC(G/C)ACCTGCTT(A/G)TA-3’)的設(shè)計(jì)分別是基于肽序列TWWH(D/N)(N/S/T)(保守區(qū)I)和YKQVG(S/A)(保守區(qū)V)。使用這些引物組進(jìn)行PCR，得到了大約1.1kb的推斷的聚糖酶基因片段。使用AccPrepTM凝膠提取試劑盒(Bioneer，Korea)從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，然后將純化的DNA片段與pGEM-T easy載體(Promega，USA)進(jìn)行連接。DNA測序在韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所進(jìn)行。為了獲得完整的聚糖酶基因，在1.1kb DNA片段的信息的基礎(chǔ)上進(jìn)行了RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)。關(guān)于這一點(diǎn)，5’-RACE和3’-RACE取決于5’-full RACE Core Set和3’-full RACE Core Set(都來自日本Takara公司)，從而獲得完整大小的為聚糖酶編碼的cDNA。通過5’-RACE獲得了180bp的PCR產(chǎn)物，而通過3’-RACE獲得了900bp的PCR產(chǎn)物。因此獲得了總長大約2kb的聚糖酶基因(lsd1)。
實(shí)施例3聚糖酶基因的堿基和氨基酸測序通過堿裂解方法制備了質(zhì)粒DNA用于堿基測序。使用ABI PRISMCycle測序試劑盒(Perkin Elmer Corp.USA)，在GeneAmp 9600熱循環(huán)儀DNA測序系統(tǒng)(型號(hào)373-18，Applied Biosystems，USA)中進(jìn)行了堿基測序。在圖1和SEQ.ID.No.1和2中給出了堿基測序結(jié)果。
在含有聚糖酶基因的DNA片段中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由1824堿基對組成的開放閱讀框。該開放閱讀框開始于位于獲得的堿基序列的第42位核苷酸的起始密碼子(ATG)，結(jié)束于位于第1868位核苷酸的終止密碼子(TGA)。對應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因的推斷的蛋白由608個(gè)氨基酸殘基組成，計(jì)算分子量為67.6kDa。
實(shí)施例4重組質(zhì)粒pYLSD1的構(gòu)建以及用其轉(zhuǎn)化釀酒酵母將斯氏油脂酵母在YPG中培養(yǎng)并收獲，按照Schwartz和Cantor的方法分離基因組DNA。
使用一組合成引物DX-F5’-GTCCCTTGAGCTCCCAAC-3’(序列表3)和DX-R5’-TCAACTAGAATTCATGAACTTCC-3’(序列表4)，以對應(yīng)于聚糖酶基因(lsd1)的DNA片段作為模板，在存在Taq DNA聚合酶的情況下進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增進(jìn)行了30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為在94℃變性1分鐘、52℃退火1分鐘和72℃延伸2分鐘。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體連接，用其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制備的質(zhì)粒用EcoRI處理以切下PCR產(chǎn)物，然后將其與pYES2載體(Invitrogen，USA)連接。關(guān)于這一點(diǎn)，載體首先用EcoRI消化并用CIAP處理以防止自連。使用電轉(zhuǎn)化方法將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到釀酒酵母中。在SC培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化子的篩選使用了誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2％半乳糖，0.3％藍(lán)色葡聚糖，缺乏尿嘧啶)。當(dāng)接種有轉(zhuǎn)化子的SC平板在30℃培養(yǎng)2到6天后，如果它們含有重組質(zhì)粒，在菌落周圍就會(huì)形成由葡聚糖水解而產(chǎn)生的暈圈。在藍(lán)色背景上其周圍形成了透明暈圈的菌落被選出，帶有所需基因的克隆被命名為pYLSD1。
實(shí)施例5表達(dá)聚糖酶基因的細(xì)菌的篩選進(jìn)行了半乳糖誘導(dǎo)以檢查上清液中克隆的活性。將選取的克隆接種到50ml含有2％半乳糖和1％葡萄糖的SC液體培養(yǎng)基中，接種的量達(dá)到OD600＝1，然后在30℃培養(yǎng)72小時(shí)。通過離心(5000rpm，5分鐘)收獲細(xì)胞，懸浮在5ml 20mM檸檬酸/磷酸緩沖液(pH5.5)中，然后在存在0.1g 0.45mm玻璃珠的情況下劇烈振蕩3分鐘以進(jìn)行細(xì)胞破碎。將細(xì)胞裂解液以6000rpm離心2分鐘，小心回收上清液。將上清液與聚乙二醇(PEG，分子量150,000-200,000)在4℃反應(yīng)至濃縮體積，并從其中除去葡萄糖、二糖和寡糖。將PEG濃縮液對20mM檸檬酸/磷酸緩沖液(pH5.5)透析到原始體積。透析溶液作為粗酶液，為測定蛋白活性，將其與等體積1％葡聚糖混合。在反應(yīng)16小時(shí)后測定活性。
實(shí)施例6酶活性分析通過二辛可寧酸銅方法測定酶的還原值。具體來說，將100μl二辛可寧酸銅加入到100μl酶溶液中，在80℃反應(yīng)35分鐘，然后冷卻大約15分鐘。在560nm測量吸收值。聚糖酶的葡聚糖酶活性通過測量將粗酶液與2％葡聚糖緩沖液在37℃反應(yīng)15分鐘時(shí)產(chǎn)生的異麥芽糖的量來確定。一個(gè)單位的葡聚糖酶活性被定義為與葡聚糖在37℃反應(yīng)1分鐘時(shí)產(chǎn)生1μmol異麥芽糖所需的酶量。
實(shí)施例7聚糖酶的最適pH、溫度和穩(wěn)定性分析通過測量酶與葡聚糖在pH4.1-7.7的范圍內(nèi)反應(yīng)16小時(shí)后的葡聚糖酶活性以分析聚糖酶的葡聚糖酶活性的最適pH。酶的pH穩(wěn)定性是酶在每種緩沖液中于22℃保溫3小時(shí)后測定的。
酶的最適溫度是通過測量已經(jīng)在不同溫度(10-60℃)下保溫16小時(shí)的酶的反應(yīng)速度來確定的。為了確定酶的溫度穩(wěn)定性，測量酶在不同溫度(10-60℃)下保溫3小時(shí)后的殘余活性。
發(fā)現(xiàn)LSD酶在pH5.5時(shí)顯示了最適葡聚糖酶活性，在pH5.0-5.7時(shí)維持了最適活性的80％或以上(圖2，表1)。
表1pH對聚糖酶活性和穩(wěn)定性的影響
在表1中，穩(wěn)定的pH意味著在該pH范圍內(nèi)酶的殘余活性是起始活性的80％或以上。
此外，酶在溫度低于37℃時(shí)顯示了起始活性的80％或以上，最適活性是在37℃時(shí)(圖3，表2)。
表2溫度對聚糖酶穩(wěn)定性的影響
在表2中，穩(wěn)定的溫度范圍意味著在該溫度范圍內(nèi)酶的殘余活性是起始活性的80％或以上。
實(shí)施例8葡聚糖酶對不同底物的降解活性檢測了粗酶液對不同底物的降解活性(圖4)。為了進(jìn)行水解活性試驗(yàn)，除了葡聚糖之外，還制備了各種聚合物的1％水溶液，包括葡聚糖、淀粉、呋喃果聚糖(β-2，6-連接的D-果糖聚合物)、菊糖(β-2，1-連接的D-果糖聚合物)和齒斑葡聚糖(α-1，3-連接的D-葡萄糖聚合物)。酶與葡聚糖的反應(yīng)產(chǎn)生了0.1％葡萄糖、19.3％異麥芽糖、24.2％異麥芽三糖和17.0％異麥芽四糖，同時(shí)還產(chǎn)生了分枝寡糖。因此，聚糖酶相信在與葡聚糖反應(yīng)時(shí)充當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶。在存在聚糖酶的情況下，發(fā)現(xiàn)淀粉幾乎完全被降解成葡萄糖。
此外，通過與不同的聚合物進(jìn)行反應(yīng)分析了從克隆pYLDS1表達(dá)的聚糖酶的水解活性。盡管比較低，檢測到的聚糖酶的水解活性不僅能夠作用于α-1，3-D-糖苷鍵連接的聚合物例如齒斑葡聚糖，而且能夠作用于β-連接的聚合物例如菊糖。測量到的聚糖酶的水解活性以對葡聚糖為100％計(jì)算，對淀粉是54％，對齒斑葡聚糖是8％、對呋喃果聚糖是3％，和對菊糖是7％。
表3聚糖酶對不同底物的相對活性
實(shí)施例9葡聚糖酶與羥基磷灰石(HA)的結(jié)合由于其與骨骼直接結(jié)合的能力，磷酸鈣陶瓷被廣泛用于骨骼的替代物。其中，羥基磷灰石(HA)是最適合用于人造骨骼和牙齒研究的，因?yàn)樗@示出與在牙齒中發(fā)現(xiàn)的天然存在的磷灰石相似的結(jié)晶學(xué)性質(zhì)。為此，采用了HA作為測試酶與牙齒鍵合能力的材料。將HA(Bio-Gel HTP，Bio-Rad Laboratories，Richmond CA)懸浮在10mM磷酸緩沖液(pH6.8)中。酶也被獨(dú)立地懸浮在同樣的緩沖液中。將200μlHA懸浮液與同樣體積的酶懸浮液混合，然后將混合液放置60分鐘以便HA將酶吸附到其上。在將游離的酶洗掉后，用10、50、100、200、300、400和500mM的磷酸緩沖液(pH6.8)進(jìn)行洗脫，洗脫緩沖液中都含有1mM NaCl。收集后，分析酶洗脫級(jí)分的聚糖酶活性。
正如在圖5中看到的那樣，聚糖酶被300mM羥基磷灰石洗脫。還可以了解到聚糖酶在磷灰石上的殘余量高于青霉菌葡聚糖酶的殘余量?？傊?，這些結(jié)果表明聚糖酶與羥基磷灰石發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合，因此能夠留在牙齒上。
正如在本文前面所描述的那樣，本發(fā)明的斯氏油脂酵母突變株產(chǎn)生的聚糖酶是一種大約70kDa的單一蛋白，當(dāng)對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行堿基測序分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有一個(gè)由1824bp核苷酸組成的開放閱讀框。推測的結(jié)構(gòu)基因蛋白由608個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為大約67.6kDa。
聚糖酶與葡聚糖反應(yīng)獲得的最終產(chǎn)物只有內(nèi)切葡聚糖酶的典型產(chǎn)物。所需的酶降解葡聚糖主要產(chǎn)生葡萄糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖，同時(shí)還產(chǎn)生了分枝戊糖。此外，發(fā)現(xiàn)了酶對多種碳水化合物具有降解活性，包括α-1，3-D-糖苷連接的聚合物以及β-連接的果聚糖例如呋喃果聚糖和菊糖。
因此，由于具有上述的降解活性，本發(fā)明的酶不僅能夠在牙齒護(hù)理工業(yè)中發(fā)現(xiàn)廣泛的應(yīng)用，包括抗牙菌斑組合物和漱口液，而且也可以用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖或多糖污染物。
盡管出于說明的目的公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到對本發(fā)明進(jìn)行各種修改、補(bǔ)充和替代，而不背離權(quán)利要求中公開的本發(fā)明的范圍和精神仍是可能的。
序列表<110>利分扎株式會(huì)社(Lifenza Co.，Ltd.)<120>具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性的蛋白，編碼該蛋白的基因，表達(dá)該蛋白的細(xì)胞及其生產(chǎn)方法(Protein with activity of hydrolyzingdextran，starch，mutan，inulin and levan，gene encoding the same，cellexpressing the same，and production method thereof)<130>SCT063527-47<150>KR2004-0006185<151>2004-01-30<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>608<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>S.cerevisiae/pYES2-LSD1<400>1Met Thr Leu Ile Tyr Val Pro Ser Ile Phe Thr Met Val Pro Ser Ile1 5 10 15Thr Arg Ile Val Leu Val Asn Ile Leu Leu Ala Thr Leu Val Leu Gly20 25 30Ala Ala Val Leu Pro Arg Asp Asn Arg Thr Val Cys Gly Ser Gln Leu35 40 45Cys Thr Trp Trp His Asp Ser Gly Glu Ile Asn Thr Gly Thr Pro Val50 55 60Gln Ala Gly Asn Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Ser Val His Val Ser65 70 75 80Leu Ala Asp Arg Asn Gln Phe Tyr Asp Ser Phe Val Tyr Glu Ser Ile
85 90 95Pro Arg Asn Gly Asn Gly Arg Ile Tyr Ser Pro Thr Asp Pro Pro Asn100 105 110Ser Asn Thr Leu Asn Ser Ser Ile Asp Asp Gly Ile Ser Ile Glu Pro115 120 125Ser Leu Gly Ile Asn Met Ala Trp Ser Gln Phe Glu Tyr Arg Arg Asp130 135 140Val Asp Ile Lys Ile Thr Thr Ile Asp Gly Ser Ile Leu Asp Gly Pro145 150 155 160Leu Asp Ile Val Ile Arg Pro Thr Ser Val Lys Tyr Ser Val Lys Arg165 170 175Cys Val Gly Gly Ile Ile Ile Arg Val Pro Tyr Asp Pro Asn Gly Arg180 185 190Lys Phe Ser Val Glu Leu Lys Ser Asp Leu Tyr Ser Tyr Leu Ser Asp195 200 205Gly Ser Gln Tyr Val Thr Ser Gly Gly Ser Val Val Gly Val Glu Pro210 215 220Lys Asn Ala Leu Val Ile Phe Ala Ser Pro Phe Leu Pro Arg Asp Met225 230 235 240Val Pro His Met Thr Pro His Asp Thr Gln Thr Met Lys Pro Gly Pro245 250 255Ile Asn Asn Gly Asp Trp Gly Ser Lys Pro Ile Leu Tyr Phe Pro Pro260 265 270Gly Val Tyr Trp Met Asn Glu Asp Thr Ser Gly Asn Pro Gly Lys Leu275 280 285Gly Ser Asn His Met Arg Leu Asp Pro Asn Thr Tyr Trp Val His Leu290 295 300Ala Pro Gly Ala Tyr Val Lys Gly Ala Ile Glu Tyr Phe Thr Lys Gln305 310 315 320
Asn Phe Tyr Ala Thr Gly His Gly Val Leu Ser Gly Glu Asn Tyr Val325 330 335Tyr Gln Ala Asn Ala Ala Asp Asn Tyr Tyr Ala Val Lys Ser Asp Gly340 345 350Thr Ser Leu Arg Met Trp Trp His Asn Asn Leu Gly Gly Gly Gln Thr355 360 365Trp Phe Cys Met Gly Pro Thr Ile Asn Ala Pro Pro Phe Asn Thr Met370 375 380Asp Phe Asn Gly Asn Ser Asn Ile Ser Ser Arg Ile Ser Asp Tyr Lys385 390 395 400Gln Val Gly Ala Tyr Phe Phe Gln Thr Asp Gly Pro Glu Ile Tyr Glu405 410 415Asp Ser Val Val His Asp Val Phe Trp His Val Asn Asp Asp Ala Ile420 425 430Lys Thr Tyr Tyr Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Ala Thr Ile Trp Lys435 440 445Cys His Asn Asp Pro Ile Ile Gln Met Gly Trp Thr Ser Arg Asn Leu450 455 460Thr Gly Ile Ser Ile Asp Asn Leu His Val Ile His Thr Arg Tyr Phe465 470 475 480Lys Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Phe485 490 495Tyr Ala Ser Gly Met Thr Val Asp Pro Ser Glu Ser Ile Ser Met Thr500 505 510Ile Ser Asn Val Val Cys Glu Gly Leu Cys Pro Ser Leu Phe Arg Ile515 520 525Thr Pro Leu Gln Ser Tyr Asn Asn Leu Val Val Lys Asn Val Ala Phe530 535 540Pro Asp Gly Leu Gln Thr Asn Pro Ile Gly Ile Gly Glu Ser Ile Ile545 550 555 560
Pro Ala Ala Ser Gly Cys Thr Met Asp Leu Glu Ile Thr Asn Trp Thr565 570 575Val Lys Gly Gln Lys Val Thr Met Gln Asn Phe Gln Ser Gly Ser Leu580 585 590Gly Gln Phe Asp Ile Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Trp Ser Ile Asn595 600 605<210>2<211>2052<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>S.cerevisiae/pYLSD1<400>2tgggtgtgtc ccttgctctg ccaacgttgt tgattgtttt catgacatta atctacgtgc 60cttcaatatt tacaatggtc ccctcaatca cacggattgt actggttaac attctgttgg 120cgacgttggt tttgggagct gcagtccttc cacgagacaa cagaactgtt tgcgggagtc 180aactctgcac atggtggcac gactccggcg agataaacac cggtactcct gtacaggcag 240gaaacgttcg acaatcccga aagtactctg tccatgtgag cctggeagac cgtaaccaat 300tctacgactc tttcgtatat gaatcgatac ctaggaacgg caatggcaga atttattctc 360ccaccgaccc acctaacagc aatacattga atagtagcat tgacgacggt atatcaatcg 420aaccatctct cggcatcaac atggcttggt cccagttcga atatagacga gatgtcgaca 480ttaagattac tacaatcgat ggctcaatat tggatggccc tttggacatt gttattcggc 540cgacttctgt taagtactca gtcaaaagat gtgtgggtgg tatcattatt agagtccctt 600atgatcccaa tggtcgaaaa ttctctgttg agttaaagag tgacctttac agttacctct 660
ccgacggttc gcaatatgtg acctctggag ggagcgtggt tggtgtggag ccaaaaaatg 720ccctggtgat ctttgccagc cctttcttgc cacgggatat ggttcctcat atgacaccac 780acgacaccca gacaatgaag ccgggcccaa tcaataatgg ggactggggt tcaaagccta 840tactctactt cccgcctggc gtatactgga tgaacgagga tacctctggt aaccccggga 900agctcggctc aaatcatatg cggctggatc ccaataccta ctgggtccat ctagccccag 960gagcctatgt gaaaggagcc attgagtatt tcacgaagca aaatttctat gcaacgggtc 1020atggcgttct ctcaggtgag aactatgttt atcaggccaa tgcagctgat aactactatg 1080ccgtcaagag tgatggcaca agcttgagaa tgtggtggca caacaacctt ggaggcggtc 1140aaacatggtt ttgcatgggg cccaccatta atgcaccgcc gtttaatacg atggacttca 1200acggaaactc taatatttcc agccggatta gtgactataa gcaggttggc gcttattttt 1260tccaaacaga cggaccggag atctacgagg acagtgttgt ccatgacgtc ttctggcatg 1320ttaatgatga tgccatcaag acatattatt ccggagcttc aatttcacga gcaaccatct 1380ggaagtgtca caatgacccg atcatacaga tgggctggac gtcacgaaat ctcaccggaa 1440tcagcattga taacctgcac gtcatccaca cgagatattt caaatctgaa acagtggttc 1500cttcagcaat cattggagcg tctccattct acgcaagtgg aatgactgtt gatcccagcg 1560agtccatcag catgaccatc tctaacgtgg tgtgtgaggg tctatgcccc tcactgttcc 1620gtatcactcc gcttcagagc tacaacaacc ttgttgtcaa gaacgtggcc tttcccgatg 1680gactgcagac aaatccaatc ggaataggag agagcattat accagcagct tccggctgta 1740caatggactt ggaaatcaca aactggaccg tcaaaggaca aaaagtcacc atgcaaaact 1800ttcagtccgg gtcaettggc cagttcgata tcgatggttc atactggggt caatggtcca 1860taaactaaag ctattcccat tcacctgagt attttcgtgg gttcaatgag ttcttgttac 1920tgatggggcc cttgctagtg gtaaaagtag agggacttgt cctcgccggg cgccaaggaa 1980
gttcatgtct tctagttgaa tagtatttgt ttcttctctc tcgttaaaaa aaaaaaaaaa 2040aaaaaaaaaa aa 2052<210>3<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>L.starkeyi DX-F primer(sense)<400>3gtcccttgag ctcccaac18<210>4<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>L.starkeyi DX-R primer(antisense)<400>4tcaactagaa ttcatgaact tcc 2權(quán)利要求
1.含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有水解葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖活性的蛋白，其衍生物或片段。
2.SEQ.ID.No.2的基因，編碼權(quán)利要求1的蛋白，其衍生物或片段，以及該基因的衍生物或片段。
3.表達(dá)權(quán)利要求2的基因，其衍生物或片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中的細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.權(quán)利要求3或4的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中的細(xì)胞是2003年12月24日保藏的、登記號(hào)為KCTC10574BP的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS。
6.生產(chǎn)具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性的酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求3的細(xì)胞；在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)酶；以及純化被表達(dá)的酶。
7.通過權(quán)利要求6的方法生產(chǎn)的酶。
8.含有權(quán)利要求7的酶的組合物。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中的組合物用于在糖生產(chǎn)過程中除去葡聚糖。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中的組合物用于消除牙菌斑或用作漱口液。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖水解活性，氨基酸序列為SEQ.ID.No.1的酶，以及編碼該酶的基因和表達(dá)該酶的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此外，本發(fā)明還公開了生產(chǎn)能夠降解葡聚糖、淀粉、齒斑葡聚糖、菊糖和呋喃果聚糖的酶的方法，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞、在細(xì)胞中表達(dá)該酶以及酶的純化。含有該酶的組合物提供用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖或多糖污染物。由于具有這種降解活性，該酶不僅在牙齒護(hù)理工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，包括抗牙菌斑組合物和漱口液，而且也可以用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖或多糖污染物。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1914315SQ200580003744
公開日2007年2月14日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者金都滿, 姜希暻, 李鎮(zhèn)河 申請人:利分扎株式會(huì)社