專利名稱：色譜分離核酸混合物的方法
技術領域：
本發(fā)明的主題是一種色譜分離核酸混合物的方法，即主要是把質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DNA)從核酸混合物的其它組分中，特別是從其它核酸中分離出并進行提純的方法。本發(fā)明的主要特點是，無需添加核糖核酸酶就能把質(zhì)粒DNA從混合的核糖核酸(RNA)中分離出來，而且所采用的都是成本低廉并對環(huán)境友好的組分。分離過程的參數(shù)，允許本發(fā)明方法應用于“大規(guī)?！鄙a(chǎn)質(zhì)粒脫氧核糖核酸。此外，本發(fā)明還包括按照本法制得的質(zhì)粒脫氧核糖核酸在生產(chǎn)一種內(nèi)含質(zhì)粒DNA制劑中的應用，而這種制劑是用于基因治療和遺傳疫苗接種的藥物。
質(zhì)粒提純的根本問題是要除去產(chǎn)品中其它種類的核酸。這個問題主要出現(xiàn)在需要提供特別純的質(zhì)粒DNA制劑的行業(yè)，例如將質(zhì)粒DNA用于基因治療的領域。前已提及的其它核酸類，主要是不同的RNAs，但也包括基因組的DNA和ssDNA(單鏈DNA)等。要除去RNA特別困難。根據(jù)現(xiàn)有的技術水平，常見的是采用核糖核酸酶除去RNA。RNA在核糖核酸酶的作用之下被降解成核糖核苷酸，從而在隨后的色譜分離過程中更容易從質(zhì)粒DNA中除去。這種方法的一個最大缺點是要使用RNA酶。這種酶通常為一種外源蛋白質(zhì)。RNA酶是從動物材料中分離出來的，通常是從牛體材料中分離而得。特別是在制備用于人類的腸胃外治療劑時，由于會對產(chǎn)品造成細菌、病毒或蛋白原性病原體污染，所以不允許在制造過程中添加動物蛋白。由于導致發(fā)生BSE(牛海綿樣腦病)問題，在治療劑制造過程中尤其不允許添加牛蛋白。
此外，使用RNA酶和含有乙醇的緩沖液會明顯增加成本。尤其是在“大規(guī)模”(大約2克以上)制造質(zhì)粒DNA時，所需酶和緩沖液花費的是不容低估的成本。另外，使用乙醇也是相關員工的一種負擔，而且對環(huán)境來說也是應該考慮的重要因素。
從原核細胞中，還有從真核細胞中進行核酸提純的一個普遍問題是，為了釋出核酸，必需首先進行細胞的裂解。在本發(fā)明的方法中，首選采用的是Birnborn和Dohly(Nucl.Acids Res.7，pp.1513-1522；1979)所述的堿性裂解，但不局限于堿性裂解。也可以通過熱裂解或在去污劑存在下進行裂解。高壓裂解(弗氏壓碎器)被證明是不適合的，因為高壓形成的大剪切力產(chǎn)生了非常小的基因組DNA片，而這種DNA小片實際上不可能從質(zhì)粒DNA中分離出來。
為了把核糖核酸從這樣種裂解(溶胞)產(chǎn)物中提純出來，現(xiàn)有技術中已知的有色譜分離法。色譜分離法通常又分為兩種不同的方法。一種是現(xiàn)有技術中已知的Gillespie和Vogelstein的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，76pp.615-619；1979)。在這種方法中，核糖核酸的提純是通過在離液鹽，例如GuHCl、NaI等存在下與硅膠或硅藻土的結(jié)合來完成的。與陰離子交換劑不同，在高濃度鹽的存在下結(jié)合DNA，而在低濃度鹽中進行它的洗脫。由于在該法中核酸的結(jié)合遵照“要麼全部要麼沒有”的原則，所以不能定量分離RNA、ssDNA和蛋白質(zhì)。因此，通過該方法獲得的DNA樣品，由于會混雜RNA和蛋白質(zhì)而不適用于基因治療。
第二種方法是通過陰離子交換劑進行提純，如EP 0268946所述。按照此法，細胞，例如細菌細胞，首選采用堿性裂解法。細胞蛋白質(zhì)和基因組DNA利用去垢劑和隨后的離心過程進行分離。這樣獲得的含有質(zhì)粒DNA的上清液，被稱為濾清的溶胞液。將此溶胞液在陰離子交換柱(例如QIAGEN，QIAGEN GmbH，Hilden，德國)中提純并進行定量分離RNA和ssDNA。
本發(fā)明方法的基本技術問題是從核酸混合物中提純質(zhì)粒DNA和在不使用RNA酶的情況下改進對RNA、ssDNA和基因組DNA等污染物的分離。本發(fā)明的另一個基本任務是，提出一種同樣適用于“大批量”生產(chǎn)的成本低廉且對環(huán)境友好的質(zhì)粒提純方法。
令人意外的是，本發(fā)明的基本技術問題可通過權(quán)利要求書所述的方法來解決。在本發(fā)明的方法中，質(zhì)粒DNA從核酸混合物的其它組分中，特別是從其它種類的核酸中分離出來，a)在必要時，在水溶液中用一種或多種堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于在pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至95mS的電導率，并且b)使核酸混合物和色譜載體材料接觸，并且a)然后，用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在900mM至1800mM的含堿金屬鹽溶液和/或以pH值7至7.4為基準濃度范圍在100mM至240mM的含堿土金屬溶液，將載體材料至少洗滌一次；并且c)接著，用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1300mM的含堿金屬鹽溶液和/或以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于270mM的含堿土金屬鹽溶液，對與色譜載體材料結(jié)合的質(zhì)粒DNA進行洗脫。為分離核酸混合物，必須首先裂解細胞。這些細胞可以是原核細胞或真核細胞。裂解細胞的過程可以按照上述方式進行。在本發(fā)明的方法中，原則上首選采用的是Birnborn和Dohly(Nucl.Acids Res.7，pp.1513-1522；1979)描述的堿性裂解法，但不局限于此法。其它的裂解法有熱裂解法或去垢劑裂解法。高壓裂解(弗氏壓碎器)被證明是不適合的，因為高壓形成的大剪切力產(chǎn)生了非常小的基因組DNA片，而這種DNA小片實際上不可能從質(zhì)粒DNA中分離出來。
本發(fā)明意義上的核酸混合物，同時是一種細胞裂解液，正如一種經(jīng)過預先提純或澄清的裂解液，也可以是人工混合物其中質(zhì)粒DNA被至少一種其它核酸種類以及可能的其它污染物所污染。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述核酸混合物是原核澄清裂解液。
本發(fā)明的方法能夠確保對前面提及的污染物進行色譜分離，并提供滿足基因治療或遺傳疫苗接種純度要求的質(zhì)粒DNA。在本文中，技術人員對色譜法的理解為根據(jù)混合物在固定相和流動相之間的分配不同從而物理-化學分離所述混合物的集合概念。在這里的典型方法中，用陰離子交換劑材料來分離質(zhì)粒DNA和污染物。令人吃驚的是，市售的QIAGEN(QIAGEN GmbH，Hilden，德國)材料特別適用于本發(fā)明方法。通過本發(fā)明的方法，這種材料能夠非常有效地將RNA以及例如ssDNA與質(zhì)粒DNA分離。在本申請中更詳細定義的條件下，RNA和ssDNA在一個單獨的峰中被洗脫出來，該峰在本發(fā)明方法中遠離同樣是單獨的質(zhì)粒DNA的峰。與本領域已知的方法相比，質(zhì)粒DNA與RNA和/或ssRNA共洗脫的危險被大大降低以商品名為QIAGEN(QIAGEN GmbH，Hilden，德國)購得的色譜載體材料是一種經(jīng)過改性的多孔無機材料。適合于本發(fā)明方法的色譜無機載體材料有硅膠、硅藻土、玻璃、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、羥基磷灰石等，可考慮采用的有機載體材料有，如葡聚糖、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯樹脂或所述材料單體組分的共聚物。
首選用于本發(fā)明方法的陰離子交換劑，例如可通過如下反應獲得。在第一步中，使前面所列的任一種載體材料與通式I的硅烷化試劑進行反應R1R2R3SiR4(I)式中R1是含有1-10個碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或者是鹵原子，主要是-Cl，或者是具有相同或不同的有1-6個碳原子的烷基的二烷基氨基；R2和R3各自獨立地為含有1-10個碳原子的烴基，主要是-CH3、-C2H5或-C3H7，或是含有1-10個碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或是鹵原子或插入至少一個氧原子或氨基基團的含有4-20個碳原子的烷基，其中前述基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基或芳基取代一次或多次；R4是含有1-20個碳原子的烴鏈或是插入至少一個氧原子或一個氨基的烷基，其中前述基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羥基、芳基和/或環(huán)氧基取代一次或多次，主要是 在隨后的第二步中，使在第一個步驟中得到改性的載體材料與通式II的試劑進行反應X-R-Y (II)式中X是氨基-、羥基-、環(huán)氧基或一個鹵原子；R是含有2-20個碳原子的烴鏈或是插入至少一個氧原子或氨基的烷基，此處的基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羥基、芳基和/或環(huán)氧基取代一次或多次；Y是一個帶有形成陰離子交換劑的官能團的烴基，含有1-10個碳原子，并可被氨基-、單烷基氨基-、二烷基氨基-、三烷基銨取代一次或多次。也可參見EP 0743949第4-5頁的所述，其內(nèi)容已摘選并引入本文。
在優(yōu)選的實施方式中，前述本發(fā)明方法的選用步驟a)中所述的核酸混合物在水溶液中用一種或多種堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽調(diào)節(jié)到相當于在pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至95mS的電導率。專業(yè)人員明白，含鹽溶液的電導率會依照當時的溫度和pH值發(fā)生明顯的波動，并可根據(jù)自己熟悉的原理，通過改變溫度和/或pH值對電導率作相應調(diào)節(jié)。因此，在改變上述參數(shù)時實施本發(fā)明方法不會產(chǎn)生任何問題。
在本發(fā)明方法中優(yōu)選采用的鹽是堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽，堿金屬鹽的陽離子組分或部分陽離子組分來源于元素周期表的第一主族，堿土金屬鹽的陽離子組分或部分陽離子組分來源于元素周期表的第二主族。特別優(yōu)選的堿金屬鹽是堿金屬鹵化物，特別優(yōu)選的堿土金屬鹽是堿土金屬鹵化物。特別優(yōu)選使用堿金屬鹵化物KCl、NaCl、CsCl和/或LiCl以及堿土金屬鹵化物CaCl2。除堿金屬鹽或堿土金屬鹽以外，銨鹽(偽堿金屬鹽)也可用于本發(fā)明的方法，優(yōu)選的是羧酸的銨鹽，更優(yōu)選的是乙酸銨。最優(yōu)選使用的鹽是KCl和/或NaCl。除了單獨的鹽以外，不同堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽的混合物也可用于本發(fā)明的方法。
在上述洗滌步驟c)中，用以pH值7至7.4為基準濃度為900-1800mM的堿金屬鹽和/或以pH值7至7.4為基準濃度為100-240mM的堿土金屬鹽洗脫污染物。從原則上說，專業(yè)人員認為合適的所有水溶液都可用于洗滌步驟，例如緩沖體系，但不限于所舉下例，例如Tris、乙酸鉀、硼酸鹽或MOPS緩沖體系，或者非緩沖體系，即僅溶于水的鹽。不同的緩沖系統(tǒng)也可能導致不同的pH值，或者可以調(diào)節(jié)pH值。這里選擇的濃度范圍是針對pH值為7-7.4而言的，從原則上說，洗滌液的pH值在上述pH范圍內(nèi)是可以改變的。專業(yè)人員清楚，在改變這種洗滌液的pH值時，必然會改變其所含鹽的濃度，以便達到在這種情況下洗脫污染物的相同效果；這就是說，在實施該方法時，在相同的洗滌和洗脫液pH值時，污染物(例如RNA)和質(zhì)粒DNA的洗脫點發(fā)生了移動，但洗脫點的關系未發(fā)生改變，這就意味著不同種類核酸的洗脫峰的間距離始終保持相同。該過程必需的參數(shù)可由專業(yè)人員根據(jù)他的專業(yè)知識來選擇，無需創(chuàng)造性勞動。本發(fā)明的方法包括至少一次洗滌步驟，但專業(yè)人員認為合適，也可以采用多個洗滌步驟，也可采用本發(fā)明所列的互不相同的洗滌緩沖液。
在一個優(yōu)選的實施方式中，用以pH值7至7.4為基準濃度為1100-1800mM的含KCl溶液進行至少一個洗滌步驟，特別優(yōu)選用以pH值7至7.4為基準濃度為1300-1700mM的含KCl溶液進行至少一個洗滌步驟。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，用以pH值7至7.4為基準濃度為950-1200mM的含NaCl溶液進行至少一個洗滌步驟，特別優(yōu)選用以pH值7至7.4為基準濃度為1100-1150mM的含NaCl溶液進行至少一個洗滌步驟。
在上述洗脫質(zhì)粒DNA的步驟d)中，所用的是pH值為7至7.4為基準濃度等于或高于1300mM的堿金屬鹽和/或以pH值7至7.4為基準濃度等于或高于270mM的堿土金屬鹽。與洗滌步驟相似，原則上專業(yè)人員認為合適的所有水溶液，都可用于洗脫過程，例如緩沖體系，例如但不限于Tris、乙酸鉀、硼酸鹽或MOPS緩沖體系，或者非緩沖體系，即僅溶于水的鹽。不同的緩沖系統(tǒng)也可能導致不同的pH值，或者可以調(diào)節(jié)pH值。這里選擇的濃度范圍是針對pH值范圍為7至7.4而言，但是從原則上說，洗滌液的pH值是可以在上述范圍內(nèi)波動的。專業(yè)人員知道，在改變這種洗脫液的pH值時必然改變其所含鹽的濃度，以便在這種情況下獲得洗脫污染物的同等效果；這就是說，在實施該方法時，在相同的洗滌和洗脫液pH值時，污染物(例如RNA)和質(zhì)粒DNA的洗脫點發(fā)生了移動，但洗脫點的關系未發(fā)生改變，這就意味著不同種類核酸的洗脫峰的間距離始終保持相同。該過程必需的參數(shù)可由專業(yè)人員根據(jù)他的專業(yè)知識來選擇，無需創(chuàng)造性勞動。
在一個優(yōu)選的實施方式中，洗脫步驟采用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1900mM的含KCl溶液進行的。KCl的上限濃度僅受在所用溶液中的溶解度所限制。
在另一個優(yōu)選的實施型式中，洗脫步驟采用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1300mM的含NaCl溶液進行的。NaCl的上限濃度僅受在所用溶液中的溶解度所限制。
如上所述，在使核酸混合物和色譜分離載體材料接觸前，核酸混合物的電導率同樣用堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽進行調(diào)節(jié)。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，核酸混合物用KCl調(diào)節(jié)到相當于20℃和pH4.8-5.4時為70-85mS的電導率，特別優(yōu)選地調(diào)節(jié)到相當于20℃和pH4.8-5.4時為70-80mS的電導率。在另一個特別優(yōu)選的實施方式中，核酸混合物用NaCl調(diào)節(jié)到相當于20℃和pH4.8-5.4時為70-95mS的電導率，，特別優(yōu)選地調(diào)節(jié)到相當于20℃和pH4.8-5.4時為85-95mS的電導率。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明方法中至少在色譜載體材料的洗滌步驟c)中采用堿金屬鹵化物KCl。
本發(fā)明方法優(yōu)選在室溫下實施。在這種情況下，室溫表示該方法在約18-25℃的常規(guī)操作條件下進行。原則上說，該方法可在專業(yè)人員認為合適的所有溫度下進行。
本發(fā)明方法特別適合提純質(zhì)粒DNA。人們可以驚喜地看到，它能使大小不同的質(zhì)粒在洗脫點上不出現(xiàn)顯著的差別，也就是說在這個鹽濃度下，質(zhì)粒DNA都可從色譜載體材料中洗脫下來。因此不要求根據(jù)不同質(zhì)粒大小改變該方法的參數(shù)，例如鹽濃度或pH值。
因為本發(fā)明提供了一個可以獲得“大量”質(zhì)粒以制取用于基因治療或遺傳疫苗接種的含有質(zhì)粒DNA制劑的方法，能夠把除去內(nèi)毒素技術引入本方法是非常有利和毫無問題的。為此，幾乎可以利用所有具有目前技術水平的工藝方法，例如，給澄清的裂解液摻入一種現(xiàn)有技術中已知的清除內(nèi)毒素的緩沖液(例如含有Triton X 100、Triton X 114、多粘菌素等)并無需改變便可進一步用于本發(fā)明的方法中。


圖1通過充填QIAGEN色譜材料的HPLC柱后254nm時的消光與KCl濃度的關系。表示隨著KCl濃度的升高不同種類核酸的洗脫狀態(tài)。試驗條件，詳見實施例2。
實施例實施例1從大腸桿菌DHSα中提純pCMVβ將內(nèi)含pCMVβ質(zhì)粒的30L大腸桿菌DH5α過夜發(fā)酵培養(yǎng)物離心過濾后獲得1kg生物質(zhì)。將該生物質(zhì)在15L再懸浮緩沖液(10mM EDTA；50mM Tris/HCl pH8)中進行再次懸浮，然后用15L溶胞緩沖液(200mM NaOH；1％(w/v)SDS)在室溫下培育10分鐘。隨后加入15L中和緩沖液(3M乙酸鉀，pH5.5)。繼而撇出該步驟中形成的沉淀物(蛋白質(zhì)、膜組分、基因組DNA等)。然后再過濾這種經(jīng)過初步澄清的溶胞液，從而制得澄清的溶胞液。澄清溶胞液的pH值為5.2，用3M KCl調(diào)節(jié)其電導率，使20℃的電導率為80mS。
在一個色譜分離柱中裝填QIAGEN色譜材料(柱容積大約為7L)，并用10個柱容積的平衡緩沖液(20mM乙酸鉀)以3.3cm/min的流速進行平衡。將濾清的溶胞液在色譜分離材料平衡后添加到分離柱內(nèi)，該過程的流速為1.1cm/min。然后使5個柱容積的平衡緩沖液(20mM乙酸鉀)以3.3cm/min的流速通過分離柱。
繼而直接用10個柱容積的KCl溶液(1350mM KCl；50mM Tris/HCl，pH7.2)以3.3cm/min的流速洗滌分離柱。然后用1個柱容積的洗脫緩沖液(1600mM NaCl；50mM Tris/HCl，pII7.2)洗脫質(zhì)粒。在經(jīng)過隨后進行的超濾/滲濾和最終的無菌過濾后，獲得收率大約為400mg的pCMVβ。
實施例2在4種不同沉淀物中，每次取600μg經(jīng)提純的質(zhì)粒(1質(zhì)粒A[3266bp]；2質(zhì)粒B[7200bp]；3質(zhì)粒C[7687bp]；4質(zhì)粒D[19535bp])與600μg經(jīng)提純的RNA(大腸桿菌HB101)一起溶解到5ml 60mM的乙酸鉀中。
在HPLC柱(柱容積為4.4ml)中填裝QIAGEN色譜材料，并用2個柱容積(流速1ml/min)的平衡緩沖液(60mM乙酸鉀)進行平衡。然后把5ml質(zhì)粒-RNA混合物以1ml/min的流速通過色譜分離柱加注到4根配有當時新裝HPLC柱的單獨分離柱內(nèi)。然后再用3個柱容積的60mM乙酸鉀沖洗前一句提及的色譜分離柱。
使Tris緩沖液以連續(xù)梯度通過分離柱(50mM Tris/HCl；pH7.2；從0到3M KCl梯度)，然后用光度計測定DNA和RNA的洗脫狀態(tài)(在254nm時進行消光測量)。在這里可以看到，已經(jīng)有部分經(jīng)降解的RNA及短鏈RNA以一個明顯的峰值(在780mMKCl濃度時達到最大值)獲得洗脫，接著是長鏈RNA的稍微擴散的峰(在1120mM KCl時達到最大值，1310mM KCl時洗脫結(jié)束)。在1900mMKCl濃度時，質(zhì)粒DNA的洗脫達到最大值，在2150mM KCl濃度時，洗脫終結(jié)。這個結(jié)果在圖1中以疊加軌跡線表示。顯而易見，質(zhì)粒的洗脫與其粒徑大小無關。
權(quán)利要求
1.把質(zhì)粒脫氧核糖核酸從混合物的其它組分中，特別是從其它核酸中分離出的色譜分離法，其特征在于b)在必要時，在水溶液中用一種或多種堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于在pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至95mS的電導率；c)使核酸混合物和色譜載體材料接觸；d)然后，用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在900mM至1800mM的含堿金屬鹽溶液和/或以pH值7至7.4為基準濃度范圍在100mM至240mM的含堿土金屬鹽溶液，將載體材料至少洗滌一次；e)接著，用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1300mM的含堿金屬鹽溶液和/或以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于270mM的含堿土金屬鹽溶液，對與色譜載體材料結(jié)合的質(zhì)粒DNA進行洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的色譜分離法，其特征在于，所述的堿金屬鹽是堿金屬鹵化物，以及所述的堿土金屬鹽系堿土金屬鹵化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的色譜分離法，其特征在于，所述的堿金屬鹵化物為NaCl、KCl、CsCl和/或LiCl，以及堿土金屬鹵化物為CaCl2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的色譜分離法，其特征在于，用KCl把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至85mS的電導率。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的色譜分離法，其特征在于，用KCl把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至80mS的電導率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的色譜分離法，其特征在于，用NaCl把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為70mS至95mS的電導率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的色譜分離法，其特征在于，用NaCl把核酸混合物調(diào)節(jié)到相當于pH值為4.8至5.4以及溫度為20℃時為85mS至95mS的電導率。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟b的洗滌步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在1100mM至1800mM的含KCl溶液進行洗滌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8項所述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟b的洗滌步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在1300mM至1700mM的含KCl溶液進行洗滌的特點。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟b的洗滌步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在950mM至1200mM的含NaCl溶液進行洗滌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10項所述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟b的洗滌步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度范圍在1100mM至1150mM的含NaCl溶液進行洗滌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟c的洗脫步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1900mM的含KCl溶液進行洗滌。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11所述的色譜分離法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟c的洗脫步驟中用以pH值7至7.4為基準濃度為等于或高于1300mM的含NaCl溶液進行洗滌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13所述的色譜分離法，其特征在于，所述的色譜載體材料是陰離子交換劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14所述的色譜分離法，其特征在于，硅膠、硅藻土、玻璃、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、羥基磷灰石、葡聚糖、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯樹脂或前述材料的共聚物用作色譜載體材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求15項所述的色譜分離法，其特征在于，所述的色譜載體材料通過通過如下反應制得，在第一步中，使權(quán)利要求15中所列的任一種載體材料與通式I的硅烷化試劑反應R1R2R3SiR4(I)式中R1是含有1-10個碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或者是鹵原子，主要是-Cl，或者是具有相同或不同的有1-6個碳原子的烷基的二烷基氨基；R2和R3各自獨立地為含有1-10個碳原子的烴基，主要是-CH3、-C2H5或-C3H7，或是含有1-10個碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或是鹵原子或插入至少一個氧原子或氨基基團的含有4-20個碳原子的烷基，其中前述基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基或芳基取代一次或多次；R4是含有1-20個碳原子的烴鏈或是插入至少一個氧原子或一個氨基的烷基，其中前述基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羥基、芳基和/或環(huán)氧基取代一次或多次，主要是 在隨后的第二步中，使在第一個步驟中得到改性的載體材料與通式II的試劑進行反應X-R-Y(II)式中X是氨基-、羥基-、環(huán)氧基或鹵原子；R是含有2-20個碳原子的烴鏈或是插入至少一個氧原子或氨基的烷基，此處的基團可被鹵素、氰基、硝基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羥基、芳基和/或環(huán)氧基取代一次或多次；Y是帶有形成陰離子交換劑的官能團的烴基，含有1-10個碳原子，并可被氨基-、單烷基氨基-、二烷基氨基-、三烷基銨取代一次或多次。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16所述的色譜分離法，其特征在于，所述的方法在室溫下進行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的色譜分離法，其特征在于，至少在權(quán)利要求1的b)步驟中將KCl用作鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的色譜分離方法，其特征在于，不同堿金屬鹽和/或堿土金屬鹽的混合物也可用于權(quán)利要求1的a)、c)和d)步驟中。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19所述的色譜分離法，其特征在于，所述核酸混合物是原核細胞經(jīng)過澄清的裂解產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20所述的色譜分離法在提純質(zhì)粒脫氧核糖核酸方面的應用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至20所述的方法制得的質(zhì)粒在生產(chǎn)用于基因治療或遺傳疫苗接種的含有質(zhì)粒脫氧核糖核酸的制劑方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明的主題是一種色譜分離核酸混合物的方法，具體是把質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DNA)從核酸混合物的其它組分中，特別是從其它核酸中分離出并進行提純的方法。本發(fā)明的主要特點是，無需添加核糖核酸酶就能把質(zhì)粒DNA從污染的核糖核酸(RNA)中分離出來，而且所采用的都是成本低廉并對環(huán)境友好的組分。這些參數(shù)允許本發(fā)明方法應用于“大規(guī)?！鄙a(chǎn)質(zhì)粒脫氧核糖核酸。此外，本發(fā)明還包括按照本發(fā)明方法制得的質(zhì)粒脫氧核糖核酸在生產(chǎn)一種內(nèi)含質(zhì)粒DNA制劑中的應用，而這種制劑用于基因治療和遺傳疫苗接種。
文檔編號C12N15/10GK1914319SQ200580003764
公開日2007年2月14日 申請日期2005年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月29日
發(fā)明者M·穆勒, J·赫克倫布羅奇, L·布雷特普夫 申請人:恰根有限公司