專利名稱：用于生產(chǎn)拴系蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用重組表達(dá)載體生產(chǎn)拴系的(tethered)跨膜蛋白細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的方法。
背景技術(shù)：
目前市場上治療的主要部分瞄準(zhǔn)了細(xì)胞膜成分。發(fā)明針對細(xì)胞膜目標(biāo)的藥物的主要挑戰(zhàn)是保證分離的細(xì)胞膜樣本及其成分如在體內(nèi)一樣發(fā)揮功能。從天然細(xì)胞環(huán)境移出時，細(xì)胞膜常常失去了其主要生理特征流動性。流動性是中心膜特性之一，其有助于在無數(shù)的生化過程中的受體和信號分子的引人注目的空間重排，從細(xì)胞間的聯(lián)系到病毒感染。例如，多價配體誘導(dǎo)他們的靶受體的共同定位，從而編碼被承認(rèn)的不同于獨立結(jié)合過程的集合特性。在許多情況中，靶受體能夠移動和采納互補(bǔ)構(gòu)建的能力對于確定分子識別過程的整體親和性極為重要。在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和整合信號中，結(jié)合配體觸發(fā)受體蛋白自身的構(gòu)象改變，依次，改變其與其他膜信號分子的結(jié)合。在各種情況中，膜成分的組織和遷移率的改變發(fā)生在信號傳送和識別過程中。
為了保留細(xì)胞膜的生理完整性，大多數(shù)藥物開發(fā)過程被強(qiáng)制開發(fā)分析膜靶物質(zhì)的“活細(xì)胞”分析。這些方法導(dǎo)致了顯著的復(fù)雜性，且常常難以被工業(yè)化。而且，活細(xì)胞系統(tǒng)特定受體的機(jī)制研究高度問題化，原因是天然膜含有數(shù)百的獨特的受體分子。
美國專利No6228326，在此引入作參考，描述了已知為MembraneChipTM的系統(tǒng)。此技術(shù)解決了許多上述問題，原因是其結(jié)合了體內(nèi)環(huán)境的生理精確性和工業(yè)藥物篩選所需的高產(chǎn)量。此技術(shù)包括被輕移到硅底物上的被支持的脂質(zhì)雙層，以及在不連續(xù)的列陣欄空間分離他們。MembraneChipTM能夠展示出細(xì)胞膜及其分子成分在體內(nèi)系統(tǒng)中的流動性及其功能特性。該技術(shù)的此特征不同于其他生物列陣技術(shù)，有助于準(zhǔn)確代表種種生物功能，具有無先例的準(zhǔn)確性。
磷脂瞄定區(qū)域的融合以及瞄定區(qū)域供體多肽的異種多肽已被描述了(美國專利No5,109,113)。而且，糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號區(qū)域與GPI信號區(qū)域的異種多肽的融合已經(jīng)被描述(美國專利No5,374,548)用于瞄定細(xì)胞膜表面。這些融合蛋白質(zhì)并不定位于細(xì)胞膜。但是，這些融合蛋白質(zhì)的純化存在問題。
因此，仍然需要一種新的生產(chǎn)拴系膜蛋白的方法，特別是使用以上所描述的設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)拴系的跨膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的方法。在一個實施方案中，該方法包括制備含有5’信號序列，純化的抗原決定簇標(biāo)記，編碼膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列，和3’瞄定序列的表達(dá)載體。然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，以生產(chǎn)融合至膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的錨，從而瞄定細(xì)胞膜。在一個實施方案中，信號序列選自下組中的蛋白表皮生長因子，胰島素，神經(jīng)生長因子，血小板衍生的生長因子，胰高血糖素，ICAM-1，B7-1，TrkA，血小板衍生的生長因子受體，及CD58。在一個實施方案中，3’的瞄定序列是GPI瞄定序列。在另一個實施方案中，3’的瞄定序列是GPI序列的32個末端氨基酸。
在另一個實施方案中，該方法包括制備一種含有5’豆蔻?；幋a序列，編碼膜蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列，和3’純化的抗原決定簇標(biāo)記的表達(dá)載體。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，以生產(chǎn)瞄定膜細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的豆蔻?；乃┫档鞍?。在一個實施方案中，豆蔻?；幋a序列是來自c-Src。
在一個實施方案中，純化標(biāo)記是六-組氨酸抗原決定簇。哺乳動物細(xì)胞可以選自CHO或HEK-293細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明包括用于生產(chǎn)含有5’信號序列；純化抗原決定簇標(biāo)記；編碼膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列；和3’瞄定序列的拴系細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體。在一個可效仿的實施方案中，3’瞄定序列是GPI瞄定序列。
在另一方面，本發(fā)明包括用于生產(chǎn)含有豆蔻?；?’信號序列；編碼膜蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列；和3’純化抗原決定簇標(biāo)記的拴系的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體。
在一個實施方案中，純化抗原決定簇標(biāo)記是六-組氨酸抗原決定簇標(biāo)記。


圖1A-1B分別表示表達(dá)載體pYBS101和pYBS201。
圖2A-2C表示實施例3中描述的使用ICAM-1(圖2A)和B7-1(圖2B)的試驗的FACS分析，以及ICAM-1和B7-1的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印記分析(圖2C)；圖3A-3C是描述細(xì)胞黏附至MembraneChipTM顯示蛋白的圖；圖4A-4B表示“免疫學(xué)的突觸”的結(jié)果和T細(xì)胞激活試驗，以進(jìn)一步確定MembraneChipTM顯示蛋白的功能。圖4A表示在MembraneChipsTM顯示的ICAM-1和PCC加載的IEk上PCC抗原特異的鼠科T細(xì)胞的不成熟和成熟的突觸的熒光顯微圖片。圖4B是圖4A中圖片的定量圖。
具體實施例方式
I定義“表達(dá)載體”和“質(zhì)?！被Q使用是指可以被用于攜帶特定基因到靶細(xì)胞的單鏈或雙鏈DNA分子。一旦表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞，被基因編碼的蛋白質(zhì)可以通過宿主細(xì)胞的正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程被生產(chǎn)。應(yīng)當(dāng)理解DNA分子可以被可操縱的連接到控制序列如啟動子上。可被進(jìn)一步理解的是表達(dá)載體可以包含額外的調(diào)節(jié)序列以控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
本文使用的“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”指的是膜蛋白的細(xì)胞外部分。這些片段通常為生理配體的結(jié)合位點，例如，神經(jīng)傳導(dǎo)因子和激素。如果蛋白的多肽鏈幾次通過雙層，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包含幾個突出膜的“環(huán)”。
本文使用的“細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域”指的是膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)(或細(xì)胞質(zhì))區(qū)域。
本文使用的“純化抗原決定簇標(biāo)記”指的是用于從裂解的細(xì)胞中純化表達(dá)蛋白的肽系列。可效仿的純化肽是六-組氨酸。
本文使用的“信號序列”指的是指導(dǎo)翻譯后蛋白運輸?shù)碾男蛄小?br> 本文使用的“錨”和“拴系”指的是用磷脂或磷脂雙層瞄定或連接膜蛋白結(jié)構(gòu)域的序列。可效仿的錨序列編碼GPI拴系或豆蔻?；┫怠?br> 除非特別指明，本發(fā)明的實踐應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)中的分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)中的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的解釋。見，例如，Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等人，Molecular Cloning；A Laboratory Manual(2ndEdition，1998)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds.，Academic Press，Inc.)。
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并沒有局限于特定的配方或方法參數(shù)，其應(yīng)該有不同。還應(yīng)該理解用于本文的技術(shù)僅僅是為了描述本發(fā)明的特定實施方案，并沒有限定本發(fā)明的意思。
盡管有許多類似或等同于本文描述的方法和物質(zhì)可用于本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的物質(zhì)和方法。
II.拴系的蛋白膜蛋白構(gòu)成了人基因組中總蛋白的重要的部分，表明其調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如生長和分化，細(xì)胞間黏附，神經(jīng)突觸產(chǎn)生，和免疫細(xì)胞活化。估計在約20,000已知的人蛋白中(NCBI Human ReferenceProtein Sequence，9/10/03)，通過TMHMM運算法則預(yù)計大約24.3％具有跨膜片段(Technical University of Denmark)。其中估計2,658個具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，有531那么多蛋白具有僅通過膜一次的兩個跨膜區(qū)域，信號肽的疏水特性使其常常在常規(guī)的數(shù)據(jù)庫檢索中作為跨膜片段顯示。預(yù)計這些具有信號序列的蛋白的大約0.5％已經(jīng)含有GPI錨，該GPI錨為一個天然發(fā)生的膜拴系。本質(zhì)上，本發(fā)明確保使用和研究超過66％的膜蛋白，作為額外的膜蛋白種類，包括具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域，但是具有不連續(xù)的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的蛋白，沒有算在內(nèi)。從而，本文描述的蛋白表達(dá)和顯示的普通的方法有助于發(fā)現(xiàn)和研究大多數(shù)膜蛋白的與細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外有關(guān)的方面。
跨膜受體是完整的膜蛋白，典型的其位于并在細(xì)胞質(zhì)膜中工作，但也存在于一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的膜上。在膜的一側(cè)與一個信號傳導(dǎo)分子或有時候與一對這樣的分子結(jié)合，跨膜受體在另一側(cè)啟動反應(yīng)。在這種方法中，他們在細(xì)胞通訊和信號傳導(dǎo)中起到獨特的和重要的作用。
膜蛋白通常具有三個不同的片段細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)域，和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是突出于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的腔表面上的膜的蛋白的一部分。如果蛋白的多肽鏈多次穿過雙層，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包括幾個突出于膜的“環(huán)”。此區(qū)域有助于配體的結(jié)合。跨膜區(qū)域貫穿膜。在結(jié)構(gòu)明確的大多數(shù)蛋白中，跨膜的α螺旋組成了跨膜結(jié)構(gòu)域的大部分。在某些蛋白中，如煙堿乙酰膽堿受體，跨膜結(jié)構(gòu)域形成一個通過膜的蛋白線孔，或離子通道。通過結(jié)合適當(dāng)?shù)呐潴w激活細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，孔變得對離子可通透，離子隨后通過該通道。在其他蛋白中，跨膜結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為通過結(jié)合完成構(gòu)向改變，其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。在某些受體中，如7TM超家族(如GPCR)的成員，跨膜結(jié)構(gòu)域可以含有配體結(jié)合袋(關(guān)于這類受體已知的這些和其他的一些證據(jù)是部分基于噬菌調(diào)理素以及通過結(jié)晶學(xué)確定的其詳細(xì)結(jié)構(gòu)的研究)。受體的細(xì)胞內(nèi)(或細(xì)胞質(zhì))結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞或細(xì)胞器的內(nèi)部相互作用，傳遞信號(www.wikipedia.com)。
許多跨膜受體與兩個或更多蛋白亞單位組成，當(dāng)受體結(jié)合、分離或他們的“激活”循環(huán)的其他步驟中，該亞單位可操縱的結(jié)合或分離。通常根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)分類，或者除了一部分，大多數(shù)受體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)不清楚，根據(jù)其假定的(有時是試驗證實的)膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分類。預(yù)計最簡單的多肽鏈僅通過脂質(zhì)雙層一次，而其他通過七次之多(被稱為G蛋白偶聯(lián))(www.wikipedia.com)。
膜蛋白在膜中具有多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，蛋白的最疏水部分包埋在膜中。蛋白可以具有一個跨膜成分，其N末端和C末端位于膜的相反兩端，或N末端信號肽被切斷在膜的細(xì)胞外部分產(chǎn)生一個新的N末端。在另一個實施方案中，膜蛋白可以具有多個跨膜部分。而且，許多膜蛋白沒有包埋在膜中而是通過共價鍵連接的脂肪酸拴系于膜，該脂肪酸構(gòu)成脂質(zhì)雙層的一部分(Creighton，ProteinsStructure and MolecularProperties，2ndEd.，W.H.Freeman and Company，New York，1984)。
II.生產(chǎn)拴系蛋白的方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備拴系的跨膜蛋白的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的方法。這些拴系蛋白特別用于通過瞄定流動的雙層膜展示跨膜蛋白的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如，但不局限于，美國專利No6,228,326中描述的MembraneChipTM中存在的那些，該專利在此引作參考。
特別地，膜蛋白拴系于錨上，例如，GPI拋錨點，脂質(zhì)連接(如豆蔻?；蜃貦盎?，連接于生物素亞磷酰氨膜脂質(zhì)的抗生物素蛋白/鏈霉素/神經(jīng)抗生物素蛋白融合，通過Ni2+膜協(xié)調(diào)拴系的六-組氨酸標(biāo)記蛋白，連接于與谷胱甘肽連接的膜脂質(zhì)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)染酶融合蛋白，以及連接于與麥芽糖結(jié)合的膜脂質(zhì)的麥芽糖結(jié)合蛋白融合蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，膜蛋白被基因工程操縱地含有如下所述的拴系連接。
A.細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域膜蛋白的可效仿的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括人B7-1，ICAM-1，ErbB1，ErbB4，及鼠科的含有α和β多肽鏈的I-Ek二聚體。
細(xì)胞間信號傳導(dǎo)是腫瘤重要的基礎(chǔ)，因為為了其生長和維持，腫瘤常常需要細(xì)胞間的密切接觸。信號通過的(促)紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的肝細(xì)胞瘤(Eph)受體(EphRs)是受體酪氨酸激酶(RTKs)最大的家族，表明其在癌發(fā)生中很重要(Dodelet等人，Oncogene(2000)195614-5619)。而且，EphRs的配體，已知為Ephrins是一次通過或GPI-瞄定膜蛋白(Cutforth等人，Trends Neurosci.(2002)25332-334)，反應(yīng)了通過此受體家族用于跨膜信號傳導(dǎo)的細(xì)胞間接觸的重要作用。EphRs/Ephrin信號傳導(dǎo)在血管形成過程中起重要作用，通過該精細(xì)的過程，腫瘤形成了維持有氧狀態(tài)的脈管系統(tǒng)。因此血管形成需要細(xì)胞間親密的相互作用和信號傳導(dǎo)，其也被認(rèn)為是腫瘤治療干擾的重要機(jī)理(Huang，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USE 1007785-7790)。使用本發(fā)明的方法，可以展示EphRs或Ephrin配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，并可以在被覆蓋的完整的細(xì)胞上測定通過其同源受體的完整的信號傳導(dǎo)路徑。在腫瘤的一種情況中，合適的EphR/Ephrin配對介導(dǎo)的血管生成可被用于鑒別破壞信號系統(tǒng)的藥物的目的研究。從而，這種展示一個跨膜蛋白的方法可以鑒別和確認(rèn)新的腫瘤化療藥物。
除了組織再生和腫瘤外，免疫激活過程需要廣泛的細(xì)胞間相互作用和信號傳導(dǎo)。最終導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放和激活的T細(xì)胞增殖的連續(xù)的步驟需要與APCs的親密接觸。在T細(xì)胞/APC相互作用的情況中，細(xì)胞間接觸非常緊密，以致被稱為“突觸”這一術(shù)語，其非常有助于精確地制定介導(dǎo)免疫反應(yīng)的T細(xì)胞受體、MHC、黏附和共同刺激的分子的模式(Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。而且，在MHC和特定抗原肽的上下文中的展示ICAM-1的被支持的脂質(zhì)雙層表明足以形成免疫突觸和覆蓋完整T細(xì)胞的骨側(cè)(fide)激活(Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。由于MHC分子、ICAM-1和大部分其他的黏附和共同刺激分子既是一次通過或GPI-瞄定的膜蛋白，展示此蛋白的本發(fā)明的方法提供了研究免疫系統(tǒng)活性的有力的機(jī)會。而且，過多的T細(xì)胞激活導(dǎo)致了許多嚴(yán)重的使衰弱的自體免疫疾病，包括多發(fā)硬化和Crohn氏病，此技術(shù)可以導(dǎo)致更好地治療這些免疫性疾病。
B.細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域本發(fā)明還有助于通過膜蛋白細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的展示研究細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。RTKs是一個特別的受體的家族，其細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)路徑是抗腫瘤治療的潛在的靶子。表皮生長因子受體，可能是最常見的RTK，在許多腫瘤中被上調(diào)了(Gill等人，Mol.Cell Endocrinol(1987)51169-186)，其是抗體治療Erbitux和Herceptin的靶子。由于RTKs的細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被表明當(dāng)從其細(xì)胞外和跨膜區(qū)域被分離時，具有組成活性，其有可能重建發(fā)源自拴系到流動雙層的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的信號傳導(dǎo)路徑，如在MembraneChipTM上展示的。在一個實施方案中，RTK的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通過N末端膜錨瞄定到MembraneChipTM上，隨后用信號路徑的細(xì)胞提取液或純化的成分孵育。在此方法中，體外重建RTK路徑有助于鑒別用難以相信的特異性篩選的小分子藥物。各種RTKs可以在一般的信號傳導(dǎo)機(jī)制存在的情況下在MembraneChipTM上排列，其可以鑒別對指定RTK特異的抑制劑。靶RTKs與非靶RTKs平行排列，保證了鑒別影響酪氨酸激酶路徑和可能的抗各種腫瘤活性的高特異的小分子藥物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，RTK蛋白中的興趣細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步適合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以或可以不具酪氨酸激酶活性，這依賴其生物活性的模式，其選自粘合素和如腫瘤壞死因子受體、表皮生長因子受體和干擾素受體的受體。應(yīng)該理解許多細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域已知的，適合用于本發(fā)明。
C表達(dá)載體在一個優(yōu)選的實施方案中，拴系膜蛋白如以下描述使用表達(dá)載體被基因工程構(gòu)建。將拴系序列，如GPI黏附信號與引起蛋白被細(xì)胞翻譯后修飾的基因結(jié)合產(chǎn)生了拴系蛋白。例如，當(dāng)使用GPI黏附信號時，GPI連接導(dǎo)致信號定位。
在一個實施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域作為配體的結(jié)合位點發(fā)揮作用。
在另一個實施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作為細(xì)胞質(zhì)蛋白(如，轉(zhuǎn)換器、激酶、磷酸酶)的結(jié)合位點發(fā)揮作用，即，用于研究信號路徑。
首先使用本領(lǐng)域已知的方法，通過PCR擴(kuò)增膜蛋白。為了跨膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，編碼感興趣的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA而后被克隆至恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的靈活的多克隆位點，以產(chǎn)生pYBS101。恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，是商業(yè)可售的(Invitrogen)。制備并將DNA插入表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域已知的(Sambrook，1989)。應(yīng)該理解商售的表達(dá)載體可以包括調(diào)節(jié)序列以及限制性位點。應(yīng)該理解表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括可選擇的標(biāo)記，如那些具有抗生素抗性的。在一個實施方案中，可選擇的標(biāo)記是新霉素抗性。
如圖1A中所見，pYBS101載體包括5’信號序列，純化抗原決定簇標(biāo)記，以及3’拴系錨序列。信號序列將表達(dá)的蛋白定向于細(xì)胞表面。恰當(dāng)?shù)男盘栃蛄惺潜绢I(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，信號序列是來自Igk鏈的信號序列，條件是其是被很好定性的?？尚Х碌男盘栃蛄袔缀醢捎糜诒景l(fā)明的每一個分泌蛋白，以及許多膜蛋白。含有信號序列的分泌蛋白和膜蛋白的例子包括表皮生長因子(分泌的)、胰島素(分泌的)、神經(jīng)生長因子(分泌的)、血小板衍生的生長因子(分泌的)、胰高血糖素(分泌的)、ICAM-1(膜蛋白)、B7-1(膜蛋白)、TrkA(膜蛋白)、血小板衍生的生長因子受體(膜蛋白)、以及CD58(膜蛋白)。應(yīng)該理解，如本領(lǐng)域已知的，基因的密碼子是簡并的，超過一個密碼子可以編碼一個特定的蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，純化的抗原決定簇標(biāo)記是六-組氨酸?？墒?，應(yīng)該理解，六-組氨酸以外的其他抗原決定簇標(biāo)記也可以被使用，如myc，F(xiàn)lag，HA，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)染酶，以及麥芽糖結(jié)合蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，拴系序列是GPI拴系序列。應(yīng)該理解，在另一個實施方案中，拴系由結(jié)合至生物素?；哪ぶ|(zhì)的抗生物素蛋白/鏈霉素/神經(jīng)抗生物素蛋白融合、通過Ni2+膜協(xié)同作用拴系的六-組氨酸標(biāo)記蛋白、結(jié)合至與谷胱甘肽連接的膜脂質(zhì)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)染酶融合蛋白、以及結(jié)合至與麥芽糖連接的膜脂質(zhì)的麥芽糖結(jié)合蛋白融合蛋白。
對于膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，將編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的cDNA克隆至pYBS201靈活的多克隆位點。如圖1B中所見，如上所述，pYBS201載體包括5’拴系序列和3’純化抗原決定簇標(biāo)記。編碼膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的cDNA被亞克隆至側(cè)面有兩個修飾序列的多克隆位點。在一個實施方案中，拴系序列優(yōu)選豆蔻?；幋a序列。在一個實施方案中，拴系序列來自c-Src蛋白，可是，也可以使用幾乎任何一個N末端豆蔻?；鞍椎南鄳?yīng)的序列。此種蛋白的例子包括酪氨酸激酶的Src家族的其他成員、鈣調(diào)蛋白磷酸酶B、蛋白的ADP-核糖基化因子家族的成員、一氧化氮合成酶、以及cAMP-依賴的蛋白激酶。
可選擇的，可以使用在5’端(pYBS101)或3’端(pYBS201)的腸激酶剪切位點亞克隆cDNA，如果必要，其可以除去純化的標(biāo)記。除了腸激酶外，也可以使用其他蛋白酶和蛋白酶識別序列，包括但不局限于凝血酶和Xa因子。盡管已知pYBS101和pYBS201新霉素抗性基因，可用于選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)該理解可以很容易地修飾載體以確保用其他的藥物選擇，包括但不局限于，潮霉素和zeocin。此種增加的靈活性有助于選擇共同表達(dá)不同蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如復(fù)合型蛋白(multimeric complex)。
如實施例1和3中所描述的，構(gòu)建質(zhì)粒pYBS101以生產(chǎn)膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的膜拴系型。在實施例3中，膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是人B7-1或ICAM-1。PYBS101質(zhì)粒是通過修飾pcDNA3.1(+)的通用表達(dá)載體(圖1A)，其含有5’信號序列、六-組氨酸純化抗原決定簇標(biāo)記、感興趣膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和3’GPI瞄定序列。
如實施例2中所描述的，pYBS201是通過pcDNA3.1(+)修飾的通用質(zhì)粒(圖1B)，其含有5’豆蔻?；幋a序列(衍生自c-Src的N端瞄定氨基酸)和3’六-組氨酸抗原決定簇標(biāo)記。
通過本領(lǐng)域已知的方法繁殖載體。可以用本領(lǐng)域已知的方法評估結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，例如，使用免疫組化染色、蛋白印跡雜交、和ELISA。而后根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。如實施例3所見，將得到的構(gòu)建pYBS101轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞，如中國倉鼠細(xì)胞(CHO)或HEK-293中，生成瞄定質(zhì)膜的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和通過C末端GPI錨的拴系。應(yīng)該理解，用pYBS201轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了瞄定質(zhì)膜的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和通過N端的豆蔻?；^的拴系。還可以通過病毒載體完成在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，其依賴于用于任何指定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染試劑的成功性。N末端的六-組氨酸序列的融合有助于快速、高效的在Ni2+樹脂上純化。使用本發(fā)明的方法觀察到50-75％的轉(zhuǎn)染效率。在一些實施方案中，使用本發(fā)明至少達(dá)到50％的轉(zhuǎn)染效率。在其他實施方案中，使用本發(fā)明至少達(dá)到70-75％的轉(zhuǎn)染效率。如圖2A所見，在HEK293細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)是72％。圖2A表明使用特異的抗人ICAM-1的PE-連接抗體的FASC分析結(jié)果。左面一組表明在對照的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中基本上沒有ICAM-1表達(dá)，而在用有人ICAM-1的pYBS101轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到強(qiáng)表達(dá)(右組)。在圖2B中的用FASC的分析中表明相似的人B7-1的表達(dá)結(jié)果。可以使用如圖2C中的SDS-PAGE和蛋白印跡雜交證明拴系蛋白的表達(dá)。該圖分別顯示了對應(yīng)于ICAM-1或B7-1蛋白(左)或免疫反應(yīng)性(右)的條帶。參考實施例3-11，盡管此處的實施例涉及使用pYBS101的膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生和顯示，應(yīng)該理解，這些實施例等同于使用pYBS201的膜蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合應(yīng)用。
使用純化抗原決定簇標(biāo)記純化翻譯后的膜蛋白。在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)分別產(chǎn)生了細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其通過很容易被Ni2+樹脂純化的拴系拴系到膜上。如實施例4中所描述，根據(jù)已知的方法，抗原決定簇標(biāo)記連接到小珠或樹脂上。
IV列陣如上所述，通過此處描述的方法形成的拴系蛋白被用于產(chǎn)生和展示脂質(zhì)雙層列陣上的跨膜蛋白的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可被用作受體或配體結(jié)合區(qū)域，用于檢測列陣中的分析物。特別優(yōu)選地，使用本發(fā)明與美國專利No6,228,326中描述的流動的雙層膜。此流動的雙層膜，以下稱MembraneChipTM，如那里所描述的，能夠展示活的細(xì)胞膜的特性，這有助于使用他研究幾乎調(diào)節(jié)細(xì)胞生理學(xué)每一方面的膜蛋白。
發(fā)現(xiàn)這些膜列陣可用于很多應(yīng)用，包括簡單質(zhì)量確認(rèn)/質(zhì)量對照優(yōu)化研究、醫(yī)學(xué)診斷和涉及細(xì)胞間反應(yīng)的藥物發(fā)現(xiàn)。使用此方法展示的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以使研究整體的完整的信號傳導(dǎo)路徑變得可能。本文描述的展示方法，能夠處理含有不連續(xù)功能性細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的基因組中的大多數(shù)膜蛋白，從而使無數(shù)的工業(yè)和醫(yī)學(xué)臨床中的用于變?yōu)榭赡堋?br> 例如，受體酪氨酸激酶(RTKs)，其是細(xì)胞生長和分化重要的調(diào)節(jié)子，與多種腫瘤有關(guān)，使用本發(fā)明的技術(shù)其可被瞄定。RTKs的配體誘導(dǎo)的二聚化和自體磷酸化特性能夠如實的被重建，用于指定MembraneChipTM環(huán)境的藥物發(fā)現(xiàn)。除了研究膜蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞自體狀況外，此技術(shù)還可用于示范細(xì)胞間的相互作用，包括細(xì)胞間黏附和信號傳導(dǎo)。細(xì)胞間信號傳導(dǎo)對于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、胚胎發(fā)生的器官和組織發(fā)育、神經(jīng)突觸的建立、血管生成和免疫反應(yīng)的激活非常重要。基本上，這些細(xì)胞間相互作用通過同源的跨膜結(jié)合的配體和受體的結(jié)合，在并列的細(xì)胞中啟動信號級聯(lián)中發(fā)生。不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞間聯(lián)系發(fā)生在一些疾病狀態(tài)中，包括腫瘤和自體免疫性疾病，其相關(guān)的信號分子是發(fā)現(xiàn)藥物的重要的靶子。在芯片欄中配體結(jié)合的膜，其上覆蓋表達(dá)膜結(jié)合受體的完整的細(xì)胞，其優(yōu)點是具有很好定義的、純化成分，能夠同時研究完整的信號傳導(dǎo)路徑。
在免疫系統(tǒng)中，例如，展示復(fù)合至流動的雙層中的MHC和輔助黏附和共刺激分子的抗原肽可成功地再獲得抗原提呈細(xì)胞的能力(APCs)。覆蓋在芯片上展示的抗原肽特異的完整T細(xì)胞上，可使其快速激活，有助于T細(xì)胞激活路徑中幾乎每個檢測點的瞄定(見，例如Grakoui等人Science(1999)285221-227，用于討論其相互作用)。
MembraneChipTM的生理特性使其對于研究需要細(xì)胞間接觸的過程非常有用。例如，在有支持的脂質(zhì)雙層中展示一次穿過膜蛋白的GPI連接的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可作為被覆蓋的完整細(xì)胞中的黏附分子和用于識別受體的信號傳導(dǎo)配體，使各種組織生長成為可能。許多研究表面干細(xì)胞可在體外通過與特定的組織共同培養(yǎng)分化成各種細(xì)胞類型(Prockop等人Proc.Natl.Sci.USA(2003)10011917-11923)。從而，本發(fā)明的膜列陣有助于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)器官和組織。因此，通過提供存在于膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的特定組織中干細(xì)胞分化所需的最小信號，干細(xì)胞可在展示這些蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的MembraneChipTM的環(huán)境中培養(yǎng)。實際上，適合于移植或植入到有病器官的生長的人組織對公眾健康是非常有利的，特別是考慮到全國大約73,000人正等待器官移植，每年10,000人死于尸體器官短缺。
此列陣還可以特別地用于臨床診斷。感染性疾病變?yōu)獒t(yī)學(xué)中一個重要的分支，能夠監(jiān)控抗各種致病菌的疫苗接種的有效性變得非常有意義。通常，接種導(dǎo)致投藥的特定抗原特異性的T細(xì)胞的產(chǎn)生。通過展示與致病抗原復(fù)合的MHC分子，有可能從病人的血清中分離抗原特異性的T細(xì)胞。在一個實施方案中，被免疫一組致病菌的病人提供簡單的血清樣本，其與在流動的雙層列陣上的MHC上展示的相同組混合，有助于指示成功接種的反應(yīng)T細(xì)胞的一次高信息內(nèi)容的篩選。具有抗原的展示的MHCs也有助于診斷各種自體免疫性疾病。例如，多發(fā)硬化中的自體抗原可以在芯片上被展示以用于檢測認(rèn)為與疾病病理學(xué)相關(guān)的特定組群T細(xì)胞的存在與否。
如實施例10中所述的，JurkatT細(xì)胞選擇的黏附于包括拴系蛋白的雙層膜。如圖3A中所見，至少比對照多4X的Jurkat T細(xì)胞黏附至展示人B7-1蛋白的MembraneChipTM上。對于展示人ICAM蛋白的MembraneChipTM，觀察到至少多3X的黏附。而且，Jurkat T細(xì)胞的黏附可以分別被被預(yù)先與抗人B7-1和ICAM-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體孵育的MembraneChipTM抑制(圖3B)，表明展示蛋白的黏附特異性。圖3B是用或不用抗體阻斷的對照、具有拴系的ICAM-1蛋白的膜、具有拴系的B7-1蛋白的膜的Jurkat T細(xì)胞黏附的圖?？梢杂妹總€領(lǐng)域的細(xì)胞數(shù)測定黏附。如圖3B所見，使用抗體阻斷比不使用抗體阻斷至少少8X的Jurkat T細(xì)胞黏附。
圖3表明抗原特異性T細(xì)胞在具有或不具有ICAM-1、I-Ek-PCC抗體阻斷以及空膜對照中向MembraneChipTM的黏附。在另一個實施方案中，雙層可以包括兩個或多個拴系蛋白。如實施例10中所述，用ICAM-1或I-Ek-PCC拴系蛋白制備MembraneChipTM。在這種方式中，可以以同一個MembraneChipTM組合物檢測超過一個分析物。兩種蛋白均保留功能。如圖3A所見，用抗I-Ek-抗體預(yù)處理后與沒用單克隆抗體處理的MembraneChipTM相比大約一半的細(xì)胞黏附至ICAM-1/IEk-PCC。
本發(fā)明的方法為質(zhì)量確定和對照應(yīng)用提供了有效地設(shè)備。已被鑒別具有對抗使用本方法展示的任何膜蛋白的活性的藥物(包括但不局限于小分子、抗體、和生物制劑)能夠很容易的使用此技術(shù)鑒別和優(yōu)化。此技術(shù)的列陣形式非常有助于特異性和敏感性的研究，其與許多不同的檢測系統(tǒng)兼容，包括如美國專利公布No.20040053337中描述的無標(biāo)記方法和表面等離子共振。在此方法中，可以快速獲得活性藥物的親和性檢測，有助于進(jìn)一步優(yōu)化和確認(rèn)。從而，本發(fā)明的膜蛋白展示方法對于許多不同的領(lǐng)域非常有利。
表1免疫學(xué)的膜蛋白


膜蛋白被拴系到脂質(zhì)上，而后被用于形成美國專利No6,228,326中描述的流動的雙層。通過上述表達(dá)載體產(chǎn)生的膜蛋白被拴系至雙層膜的脂質(zhì)，與雙層列陣一起使用。將純化的蛋白加入到形成小囊的脂質(zhì)混合物中，透析以形成囊懸著物。使用的脂質(zhì)依賴于雙層需要的特性?？尚Х碌闹|(zhì)包括合成的和天然生產(chǎn)的脂質(zhì)，包括磷脂如卵磷脂(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)等。然后將脂蛋白小囊沉積于底物而表面形成雙層列陣。底物包括至少一個雙層兼容的表面區(qū)域。典型的，底物表面與脂質(zhì)蛋白小囊懸著物接觸。允許懸著物在一個恰當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)與表面接觸，該時間允許脂質(zhì)與表面融合形成流動雙層。所需時間典型為幾分鐘，如，大約5分鐘。
如實施例5中所描述的，將純化的蛋白加入到雞蛋PC脂質(zhì)混合物中形成小囊懸著物。將小囊懸著物沉積，并與MembraneChipTM或蓋玻片孵育形成具有拴系膜蛋白的流動雙層。通過免疫熒光確定蛋白與雙層膜的結(jié)合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法確認(rèn)黏附至展示結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞，如實施例6-7中描述的。如實施例9所述，使用免疫熒光顯微鏡確認(rèn)膜蛋白展示。
在實施例10中描述的，在圖3A-3C中表明的T細(xì)胞黏附試驗證實了使用本發(fā)明方法表達(dá)、純化、展示的膜蛋白的活性，免疫突觸形成的檢測證實了在MembranChipTM的脂質(zhì)雙層中的這些蛋白的流動性和信號傳導(dǎo)能力。信號傳導(dǎo)路徑通常需要細(xì)胞表面分子的低聚化和/或聚集，從而使傳導(dǎo)信號穿過質(zhì)膜，由生理膜的側(cè)向流動性產(chǎn)生的必要的現(xiàn)象使其可能。如美國專利Nos6,228,326和6,503,452；美國專利公開Nos20020009807和20020160505和PCT公開No WO01/26800中所描述的，所有這些都引入本文作參考，MembranChipTM支持的脂質(zhì)雙層顯示了流動性的生理水平。通過此處描述的方法生產(chǎn)的膜蛋白的遷移率在“免疫突觸”的形成中檢測，T細(xì)胞激活的動力學(xué)固定的過程，其中T細(xì)胞受體/MHC和LFA-1/ICAM-1對在細(xì)胞表面進(jìn)行了令人吃驚的重組(Grakoui等，Science，(1999)285221-227)。
如實施例8中所述，在MembranChipTM上展示的結(jié)構(gòu)域保留了結(jié)構(gòu)域的功能。圖4A表明當(dāng)與PCC特異的T細(xì)胞接觸時ICAM-1和I-E-PCC加載的MembranChipTM的成熟和不成熟的突觸。當(dāng)PCC-特異的鼠科T細(xì)胞首次遇到顯示ICAM-1(用標(biāo)記ICAM-1的箭頭指定)和PCC加載的I-Ek(用標(biāo)記IEk-PCC的箭頭指定)的MembraneChipTM時，T細(xì)胞黏附并形成不成熟的“突觸”，其特征為ICAM-1位于中間，I-Ek位于周圍(圖4A，左組)?？墒?，在與T細(xì)胞接觸的下一個30分鐘內(nèi)，這個“突觸”模式急劇改變，PCC-加載的I-Ek移到中間，ICAM-1移到更周圍的位置(圖4A，右組)。這種ICAM-1和I-Ek戲劇性的重排完全是抗原依賴的，因為它不發(fā)生在空的或加載突變的PCC*肽的I-Ek中(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，活T細(xì)胞加入后的這些蛋白的重定位強(qiáng)調(diào)了這些拴系蛋白顯示的側(cè)流動性的生理水平。除了免疫突觸形成的定性分析，通過測量T細(xì)胞/APC突觸中間的I-Ek聚集程度，很容易獲得更多的定量信息。如在圖4B中描述的，顯示ICAM-1和PCC-加載的I-Ek的MembraneChipTM結(jié)合與展示空的I-Ek或復(fù)合至突變的PCC*肽的I-Ek膜相比，聚集的I-Ek分子大約增加了3-4倍。
此處引用的所有的文獻(xiàn)、專利和專利申請，無論是在上還是在下，均在此引入作參考。
實施例下面的實施例僅僅提供了說明的目的，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)盡力保證所使用數(shù)字的準(zhǔn)確性(如，含量，溫度等)，但有些試驗的失誤和偏差應(yīng)該是被允許的。
材料和方法細(xì)胞CHO、HEK-293和Jurkat T細(xì)胞來自加利福尼亞大學(xué)，舊金山細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施，分別在Ham’s F12，Dulbecco’s修飾的Eagle培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃具有5％CO2的培養(yǎng)箱中，根據(jù)廠家推薦的方法培養(yǎng)。
實施例1生產(chǎn)GPI拴系細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體的產(chǎn)生通過修飾pcDNA3.1(+)(Invitrogen)生成pYBS101。編碼Igκ領(lǐng)導(dǎo)序列(SEQ ID NO1)的序列之后為編碼六個串連組氨酸殘基的序列(SEQ ID NO2)，將其作為寡核甘酸克隆至NheI-HindIII消化的pcDNA3.1(+)，僅生成HindIII位點。編碼來自胎盤的堿性磷酸酶的GPI-瞄定序列(SEQ ID NO3)的32個末端氨基酸的序列被從pVac2-mcs(Invivogen)中作為Xhal-NheI片段被PCR擴(kuò)增，并連接至上面提到的修飾pcDNA3.1(+)的XbaI位點，僅在序列的5’端重新產(chǎn)生XbaI位點，生成pYBS101。
實施例2生成豆蔻?；┫导?xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體的產(chǎn)生通過修飾pcDNA3.1(+)(Invitrogen)生成pYBS201。將編碼c-Src N末端的豆蔻?；蛄?SEQ ID NO4)作為寡核甘酸克隆至NheI-HindIII消化的pcDNA3.1(+)中。隨后將編碼六個串連的組氨酸殘基的序列(SEQ ID NO2)作為寡核甘酸克隆至含有編碼豆蔻?；蛄械腦baI-ApaI消化的載體中。得到pYBS201，即含有5’c-Src豆蔻?；趾?’六組氨酸編碼序列。
實施例3在GPI瞄定的形式中表達(dá)膜蛋白編碼人B7-1和ICAM-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA(不包括信號序列)從ESTs中擴(kuò)增并作為HindIII-XbaI片段與在其N端的腸激酶編碼切斷位點(DDDDK，SEQ ID NO5)克隆至pYBS101中。使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法(Promega)或SuperFect(Qiagen)，根據(jù)廠家的推薦，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后，將細(xì)胞以1∶5、1∶10和1∶20的比率接種到含有500μg/ml的G418(Invitrogen)的生長培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生表達(dá)人B7-1和ICAM-1的穩(wěn)定的細(xì)胞系。維持多克隆的穩(wěn)定細(xì)胞系，并在含有G418的培養(yǎng)基中傳代4周。ICAM-1和B7-1也在HEK-293細(xì)胞中瞬時表達(dá)。使用PE-連接的抗體通過FACS分析確定這些蛋白的表達(dá)(Beckton Dickinson)，結(jié)果分別表示在圖2A和2B中。通過蛋白印記分析進(jìn)一步確定ICAM-1和B7-1的表達(dá)，結(jié)果在圖2C中顯示。
實施例4膜蛋白的純化制備表達(dá)B7-1或ICAM-1的pYBS101質(zhì)粒，并如實施例3所述轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。用冷的PBS從6-8個10cm的平皿中洗滌融合的CHO細(xì)胞兩次，將其刮入600μl(每個平皿)含有50mM Tris-Cl pH8.0，150mMNaCL，和1％ Triton X100和蛋白酶抑制混合物(Sigma)的裂解緩沖液中。將收集的細(xì)胞在冰上溶解30分鐘，隨后以最大速度通過微離心機(jī)離心15分鐘。用裂解緩沖液洗滌Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)1次，并加入澄清的提取物，每600μl細(xì)胞提取液加50μl小珠。在4℃下將細(xì)胞提取液與小珠旋轉(zhuǎn)孵育2小時。用含有50mM Tris PH8.0，150mMNaCl，10mM咪唑(Sigma)和1％的辛基-葡萄糖吡喃糖苷(Calbiochem)和蛋白酶抑制混合物的緩沖液中洗滌4次。用含有50mM Tris PH8.0，150mM NaCl，200mM咪唑和1％的辛基-葡萄糖吡喃糖苷和蛋白酶抑制混合物的600μl緩沖液在4℃旋轉(zhuǎn)1小時洗提結(jié)合的蛋白。通過SDS-PAGE的檢測，洗提的蛋白大約50％純，根據(jù)Bradford分析(BioRad)，大約6.8μg B7-1/mg總蛋白，3.3μg ICAM-1/mg總蛋白。洗提后大約10-50％純化的蛋白仍連接在小珠上。
實施例5膜蛋白的重建通過實施例4的方法制備的蛋白提取液的水性部分基本上加入到eggPC脂質(zhì)混合物(1％ NBD-PG，99％eggPC)，在室溫下在PBS中過夜透析，換3次緩沖液。在這種情況下，eggPC用于產(chǎn)生膜，這些蛋白可以很容易與多種脂質(zhì)組合物在小囊中重建。為了形成支持的脂質(zhì)膜，20μl未稀釋(或1∶2稀釋的)蛋白-脂質(zhì)混合物在室溫下被沉積到MembraneChipTM或蓋玻片上3-5分鐘，隨后用緩沖液洗滌5次。使用各自蛋白的抗體通過免疫熒光確定融合到支持膜上的蛋白。在5％的FCS中用30μlPE結(jié)合的抗體(Becton Dickinson)染色30分鐘，然后用PBS充分洗滌，用熒光顯微鏡分析。根據(jù)在7mm直徑的芯片表面20μl滴中的脂質(zhì)蛋白濃度為0.6μg/μl(50％純度)的分析，蛋白密度大約為10,000-20,000個分子/μm2。假定僅僅有1％的滴含量保留在用于膜展示的芯片表面。
實施例6黏附至MembraneChipTM的Jurkat T細(xì)胞如Chan等(Chan等，J CellBiol(1991)115245-255)描述的并經(jīng)過各種改進(jìn)進(jìn)行細(xì)胞黏附分析。簡言之，通過實施例5的方法基本上由B7-1和ICAM-1形成的膜在室溫下在PBS中用10％的胎牛血清(VWR)阻斷1小時，隨后在37℃下在含有10％的FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中(Invitrogen)孵育10分鐘。將1×105的Jurkat T細(xì)胞加入到孔中15分鐘。通過在明場顯微鏡下的計數(shù)確定每一個膜欄上大概的細(xì)胞數(shù)(通常為150-200個細(xì)胞/欄)。隨后將MembraneChipTM顛倒放置到含有10％FBS的PBS的平皿中，放置15-20分鐘，以洗掉未結(jié)合的細(xì)胞。通過直接在顯微鏡下或照片后計數(shù)確定最后的細(xì)胞數(shù)。在使用抗人B7-1或ICAM-1(Santa Cruz)單克隆抗體阻斷Jurkat T細(xì)胞黏附的試驗中，預(yù)先將MembraneChipTM與抗體孵育，在與細(xì)胞孵育前用PBS洗滌3次。在Nikon Eclipse垂直顯微鏡中進(jìn)行顯像。
實施例7黏附至MembraneChipTM的抗原特異性T細(xì)胞為了進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞的黏附，使用實施例3和4中描述的方法，鼠科II型MHC二聚分子I-Ek被表達(dá)、純化，并在MembraneChipTM上展示。在各種試驗中，I-Ek在存在或不存在ICAM-1的情況下被展示。用從鴿子細(xì)胞色素c(PCC)衍生的短肽加載I-Ek，該鴿子細(xì)胞色素c(PCC)為衍生自轉(zhuǎn)基因小鼠株B10.Cg-Tg(TcrAND)53Hed/J和B6；SJL-Tg(TcrAND)53Hed/J細(xì)胞(Jackson實驗室)(Kaye等人，Nature(1989)341746-749)的T細(xì)胞特異性識別的蛋白抗原。用磁性小珠選擇(Dynal)從前述轉(zhuǎn)基因小鼠得到的脾臟中分離PCC特異的鼠T細(xì)胞?；旧鲜褂肨uekat T細(xì)胞試驗(實施例6)中描述的進(jìn)行這些鼠PCC特異的T細(xì)胞在單獨或聯(lián)合展示ICAM-1和PCC-加載的I-Ek的MembraneChipTM上的測量。使用直接抗人ICAM-1和鼠I-Ek(Santa Cruz)的單克隆抗體阻斷試驗。
實施例8在MembraneChipTM上抗原特異的免疫突觸的形成基本上如實施例7中所描述的方法制備免疫突觸試驗使用的PCC抗原特異的鼠科T細(xì)胞和展示ICAM-1和PCC加載的I-EkMembraneChipTM(也見Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。基本上使用實施例3-5中描述的方法表達(dá)、純化和展示人ICAM-1(熒光標(biāo)記的綠色)和鼠科I-Ek(熒光標(biāo)記的紅色)。圖4A顯示了PCC抗原特異的鼠科T細(xì)胞黏附至展示ICAM-1中央的和PCC加載I-Ek周邊的MembraneChipTM不成熟突觸(左組)。右組顯示孵育30分鐘后的成熟突觸。
如在Adobe Photoshop中圖像定量所確定的通過確定I-Ek聚集的中央的程度確定免疫突觸形成的強(qiáng)度，結(jié)果在圖4B中表示。沒有肽制備的、突變PCC*制備的和野生型PCC制備的MembraneChipTM的I-Ek聚集的密度以相對的熒光單位測定。
實施例9膜蛋白展示的確認(rèn)使用免疫突觸的幾種蛋白確定pYBS101表達(dá)系統(tǒng)，該免疫突觸調(diào)節(jié)T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞B7-1、ICAM-1和α和β鏈形成的二聚體I-Ek的相互作用。編碼這些蛋白的人(ICAM-1、B7-1)或鼠科(I-Ek)的異構(gòu)體的cDNA通過實施例3的方法被克隆至pYBS101中，穩(wěn)定(在CHO細(xì)胞中)或瞬時(在HEK-293細(xì)胞中)表達(dá)。FACS分析(圖2A和2B)證明這些蛋白高水平的表達(dá)(見ICAM-1和B7-1)，以及其正確的定位和拴系至質(zhì)膜(未轉(zhuǎn)染的在左，轉(zhuǎn)染的在右)。如實施例4中描述的使用Ni2+樹脂一步完成這些蛋白的純化，SDS-PAGE和蛋白印跡雜交表面這些蛋白為預(yù)期的大小(圖2C)。隨后將純化的蛋白重建到卵磷脂小囊中，如實施例5中所述列陣到MembraneChipTM的膜欄中。
免疫熒光顯微鏡顯示了在支持雙層中這些蛋白的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。在從芯片列陣中任意釋放可溶蛋白的情況下，用磷脂酰肌醇磷脂酶C可以完成對GPI錨的酶切。
實施例10Jurkat T細(xì)胞黏附分析為了證實純化的、MembraneChipTM展示蛋白是具有功能的，測試了調(diào)節(jié)Jurkat T細(xì)胞黏附的系統(tǒng)的能力(圖3A)。與如實施例5中制備的具有或不具展示的人B7-1或ICAM-1的MembraneChipTM孵育大約1×105Jurkat T細(xì)胞，密度大約為10,000-20,000個分子/μm2。僅在展示這些蛋白的膜上觀察到強(qiáng)的T細(xì)胞黏附，對于沒有蛋白的膜，細(xì)胞幾乎不黏附。作為細(xì)胞黏附特異性的進(jìn)一步試驗，分別用抗人B7-1和ICAM-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體阻斷CD28/B7-1和LFA-1/ICAM-1的相互作用。在圖3B中的結(jié)果表明與抗B7-1或ICAM-1的抗體預(yù)孵育的膜使Jurkat T細(xì)胞向展示各種蛋白的MembraneChipTM膜的黏附消失了，在沒有蛋白的膜中觀察到的降低至背景水平的細(xì)胞黏附。而且，檢測了PCC抗原特異的鼠科T細(xì)胞對MembraneChipTM單獨或聯(lián)合展示ICAM-1和PCC加載的I-Ek的黏附(圖3C)。如在Jurkat T細(xì)胞試驗的情況中，可以使用抗ICAM-1和I-Ek的單克隆抗體完成T細(xì)胞黏附的特異性阻斷(圖3C)。
因此，本發(fā)明描述了生成拴系的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的新方法，特別是用于與流動的雙層膜使用。本文所描述的試驗證實了在生物分析中拴系蛋白的強(qiáng)活性。盡管本發(fā)明主旨的優(yōu)選實施方案被詳細(xì)的描述了，應(yīng)該理解在不偏離本發(fā)明的主旨和范圍的前提下可以進(jìn)行各種改變。
序列表<110>西納門公司V·山崎O·西連科J·T·格羅夫斯<120>用于生產(chǎn)拴系蛋白的方法<130>547958003WO0<140>Not Yet Assigned<141>Filed Herewith<150>US 60/543,324<151>2004-02-09<160>5<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgK引導(dǎo)序列<400>1Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp20<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>六-組氨酸標(biāo)記<400>2His His His His His His1 5<210>3<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GPI序列<400>3Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg Ser Val Val Pro Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro20 25 30
<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>c-Src豆蔻酰化序列<400>4Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp1 5 10<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>腸激酶編碼切斷位點<400>5Asp Asp Asp Asp Lys1 權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生跨膜蛋白的拴系的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的方法，其包括(a)制備含有5’信號序列，純化的抗原決定簇標(biāo)記，膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列和3’錨序列的表達(dá)載體；以及用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，以產(chǎn)生瞄定質(zhì)膜的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的錨拴系蛋白；或(b)制備含有5’豆蔻?；幋a序列，膜蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的編碼序列和3’純化的抗原決定簇標(biāo)記的表達(dá)載體；和用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞以產(chǎn)生瞄定膜的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的豆蔻?；乃┫档鞍?。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述3’瞄定序列是GPI錨序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述GPI錨序列含有GPI錨定序列的32個末端氨基酸。
4.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自CHO或HEK-293細(xì)胞。
5.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述信號序列選自由表皮生長因子、胰島素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子、胰高血糖素、ICAM-1、B7-1、TrkA、血小板衍生的生長因子受體或CD58組成的蛋白。
6.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述純化的抗原決定簇標(biāo)記是六-組氨酸抗原決定簇標(biāo)記。
7.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述豆蔻酰化編碼序列是c-Src豆蔻?；幋a序列。
8.一種用于產(chǎn)生拴系的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體，其包括
5’信號序列，純化的抗原決定簇標(biāo)記，膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列，和
3’錨序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其中所述錨序列是GPI序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的載體，其中所述純化抗原決定簇標(biāo)記是六-組氨酸抗原決定簇標(biāo)記。
11.一種用于產(chǎn)生拴系的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體，其包括豆蔻?；?’信號序列；膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的編碼序列；和
3’純化抗原決定簇標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的載體，其中所述純化抗原決定簇標(biāo)記是六-組氨酸抗原決定簇標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的使用表達(dá)載體生產(chǎn)拴系的(tethered)跨膜蛋白細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的方法。本發(fā)明還提供了用于此領(lǐng)域的表達(dá)載體。
文檔編號C12N15/85GK1918299SQ200580004464
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月9日
發(fā)明者V·山崎, O·西連科, J·T·格羅夫斯 申請人:西納門公司