專利名稱：用于治療IgE介導(dǎo)的失調(diào)的RNA干涉分子的靶向遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過RNA干涉(RNAi)治療失調(diào)。更特別地，本發(fā)明涉及能介導(dǎo)RNAi的小核酸分子的靶向遞送，其針對在失調(diào)，例如免疫球蛋白-∈(IgE)-介導(dǎo)的失調(diào)中涉及的關(guān)鍵途徑中有活性的基因。
背景技術(shù)：
有許多過敏性失調(diào)，包括過敏性鼻炎(例如花粉熱)，哮喘，過敏性反應(yīng)，風(fēng)疹(蕁麻疹)，特應(yīng)性皮炎(濕疹)和食物過敏，是由被稱為免疫球蛋白∈(IgE)的抗體類別調(diào)節(jié)的。具有嚴(yán)重特應(yīng)性反應(yīng)，或過敏的個體，典型地具有升高水平的血清IgE。這類抗體是由特定類型的B細(xì)胞產(chǎn)生的，其在發(fā)育過程中變得可產(chǎn)生IgE。一旦這些B細(xì)胞被抗原激活，它們就分泌IgE抗體，IgE抗體然后在血液中和淋巴系統(tǒng)中循環(huán)并結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞表面的FcεR1。
B細(xì)胞中IgE合成的誘導(dǎo)涉及抗原(在過敏性反應(yīng)中通常稱為過敏原)與抗原呈遞細(xì)胞(APC)的相互作用以及一類稱為TH2細(xì)胞的輔助T細(xì)胞。當(dāng)其細(xì)胞表面表達(dá)IgE分子的B細(xì)胞與抗原，或過敏原，并且也與APC和TH2細(xì)胞特異性結(jié)合時，該B細(xì)胞被激活，開始合成和分泌大量的IgE分子到血液系統(tǒng)中。
只有非常少量的IgE分子在循環(huán)著，因為它迅速地被組織中的肥大細(xì)胞和循環(huán)中的嗜堿細(xì)胞表面的高親和性IgE受體(FcεR1)捕獲。過敏原導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)合的IgE的連接引發(fā)導(dǎo)致過敏反應(yīng)的媒介物的釋放。這些媒介物(mediators)，包括組胺，白細(xì)胞三烯，前列腺素和細(xì)胞因子(包括IL-4，IL-5，IL-6，TNF和GM-CSF)，導(dǎo)致快速反應(yīng)，稱為速發(fā)型超敏反應(yīng)(immediate hypersensitivity)，以及延遲的反應(yīng)，稱為晚期反應(yīng)(late phase reaction)，其在肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞激活后2-24小時發(fā)生。速發(fā)型超敏反應(yīng)的特征為增加的血管滲透性，血管舒張，支氣管和內(nèi)臟平滑肌收縮，以及局部炎癥。晚期反應(yīng)的特征為嗜伊紅細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的炎性滲透。晚期反應(yīng)的重復(fù)發(fā)作可引起組織損傷。
在激活B細(xì)胞的過程中，TH2細(xì)胞能釋放細(xì)胞因子如GM-CSF和IL-5，其相應(yīng)能激活嗜伊紅細(xì)胞釋放媒介物，其也包括組胺，白細(xì)胞三烯，前列腺素和細(xì)胞因子，從而增加過敏反應(yīng)。過敏性失調(diào)因此被認(rèn)為是TH2-依賴性的失調(diào)。
哮喘是一種常見疾病，在發(fā)達(dá)國家高度流行。哮喘的特征是氣管支氣管樹對多種刺激源的反應(yīng)性增加，最初的生理失調(diào)是可逆的氣流受限，其可能是自發(fā)的或者與藥物相關(guān)，病理學(xué)特點是呼吸道炎癥?，F(xiàn)已確定大部分哮喘都是速發(fā)型超敏反應(yīng)類型。在臨床上，哮喘可以再分為外源性和內(nèi)源性變體。
外源性哮喘具有可辨別的沉淀物，可以認(rèn)為是特應(yīng)性的，職業(yè)性的和藥物誘導(dǎo)的。特應(yīng)性哮喘與產(chǎn)生特定IgE的TH2型免疫反應(yīng)的增加有關(guān)。外源性哮喘中的氣流阻塞是由于呼吸道炎癥引起的非特異性的支氣管超反應(yīng)性造成的。在特應(yīng)性哮喘中，產(chǎn)生呼吸道炎癥的免疫反應(yīng)是由分泌IL-4，IL-5和IL-10的TH2型T細(xì)胞造成的。已表明特應(yīng)性哮喘患者的肺部的淋巴細(xì)胞當(dāng)激活的時候產(chǎn)生IL-4和IL-5。IL-4和IL-5都是TH2型的細(xì)胞因子，是哮喘中產(chǎn)生IgE和伴隨著嗜伊紅細(xì)胞所必需的。內(nèi)源性，或者原因不明的哮喘據(jù)報道發(fā)生于上呼吸道感染之后，但是在中年人或老年人中可能再次從頭(de novo)發(fā)生，對這些人它比外源性哮喘更難以治療。
哮喘理想地是通過避免觸發(fā)過敏原來預(yù)防，但是這并不總是可能的，觸發(fā)性過敏原也并不總是容易被鑒別的。哮喘的藥物治療是基于使用皮質(zhì)類固醇和支氣管擴(kuò)張劑藥物減少炎癥并逆轉(zhuǎn)呼吸道阻塞。在慢性哮喘中，用皮質(zhì)類固醇治療導(dǎo)致無法接受的不良副作用。
另一種與哮喘具有類似的免疫異常的失調(diào)是過敏性鼻炎。過敏性鼻炎是一種常見的失調(diào)，據(jù)估計影響了至少10％的人。過敏性鼻炎可以是季節(jié)性的(花粉熱)，由于對花粉過敏造成的。非季節(jié)性的，或長期的鼻炎是由于對抗原例如那些來自于屋塵螨或動物毛屑的抗原過敏造成的。
過敏性鼻炎中的異常免疫反應(yīng)的特征是過量產(chǎn)生特異性抗過敏原的IgE抗體。炎性反應(yīng)發(fā)生在鼻粘膜而不是象哮喘一樣發(fā)生在呼吸道進(jìn)一步向下的位置。象哮喘一樣，在受影響的組織中，局部嗜伊紅細(xì)胞是過敏性鼻炎的主要特征。作為這種炎癥的結(jié)果，患者開始打噴嚏，流鼻涕和鼻塞。在更嚴(yán)重的情況中，炎癥延伸到眼睛(結(jié)膜炎)，上顎和外耳。雖然它不危及生命，但過敏性鼻炎可以有很強(qiáng)的致殘性，妨礙正?；顒?，干擾人工作的能力。目前的治療包括使用抗組胺劑，鼻減充血劑和，如哮喘一樣，色甘酸鈉和皮質(zhì)類固醇。
特應(yīng)性皮炎，也稱為特應(yīng)性濕疹，是一種慢性的復(fù)發(fā)的搔癢性炎性皮膚疾病，通常發(fā)生在對各種過敏性失調(diào)，例如過敏性鼻炎和哮喘具有遺傳敏感性的家庭中。特應(yīng)性皮炎流行性增加，高達(dá)15％的人在幼年時代患過特應(yīng)性皮炎。主要癥狀是皮膚干燥，皮炎(濕疹)主要位于面部，頸部和屈肌側(cè)和四肢折疊處，伴隨著嚴(yán)重搔癢。其典型地在生命的第一個五年內(nèi)開始。在許多患者中，這種皮膚病在幼年時代消失，但是癥狀可以持續(xù)到成年時代。而且，50％的患者發(fā)生哮喘，大約75％的患者發(fā)生過敏性鼻炎。特應(yīng)性皮炎在全球是皮炎的最常見形式之一。
過敏原在特應(yīng)性皮炎中具有重要作用。大約80％的患者對多種食物和吸入的過敏原具有IgE抗體，大部分具有嚴(yán)重特應(yīng)性皮炎的患者具有升高的血清IgE水平，特別是如果他們還具有其它形式的特應(yīng)性疾病。此外，血液中嗜伊紅細(xì)胞的循環(huán)水平通常升高。在特應(yīng)性皮炎中，皮膚損傷處的真皮被巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞和嗜伊紅細(xì)胞滲透，在慢性損傷中，具有增加數(shù)量的肥大細(xì)胞。急性損傷具有顯著更多的表達(dá)細(xì)胞因子IL-4，IL-5和IL-13的細(xì)胞，表明優(yōu)先積累Th2型T細(xì)胞。此外，與正常個體相比，特應(yīng)性皮炎患者中的循環(huán)的T細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-4和IL-5。IL-4負(fù)責(zé)將抗體產(chǎn)生轉(zhuǎn)換至IgE同種型，TH2細(xì)胞的發(fā)育，募集嗜伊紅細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子的誘導(dǎo)。IL-5對于嗜伊紅細(xì)胞的發(fā)育和分化是重要的。
過敏性接觸性皮炎是一種常見的非感染性的皮膚炎性失調(diào)。在接觸性皮炎中，直到身體對特定的抗原變的敏感才能發(fā)生免疫反應(yīng)。然后皮膚暴露于該抗原以及T細(xì)胞對這些抗原的識別導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的釋放，T細(xì)胞的增殖和募集，最終導(dǎo)致皮炎(濕疹)。如果這些原因可以被鑒別，僅僅是將其除去就能治愈過敏性接觸性皮炎。在活性炎癥期間，局部皮質(zhì)類固醇是有用的。
在過敏性反應(yīng)中，或者系統(tǒng)性速發(fā)型超敏反應(yīng)中，肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞媒介物進(jìn)入到遍布身體的血管床上，引起血管舒張和血漿滲出。這又導(dǎo)致血壓降低，或休克，稱為過敏性休克，其可能是致命的。過敏性休克通常是由于通過注射引入的抗原的系統(tǒng)性存在，昆蟲螫傷，或者穿過上皮表面，例如皮膚或腸粘膜的吸收造成的。治療通常是系統(tǒng)性施用腎上腺素，這可逆轉(zhuǎn)媒介物的支氣管收縮和血管擴(kuò)張效果。
STAT(轉(zhuǎn)錄的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和激活因子)家族的蛋白是潛在的轉(zhuǎn)錄因子，在許多細(xì)胞類型中豐富表達(dá)。STAT6是普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，在IL-4/IL-13受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)后被特異性激活，作用于由這些細(xì)胞因子，包括IgE調(diào)節(jié)的基因的共同點(a point of convergence)上。STAT6缺陷型小鼠顯著減少IgE和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在呼吸道炎癥模型中不能發(fā)生抗原誘導(dǎo)的呼吸道過度反應(yīng)(Kuperma et al.J.Exp.Med.，187939-948，1998)。已證明STAT6對于有效的TH2分化以及B細(xì)胞類別向IgE合成轉(zhuǎn)換是必須的。在小鼠模型中在體內(nèi)脂質(zhì)體介導(dǎo)的針對STAT6的順式元件雙鏈寡核苷酸(ODN)轉(zhuǎn)染已表明抑制慢性和急性接觸性超敏反應(yīng)(Sumi et al. Gene Ther.111763-1771，2004)。在特應(yīng)性皮炎的小鼠模型中，這些同樣的STAT6誘捕ODN也已表明對IgE介導(dǎo)的晚期過敏性反應(yīng)具有顯著的抑制效果(Yokozekiet al.Gene Ther.111753-62-1771，2004)。
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是大部分真核生物用作對抗病毒攻擊和換位因子的防御機(jī)制的轉(zhuǎn)錄后RNA沉默現(xiàn)象。這種RNA沉默過程首先在植物中被確認(rèn)，在其中被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)，然后由Fire and Mello在秀麗線蟲(nematode C.elegans)中觀察到(Nature 391806-811，1998)。RNAi涉及與互補(bǔ)mRNA序列選擇性結(jié)合的小干涉核酸或RNA分子(siRNA)的使用，將它們靶定用于降解從而抑制相應(yīng)的蛋白產(chǎn)生。最近已表明siRNA可以誘導(dǎo)從頭甲基化以及啟動子序列的沉默，稱為轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)。
更特別地，在起始步驟中，雙鏈RNA(dsRNA)被酶Dicer(dsRNA-特異的核糖核酸酶的RNase III家族的成員)消化成長度為19-25個核苷酸的小干涉RNA(siRNA)。每個siRNA由兩個獨立的，退火的單鏈核苷酸組成，每條鏈具有2-3個核苷酸的3’懸末端(overhang)。在效應(yīng)步驟中，siRNA雙鏈體與核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。RISC然后靶向與復(fù)合物中的siRNA互補(bǔ)的內(nèi)源mRNA，并在siRNA的3’末端大約十二個核苷酸切割內(nèi)源mRNA。內(nèi)源mRNA的降解然后由核酸外切酶完成。在某些生物體中，擴(kuò)增步驟也可以存在于RNAi途徑中，例如通過輸入的dsRNA的拷貝或通過siRNA本身的復(fù)制。
大于30個核苷酸的長dsRNA分子轉(zhuǎn)染到大部分哺乳動物細(xì)胞中引起基因表達(dá)的非特異性抑制，與在其它生物體中觀察到的基因特異性抑制相反。這相信是由于抗病毒防御機(jī)制的激活，該機(jī)制包括干擾素的產(chǎn)生，并且導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生的整體(global)停止。但是已經(jīng)表明這條途徑不由長度少于30個核苷酸的dsRNA激活，21-23個核苷酸的短dsRNA可用于在哺乳動物中減少特定的基因表達(dá)(Caplen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-9747，2001；Elbashir et al.，Nature6836494-498，2001)。最近，Brummelkamp et al.證明靶向癌基因的siRNA在小鼠中有效減少腫瘤(Cancer Cell 2243-247，2002)。
RNAi相對于其它基因沉默技術(shù)，例如反義寡核苷酸(ODN)的使用具有幾個優(yōu)勢。RNAi技術(shù)比ODN導(dǎo)致對基因表達(dá)的更特異性的抑制，能以低的多的試劑濃度誘導(dǎo)與ODN相同水平的沉默。而且，siRNA比ODN更抗核酸酶降解。Bertrand et al.(Biochem.Biophys.Res.Commun.2961000，2002)表明在小鼠中，siRNA沉默比反義抑制更有效。
已表明siRNA的序列特異性是重要的，因為siRNA和其靶mRNA之間的單堿基對的錯配可以顯著減少沉默。相應(yīng)地，為了高度有效地抑制感興趣的基因的表達(dá)，siRNA必須設(shè)計為對靶基因是特異的。此外，為了避免不需要的副作用，遞送系統(tǒng)必須特異性地將siRNA遞送到所希望的靶。通過預(yù)制siRNA的外源遞送或通過siRNA或shRNA的基于啟動子的表達(dá)的siRNA向細(xì)胞的遞送已有描述。用于遞送siRNA分子的基因構(gòu)建體已經(jīng)例如在US Patent 6,573,099中被描述。由于RNA的快速降解，在哺乳動物中在體內(nèi)短RNA片段向細(xì)胞的遞送可能有問題。短發(fā)夾RNA(shRNA)是模擬RNAi雙鏈體結(jié)構(gòu)的核酸分子，可以在編碼shRNA的表達(dá)載體的遞送后在細(xì)胞中產(chǎn)生。使用shRNA表達(dá)質(zhì)粒在大鼠中在體內(nèi)減少基因表達(dá)已由Zhang et al.，描述(J.Gene Med.51039-1045，2003)。
發(fā)明概述簡短地說，本發(fā)明提供了用于在哺乳動物中通過RNA干涉治療和/或預(yù)防失調(diào)的組合物，以及使用這些組合物的方法。優(yōu)選地，所述失調(diào)是IgE介導(dǎo)的失調(diào)。在一個方面，所發(fā)明的組合物包括(a)與在感興趣的靶細(xì)胞表面表達(dá)的靶可內(nèi)在化抗原特異性結(jié)合的結(jié)合試劑，和(b)抑制靶基因在所述靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的小干涉核酸分子(siNA)，由此在與所述靶抗原結(jié)合后，所述結(jié)合試劑和siNA被內(nèi)在化到所述細(xì)胞中，所述siNA被釋放。
在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了組合物，包括(a)與在感興趣的靶細(xì)胞表面表達(dá)的靶可內(nèi)在化抗原特異性結(jié)合的結(jié)合試劑；和(b)能表達(dá)抑制靶基因在靶細(xì)胞中表達(dá)的siNA的基因構(gòu)建體，由此在與靶抗原結(jié)合后，所述結(jié)合試劑和基因構(gòu)建體被內(nèi)在化到所述細(xì)胞中，所述siNA被所述基因構(gòu)建體表達(dá)。優(yōu)選地，所述siNA在RNA聚合酶III或組織特異性RNA聚合酶II啟動子的控制下。
在另一個方面，所發(fā)明的組合物含有能表達(dá)抑制靶基因在靶細(xì)胞中表達(dá)的siNA的基因構(gòu)建體，其中所述基因構(gòu)建體包裝在病毒載體中，其在感染細(xì)胞的時候釋放其遺傳物質(zhì)，使得所述基因構(gòu)建體能夠表達(dá)。優(yōu)選地，所述病毒載體是腺病毒相關(guān)載體(AAV)。在這個方面，病毒衣殼蛋白可以作為結(jié)合試劑。
在特定的實施方案中，用于所發(fā)明的組合物的結(jié)合試劑是抗體，或其抗原結(jié)合片段?？梢员挥行в糜谒l(fā)明的組合物中的其它結(jié)合試劑包括細(xì)胞特異性配體，和與細(xì)胞特異性受體特異性結(jié)合的肽或小分子。病毒(衣殼)蛋白也可以用作結(jié)合試劑。
在一個實施方案中，所述結(jié)合試劑通過抗生物素蛋白鏈菌素-生物素連接體與siNA，基因構(gòu)建體或病毒載體相連，如下所述。在另一個實施方案中，所述siNA，基因構(gòu)建體或病毒載體被復(fù)合為脂質(zhì)載體，例如陽離子脂質(zhì)載體，然后與所述結(jié)合試劑相連。在一個相關(guān)的實施方案中，所述siNA，基因構(gòu)建體或病毒載體被封裝在脂質(zhì)體中，所述結(jié)合試劑，或其抗原結(jié)合部分存在于所述脂質(zhì)體的表面。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物有效減少在IgE介導(dǎo)的疾病涉及的途徑中有活性的基因的表達(dá)。在這樣的一個方面，用于所發(fā)明的組合物的siNA能在天然表達(dá)IgE的細(xì)胞，例如B細(xì)胞中抑制IgE的產(chǎn)生。在這樣的組合物中，靶抗原是在B細(xì)胞表面表達(dá)的可內(nèi)在化抗原，其中復(fù)合物與所述抗原的結(jié)合導(dǎo)致所述復(fù)合物在所述B細(xì)胞中的內(nèi)在化。優(yōu)選地，所述靶抗原是C19或CD22。能抑制IgE的表達(dá)的siNA的實例包括相應(yīng)于SEQ ID NO12-100和824-915中提供的靶序列的siRN序列。
在進(jìn)一步的方面，用于所發(fā)明的組合物中的siRNA能抑制高親和性受體，F(xiàn)cεR1的表達(dá)，所述結(jié)合試劑與在肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞表面表達(dá)并使與靶抗原結(jié)合的復(fù)合物容易內(nèi)在化的靶抗原特異性結(jié)合。在一個實施方案中，所述靶抗原是FcεR1本身，因為FcεR1結(jié)合的復(fù)合物已知被細(xì)胞內(nèi)在化并降解。在另一個實施方案中，所述靶抗原是受體CXCR4。能有效用于這些組合物的siNA的實例包括相應(yīng)于SEQ IDNO101-823提供的靶序列的siRNA序列。
在另一個方面，用于所發(fā)明的組合物的siNA能抑制STAT6的表達(dá)，所述結(jié)合試劑與在表達(dá)STAT6的細(xì)胞表面表達(dá)并使與該靶抗原結(jié)合的復(fù)合物容易內(nèi)在化的靶抗原特異性結(jié)合。能夠抑制STAT6的表達(dá)的組合物的遞送優(yōu)選靶向造血細(xì)胞，例如T細(xì)胞，B細(xì)胞，樹突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。位于這些細(xì)胞表面的可內(nèi)在化靶抗原包括，例如整聯(lián)蛋白超家族的成員和細(xì)胞粘附分子。STAT6的cDNA序列在SEQ ID NO942中提供，STAT6啟動子的序列在SEQ ID NO943中提供。在特定的實施方案中，抑制STAT6表達(dá)的所發(fā)明的組合物包括針對STAT6基因的非編碼不翻譯區(qū)(UTR)或STAT6啟動子序列的siNA。能抑制STAT6的表達(dá)的siNA的實例包括相應(yīng)于SEQ ID NO944-980提供的靶序列的siRNA序列，其中SEQ ID NO971-980的靶序列指向STAT6啟動子。
在另一個更進(jìn)一步的方面，基因構(gòu)建體中的siNA與對靶細(xì)胞特異的啟動子可操作地連接，由此在非靶細(xì)胞中基因表達(dá)的抑制被減少。例如，驅(qū)動B細(xì)胞特異的抗原的表達(dá)的啟動子的使用將防止所述siNA在非B細(xì)胞中表達(dá)，所述抗原包括但不限于免疫球蛋白重鏈(SEQ IDNO916，NCBI Locus ID HUMIGCC4)，CD19(SEQ ID NO917，NCBI Locus ID NM_001770，相應(yīng)的基因組contig ID NT_024812)，CD20(SEQ ID NO918，cDNA序列的NCBI Locus ID NM_021950，蛋白質(zhì)序列NP_068769，相應(yīng)的基因組contig ID NC_000011)，CD21(SEQ ID NO919，NCBI Locus ID AF298224)，或CD22(SEQ ID NO920，相應(yīng)的基因組序列HSU62631)啟動子。
在另一個實施方案中，用于所發(fā)明的組合物的siNA靶向IgE鏈合成所需的啟動子(SEQ ID NO2)或靶向IgE受體基因的啟動子(SEQID NO5和6，其中SEQ ID NO6是IgE beta受體啟動子的一個示例性片段)，其中將所述基因構(gòu)建體引入到靶細(xì)胞，例如B細(xì)胞，肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞中，會導(dǎo)致靶細(xì)胞中IgE或IgE受體基因的轉(zhuǎn)錄性基因沉默。
在另一個實施方案中，用于所發(fā)明的組合物的siNA靶向IgE鏈合成所需的重組酶的啟動子或編碼序列，由此將所述基因構(gòu)建體引入到靶細(xì)胞，例如B細(xì)胞，肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞中，會導(dǎo)致細(xì)胞合成IgE的減少。
在其它的實施方案中，用于所發(fā)明的組合物的siNA靶向要被沉默的IgE或IgE受體基因/外顯子側(cè)翼的基因間/內(nèi)含子區(qū)域，由此將所述基因構(gòu)建體引入到靶細(xì)胞，例如B細(xì)胞，肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞中，會導(dǎo)致所希望的基因部分或完全沉默。優(yōu)選地，通過在所發(fā)明的組合物中使用幾個相互接近地結(jié)合靶區(qū)域的獨特位點的siNA，基因沉默的程度可以被控制。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了在患者中預(yù)防和治療IgE介導(dǎo)的失調(diào)的方法，包括給患者施用本發(fā)明的組合物。可以用所發(fā)明的方法治療的IgE介導(dǎo)的失調(diào)包括但不限于，過敏性鼻炎(例如花粉熱)，哮喘，過敏性反應(yīng)，風(fēng)疹(蕁麻疹)，特應(yīng)性皮炎(濕疹)，食物過敏，受益于在呼吸系統(tǒng)的組織中嗜伊紅細(xì)胞增多的減少的疾病，和其特征是超敏性免疫反應(yīng)的失調(diào)。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了在患者中減少嗜伊紅細(xì)胞增多(eosinophilia)的方法，這種方法包括施用本文公開的至少一種組合物。嗜伊紅細(xì)胞增多的減少在大約20％和大約80％之間變化，優(yōu)選在80％和100％之間，最優(yōu)選在90％和100％之間。肺嗜伊紅細(xì)胞增多減少的百分比可以通過測定治療前后的支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage)液體的數(shù)量來確定。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在患者中調(diào)節(jié)IgE-介導(dǎo)的對特定抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括施用本發(fā)明的組合物。
在另一個方面，提供了在患者中預(yù)防或減少對特定抗原的免疫反應(yīng)的嚴(yán)重程度的方法，包括給患者施用所述特定的抗原和本發(fā)明的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，所述特定的抗原是過敏原。優(yōu)選地，所述組合物在敏化的時候或在患者暴露于特定抗原的時候被施用。
參考下述詳細(xì)的描述，本發(fā)明的這些和其它方面將變得明顯。本文公開的所有參考文獻(xiàn)在此以引用的方式引入其全文，就如同其被單獨引入一樣。
附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明的示例性RNAi載體。
圖2顯示了用實時PCR(real time PCR)測定的在轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中shRNA對IgE表達(dá)的抑制。
圖3顯示了用實時PCR測定的在轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中shRNA對鼠FcεRIβ表達(dá)的抑制。
圖4顯示了用流式細(xì)胞術(shù)測定的shRNA對鼠FcεRIβ/GFP融合蛋白的表達(dá)的抑制。
圖5顯示了用eGFP報道子質(zhì)粒和表達(dá)被設(shè)計用于沉默IgE表達(dá)的shRNA構(gòu)建體的pSilencer 2.1質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔后48小時在轉(zhuǎn)染的(eGFP+)IGEL b4細(xì)胞上的胞內(nèi)IgE蛋白表達(dá)。
圖6顯示了用eGFP報道子質(zhì)粒和表達(dá)被設(shè)計用于沉默F(xiàn)cεRIβ表達(dá)的shRNA構(gòu)建體的pSilencer 2.1質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔后48小時在轉(zhuǎn)染的(eGFP+)MC/9細(xì)胞相對于未轉(zhuǎn)染的(eGFP-)MC/9細(xì)胞上的細(xì)胞表面FcεRIα蛋白表達(dá)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般性地涉及用于治療由IgE介導(dǎo)的失調(diào)的組合物和方法。在特定的實施方案中，這種失調(diào)選自下組過敏性鼻炎(例如花粉熱)，哮喘，過敏性反應(yīng)，風(fēng)疹(蕁麻疹)，特應(yīng)性皮炎(濕疹)，食物過敏，受益于在呼吸系統(tǒng)的組織中嗜伊紅細(xì)胞增多的減少的疾病，和其特征是超敏性免疫反應(yīng)的失調(diào)。
所發(fā)明的組合物包括復(fù)合物，該復(fù)合物包括(a)針對靶基因的“裸露的”或修飾的小干涉核酸分子(siNA)或表達(dá)受組織特異性啟動子控制的siNA的基因構(gòu)建體；和(b)結(jié)合試劑，例如抗體，其與存在于所感興趣的靶細(xì)胞表面上的靶抗原特異性結(jié)合。所述靶抗原以這樣的方式識別并內(nèi)在化某些特異性生物分子，當(dāng)siNA-抗體或基因構(gòu)建體-抗體復(fù)合物與所述靶抗原結(jié)合的時候，所述復(fù)合物通過胞吞作用內(nèi)在化到所述靶細(xì)胞中，所述siNA或基因構(gòu)建體從所述復(fù)合物中釋放，所述siNA通過RNA干涉減少所述靶基因的表達(dá)。
本文所用的術(shù)語“靶基因”指多核苷酸，其含有編碼感興趣的多肽的區(qū)域，和/或調(diào)節(jié)所述多肽的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯或其它對所述多肽的表達(dá)重要的過程的多核苷酸區(qū)域。
本文所用的術(shù)語“小干涉核酸分子”，或siNA，指能夠通過RNA干涉(RNAi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的任何核酸分子，因此包括短干涉RNA(siRNA)，短干涉DNA(siDNA)，雙鏈RNA(dsRNA)，雙鏈DNA(dsDNA)，互補(bǔ)RNA/DNA雜交物，含有修飾的(半合成的)堿基/核苷或核苷酸類似物的核酸分子(其可以或可以不通過與非核酸分子結(jié)合被進(jìn)一步修飾)，定制的修飾的基本或前體microRNA(miRNA)，短發(fā)夾RNA(shRNA)分子，和較長的(直至1kb或更長)，dsRNA或發(fā)夾RNA分子，只要它們不激活非特異性干涉，例如通過干擾素。所述發(fā)夾區(qū)域可以是短的(例如6個核苷酸)，長的(未定義長度)，或可以包含在靶細(xì)胞或組織中有效被剪接的內(nèi)含子。此外，一個方向上的多個串連重復(fù)(例如三個或更多個短有義重復(fù))包括在siRNA的定義中，它們可以在一些系統(tǒng)中引發(fā)強(qiáng)大的RNAi樣反應(yīng)。
能有效用于所發(fā)明的組合物和方法的siNA的實例包括那些相應(yīng)于SEQ ID NO12-915和944-980提供的靶DNA序列的siNA。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，當(dāng)將RNA序列與DNA序列比較的時候，在所述DNA序列包含脫氧核糖核苷酸的位置RNA序列會包含核糖核苷酸，進(jìn)一步在所述DNA序列包含胸腺嘧啶的位置所述RNA序列典型地包含尿嘧啶。
術(shù)語siRNA在本文公開的內(nèi)容中用作典型的小干涉核酸分子。
在一些實施方案中，所述siNA由引入的DNA分子產(chǎn)生，該引入的DNA分子含有負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄含有所述siNA的核酸序列的啟動子和終止子序列。所述引入的DNA可以是共價閉合線狀或環(huán)狀質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物的形式，其優(yōu)選含有少量或不含原核來源的DNA。DNA構(gòu)建體還可以含有核定位序列，例如衍生自SV40增強(qiáng)子的，以促進(jìn)核吸收和所述構(gòu)建體的表達(dá)。啟動子可以是被RNA聚合酶III或RNA聚合酶II激活的類型。第一種類型包括U6，tRNAval，H1，以及這些啟動子被修飾以獲得較高水平的轉(zhuǎn)錄的形式。被RNA聚合酶II激活的啟動子可以是組成型的(例如廣泛使用的CMV和EF1α啟動子)，或可以以優(yōu)選的方式在單個細(xì)胞，細(xì)胞類型，組織類型，或生物化學(xué)事件中被轉(zhuǎn)錄。第二種啟動子可以被選擇用于高水平或低水平的表達(dá)。當(dāng)發(fā)夾或定制的miRNA被使用的時候，單個特異性啟動子可以被使用。當(dāng)具有互補(bǔ)靶區(qū)域的兩個定制microRNA被使用的時候，或者當(dāng)dsRNA是從兩個單獨鏈形成的時候，組成型和特異性啟動子的組合，或特異性啟動子的組合可以被使用。在所希望的是減少，而不是消除表達(dá)水平的情況下，可以通過完全或不完全同源的反義siRNA，或通過具有可變轉(zhuǎn)錄活性的啟動子實現(xiàn)?；蛘?，siNA可以被靶向受siNA高度影響，或者欠完全影響的mRNA區(qū)域，或者指向靶基因、多個靶基因或途徑的多于一個siNA可用于獲得更強(qiáng)的干涉。
所述siNA可以靶向所述靶基因或信息(message)的5’不翻譯區(qū)，編碼區(qū)，或3’不翻譯區(qū)。此外，靶基因的啟動子區(qū)域，或通常在基因上游的區(qū)域可以被靶向以用于RNAi輔助的異染色質(zhì)形成。
siNA可以不被修飾，或可以被化學(xué)修飾以增加對核酸酶降解的抗性，例如國際專利
發(fā)明者J·D·沃特森, G·J·穆里森, M·R·格里戈爾, I·J·哈武卡拉, G·蒙羅, N·阿伯內(nèi)蒂, G·韋布斯特 申請人:吉尼西斯研究及發(fā)展有限公司