專利名稱：Pgg的分離和純化的制作方法
與相關(guān)申請(qǐng)的交互參考本申請(qǐng)要求2004年1月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/538,698的優(yōu)先權(quán)，該專利全文納入本申請(qǐng)作為參考。
背景技術(shù)：
已證明PGG及其類似物具有抗糖尿病活性以及其它生物活性，這使它們可用于新藥的研發(fā)。通常，要獲得FDA批準(zhǔn)的新藥其純度必須大于95％。當(dāng)前，沒有一種高效和成本有效的方法制備和純化克-千克規(guī)模的PGG或其類似物。迄今，層析純化方法是唯一已知可用于產(chǎn)生純度為95％或更高的PGG或其類似物的方法。然而，層析方法非常昂貴，而且不能用于PGG及其類似物的大規(guī)模純化。用當(dāng)前已知的方法進(jìn)行PGG的工業(yè)規(guī)模生長(zhǎng)非常昂貴，因此不能進(jìn)行。
因此，需要比當(dāng)前已知方法便宜并且可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的分離和純化PGG及其類似物的方法。
發(fā)明概述本文提供一種分離和純化α-和β-形式的五-O-沒食子酰-D-葡萄糖(PGG)的簡(jiǎn)單、便宜和高效的方法。具體地說，本文提供的方法可用于從含有α-PGG和β-PGG以及其它化合物的混合物中分離α-PGG或β-PGG。與以前的分離和純化方法不同，本文所述的方法不需要HPLC步驟。因?yàn)椴恍枰狧PLC步驟，本文所述的方法可經(jīng)改造用于純化的α-PGG和β-PGG的大量生產(chǎn)。
本文提供從含有α-PGG和β-PGG的混合物中分離α-PGG的方法。本文提供從含有α-PGG和β-PGG的混合物中分離β-PGG的方法。本文所述的方法尤其適于從含有大于50％的α-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分離α-PGG，或從含有大于50％的β-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分離β-PGG。
本文還提供將α-PGG和β-PGG純化至純度大于95％的方法，在一種實(shí)施方式中，所述方法提供純度大于98％的α-PGG或β-PGG。還提供生長(zhǎng)α-PGG單晶和β-PGG單晶的方法。
本文還提供PGG的葡萄糖部分被其它糖取代的α-或β-PGG類似物的分離和純化方法。一些實(shí)施方式中，所述糖是己糖、戊糖或丁糖。在葡萄糖被一種或多種己糖取代的實(shí)施方式中，己糖可選自但不限于，半乳糖、甘露糖、艾杜糖、塔羅糖、阿卓糖、阿洛糖、古洛糖(gulose)、果糖等。在葡萄糖被一種或多種戊糖取代的實(shí)施方式中，戊糖可選自但不限于，木糖、核糖、阿拉伯糖和來蘇糖。在葡萄糖被丁糖取代的實(shí)施方式中，合適的丁糖包括但不限于蘇糖和赤癬糖。本文提供的方法能夠從含有α-形式和β-形式的混合物中分離α-和β-PGG類似物。根據(jù)本文所述的方法，從含有50％或更多α-形式的混合物中分離α-形式的類似物；從含有50％或更多β-形式的混合物中分離β-形式的類似物。在這兩種情況下，α-形式和β-形式可被純化到95％或更高純度的水平。本文還提供生產(chǎn)純度為98％或純度更大的α-形式和β-形式PGG的方法。
本文還提供PGG中葡萄糖部分被其它糖如其它己糖、戊糖或丁糖取代并且這些糖類似物中的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的α-和β-PGG類似物的分離和純化方法。對(duì)于這些糖，本文所述的方法可分離α-PGG類似物和β-PGG類似物。當(dāng)在不純的起始物中分別存在大于50％的α-PGG類似物或大于50％的β-PGG類似物時(shí)，這種分離方法得到進(jìn)一步增強(qiáng)。根據(jù)本文所述的方法，α-PGG類似物和β-PGG類似物均可純化到95％或更高的純度。本文還提供生產(chǎn)純度為98％或純度更高的α-形式或β-形式的方法。
本文還提供PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的α-和β-PGG類似物的分離和純化方法。一些實(shí)施方式中，酚類包括但不限于2，3-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸和3，5-二羥基苯甲酸。根據(jù)本文所述的方法，可從α-PGG類似物和β-PGG類似物的混合物中分離α-PGG類似物和β-PGG類似物。一些實(shí)施方式中，用于分離α-形式類似物的起始物含有大于50％的α-形式，用于分離β-形式類似物的起始物含有50％多的β-形式。此外，可將沒食子酸被其它酚類取代的α-PGG類似物和β-PGG類似物純化到95％或更大純度，98％或更大純度。
從α-PGG和β-PGG混合物中分離α-PGG的方法包括以下步驟(a)將水加入含有50％或更多α-PGG和50％或更少β-PGG的樣品中；(b)將PGG和水混合以溶解PGG；(c)濾除所有不溶顆粒；以及(d)不干擾濾液直到晶體形成。一些實(shí)施方式中，所用的水是雙蒸水。一些實(shí)施方式中，水和PGG的比例約是1gPGG用20mL水。一些實(shí)施方式中，步驟中的混合進(jìn)行約5分鐘。任選地，混合步驟可在升高的溫度下進(jìn)行，以幫助PGG溶解。一些實(shí)施方式中，通過將燒瓶置于水浴器中等方式，使混合步驟在80℃進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，過濾通過45μ的濾器進(jìn)行。一些實(shí)施方式中，含有濾液的燒瓶置于室溫，但燒瓶也可置于更低的溫度下以加速晶體形成。可重復(fù)該方法以獲得更純的α-PGG。根據(jù)本文所述方法，用于純化α-PGG的方法也可用于α-PGG類似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物；葡萄糖被糖類似物取代并且所述糖類似物的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物；和PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
從α-PGG和β-PGG混合物中分離β-PGG的方法包括以下步驟(a)將丙酮加入含有50％或更多β-PGG和50％或更少α-PGG的樣品中；(b)將PGG和丙酮混合以溶解PGG；(c)濾除所有不溶顆粒；以及(d)不干擾濾液直到晶體形成。一些實(shí)施方式中，丙酮和PGG的比例約是1gPGG用5mL丙酮。一些實(shí)施方式中，步驟(b)中的混合進(jìn)行約5分鐘。任選地，混合步驟(b)可在升高的溫度下進(jìn)行，以幫助PGG溶解。一些實(shí)施方式中，通過將燒瓶置于水浴器中等方式，使混合步驟(b)在80℃進(jìn)行。一些實(shí)施方式中，過濾通過濾紙進(jìn)行。一些實(shí)施方式中，含有濾液的燒瓶置于室溫，但燒瓶也可置于更低的溫度下以加速晶體形成。根據(jù)本文所述方法，用于純化β-PGG的方法也可用于β-PGG類似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物；葡萄糖被糖類似物取代并且所述糖類似物的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物；和PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
制備α-PGG單晶的方法包括以下步驟(a)將水加入純化(95％或更高)的α-PGG樣品中；(b)將α-PGG和水混合以溶解α-PGG；(c)濾除所有不溶顆粒，將濾液置于干凈的容器中；以及(d)不干擾濾液直到晶體出現(xiàn)。一些實(shí)施方式中，在制備α-PGG單晶的方法使用雙蒸水。一些實(shí)施方式中，水和α-PGG的比例約是1.0g α-PGG加入100mL水。一些實(shí)施方式中，步驟(b)中的混合進(jìn)行約5分鐘。任選地，混合步驟(b)中可加熱溶液以幫助α-PGG溶解。一些實(shí)施方式中，混合步驟(b)在80℃進(jìn)行。一些實(shí)施方式中，步驟(c)中通過濾紙過濾溶液。一些實(shí)施方式中，步驟(d)在室溫進(jìn)行約15天。根據(jù)本文所述方法，制備α-PGG單晶的方法也可用于α-PGG類似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物；葡萄糖被糖類似物取代并且所述糖類似物的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物；和PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
制備β-PGG單晶的方法包括以下步驟(a)將丙酮加入純化(95％或更高)的β-PGG樣品中；(b)將β-PGG和丙酮混合以溶解β-PGG；(c)濾除所有不溶顆粒，將濾液置于干凈容器中；以及(d)不干擾濾液直到晶體出現(xiàn)。一些實(shí)施方式中，丙酮和PGG的比例約是每1.0g β-PGG用50mL丙酮。一些實(shí)施方式中，步驟(b)中的混合進(jìn)行約5分鐘。任選地，混合步驟(b)中可加熱溶液以幫助PGG溶解。一些實(shí)施方式中，混合步驟(b)在80℃進(jìn)行。一些實(shí)施方式中，步驟(c)中的通過濾紙過濾溶液。一些實(shí)施方式中，步驟(d)在室溫進(jìn)行約20天。用于制備β-PGG單晶的所述方法也可用于β-PGG類似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物；葡萄糖被糖類似物取代并且所述糖類似物的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物；和PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示干涉相襯(differential interference contrast)顯微鏡下α-PGG(左)和β-PGG(右)的晶體結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述本文提供通過結(jié)晶來分離和純化PGG的α-和β-異構(gòu)體的方法。本文所述的方法還可用于分離很多不同PGG類似物的α-和β-異構(gòu)體，這些類似物包括可能用作藥物的物質(zhì)。本文所述方法可用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的產(chǎn)量和千克規(guī)模產(chǎn)量，最高到噸產(chǎn)量，同時(shí)仍然產(chǎn)生純度為95％或更高的異構(gòu)體。此外，因?yàn)樗俏ㄒ恍枰娜軇疚乃龇椒ň哂泻芨叩某杀居行院铜h(huán)境友好性。本文所述方法還可用于制備α-PGG、β-PGG或其類似物的單晶。
本文所述的方法可在千克至噸的規(guī)模上實(shí)現(xiàn)α-和β-PGG及其類似物的分離和純化，因此這些方法適于工業(yè)應(yīng)用。而且，本文所述的方法是很便宜的一唯一需要的溶劑是水，在實(shí)施發(fā)明方法時(shí)可使用標(biāo)準(zhǔn)儀器。此外，該方法在室溫進(jìn)行，不需要既昂貴又耗費(fèi)時(shí)間的加熱和/或冷卻步驟。該方法是環(huán)境友好的，因?yàn)椴恍枰袡C(jī)溶劑，并且該實(shí)施方法可不進(jìn)行加熱和冷卻。
迄今，可制備高純度α-PGG和β-PGG異構(gòu)體的唯一可用方法是高效液相色譜(HPLC)。HPLC有很多缺點(diǎn)，使其不適于分離大量物質(zhì)。HPLC只能用于分離毫克至克水平數(shù)量的PGG。此外，HPLC比結(jié)晶要慢而且貴得多，它需要至少價(jià)格為$25,000-$30,000的復(fù)雜HPLC系統(tǒng)。而且，必須使用大量的溶劑來進(jìn)行HPLC，為了保持高純度必須損失(丟棄)大量的化合物，使回收的產(chǎn)物產(chǎn)率很低。
用本文所述的方法，可在水中或水系溶劑系統(tǒng)中分離和純化PGG及其類似物，高效、成本很低并且產(chǎn)率高。本文所述的方法降低了PGG及其類似物異構(gòu)體的總制備成本，純度至少為95％或超過95％。
本文所述方法可用于從含有α-PGG和β-PGG的混合物中分離α-PGG，和用于從含有α-PGG和β-PGG的混合物中分離β-PGG。本發(fā)明方法尤其適用于從含有大于50％的α-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分離α-PGG，以及從含有大于50％的β-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分離β-PGG。
本文所述的結(jié)晶方法提供純度大于95％的α-PGG和β-PGG及其類似物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的法提供純度大于98％的α-PGG或β-PGG或其類似物。本文還提供生長(zhǎng)α-PGG和β-PGG單晶的方法。
本文還提供α-和β-PGG的很多類似物的分離和純化方法。在一種此類類似物中，PGG的葡萄糖部分被其它糖類，如己糖、戊糖或丁糖取代。可用的己糖包括但不限于半乳糖、甘露糖、艾杜糖、塔羅糖、阿卓糖、阿洛糖、古洛糖(gulose)、果糖等。可用的戊糖包括但不限于，木糖、核糖、阿拉伯糖和來蘇糖?？捎玫亩√前ǖ幌抻谔K糖和赤癬糖。本文所述方法能夠從α-和β-PGG類似物的混合物中分離α-和β-類似物，包括存在大于50％的α-形式的情況和存在大于50％的β-形式的情況。兩種情況下，α-形式和β-形式均可被純化到95％或更高純度水平。
適于用本文所述方法分離和純化的第二類PGG-類似物是PGG的葡萄糖部分被葡萄糖、其它己糖、戊糖或丁糖的糖類似物取代，而這些糖類似物的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的α-和β-PGG類似物。對(duì)于這些類似物，本文所述方法可分離α-PGG類似物和β-PGG類似物。這些方法適于存在大于50％的α-PGG類似物或大于50％的β-PGG類似物的混合物。根據(jù)本文所述方法，α-PGG類似物和β-PGG類似物均可被純化到95％或更高純度。
本文還提供PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的α-和β-PGG類似物的分離和純化方法。可用的其它合適的酚類包括但不限于，2，3-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸和3，5-二羥基苯甲酸。根據(jù)本文所述方法，可從含有大于50％的α-形式或從含有大于50％的β-形式的α-PGG和β-PGG類似物的混合物中分離α-PGG類似物和β-PGG類似物。此外，沒食子酸被另一種酚類取代的α-PGG類似物和β-PGG類似物可被純化到95％或更高純度。
方法結(jié)晶α-PGG或其類似物的標(biāo)準(zhǔn)操作方法結(jié)晶在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行，如下所述(1)將含有純度大于等于50％的α-PGG的1.0g樣品加入100mL燒瓶中。(2)然后將20mL雙蒸水加入燒瓶中。(3)將燒瓶置于80℃水浴器中約5分鐘，輕輕搖動(dòng)以溶解樣品。(4)用0.45μm的濾膜除去所有不溶顆粒。濾液加到干凈的燒瓶中。(5)不干擾燒瓶，室溫放置約5-7天，直到晶體出現(xiàn)。
結(jié)晶的速度受溫度影響，將燒瓶置于低于室溫的溫度可加速結(jié)晶。
如果需要更高純度，過濾晶體，然后重復(fù)步驟1-5。重復(fù)這些步驟4次以上可獲得純度大于98％的樣品。
為了放大該方法，每1g樣品可加入20mL雙蒸水，進(jìn)行上述步驟。
生長(zhǎng)α-PGG單晶的標(biāo)準(zhǔn)操作方法(1)將1.0g純度大于或等于95％的α-PGG加入到200mL燒瓶中。(2)將100mL雙蒸水加入燒瓶中。(3)將燒瓶置于80℃水浴器中約5分鐘，輕輕搖動(dòng)以溶解樣品。(4)用濾紙除去所有不溶顆粒，將干凈的濾液加到干凈的燒瓶中。(5)不干擾燒瓶，室溫放置約15天，直到一些細(xì)的、無色、針形晶體出現(xiàn)。(6)過濾晶體，將其存貯在密封的燒瓶中。
結(jié)晶β-PGG的標(biāo)準(zhǔn)操作方法β-PGG的結(jié)晶方法如下(1)將含有純度大于或等于50％的β-PGG的1.0g樣品加入到10mL燒瓶中。(2)將5.0mL丙酮加入燒瓶中。(3)將燒瓶置于80℃水浴器中約10分鐘，輕輕搖動(dòng)以溶解樣品。(4)用濾紙過濾溶液，將濾液加到干凈的燒瓶中。(5)不干擾燒瓶，室溫放置約15天，直到一些無色針形晶體出現(xiàn)。(6)如果需要更高純度，過濾晶體，重復(fù)步驟1-5。為了放大該方法，按每1g樣品5g丙酮的比例加入樣品，結(jié)晶β-PGG。
生長(zhǎng)β-PGG單晶的標(biāo)準(zhǔn)操作方法(1)將含有純的(95％或更大)β-PGG的1.0g樣品加入到100mL燒瓶中。(2)將50mL丙酮加入燒瓶中。(3)將燒瓶置于80℃水浴器中約10分鐘，輕輕搖動(dòng)以溶解樣品。(4)用濾紙過濾溶液，將濾液加到干凈的燒瓶中。(5)不干擾燒瓶，室溫放置約20天，直到一些無色針形晶體出現(xiàn)。(6)過濾晶體，將其存貯在密封的燒瓶中。
權(quán)利要求
1.從α-PGG和β-PGG或其類似物的混合物中分離α-五-O-沒食子酰-D-葡萄糖(PGG)的方法，所述方法包括以下步驟a)將水加入含有50％或更多α-PGG和50％或更少β-PGG的PGG混合物中；b)將PGG和水混合以溶解PGG；c)濾除所有不溶顆粒；以及d)不干擾濾液直到晶體形成，其中所述晶體含有α-PGG或α-PGG類似物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中使用雙蒸水。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，水和PGG的比例約為1gPGG加入20mL水。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合步驟進(jìn)行約5分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合步驟在升高的溫度下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合步驟在80℃進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述過濾步驟采用45μm的濾器。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)中的濾液置于低于室溫的溫度下。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自葡萄糖或其它己糖、戊糖或丁糖的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和α-PGG類似物的純度為95％或更高。
13.從α-PGG和β-PGG或其類似物的混合物中分離β-PGG或其類似物的方法，所述方法包括以下步驟a)將丙酮加入含有50％或更多β-PGG和50％或更少α-PGG的PGG混合物中；b)將PGG和丙酮混合以溶解PGG；c)濾除所有不溶顆粒；以及d)不干擾濾液直到晶體形成，其中所述晶體含有β-PGG或β-PGG類似物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，以約1g PGG加入約5mL丙酮的比例加入丙酮。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合步驟(b)中的混合進(jìn)行約5分鐘。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合步驟(b)可在升高的溫度下進(jìn)行。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述混合步驟(b)在80℃進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過濾步驟(c)采用濾紙。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，步驟(d)在低于室溫的溫度下進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的類似物。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自葡萄糖或其它己糖、戊糖或丁糖的環(huán)氧被碳、氮或硫取代的類似物。
22.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG類似物選自PGG的沒食子酸部分被其它酚類取代的類似物。
23.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和α-PGG類似物的純度為95％或更高。
24.一種制備α-PGG或其類似物單晶的方法，所述方法包括步驟a)將水加入含有純度大于或等于95％的α-PGG的樣品中；b)將α-PGG和水混合以溶解α-PGG；c)濾除所有不溶顆粒，將濾液置于干凈容器中；以及d)不干擾濾液直到α-PGG晶體出現(xiàn)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，水加入到α-PGG中的比例是約1.0gα-PGG加入約100mL水。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，步驟(d)進(jìn)行約15天。
27.一種制備β-PGG單晶的方法，所述方法包括步驟a)將丙酮加入含有純度大于或等于95％的β-PGG的樣品中；b)將β-PGG和丙酮混合以溶解β-PGG；c)濾除所有不溶顆粒，將濾液置于干凈容器中；以及d)不干擾濾液直到晶體出現(xiàn)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，丙酮加入到PGG中的比例是約每1.0gβ-PGG加入約50mL丙酮。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，步驟(d)進(jìn)行約20天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離和純化α－和β－形式的五－O－沒食子酰－D－葡萄糖(PGG)的簡(jiǎn)單、便宜和高效的方法，該方法不需要使用HPLC。本文提供的方法可用于從含有α－PGG和β－PGG的混合物中分離α－PGG，所述方法包括下列步驟將水加入含有50％或更多α－PGG和50％或更少β－PGG的樣品中；將PGG和水混合以溶解PGG；濾除所有不溶顆粒；以及使濾液不受干擾地放置直到晶體形成。
文檔編號(hào)C13B20/16GK1930178SQ200580005577
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者任育林, K·B·希默爾迪克, X·陳 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)