專利名稱：單個顆粒的冷凍乳酸菌培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及市售相關(guān)包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質(zhì)，其中所述冷凍物質(zhì)以單個顆粒的形式存在，特征在于，當(dāng)貯藏在低于培養(yǎng)物起始融解溫度(Tm’)如-46℃下7-14天時，所述冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒。
背景技術(shù)：
微生物涉及包括大多數(shù)乳制品在內(nèi)的食品及飼料產(chǎn)品的制造。細(xì)菌培養(yǎng)物，特別是一般分類為乳酸菌的細(xì)菌培養(yǎng)物是制造所有發(fā)酵乳制品、干酪和黃油所必不可少的。這樣的細(xì)菌培養(yǎng)物可稱為起子培養(yǎng)物，它們通過執(zhí)行許多功能以賦予各種乳制品之獨特性質(zhì)。
乳制品起子培養(yǎng)物一般由乳酸菌組成。在本發(fā)明上下文中，措辭“乳酸菌”(LAB)指一組革蘭氏陽性的、過氧化氫酶陰性的、非運動性的、不形成孢子的、微需氧的或厭氧的細(xì)菌，其發(fā)酵糖產(chǎn)生有機(jī)酸，包括作為主要產(chǎn)物的乳酸、甲酸和丙酸。在本發(fā)明上下文中乳酸菌包括厚壁菌(Firmicutes)門中的許多細(xì)菌屬。肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)被認(rèn)為是LAB。同樣，屬于放線菌(Actinobacteria)門產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽性菌，例如氣球菌屬(Aerococcus)、細(xì)桿菌屬(Microbacterium)和丙酸菌屬(Propionibacterium)以及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)在本發(fā)明上下文中也被認(rèn)為是LAB。工業(yè)上最有用的乳酸菌存在于乳球菌(Lactococcusspp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、雙歧桿菌(Bifdobacteriumspp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。除用于乳品加工業(yè)之外，乳酸菌培養(yǎng)物也可廣泛用于肉類加工業(yè)及許多其它加工業(yè)。
市售起子培養(yǎng)物可作為冷凍培養(yǎng)物來經(jīng)銷。高濃縮冷凍培養(yǎng)物在市場上十分受歡迎，因為這樣的培養(yǎng)物能直接接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(如乳品或肉類)中，無需居間轉(zhuǎn)移。換句話說，這樣的高濃縮冷凍培養(yǎng)物所包含的細(xì)菌量足夠最終用戶制造生產(chǎn)用起子培養(yǎng)物所需。在此“生產(chǎn)用起子”定義為在食品加工廠用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種的繁殖用起子培養(yǎng)物。高濃縮培養(yǎng)物可稱為槽內(nèi)直接凝固(direct vat set)(DVS)-培養(yǎng)物。為了在最終用戶處包含足夠量用作為DVS-培養(yǎng)物的細(xì)菌，濃縮的冷凍培養(yǎng)物一般至少重50g，并且含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克的活細(xì)菌。
在使用冷凍培養(yǎng)物實踐中，關(guān)鍵在于要方便培養(yǎng)物的實際操作。雖然培養(yǎng)物“整體”冷凍難以操作，但是對于生產(chǎn)者和消費者來說，已發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物顆粒冷凍是十分容易操作的。
因此，高濃縮顆粒冷凍培養(yǎng)物，即已成形的所謂冷凍的槽內(nèi)直接凝固(F-DVS)-培養(yǎng)物十分暢銷。
出現(xiàn)了許多與冷凍培養(yǎng)物活性有關(guān)的出版物。
Chavarri等.(1988)描述了冷凍的純?nèi)樗徭溓蚓?Streptococcus lactis)培養(yǎng)物的活性可通過添加5％乳糖或5％蔗糖而得到改善。
Cárcoba等.(2000)描述了冷凍的純?nèi)樗崛榍蚓閬喎N(Lactococcuslactis subsp.lactis)培養(yǎng)物的活性可通過添加不同的低溫防護(hù)劑例如糖類(乳糖、蔗糖和海藻糖)、谷氨酸和明膠而得到改善。
US 4.140.800(Kline)描述了凍干培養(yǎng)物的活性可通過添加不同的低溫保護(hù)劑而得到改善。也討論了添加了乳糖、蔗糖或麥芽糖的冷凍培養(yǎng)物的活性。
WO 00/39281(Kringelum等.)描述了非冷凍的液體起子培養(yǎng)物的活性可通過添加不同的低溫保護(hù)劑而得到改善，以及WO 2004/065584 A1(Bisgaard-Frantzen)描述了高濃縮冷凍起子培養(yǎng)物的活性可通過添加不同的低溫保護(hù)劑而得到改善。
只有WO 2004/065584A1描述了顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其它上述出版物則沒有涉及貯藏過程中顆粒狀冷凍培養(yǎng)物的物理穩(wěn)定性。
發(fā)明概要市售顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物通常以合適的包裝(如2L四角紙盒)提供。一般貯藏在約-46℃的貯藏溫度下，冷凍物質(zhì)以相對小重量的單個顆粒形式存在。
在本發(fā)明之前，本發(fā)明人認(rèn)為就貯藏上述市售相關(guān)顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物來說，并不存在明顯的困難。
然而，基于不同的研究，本發(fā)明人確定當(dāng)許多市售相關(guān)培養(yǎng)物在約-46℃下貯藏7天或更久時，單個顆粒粘在一起并形成較大的凝塊。在工業(yè)生產(chǎn)中，調(diào)節(jié)顆粒凝塊造成了處理上的困難。比如當(dāng)培養(yǎng)物凝結(jié)成塊時，顯然從培養(yǎng)物包裝中就很難給予適當(dāng)?shù)挠昧?。甚至還很難以便利的方法將凝結(jié)成塊的培養(yǎng)物從包裝中取出。
進(jìn)一步的研究確定“出問題的”培養(yǎng)物的特征可能在于顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’值(冰開始融解，如Roos(1995)所定義的)低于約-46℃的貯藏溫度。該Tm’值是食品工業(yè)及其它工業(yè)所使用的標(biāo)準(zhǔn)物理化學(xué)術(shù)語。Tm’通常用Roos(1991)描述的差示掃描量熱法(DSC)技術(shù)測定。其與食品(在此為冷凍LAB培養(yǎng)物)開始融解的溫度有關(guān)。有關(guān)詳情請見作為參考文獻(xiàn)的教科書“Food Chemistry”Fennema(1996)和“PhaseTransition in Foods”Roos(1995)。
不受理論所限，相信當(dāng)冷凍培養(yǎng)物具有低于其貯藏溫度如約-46℃的Tm’值時，出現(xiàn)初相轉(zhuǎn)變(融解)，造成了單個顆粒粘在一起并形成較大的凝塊。
總之，本發(fā)明人的工作已確定了迄今尚未認(rèn)識到的貯藏問題，這些問題與某些類型市售相關(guān)高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養(yǎng)物的物理性質(zhì)相關(guān)。一旦確定了此問題，本發(fā)明人就能開始嘗試解決該問題。
不依賴于任何可能的理論解釋，本發(fā)明人確定通過添加某些相關(guān)的添加劑化合物到出問題的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物中，就能獲得在-46℃下貯藏7-14天后不會形成單個顆粒凝塊的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物。這樣的培養(yǎng)物特征在于，冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，甚至在約-46℃下長期貯藏后亦然。
大體說來，相關(guān)的添加劑化合物特征在于，它們能增加冷凍培養(yǎng)物Tm’值至高于貯藏溫度如-46℃的值，例如將-70至-46℃的Tm’值增加到-45至-15℃。
在此指導(dǎo)性的例子描述的是合適的添加劑化合物的優(yōu)選例子。所述化合物包括海藻糖、麥芽糖糊精、環(huán)糊精、噴膠(spray gum)、魚膠粉和麥芽糖醇?；诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的常識，完全能確定其它能增加冷凍培養(yǎng)物Tm’值至高于貯藏溫度如-46℃的值的相關(guān)添加劑化合物。
如上所述，為了包含足夠的細(xì)菌，市售相關(guān)高濃縮冷凍培養(yǎng)物一般重至少50g且活細(xì)菌量至少為109個菌落形成單位(CRU)/克。Chavarri(1988)和Carcoba(2000)文章中所描述的培養(yǎng)物并不涉及顆粒狀冷凍培養(yǎng)物的物理穩(wěn)定性，而且在其上下文中市售相關(guān)高濃縮冷凍培養(yǎng)物并不考慮冷凍細(xì)菌的活性，因為它們量很少且包含的是克數(shù)明顯較小的冷凍培養(yǎng)物，此外所述培養(yǎng)物也不是顆粒狀冷凍的培養(yǎng)物。同樣，Chavarri(1988)和Carcoba(2000)所描述的培養(yǎng)物根本就不涉及顆粒狀冷凍培養(yǎng)物的物理穩(wěn)定性，反而涉及的是冷凍細(xì)菌的活性。
因此，本發(fā)明第一方面涉及市售相關(guān)包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質(zhì)，其中冷凍物質(zhì)以單個顆粒的形式存在，含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，并包含占冷凍物質(zhì)0.5％-13％w/w量的添加劑化合物。
所述添加劑化合物選自一化學(xué)物組，其通過使用占冷凍物質(zhì)10％w/w量的添加劑化合物能增加冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’(冰融解開始溫度)，所含有的添加劑化合物能將Tm’值從-70℃至-46℃增加到-45至-15℃(通過DSC測定)。
此外，所述冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物特征在于，當(dāng)貯藏在約-46℃下7-14天時，該冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，在此是通過下列測試來測定的冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養(yǎng)皿中，從而形成了松散的、單個顆粒的薄層，該薄層特征在于，大多數(shù)顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天并檢查顆粒是否仍然松散或顆粒是否凝結(jié)成塊或粘在一起，其中對于冷凍培養(yǎng)物的單個顆?；旧媳３譃閱蝹€顆粒的判斷標(biāo)準(zhǔn)是至少100個單個顆粒中的80個保持為松散的單個顆粒。
然而，包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，且其中所包含的低溫保護(hù)劑化合物選自占冷凍物質(zhì)2％-13％w/w量的蔗糖；和占冷凍物質(zhì)4％-6％w/w量的海藻糖；以及占冷凍物質(zhì)12％-14％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物的培養(yǎng)物，均明確地從本發(fā)明第一方面中排除。
在第一方面結(jié)尾處所描述的“放棄”涉及PCT申請WO 2004/065584A1。該申請是在2004年1月19日提交的。在本申請優(yōu)先權(quán)提交之時，PCT申請WO 2004/065584A1尚未公開。
WO 2004/065584A1涉及在冷凍培養(yǎng)物貯藏過程中改善其活性。其沒有描述本發(fā)明的“顆粒粘性”問題。大體上，主權(quán)利要求1涉及“包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，具有至少重50g的冷凍物質(zhì)并含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，其特征在于，所述冷凍培養(yǎng)物包含占冷凍物質(zhì)0.5％-80％w/w量的低溫保護(hù)劑?！彪m然WO 2004/065584A1中描述了具有低溫保護(hù)劑的顆粒狀冷凍的培養(yǎng)物，但是可將本領(lǐng)域技術(shù)人員不可避免地得到的落入WO 2004/065584A1范圍的結(jié)果排除在外，因為WO 2004/065584A1僅明確要求保護(hù)能利用蔗糖的培養(yǎng)物。
關(guān)于本發(fā)明的冷凍培養(yǎng)物，所述添加劑化合物應(yīng)當(dāng)優(yōu)選在它們凍結(jié)之前能添加到活細(xì)菌中。
因此，本發(fā)明第二方面涉及制造在此描述的本發(fā)明第一方面和實施方案的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細(xì)菌中以使至少50g的物質(zhì)含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質(zhì)的活細(xì)菌，所添加的添加劑化合物占所述物質(zhì)的0.5％-13％w/w量，(ii)冷凍所述物質(zhì)以獲得顆粒狀冷凍的物質(zhì)，和(iii)以合適的方式包裝所述冷凍物質(zhì)以獲得包裝的在此描述的本發(fā)明第一方面和實施方案的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物。
本發(fā)明第三方面涉及通過本發(fā)明第二方面的制造顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法獲得的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物。
本發(fā)明第四方面涉及上述顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物在制造食品或飼料產(chǎn)品方法中的應(yīng)用。
定義在詳細(xì)討論本發(fā)明具體實施方案之前，提供了與本發(fā)明主要方面相關(guān)的特定術(shù)語定義。
術(shù)語“能利用蔗糖的LAB”指能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)生酸的LAB。其與PCT申請?zhí)朩O 2004/065584A1中的定義相同。
術(shù)語培養(yǎng)“物質(zhì)”指培養(yǎng)相關(guān)物質(zhì)，包括活細(xì)菌和低溫保護(hù)劑。并不包括可能存在的包裝。因此，培養(yǎng)物的物質(zhì)重量不包括可能存在的包裝的重量。
術(shù)語“包裝(packing)”或“包裝(package)”應(yīng)作廣義理解。其指顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)包裝以便提供給用戶，其可包裝在瓶、四角紙盒容器等中。
術(shù)語“添加劑化合物”在本發(fā)明上下文中可以是一種特定的添加劑化合物或可以是兩種或更多種不同的添加劑化合物。因此，培養(yǎng)物中添加劑化合物的w/w％應(yīng)當(dāng)理解為添加劑化合物量之和。優(yōu)選地，該術(shù)語涉及發(fā)酵后添加到培養(yǎng)物中的化合物。因此，其可以是不以顯著量存在于培養(yǎng)物發(fā)酵液自身中的化合物。
術(shù)語“顆粒狀冷凍的”和“顆粒狀冷凍培養(yǎng)物”指通過利用能產(chǎn)生冷凍培養(yǎng)物顆?；蛭⒘５姆椒▋鼋Y(jié)的培養(yǎng)物。顆粒狀冷凍培養(yǎng)物可方便地通過將培養(yǎng)物逐滴地添加到液氮中形成凍結(jié)的培養(yǎng)物顆粒而制得。一般地，但不是必要的，該處理在常用的工業(yè)凍干裝置塔盤上進(jìn)行。
術(shù)語“顆粒(pellets)”或“微粒(granula)”指通過冷凍液體形成的小固體，平均尺寸為0.1-10mm。
本發(fā)明的實施方案描述如下，僅作為舉例。


圖1從該圖中可見冰融解開始發(fā)生的溫度Tm’與添加的二糖量之間的相關(guān)性。有關(guān)詳情見實施例3。打點線表示為貯藏溫度，-46℃。
圖2許多培養(yǎng)物冰融解開始的溫度(Tm’)(Y-軸)作為麥芽糖糊精(Glucidex 12)濃度(％w/w)(X-軸)的函數(shù)。培養(yǎng)物名稱后跟隨“A”表示已將甘油添加到培養(yǎng)物中，跟隨B表示在顆粒凍結(jié)前沒有將甘油添加到培養(yǎng)物中。
發(fā)明詳述Tm’值如上所述，Tm’值是已知的標(biāo)準(zhǔn)物理化學(xué)術(shù)語，描述的是冰融解開始發(fā)生時的溫度。在本發(fā)明上下文中，Tm’指冷凍LAB培養(yǎng)物開始發(fā)生融解時的溫度。
優(yōu)選地，通過利用DSC方法測定Tm’值，該方法描述于本文實施例1中名為“Tm的測定”的段落。
顆粒凝結(jié)測試根據(jù)本發(fā)明第一方面的解釋，該測試要分析的是顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物是否這樣的培養(yǎng)物，即該培養(yǎng)物特征在于當(dāng)貯藏在約-46℃下(在當(dāng)前情況下預(yù)調(diào)至-50℃的冷凍機(jī)具有-46℃的樣品溫度)7-14天時，在測試中冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，包括如下冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養(yǎng)皿中，從而形成了松散的、單個顆粒的薄層，該薄層特征在于，大多數(shù)顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天并檢查顆粒是否仍然松散或顆粒是否凝結(jié)成塊或粘在一起，其中對于冷凍培養(yǎng)物的單個顆?；旧媳３譃閱蝹€顆粒的判斷標(biāo)準(zhǔn)是至少100個單個顆粒中的80個保持為松散的單個顆粒。優(yōu)選至少100個單個顆粒中的90個保持為松散的單個顆粒，更優(yōu)選至少100個單個顆粒中的95個保持為松散的單個顆粒。
可目測檢查并計數(shù)保持為松散單個顆粒的單個顆粒。以一貫的方法進(jìn)行目測是落在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的，所得到的結(jié)果在正常的技術(shù)偏差限度內(nèi)應(yīng)當(dāng)是一致且可重復(fù)的。本文的實施例1提供了更多的技術(shù)細(xì)節(jié)。
顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物優(yōu)選地，術(shù)語“冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物”在此指不包含所添加的添加劑化合物的培養(yǎng)物，如在此描述的具有-70至-46℃的Tm’值的培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物可以顆?；蛭⒘５男问絻鼋Y(jié)，形成“顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物”。顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物可通過將培養(yǎng)物逐滴添加到液氮中形成凍結(jié)的培養(yǎng)物顆?；蛭⒘６奖愕刂频?。
培養(yǎng)物的LAB可以是任意的LAB，特別是根據(jù)國際IDF標(biāo)準(zhǔn)146A1998“Identification of Characteristic Microorganisms”使用適當(dāng)?shù)腁PI檢測試劑盒(bioMérieux SA，Lyon，F(xiàn)rance)測定的不利用蔗糖的市售相關(guān)LAB。對于大多數(shù)LAB屬使用API試劑盒“rapid ID 32STREP”和“50CHLMedium”確定蔗糖利用情況。
優(yōu)選地，LAB是選自雙歧桿菌(Bifdobacterium spp.)、短桿菌(Brevibacterium spp.)、丙酸桿菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青霉菌(Pencillium spp.)、隱球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)所組成的組。
即使這些屬中某些種被描述為能利用蔗糖突變體，但其不能利用蔗糖已分離或能持續(xù)地得到分離。無論這樣的突變體是否分離或獲得，它們依然是本發(fā)明的一方面。
工業(yè)上最有用的乳酸菌存在于乳球菌(Lactococcus spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、乳桿菌(Lactobacillusspp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。
術(shù)語“混合乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物”指包含兩種或更多種不同LAB的混合培養(yǎng)物。術(shù)語“純?nèi)樗峋?LAB)培養(yǎng)物”指僅包含一種LAB的純培養(yǎng)物。
在此描述的培養(yǎng)物可以是嗜溫培養(yǎng)物，由具有約為30℃最適生長溫度的嗜溫細(xì)菌組成?！笆葴嘏囵B(yǎng)物”是包含兩種或更多種不同的嗜溫LAB的培養(yǎng)物。
屬于嗜溫群的典型微生物包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、腸系膜明串珠菌乳脂亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis和干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp.casei)。嗜熱乳酸菌包括例如嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。
在此描述的培養(yǎng)物可包含不能利用蔗糖的LAB。所謂的氧-培養(yǎng)物(O-culture)用來制造不帶孔洞的干酪(切達(dá)干酪、柴郡干酪、羊奶干酪)且一般包括一種或多種選自乳酸乳桿菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳桿菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)的微生物。通常氧-培養(yǎng)物被認(rèn)為是不利用蔗糖的。
高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養(yǎng)物在此描述的冷凍培養(yǎng)物在食品工業(yè)中可稱為高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養(yǎng)物。為了包含足夠的細(xì)菌，這樣的培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)相對大(具有足夠的重量)以及具有相對高的活細(xì)菌濃度。顯然如果要求相對多的細(xì)菌，那么活細(xì)菌的重量和/或濃度就要增加。
優(yōu)選地，在此描述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物具有至少100g重的冷凍物質(zhì)，更優(yōu)選地具有至少250g重的冷凍物質(zhì)，還優(yōu)選地具有至少500g重的冷凍物質(zhì)，以及最優(yōu)選地具有至少900g重的冷凍物質(zhì)。優(yōu)選地，冷凍物質(zhì)的重量小于500kg。
優(yōu)選地，在此描述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物含有至少5×109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，更優(yōu)選地含有至少1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，以及最優(yōu)選地含有至少2×1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌。
用于LAB的發(fā)酵和合適的發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域所公知，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇與特定LAB相關(guān)的合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。在本文的實施例部分中給出了合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵。
為了得到足夠量的細(xì)菌，在本發(fā)明上下文中優(yōu)選在合適的大發(fā)酵罐中進(jìn)行相對大規(guī)模的發(fā)酵。發(fā)酵罐優(yōu)選至少50L，更優(yōu)選至少90L，還優(yōu)選500L或更大的。
在合適的發(fā)酵后，優(yōu)選通過除去發(fā)酵培養(yǎng)基的液體(上清液)(如通過離心)分離獲得活細(xì)菌。所分離的活細(xì)菌可稱為分離生物量。該分離的活細(xì)菌應(yīng)優(yōu)選含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，更優(yōu)選含有至少5×109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，以及最優(yōu)選含有至少1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌。
在添加劑化合物(見以下)添加到濃縮培養(yǎng)物中后。培養(yǎng)物可方便地通過將混合物逐滴地添加到液氮中形成凍結(jié)的混合物顆?；蛭⒘６鴥鼋Y(jié)。一種可行的冷凍方法描述于DE2805676和FR2393251中。
然后以合適的方式包裝顆粒狀冷凍培養(yǎng)物以便提供給用戶。
添加劑化合物如上所述，優(yōu)選地相關(guān)的添加劑化合物特征在于，它們能增加冷凍培養(yǎng)物的Tm’值至高于貯藏溫度如-46℃的值，例如使Tm’值達(dá)到-45℃至-15℃，更優(yōu)選地使Tm’值達(dá)到-43℃至-15℃，以及還優(yōu)選地使Tm’值達(dá)到-39℃至-15℃。
本文實施例2舉例說明了一種用于鑒定相關(guān)添加劑化合物的快速實驗策略。添加不同的相關(guān)化合物(10％W/W)到具有低于-46℃的Tm’值的“模式”冷凍培養(yǎng)物(在實施例2中，“模式”培養(yǎng)物具有-54℃的Tm’值)中，并在添加前后通過DSC測定Tm’值。
實施例2的“模式”培養(yǎng)物和該實施例2的測試方法優(yōu)選地用于評估是否特定的目的添加劑化合物其特征在于，即能增加冷凍培養(yǎng)物的Tm’值至高于-46℃，例如使Tm’值達(dá)到-45℃至-15℃，更優(yōu)選使Tm’值達(dá)到-43℃至-15℃，還優(yōu)選使Tm’值達(dá)到-39℃至-15℃。
在實施例2中，可見環(huán)糊精增加Tm’至-44℃，麥芽糖醇增加Tm’至-42℃，海藻糖增加Tm’至-38℃，魚膠增加Tm’至-37℃，麥芽糖糊精增加Tm’至-32℃以及噴膠增加Tm’至-31℃。
優(yōu)選地，添加劑化合物是分子量(MW)在150-100000g/mol，更優(yōu)選地在250-100000g/mol，還優(yōu)選地在300-40000g/mol以及最優(yōu)選地在500-15000g/mol的化合物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述添加劑化合物也是低溫保護(hù)劑。
術(shù)語“低溫保護(hù)劑”指能改善冷凍培養(yǎng)物貯藏穩(wěn)定性的物質(zhì)，該貯藏穩(wěn)定性測自培養(yǎng)物的活性。在本發(fā)明上下文中，其可以是一種特定的低溫保護(hù)劑或可以是兩種或更多種不同的低溫保護(hù)劑。因此，在培養(yǎng)物中的低溫保護(hù)劑w/w％應(yīng)當(dāng)理解為低溫保護(hù)劑量之和。
優(yōu)選地，低溫保護(hù)劑可選自蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。優(yōu)選的合適例子包括選自麥芽提取物、脫脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、谷蛋白、膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、角蛋白和白蛋白的水解產(chǎn)物所組成的組。
更優(yōu)選地，低溫保護(hù)劑是碳水化合物或涉及核酸生物合成的化合物。優(yōu)選的合適碳水化合物包括選自戊糖(如核糖、木糖)、己糖(如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、寡糖(如棉子糖)、低聚果糖(Oligofrutoses)(如Actilight、Fribroloses)、多糖(如麥芽糖糊精、黃原膠、果膠、藻酸鹽、微晶纖維素、葡聚糖、PEG)以及糖醇(山梨糖醇、甘露醇)所組成的組。最優(yōu)選地，所述碳水化合物為分子量(MW)在150-100000g/mol，更優(yōu)選在250-100000g/mol，還優(yōu)選在300-40000g/mol以及最優(yōu)選在500-15000g/mol。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述添加劑化合物為選自環(huán)糊精、麥芽糖醇、魚膠、麥芽糖糊精(優(yōu)選為麥芽糖糊精DE2至麥芽糖糊精DE 19)、噴膠(如噴膠IRX 51693)、肌苷-5’-一磷酸(IMP)以及肌苷所組成的組。
冷凍培養(yǎng)物包含占冷凍物質(zhì)0.5％-13％w/w量的添加劑化合物，優(yōu)選包含占冷凍物質(zhì)1％-12％w/w量的添加劑化合物，更優(yōu)選包含占冷凍物質(zhì)2％-10％w/w量的添加劑化合物，以及還優(yōu)選包含占冷凍物質(zhì)5％-10％w/w量的添加劑化合物。
可通過在合適的溫度下將固體添加劑化合物與生物量混合如30分鐘，以將添加劑化合物，也可以是低溫保護(hù)劑，在發(fā)酵后添加到分離的活細(xì)菌(生物量)中。如果添加劑化合物是例如麥芽糖糊精的，則合適的溫度可以是室溫?；蛘撸砑觿┗衔锏臒o菌溶液可與生物量混合。
制備顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法如上所述，本發(fā)明第二方面涉及制造本發(fā)明第一方面的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細(xì)菌中以使至少50g的物質(zhì)含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質(zhì)的活細(xì)菌，所添加的添加劑化合物占所述物質(zhì)的0.5％-13％w/w量，
(ii)冷凍所述物質(zhì)以獲得顆粒狀冷凍的物質(zhì)，和(iii)以合適的方式包裝所述顆粒狀冷凍物質(zhì)。
如上所述，在此最相關(guān)的“出問題的”培養(yǎng)物是顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，其并不包含在此所述添加的添加劑化合物，具有-70℃至-46℃的Tm’值。
因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)上述步驟(i)添加添加劑化合物之前，測定不含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’值并確定其具有-70℃至-46℃或更低的Tm’值。
在根據(jù)上述步驟(i)添加添加劑化合物之前，進(jìn)行顆粒凝結(jié)測試(見上)并確定冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒在-46℃下貯藏時粘在一起。
優(yōu)選地，在添加了添加劑化合物后，測定包含添加劑化合物的冷凍的乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’值，并證實Tm’值高于-46℃，優(yōu)選在-45℃至-15℃，更優(yōu)選在-43℃至-15℃，以及還優(yōu)選在-39℃至-15℃。
最后，在添加了添加劑化合物后，培養(yǎng)物呈顆粒狀冷凍，并進(jìn)行顆粒凝結(jié)測試(見上)確保至少100個單個顆粒中的80個保持為松散的、單個顆粒。
冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的應(yīng)用根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在此描述的冷凍的乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物可用于加工制造食品或飼料產(chǎn)品過程。
具體實施例方式
實施例1R604-E(一種市售冷凍氧-培養(yǎng)物，Chr.Hansen A/S，Denmark)在冷凍貯藏過程中傾向于形成粘性顆粒。在本發(fā)明研究中，該問題是通過在更詳細(xì)地觀察融解溫度并設(shè)法通過添加酪蛋白酸鹽、蔗糖或麥芽糖糊精以增加融解溫度而得到處理的。
目的評估通過使用添加劑是否能增加F-DVS R604-E的融點。
評估了使用添加劑增加R604-E融點的效果目測，以及通過DSC對每個所測試的制劑測定Tm’。
i)材料2千克的市售培養(yǎng)物F-DVS R 604-E(Chr.Hansen A/S，Hoersholm，Denmark，批次2441258，產(chǎn)品編號616581)。
ii)用于增加制劑融點的添加劑溶液50％(w/w)蔗糖溶液(Danisco，Denmark).
10％(w/w)酪蛋白酸鈉鹽溶液(Arla，Denmark).
30％(w/w)麥芽糖糊精DE 10溶液(Glucidex 10，Roquette Frères，Lestrem，F(xiàn)rance).
30％(w/w)麥芽糖糊精DE 2溶液(Glucidex 2，Roquette Frères，Lestrem，F(xiàn)rance)。
iii)F-DVS R604-E制劑配方將冷凍的濃縮物解凍并根據(jù)表1與添加劑混合。
表1.R604-E制劑

*)g干物質(zhì)添加劑/g濃縮物目測評估F-DVS R604融點6種F-DVS R-604E制劑在液氮中呈顆粒狀冷凍，并將100個單個顆粒(約20-30g)的顆粒物倒入培養(yǎng)皿中，從而形成了松散的、單個顆粒的薄層。
將每種制劑的一個樣品置于預(yù)調(diào)為-50℃的冷凍機(jī)中，樣品的實際溫度為-46℃。貯藏7天后，檢查樣品是否仍然松散或是否顆粒已經(jīng)凝結(jié)成塊或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情況下能否通過振動自發(fā)地再成為松散顆粒。
表2.目測冷凍顆粒物并測定Tm’

-＝凝結(jié)成塊、結(jié)塊或帶粘性。(100個單個顆粒中不到20個保持為松散單個顆粒)+＝部分松散的顆粒。(100個單個顆粒中不到60個保持為松散單個顆粒)++＝幾乎是松散的顆粒。(100個單個顆粒中至少80個保持為松散單個顆粒)+++＝松散的顆粒(100個單個顆粒中至少90個保持為松散單個顆粒)Tm’的測定在100μL氧化鋁坩堝中制備樣品并在液氮中凍結(jié)。將每種制劑的一個樣品以及F-DVS R604置于-46℃下6天。
在帶有100μL氧化鋁坩堝的Mettler Toledo 822e差示掃描量熱儀(aDSC)上測定相變，溫度程序，放入溫度-90℃，掃描溫度程序5℃/min.-130℃至0℃。
測定Tm’值(冰融解開始，如Roos(1995)所定義的)。結(jié)果示于表2中。
我們觀察到使用＞6％蔗糖和6％麥芽糖糊精(2或10)增加了冷凍顆粒的Tm’值。對于酪蛋白酸鈉鹽沒有觀察到任何效果。根據(jù)目測，10％蔗糖和兩種不同的麥芽糖糊精顯示出抗形成粘性顆粒傾向的積極效果。
實施例2目的進(jìn)行篩選研究以確定何種添加劑能增加冷凍培養(yǎng)物的融點。測試了如下添加劑海藻糖、麥芽糖糊精12、環(huán)糊精、噴膠、PEG、魚膠、麥芽糖醇、氯化鈉、甘油i)材料F-DVS R 604-E(批次2471755，產(chǎn)品編號616581)，詳細(xì)資料請見實施例1。
ii)用于制劑以增加融點的添加劑溶液50％(w/w)海藻糖30％(w/w)麥芽糖糊精DE 12(Glucidex 12，Roquette Frères，Lestrem，F(xiàn)rance)30％(w/w)環(huán)糊精30％(w/w)噴膠(CNI的IRX 51693)30％(w/w)PEG(PEG 6000，Merck，Germany)30％(w/w)魚膠粉200(SKW Biosystems，F(xiàn)rance)30％(w/w)麥芽糖醇30％(w/w)氯化鈉
30％(w/w)甘油iii)F-DVS R604-E制劑配方將冷凍的F-DVS R604-E濃縮物解凍并與占最終制劑10％(W/W)的不同添加劑混合。
Tm’的測定在100μL氧化鋁坩堝中制備樣品并在液氮中凍結(jié)。在Mettler Toledo822e差示掃描量熱儀記錄9種制劑的相變曲線并與參考樣品(無添加劑的R604E)比較。樣品在-90℃下放入DSC，并運行在溫度程序放入溫度-90℃；溫度掃描7℃/min從-130℃至0℃下。
結(jié)果獲得相變曲線，利用Roos(1991)所述的方法測定了Tm’值，并在下表3中給出表3.觀測到的Tm’(℃)

參考樣品的Tm’為-54℃(冰融解的開始)。
如下添加劑增加了Tm’PEG(-53℃)，，環(huán)糊精(-44℃)，麥芽糖醇(-42℃)，海藻糖(-38℃)，
魚膠(-37℃)，麥芽糖糊精12(-32℃)，噴膠(-31℃)甘油和氯化鈉并沒有增加冷凍培養(yǎng)物顆粒的融點。
實施例3該試驗主要評估了添加劑量和在DSC上測定的Tm’增加之間的關(guān)系。
i)材料F-DVS CH N 19(批次2421868)(市售冷凍的LD-培養(yǎng)物，Chr.HansenA/S，Denmark)。
表4.利用蔗糖和海藻糖作為添加劑的CH N19制劑

ii)用于制劑以增加融點的添加劑溶液每克生物量的蔗糖濃度在3％(w/w)至13％(w/w)之間。僅測試5％(w/w)水平的海藻糖。所有的蔗糖濃度從添加到生物量的50％(w/w)蔗糖溶制備。
海藻糖濃度從40％(w/w)溶液制備。
Tm’的測定將冷凍的F-DVS R604-E濃縮物解凍并與表4中所顯示的不同添加劑混合。然后將樣品轉(zhuǎn)移到100μL氧化鋁坩堝中并在液氮中凍結(jié)，在分析前貯藏在-46℃下。在DSC上對8種制劑記錄相變曲線并與參考樣品(無添加劑的R604E)比較。樣品在-90℃下放入DSC，并利用溫度程序運行放入溫度-90℃溫度掃描5℃/min.-130℃至0℃下。
根據(jù)Tm’的這些相變曲線。Tm’和添加的二糖量之間的關(guān)系可見于圖1。
根據(jù)圖1，可見8％及更多的蔗糖能保證在-46℃下貯藏的冷凍培養(yǎng)物不發(fā)生融解。
實施例4在添加麥芽糖糊精(Glucidex 12，購自Roquette Frères，Lestrem，F(xiàn)rance)前后，分析購自Chr.Hansen A/S，Denmark的市售培養(yǎng)物(HP，HPS，HP-1，LP，LL-2)的初始融點。該產(chǎn)品是以冷凍顆粒物出售的，保證其初始融點高于貯藏溫度，因此應(yīng)當(dāng)保持松散。
目的本研究的目的在于增加初始融點以高于貯藏溫度，以便獲得松散的顆粒。
材料和方法i)材料Glucidex 12(Roquette Frères，Lestrem，F(xiàn)rance)用作為添加劑化合物。
使用了100g的列于表5中的每種培養(yǎng)物。B表示沒有添加甘油到培養(yǎng)物中，而A表示在顆粒凍結(jié)前已添加了10％v/v甘油。
表5.使用的培養(yǎng)物

ii)樣品制劑配方將冷凍的濃縮培養(yǎng)物解凍并與占最終制劑3.5％至10.1％(W/W)的不同量的Glucidex 12溶液混合。
所述不同的制劑列于表6。
iii)Tm’的測定在100μL氧化鋁坩堝中制備樣品。在Mettlet DSC上對所有的制劑記錄相變曲線。樣品在-90℃下放入DSC。掃描溫度程序7℃/min.-100℃至0℃。
iiii)目測評估F-DVS R604的融點制劑在液氮中呈顆粒狀冷凍，并將100個單個顆粒(約20-30g)顆粒物倒入培養(yǎng)皿中，從而形成了松散的、單個顆粒的薄層。將每種制劑的一個樣品置于-46℃下。貯藏14天后，檢查樣品是否仍然松散或顆粒是否凝結(jié)成塊或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情況下能否通過振動自發(fā)地再成為松散顆粒。
結(jié)果添加不同量麥芽糖糊精(Glucidex 12)到不同培養(yǎng)物中的結(jié)果如圖1所示。很清楚麥芽糖糊精濃度增加，Tm’也增加。表2中列出了評估粘性/凝結(jié)成塊的結(jié)果。具有高于-46℃貯藏溫度的Tm’的樣品是松散的顆粒，而具有低于-46℃貯藏溫度的Tm’的樣品則粘在一起。
表6樣品制劑、起始融解溫度(Tm’)以及冷凍顆粒目測結(jié)果

表格注釋-表示凝結(jié)成塊、結(jié)塊或帶粘性(100個單個顆粒中不到20個保持為松散單個顆粒)。
+++表示松散的顆粒(100個單個顆粒中至少90個保持為松散單個顆粒)。
結(jié)果闡明于表6和圖2中，表明麥芽糖糊精能有效地增加含10％v/v甘油培養(yǎng)物(A-系列)和不含甘油培養(yǎng)物(B-系列)的Tm’。該實驗進(jìn)一步證明了眾所周知的低溫保護(hù)劑(即甘油)在顆粒狀冷凍的培養(yǎng)物貯藏過程中并不能用于增加其物理穩(wěn)定性。
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權(quán)利要求
1.一種市售相關(guān)包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，所述包裝具有至少重50g的冷凍物質(zhì)，其中冷凍物質(zhì)以單個顆粒的形式存在，含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質(zhì)的活細(xì)菌，并包含占冷凍物質(zhì)0.5％-13％w/w量的添加劑化合物，其中所述添加劑化合物選自化合物組，通過使用占冷凍物質(zhì)10％w/w量的添加劑化合物能增加冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’(冰融解開始溫度)至高于-46℃，例如-45至-15℃(通過DSC測定)，所述冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物不含有添加劑化合物，具有-70℃至-46℃的Tm’值，以及其中所述冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物其特征在于，當(dāng)貯藏在約-46℃下7-14天時，所述冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，在此是通過下列測試來測定的冷凍培養(yǎng)物單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養(yǎng)皿中，從而形成了松散的、單個顆粒的薄層，該薄層特征在于，大多數(shù)顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天并檢查顆粒是否仍然松散或顆粒是否凝結(jié)成塊或粘在一起，其中用于冷凍培養(yǎng)物的單個顆?；旧媳３譃閱蝹€顆粒的判斷標(biāo)準(zhǔn)是至少100個單個顆粒中的80個保持為松散的單個顆粒，排除了包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物包含的低溫保護(hù)劑化合物選自占冷凍物質(zhì)2％-13％w/w量的蔗糖，和占冷凍物質(zhì)4％-6％w/w量的海藻糖，以及占冷凍物質(zhì)13％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物所組成的組。
2.權(quán)利要求1所述的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物是由具有在約30℃最適生長溫度的嗜溫細(xì)菌組成的混合的嗜溫培養(yǎng)物。
3.權(quán)利要求1或2所述的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其中所述LAB是選自包括雙歧桿菌(Bifdobacterium spp.)、短桿菌(Brevibacterium spp.)、丙酸桿菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis subsp.cremoris)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcusspp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青霉菌(Pencillium spp.)、隱球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)的組。
4.前述權(quán)利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其中根據(jù)權(quán)利要求1不含有添加劑化合物的所述冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物具有-70℃至-46℃的Tm’值。
5.前述權(quán)利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其中所述冷凍乳酸菌培養(yǎng)物包含占冷凍物5％-10％w/w量的添加劑化合物。
6.前述權(quán)利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養(yǎng)物，其中所述添加劑化合物選自環(huán)糊精、麥芽糖醇、海藻糖、魚膠、麥芽糖糊精、酵母提取物和噴膠所組成的組。
7.一種制造權(quán)利要求1-6任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細(xì)菌中以使至少50g的物質(zhì)含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質(zhì)的活細(xì)菌，所添加的添加劑化合物占所述物質(zhì)的0.5％-13％w/w量；(ii)冷凍所述物質(zhì)以獲得顆粒狀冷凍物；和(iii)以合適的方式包裝所述冷凍物以獲得包裝的如權(quán)利要求1-6任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中在根據(jù)權(quán)利要求7步驟(i)添加添加劑化合物之前，測定不含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’值并確定其具有-70℃至-46℃的Tm’值；以及在添加了添加劑化合物后，測定包含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的Tm’值，并證實Tm’值在-49℃至-15℃，更優(yōu)選在-39℃至-15℃。
9.一種通過權(quán)利要求7或8所述制造冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物的方法獲得的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物。
10.權(quán)利要求1-6和9任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物在制造食品或飼料產(chǎn)品方法中的應(yīng)用。
全文摘要
一種市售相關(guān)包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質(zhì)，其中冷凍物質(zhì)以單個顆粒的形式存在，特征在于，當(dāng)在－46℃下貯藏7－14天時，冷凍培養(yǎng)物的單個顆粒并不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒。
文檔編號C12N1/04GK1922305SQ200580005638
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月24日
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