專利名稱：細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒，具體涉及細(xì)菌的特異性寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具、使用該細(xì)菌檢測器具的極其準(zhǔn)確且操作性高的細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
例如麥芽酒精飲料中混入有害微生物時，會產(chǎn)生渾濁、風(fēng)味劣化等現(xiàn)象，從而成為質(zhì)量劣化的原因。更加具體地說，如對于啤酒來說，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、梳狀菌屬(Pectinatus)等是代表性的有害細(xì)菌。其中，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus lindneri是有名的啤酒污染菌。作為檢測這些有害細(xì)菌的方法，現(xiàn)在最普通的方法是，用膜過濾器將對象啤酒過濾后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，然后檢測生長的菌落。
作為判斷該菌落是否為上述有害細(xì)菌的方法，使用的方法是將從菌落中提取的DNA作為模板，使用上述有害細(xì)菌特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過電泳來判斷是否能夠得到PCR產(chǎn)物(如參照日本國特開平7-289295號公報(
公開日平成7年11月7日))。但是，因?yàn)樵谠摲椒ㄖ忻總€菌種都需要使用多數(shù)引物進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，操作極其煩雜，在快速性方面存在問題。此外，為了縮短時間，雖然可將多數(shù)引物混合并在1個試管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，但可使用的引物數(shù)量有限，所以難于根據(jù)微量檢體進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。
為了解決上述問題點(diǎn)，使用了下述方法，即、設(shè)計含有各種菌種內(nèi)普遍存在的基因的種特異性序列的部分可擴(kuò)增的引物，擴(kuò)增后用識別種特異性序列的限制酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，以電泳得到的電泳帶的大小來特定其為何種菌種的基因。但是，能夠識別所有對象菌種的限制酶未必都存在，并且，需要用多種類限制酶分別切割得到的擴(kuò)增產(chǎn)物提供給電泳這樣極其煩雜的操作，在快速性、簡便性方面存在問題。
進(jìn)而，為了解決上述問題，還實(shí)施了下述方法，即、用種特異性序列作探針，通過雜交來判斷被檢體中的DNA或RNA中是否存在與該序列互補(bǔ)的序列。
但是，上述通過雜交進(jìn)行判斷的方法，對于非常近緣的DNA同源性高的菌種，也存在頻繁發(fā)生與別的菌種進(jìn)行錯誤雜交的交叉雜交問題，有時難于準(zhǔn)確鑒定菌種。
特別是，在上述代表性的啤酒污染菌即屬于乳酸桿菌屬的種中近緣菌非常多，使用頻繁發(fā)生交叉雜交的方法，不能達(dá)到檢測、鑒定有害細(xì)菌的目的。
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供可以準(zhǔn)確判斷特定細(xì)菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具、使用該細(xì)菌檢測器具通過簡便操作能夠進(jìn)行快速準(zhǔn)確判斷的細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行了精心研究，其結(jié)果在麥芽酒精飲料的代表性污染細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中，發(fā)現(xiàn)了特定屬或特定種特異性序列；并且發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)該堿基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通過和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，可快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定目的細(xì)菌，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，是用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的器具，其特征在于，對象細(xì)菌是從(1)屬于短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的細(xì)菌、(2)屬于Lactobacillus lindneri的細(xì)菌、(3)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌、(4)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌、(5)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌中選擇的至少2種或2種以上的細(xì)菌，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
本發(fā)明的(1)～(5)的細(xì)菌，例如短乳桿菌(Lactobacillus brevis)是序列號7～9及序列號71所示的堿基序列全部包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。Lactobacillus lindneri是序列號22～24所示的堿基序列全部包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌是序列號36～45所示的堿基序列中至少2個堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌是序列號50～55所示的堿基序列中至少2個堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌是序列號56～58所示的堿基序列中至少2個堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。
作為本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的檢測對象細(xì)菌，優(yōu)選包括(6)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌、(7)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌、(8)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌、(9)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌、(10)屬于Lactobacillus coryniformis的細(xì)菌、(11)屬于彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的細(xì)菌、(12)屬于德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的細(xì)菌、(13)屬于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)的細(xì)菌、(14)屬于Lactobacillus malefermentans的細(xì)菌、(15)屬于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillusparacasei、Lactobacillus zeae)的細(xì)菌、(16)屬于鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)的細(xì)菌、(17)屬于布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的細(xì)菌、(18)屬于耐久腸球菌(Enterococcus durans)的細(xì)菌、(19)屬于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的細(xì)菌。
作為固定在基板表面的寡核苷酸，優(yōu)選為下述所示的寡核苷酸，本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的特征是，至少1個或1個以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。
(A)其是根據(jù)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號1所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號2所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號3所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號4所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸。
(B)其是根據(jù)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號7所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號8所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號9所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號71所示的堿基序列的寡核苷酸。
(C)其是根據(jù)Lactobacillus coryniformis的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號10所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號11所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號12所示的堿基序列的寡核苷酸。
(D)其是根據(jù)彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號13所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號14所示的堿基序列的寡核苷酸。
(E)其是根據(jù)德氏乳桿菌(Lactobacillus delbureckii)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號16所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號17所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號18所示的堿基序列的寡核苷酸。
(F)其是根據(jù)發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列的寡核苷酸，并且是含有序列號19所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號20所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號21所示的堿基序列的寡核苷酸。
(G)其是根據(jù)Lactobacillus lindneri的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號22所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號23所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號24所示的堿基序列的寡核苷酸。
(H)其是根據(jù)Lactobacillus malefermentans的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號25所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號26所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號27所示的堿基序列的寡核苷酸。
(I)其是根據(jù)干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zeae)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號28所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號29所示的堿基序列的寡核苷酸；以及是根據(jù)玉米乳桿菌(Lactobacillus zeae、且含有干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株)特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號30所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號31所示的堿基序列的寡核苷酸。
(J)其是根據(jù)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號32所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號33所示的堿基序列的寡核苷酸。
(K)其是根據(jù)布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號34所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號35所示的堿基序列的寡核苷酸。
(L)其是根據(jù)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號36所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號37所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號38所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號39所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號40所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號41所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號42所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號43所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號44所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號45所示的堿基序列的寡核苷酸。
(M)其是根據(jù)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號46所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號47所示的堿基序列的寡核苷酸。
(N)其是根據(jù)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號48所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號49所示的堿基序列的寡核苷酸。
(O)其是根據(jù)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號50所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號51所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號52所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號53所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號54所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號55所示的堿基序列的寡核苷酸。
(P)其是根據(jù)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號56所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號57所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號58所示的堿基序列的寡核苷酸。
(Q)其是根據(jù)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號59所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號60所示的堿基序列的寡核苷酸。
(R)其是根據(jù)屬于耐久腸球菌(Enterococcus durans)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號61所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號62所示的堿基序列的寡核苷酸。
(S)其是根據(jù)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，并且是含有序列號63所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號64所示的堿基序列的寡核苷酸。
(T)其是含有屬于部分明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌及屬于部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列的共同的堿基序列中的序列號72所示的堿基序列的寡核苷酸。
通過使用將上述(A)～(T)所述的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，能夠全部檢測、鑒定食品中的污染菌、特別是麥芽酒精飲料中的污染菌。
此外，本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，優(yōu)選上述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進(jìn)行反應(yīng)形成共價鍵。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法，是用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的方法，其特征在于，包括制備被檢試料中的細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、將所述探針與固定在上述本發(fā)明細(xì)菌檢測器具的基板表面的寡核苷酸進(jìn)行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。
作為本發(fā)明細(xì)菌檢測方法的被檢試料，優(yōu)選食品，其中最優(yōu)選麥芽酒精飲料。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒，是用于實(shí)施上述本發(fā)明細(xì)菌檢測方法的試劑盒，包含上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，并且優(yōu)選包含雜交步驟、信號檢測步驟、探針制備步驟、核酸制備步驟中使用的試劑。
本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)通過下述內(nèi)容可以充分理解，并且本發(fā)明的利益通過下述參照附圖的說明可以得以證明。


表示實(shí)施例中使用的本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置圖。
是表示使用在圖1(a)所示的排列位置上固定寡核苷酸的細(xì)菌檢測器具檢測Lactobacillus brevis的結(jié)果圖像。
具體實(shí)施例方式
對本發(fā)明的一種實(shí)施方式進(jìn)行如下說明，此外，本發(fā)明并不限于下述實(shí)施方式。
(1)本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具所使用的基板的材質(zhì)，只要能夠使寡核苷酸穩(wěn)定地固定即可。例如可以為聚碳酸酯或塑料等合成樹脂、玻璃等，但并不限于這些材質(zhì)?；宓男螒B(tài)沒有特別限定，但可優(yōu)選使用如板狀、薄膜狀等基板。
固定在本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的基板表面的寡核苷酸，只要是根據(jù)檢測對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸即可。通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸之間進(jìn)行雜交，可檢測出被檢試料中含有的屬于目的種或?qū)俚募?xì)菌。此外，對于根據(jù)上述檢測對象細(xì)菌所屬種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸，以下恰當(dāng)?shù)胤Q之為“捕獲性寡核苷酸(capture olig)”。
上述特異性堿基序列，只要從檢測對象細(xì)菌的基因組堿基序列中選取屬或種特異性堿基序列即可，優(yōu)選從檢測對象細(xì)菌的核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中選取。其中，已知道細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中具有很多屬或種特異性堿基序列，特別優(yōu)選從16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的DNA序列中選取屬或種特異性堿基序列。核糖體RNA基因的堿基序列，可以從GenBank、EMBL、DDBJ等的數(shù)據(jù)庫等中得到。
根據(jù)上述屬或種特異性堿基序列來設(shè)計捕獲性寡核苷酸即可。因此，其可以為上述屬或種特異性堿基序列自身，只要能夠與從檢測對象細(xì)菌中制備的核酸進(jìn)行特異性雜交，也可包含變異，變異的位置沒有特別限定。
捕獲性寡核苷酸的長度(堿基數(shù))沒有特別限定，如果太短難于對雜交進(jìn)行檢測，如果太長會發(fā)生非特異性雜交。本發(fā)明者對捕獲性寡核苷酸的最適合長度進(jìn)行反復(fù)研究，確定標(biāo)準(zhǔn)長度為12～24個堿基。更優(yōu)選13～22個堿基，但并不限于此。本發(fā)明者確認(rèn)，堿基長度主要取決于序列特性(特定的堿基含有率、同一堿基的重復(fù))，結(jié)合性良好的序列即使鏈短，也可進(jìn)行特異性雜交。
當(dāng)捕獲性寡核苷酸具有妨礙其與來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)或除此之外的立體結(jié)構(gòu)時，通過將構(gòu)成捕獲性寡核苷酸的1個或1個以上的核苷酸置換為與肌苷或任何核苷酸不聯(lián)會的核酸，可以解除其立體結(jié)構(gòu)。
捕獲性寡核苷酸的合成方法沒有特別限定，根據(jù)公知的方法(如Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)所述方法)合成即可。一般可以用市售的DNA合成機(jī)進(jìn)行化學(xué)合成。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，不僅將根據(jù)上述檢測對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面，而且優(yōu)選在此基礎(chǔ)上將所謂的對照捕獲性寡核苷酸也固定在基板表面。對照捕獲性寡核苷酸包括陽性對照捕獲性寡核苷酸及陰性對照捕獲性寡核苷酸。陽性對照捕獲性寡核苷酸用于判斷下述探針制備步驟中的擴(kuò)增反應(yīng)是否順利進(jìn)行。陰性對照捕獲性寡核苷酸用于確認(rèn)未發(fā)生非特異性雜交，即未發(fā)生假陽性雜交。本發(fā)明也包含這些陽性對照捕獲性寡核苷酸及陰性對照捕獲性寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具。
陽性對照捕獲性寡核苷酸只要根據(jù)從檢測對象細(xì)菌中制備的探針中所包含的序列進(jìn)行設(shè)計即可。此外，使用同一細(xì)菌檢測器具同時檢測多數(shù)檢測對象細(xì)菌時，可以對各檢測對象細(xì)菌設(shè)計陽性對照捕獲性寡核苷酸，或者也可以根據(jù)從多數(shù)檢測對象細(xì)菌中制備的探針中的相同堿基序列進(jìn)行設(shè)計。從所有檢測對象細(xì)菌中制備的探針中沒有相同堿基序列時，也可分為數(shù)組分別設(shè)計陽性對照捕獲性寡核苷酸?；蛘咭部梢栽O(shè)計引物序列部分相同、與對象細(xì)菌序列不同的人工序列，使該序列的一部分成為陽性對照捕獲性寡核苷酸。以上述人工序列作模板制備探針(在本說明書中稱這種探針為對照探針)，通過添加到從被檢試料中制備的探針上，可以驗(yàn)證雜交的特異性。此外，在下面將對上述探針進(jìn)行說明。
陰性對照捕獲性寡核苷酸，優(yōu)選以下述方式設(shè)計，即、在陽性對照捕獲性寡核苷酸的堿基序列中，在1個或1個以上的堿基且小于該序列具有的堿基數(shù)的未滿20％的范圍內(nèi)具有包含人工置換堿基的堿基序列。進(jìn)行堿基置換的堿基數(shù)，取決于與雜交條件之間的關(guān)系，可選擇來源于檢測對象細(xì)菌的探針不發(fā)生雜交的堿基數(shù)。
檢測對象細(xì)菌沒有特別限定，可適當(dāng)選擇要從目的被檢試料中檢測的細(xì)菌。例如可以為混入食品中可能污染該食品的細(xì)菌。其中優(yōu)選可能混入、污染麥芽酒精飲料的細(xì)菌為檢測對象細(xì)菌。食品中混入有害細(xì)菌已成為公共衛(wèi)生方面的非常大的問題。此外，對于啤酒、發(fā)泡酒等所代表的麥芽酒精飲料，有害細(xì)菌混入時成為渾濁、風(fēng)味劣化等質(zhì)量劣化的原因，因此，特別期望開發(fā)出快速且準(zhǔn)確檢測、鑒定這些有害細(xì)菌的方法。
作為污染麥芽酒精飲料的細(xì)菌，可以為屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球形菌屬(Megasphaera)以及梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌。并且屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的菌種，可以為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus coryniformis、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus lindneri、Lactobacillusmalefermentans、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、玉米乳桿菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei的標(biāo)準(zhǔn)株)。此外，作為污染食品的細(xì)菌，除上述之外還可以為屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)及發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌，以及耐久腸球菌(Enterococcus durans)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。但檢測對象細(xì)菌并不限于上述細(xì)菌。
用于檢測、鑒定上述所示細(xì)菌的捕獲性寡核苷酸，可以為根據(jù)屬于下述菌屬的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的各屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，所述菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梳狀菌屬(Pectinatus)及發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)；以及可以為由下述菌種的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的各細(xì)菌的種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，所述菌種為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus coryniformis、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳桿菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei的標(biāo)準(zhǔn)株)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。具體來說，可以為含有序列號1～64、71及72所示的任何堿基序列的寡核苷酸，但并不限于這些寡核苷酸。
表1例舉了通過根據(jù)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)、以及根據(jù)部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和部分明串珠菌屬(Leuconostoc)所對應(yīng)的堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號72)，可以檢測出的乳酸桿菌屬的細(xì)菌。但通過具有序列號1～6及72所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。



通過根據(jù)片球菌屬(Pediococcus)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號36～45)可檢測出的細(xì)菌如表2所示。但通過具有序列號36～45所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。


通過根據(jù)鏈球菌屬(Streptococcus)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號46、47)可檢測出的細(xì)菌如表3所示，但通過具有序列號46或47所示的堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。



通過根據(jù)明串珠菌屬(Leuconostoc)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號48、49)、以及根據(jù)部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和部分明串珠菌屬(Leuconostoc)所對應(yīng)堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號72)，可檢測出的明串珠菌屬的細(xì)菌如表4所示。但通過具有序列號48、49及72所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。


通過根據(jù)巨球形菌屬(Megasphaera)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號50～55)可檢測出的細(xì)菌，可以為Megasphaera cerevisiae、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、Megasphaera micronuciformis。但通過具有序列號50～55所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。
通過根據(jù)梳狀菌屬(Pectinatus)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號56～58)可檢測出的細(xì)菌，可以為嗜啤酒梳狀菌(Pectinatuscerevisiiphilus)、Pectinatus frisingensis。但通過具有序列號56～58所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。
通過根據(jù)發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)特異性堿基序列設(shè)計的捕獲性寡核苷酸(序列號59、60)可檢測出的細(xì)菌，可以為Zymomonas mobilis、Zymomonaspomaceae。但通過具有序列號59或60所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細(xì)菌，并不限于這些。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的基板表面固定的捕獲性寡核苷酸，只要能夠與從對象細(xì)菌中制備的探針進(jìn)行雜交，沒有特別限定。因此，含有上述序列號1～64、71及72所示的任何堿基序列的寡核苷酸，可以為只含有序列號1～64、71及72所示的任何堿基序列組成的寡核苷酸，也可以為含有序列號1～64、71及72所示的任何堿基序列以外的序列的寡核苷酸。作為含有序列號1～64、71及72所示的任何堿基序列以外的序列的捕獲性寡核苷酸，可以為具有下述堿基序列的寡核苷酸，所述堿基序列為以各16S核糖體RNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)，向序列號1～64、71及72所示的各堿基序列的5’側(cè)或3’側(cè)、或者其兩側(cè)延伸的堿基序列，本發(fā)明也包含將這種寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具。
1個基板上固定化的捕獲性寡核苷酸至少有1種或1種以上即可，沒有特別限定。一般情況下，檢測試料中混入的細(xì)菌時，用1個基板可以全部檢測出被檢試料中的可檢測細(xì)菌，從操作的簡便性和檢查的快速性來看可謂優(yōu)選。因此，本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具也最優(yōu)選在1個基板上固定多數(shù)目的細(xì)菌種或?qū)傧鄬?yīng)的捕獲性寡核苷酸，成為所謂的微陣列型器具。例如使麥芽酒精飲料作被檢試料時，優(yōu)選將屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梳狀菌屬(Pectinatus)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)等的細(xì)菌所對應(yīng)的捕獲性寡核苷酸固定在基板表面。

寡核苷酸在基板表面的固定化方法沒有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用公知的方法。例如可以利用物理吸附、靜電結(jié)合或分子共價鍵等一般雜交法所使用的方法。本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，優(yōu)選使用表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基的基材(美國專利US5,908,746、日本國專利特開平8-23975號)進(jìn)行固定化。
將寡核苷酸點(diǎn)樣時，如果寡核苷酸的點(diǎn)樣量太少，無法充分確保寡核苷酸和探針之間的反應(yīng)性，因而難于判斷。此外，高密度點(diǎn)樣存在技術(shù)問題同時成本較高，并且，使用探針的熒光標(biāo)記、化學(xué)顯色等的雜交信號的檢測，也需要更加精密的昂貴的檢測裝置(例如掃描儀)。因此，優(yōu)選寡核苷酸以直徑10～1000μm的尺寸固定在基板表面。寡核苷酸在基板上的點(diǎn)樣方法沒有特別限定，例如可通過使用點(diǎn)樣機(jī)將寡核苷酸溶液點(diǎn)樣在基板上來進(jìn)行點(diǎn)樣。因此寡核苷酸溶液通?？牲c(diǎn)樣為大致的圓形。
(2)本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法是用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的方法，其包括制備被檢試料中的細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、將根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋孕蛄性O(shè)計的寡核苷酸與上述標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。本檢測方法的雜交步驟優(yōu)選使用上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具。通過使用該細(xì)菌檢測器具，可簡便、快速且準(zhǔn)確地進(jìn)行全面的檢測、鑒定。此外，本檢測方法的被檢試料優(yōu)選食品，特別優(yōu)選麥芽酒精飲料。下面將分別對各步驟詳細(xì)說明。
其為制備被檢試料中的細(xì)菌的核酸的步驟。從被檢試料中制備核酸的制備方法，可以適當(dāng)選擇并使用公知的核酸制備方法。例如制備DNA時，可以根據(jù)R-F.Wang介紹的方法進(jìn)行提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。該方法為標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，但還有多種替代方法，可以采用任一種方法。此外，也可以使用市售的試劑盒。
其為以上述核酸制備步驟所制備的核酸為模板制備標(biāo)記探針的步驟。例如可使用設(shè)計成含有捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性核苷酸的堿基序列的引物，通過核酸擴(kuò)增來制作探針。作為核酸擴(kuò)增的方法，例如可以為通過PCR擴(kuò)增DNA的方法，或者應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄法(in vitro transcription)擴(kuò)增RNA的方法，但并不僅限于這些方法。
例如通過PCR制備標(biāo)記探針時，設(shè)計PCR使用的引物時使探針含有與捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列。此外，只要能夠雜交，探針可以比捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性寡核苷酸長，也可比其短。為了得到標(biāo)記探針，可預(yù)先標(biāo)記PCR使用的引物。此外也可通過預(yù)先標(biāo)記PCR的基質(zhì)(脫氧核苷酸三磷酸dNTP)得到標(biāo)記探針。或者也可在PCR結(jié)束后標(biāo)記探針。標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限定，例如可以使用與熒光物質(zhì)、半抗原、放射性物質(zhì)等通常雜交使用的探針相同的標(biāo)記物質(zhì)。具體來說，熒光物質(zhì)可以為異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(Rodamine)、藻紅素(phycoerythrin)(PE)、德州紅(Texas Red)、矢車菊雙甙(cyanin)類蛍光色素等，半抗原可以為生物素(BIOTIN)、地高辛(Digoxigenin)(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、熒光素(fluorescein)等。
雜交步驟是根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸和上述標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的步驟。雜交可以在固定有上述寡核苷酸的薄膜上等進(jìn)行，但優(yōu)選使用本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具。通過使用該細(xì)菌檢測器具，可以簡便、快速且準(zhǔn)確地進(jìn)行全面的檢測、鑒定。雜交步驟使用的方法沒有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用公知的核酸雜交方法。下面所示的是一例具體雜交方法。
在含有SSC(Standard Saline Citrate)等鹽溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液、以及促進(jìn)融合反應(yīng)的添加劑的融合液中，加入標(biāo)記探針。當(dāng)探針為2條鏈時，通過加熱等進(jìn)行變性。在基板上加數(shù)μl標(biāo)記探針液后，進(jìn)行數(shù)小時的加熱操作(通常37℃～50℃)，在基板上固定的寡核苷酸和標(biāo)記探針之間可以雜交。然后在基板上加5×SSC或3M四甲基氯化銨進(jìn)行加熱(通常37℃～50℃)，從基板上除去沒有形成特異性雜交的標(biāo)記探針，只有特異性雜交選擇性地留在基板上。
信號檢測步驟是判斷上述雜交步驟是否發(fā)生雜交的步驟，通常與上述雜交步驟連續(xù)進(jìn)行。
雜交檢測步驟使用的方法，取決于上述探針制備步驟所制備的探針中導(dǎo)入的標(biāo)記物質(zhì)。即、檢測雜交時要使用在探針中導(dǎo)入的熒光物質(zhì)、半抗原等標(biāo)記物質(zhì)。因此，適當(dāng)選擇使用用于檢測使用的探針中所導(dǎo)入的標(biāo)記物質(zhì)的公知方法即可。
例如，使用半抗原時，在基板上加含有識別半抗原的蛋白質(zhì)或與其結(jié)合的蛋白質(zhì)、堿性磷酸酯酶或辣根過氧化物酶等的結(jié)合體(酶結(jié)合物)的溶液，室溫下使反應(yīng)進(jìn)行數(shù)10分鐘。此外，在該半抗原和酶結(jié)合物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)之前，在固定有寡核苷酸的區(qū)域以外的基板區(qū)域使用酪蛋白等蛋白質(zhì)將其完全覆蓋，因此可以阻止酶結(jié)合物和基板的非特異性吸附反應(yīng)。該過程可通過下述方式進(jìn)行，即、將寡核苷酸固定后在基板上加酪蛋白等蛋白質(zhì)溶液，室溫下放置數(shù)十分鐘。酶結(jié)合物和探針中的半抗原的結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，用含有表面活性劑的適當(dāng)緩沖液將沒有與半抗原結(jié)合的酶結(jié)合物清洗、沖掉。因此，基板上僅留下與探針中的半抗原結(jié)合的酶結(jié)合物。
為使雜交可視化，僅在半抗原與酶結(jié)合物存在的情況下，添加僅可形成不溶化合物的化合物。該不溶化合物的生成通過酶反應(yīng)可擴(kuò)增并可視化。作為添加的化合物，當(dāng)酶結(jié)合物中的酶是堿性磷酸酯酶時，可使用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-對甲苯胺鹽)，當(dāng)酶是辣根過氧化物酶時，可使用TMB(3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺)。
通過觀察已固定捕獲性寡核苷酸的位置的雜交色素沉淀或熒光顯色等雜交信號，判斷被檢試料中含有的細(xì)菌種類。即、已檢測出雜交信號時，表示與該信號位置點(diǎn)樣的寡核苷酸所對應(yīng)的細(xì)菌存在于被檢試料中。此外，如果在陽性對照捕獲性寡核苷酸的位置發(fā)現(xiàn)信號，可以確認(rèn)本試驗(yàn)正常進(jìn)行；如在陰性對照捕獲性寡核苷酸的位置沒有發(fā)現(xiàn)信號，可以確認(rèn)雜交在合適條件下進(jìn)行。
(3)本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒，是用于實(shí)施上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法的試劑盒。因此，只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的細(xì)菌檢測方法，試劑盒內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)沒有特別限定。
本細(xì)菌檢測試劑盒，優(yōu)選包含本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，使其成為包含該細(xì)菌檢測器具的試劑盒，可以簡便、快速且準(zhǔn)確地進(jìn)行全面的檢測、鑒定。此外，本細(xì)菌檢測試劑盒中優(yōu)選包含上述雜交步驟及信號檢測步驟使用的試劑。作為上述雜交步驟使用的試劑，例如可以為SSC(Standard SalineCitrate)等鹽溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液以及用以促進(jìn)融合反應(yīng)的添加劑等。作為信號檢測步驟使用的試劑，例如可以為識別半抗原的蛋白質(zhì)與酶的結(jié)合體(酶結(jié)合物)、NBT、BCIP、TMB等顯色基質(zhì)等，但并不限于這些物質(zhì)，選擇適合目的的適當(dāng)試劑構(gòu)成試劑盒即可。
本細(xì)菌檢測試劑盒中，優(yōu)選包含上述探針制備步驟使用的試劑，并且還優(yōu)選包含上述核酸制備步驟使用的試劑。作為探針制備步驟使用的試劑，例如可以為PCR用緩沖液、耐熱性DNA合成酶、脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)混合液等。作為核酸制備步驟使用的試劑，可以為溶菌用緩沖液、DNA回收用柱子、DNA提取用緩沖液等。但并不限于這些物質(zhì)，選擇適合目的的適當(dāng)試劑構(gòu)成試劑盒即可。
通過使用本發(fā)明的試劑盒(包含本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具及各步驟中使用的試劑)，收到被檢試料后約6小時即可檢測、鑒定被檢試料中含有的細(xì)菌。
(4)本發(fā)明的用途本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒的用途沒有特別限定，可在所有需要判斷細(xì)菌的用途中使用。具體來說，適合應(yīng)用于如因細(xì)菌污染而對質(zhì)量造成大的影響的各種工業(yè)制品的制造工程，從該工業(yè)制品、其制造環(huán)境等中分離出的細(xì)菌需要快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定的情況。
作為判斷對象的被判斷細(xì)菌的來源的上述工業(yè)制品，代表性物質(zhì)可以是食品、飲料、醫(yī)藥品、試劑、醫(yī)藥部外用品、一次性醫(yī)療器具等，沒有特別限定。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用于上述例舉的工業(yè)制品中的食品。作為食品，更加具體地說，可以為面包、和洋點(diǎn)心(包括冷凍點(diǎn)心)、成品菜食品、乳制品、谷類食品、豆腐、油炸豆腐類、面類、盒飯類、調(diào)味料、小麥粉、食肉等農(nóng)產(chǎn)加工品、營養(yǎng)補(bǔ)助食品(supplement等)、長期保存食品(罐頭、冷凍食品、干餾食品等)等，沒有特別限定。
本發(fā)明特別優(yōu)選應(yīng)用于上述例舉的食品中的麥芽酒精飲料。作為麥芽酒精飲料，可以為啤酒、發(fā)泡酒等，沒有特別限定。
實(shí)施例[寡核苷酸的合成]根據(jù)規(guī)定方法，使用寡核苷酸合成機(jī)(Perkin-elmer Applied biosystems公司制)合成寡核苷酸，經(jīng)脫保護(hù)后進(jìn)行干燥。使用10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA緩沖液溶解該寡核苷酸干燥體，制成100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本實(shí)施例中使用的所有寡核苷酸均用該方法合成。合成的寡核苷酸的堿基序列用序列號1～72表示，其中序列號1～64、71及72是捕獲性寡核苷酸，序列號65是檢測對象細(xì)菌的陽性對照捕獲性寡核苷酸，序列號66是陰性對照捕獲性寡核苷酸，序列號67～68是引物，序列號69是對照探針，序列號70是對照探針的陽性對照捕獲性寡核苷酸。對于捕獲性寡核苷酸，使用上述合成機(jī)使氨基結(jié)合在5’末端，引物則是使生物素結(jié)合在5’末端。
對于10μL的5’末端具有氨基的寡核苷酸溶液，混合10μL微點(diǎn)樣溶液(TeleChem International Inc.制)，分注于微孔板(Greiner LaboratoryInc制)上。在規(guī)定的點(diǎn)樣位置放置碳化二亞胺樹脂處理的載玻片Carbostation(日清紡織株式會社制)，使點(diǎn)樣機(jī)工作。點(diǎn)樣結(jié)束后，將載玻片置于熱水的蒸氣中數(shù)秒時間，然后照射600mJ紫外線。再次在蒸氣中暴露數(shù)秒時間，然后將載玻片置于加熱板上除去水分。將載玻片放入含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室溫下浸漬30分鐘，進(jìn)行阻斷。然后用緩沖液10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA清洗。室溫下干燥載玻片，使用前一直以干燥狀態(tài)保存于冷暗處。圖1(a)表示本實(shí)施例中實(shí)際使用的細(xì)菌檢測器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置。
作為檢體使用的細(xì)菌是14種乳酸桿菌屬、5種片球菌屬、1種鏈球菌屬、1種明串珠菌屬、3種巨球形菌屬、2種梳狀菌屬、2種發(fā)酵單胞菌屬、1種腸球菌屬、1種乳球菌屬的共計30種細(xì)菌。表5表示作為檢體使用的細(xì)菌。


使用Genomic DNA Purif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)，從在最適合所述各細(xì)菌的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的各菌液中分別制備各細(xì)菌的基因組DNA。
以得到的各細(xì)菌的DNA為模板通過PCR制備核酸探針。PCR反應(yīng)液的組成為，Taq聚合酶1unit、生物素化引物(序列號68和69)各10pmol、反應(yīng)用緩沖液(10×)5μL、dNTP各10nmol、模板DNA在100ng中加入滅菌蒸餾水使總量為50μL。使用熱循環(huán)器，95℃保持3分鐘后，95℃30秒、55℃15秒、72℃1分鐘的反應(yīng)循環(huán)30次，72℃保持5分鐘結(jié)束反應(yīng)。
此外，設(shè)計引物序列相同而與對象細(xì)菌的序列不同的人工序列，以此作為對照探針。將其作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，制備生物素化對照探針。PCR反應(yīng)液的組成除使模板DNA為1ng外其他與上述相同。此外，反應(yīng)溫度和循環(huán)數(shù)與上述相同。不精制探針，直接將PCR反應(yīng)液作探針溶液在下述雜交步驟中使用。
將3μL上述核酸探針溶液、1μL生物素化對照探針溶液、16μL ArrayItUnihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.制)加在一起并混合，100℃加熱處理1分鐘后在冰中浸漬5分鐘。取全量該核酸探針溶液，加在固定有捕獲性寡核苷酸的基板上，在其上面放置蓋玻片。將其放入保濕箱，在設(shè)定37℃的恒溫器中靜置120分鐘。取出基板，快速浸入室溫下的2×SSC溶液(2×SSC0.033M NaCl、0.033M枸櫞酸鈉)中并除去蓋玻片，在保持溫度為37℃的2×SSC中浸漬5分鐘。
從2×SSC中取出基板，放入離心機(jī)(Beckman公司制)內(nèi)，以2000rpm離心1分鐘，接著使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，制作卵白素-生物素化過氧化物酶復(fù)合體，在基板上滴1.4mL，室溫靜置30分鐘。然后在PBS(10mM磷酸鈉(pH7.5)、0.9％氯化鈉)中清洗。使用TMB substratekit for peroxidase(VECTOR公司)制備顯色溶液，在基板上滴1.4mL室溫靜置30分鐘。用蒸餾水清洗基盤停止顯色反應(yīng)。
使用愛普生公司制造的掃描儀GT-8700F及其透光單元，用600dpi掃描已進(jìn)行雜交的區(qū)域，用目視來確認(rèn)掃描圖像有無顯色。圖1(b)表示作為掃描圖像的一例的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的掃描圖像。此外，圖1(a)表示基板上的寡核苷酸的排列位置。
作為檢體使用的30種細(xì)菌的結(jié)果如表6～35所示。各表中“○”表示確認(rèn)的顯色點(diǎn)，“-”表示沒有確認(rèn)的顯色點(diǎn)。表6～35所示的全部結(jié)果顯示，對照探針在與其相對應(yīng)的陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號70)處顯色，此外，在陰性對照捕獲性寡核苷酸處沒有顯色，可以確認(rèn)擴(kuò)增及雜交步驟均正常進(jìn)行。此外確認(rèn)所有細(xì)菌的陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號65)處均顯色，因此可以確認(rèn)從細(xì)菌中制備的核酸得到了擴(kuò)增。此外，在下述結(jié)果的說明中不包括陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號65和70)的顯色。
表6表示Lactobacillus brevis的結(jié)果，確認(rèn)Lactobacillus brevis在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1)的1處和在Lactobacillus brevis檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號7、8、9、71)的4處，合計僅5處顯色(參照圖1)。確認(rèn)Lactobacillus curvatus(表8)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號5)的1處和Lactobacilluscurvatus檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號13、14)的2處，合計僅3處顯色。確認(rèn)Lactobacillus coryniformis(表7)、Lactobacillusdelbrueckii(表9)、Lactobacillus lindneri(表11)及Lactobacillusmalefermentans(表12)，在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)的6處中的任何1處和各細(xì)菌對應(yīng)的種特異性捕獲性寡核苷酸的3處，合計僅4處顯色。
確認(rèn)Lactobacillus fermentum(表10)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號6)的1處、部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號72)的1處、Lactobacillus fermentum檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號19～21)的3處，合計僅5處顯色。確認(rèn)Lactobacillus casei(表13)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus casei檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號28、29)的2處，合計僅4處顯色。確認(rèn)Lactobacillusrhamnosus(表14)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus rhamnosus檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號32、33)的2處，合計僅4處顯色。確認(rèn)Lactobacillus buchneri(表15)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1)的1處、Lactobacillus buchneri檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號34、35)的2處，合計僅3處顯色。確認(rèn)Lactobacillus zeae(表19)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus zeae檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號30、31)的2處，合計僅4處顯色。
此外，確認(rèn)沒有設(shè)計種特異性捕獲性寡核苷酸的Lactobacillusplantarum(表16)及Lactobacillus sakei(表18)，僅在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)的6處中任何1處顯色。確認(rèn)Lactobacillus psittaci(表17)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號6)的1處和部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號72)的1處，合計僅2處顯色。
確認(rèn)Pediococcus damnosus(表20)、Pediococcus acidilactici(表21)、Pediococcus claussenii(表22)、Pediococcus dextrinicus(表23)及Pediococcus urinaeequi(表24)僅在Pediococcus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號36～45)的10處中的任何2處顯色。
確認(rèn)Streptococcus alactolyticus(表25)僅在Streptococcus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號46、47)的2處顯色。
確認(rèn)Leuconostoc mesenteroides(表26)在Leuconostoc屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號48、49)的2處、部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(配列番號72)的1處，合計僅3處顯色。
確認(rèn)Megasphaera cerecisiae(表27)、Megasphaera elsdenii(表28)及Megasphaera micronuciformis(表29)在Megasphaera屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號50～55)的6處中的任何2處顯色。
確認(rèn)Pectinatus cerevisiiphils(表30)及Pectinatus frisingensis(表31)在Pectinatus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號56～58)的3處中的任何2處顯色。
確認(rèn)Zymomonas mobilis(表32)及Zymomonas pomaceae(表33)，僅在Zymomonas屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號59、60)的2處顯色。
確認(rèn)Enterococcus durans(表34)僅在Enterococcus durans檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號61、62)的2處顯色。
確認(rèn)Lactococcus lactis(表35)僅在Lactococcus lactis檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號63、64)的2處顯色。
上述結(jié)果顯示，對于作為檢體使用的各細(xì)菌，僅在固定有各細(xì)菌的特異性捕獲性寡核苷酸的位置顯色，均沒有非特異性顯色。因此可以確認(rèn)本實(shí)施例制作的細(xì)菌檢測器具能夠特異性地檢測Lactobacillus屬、Pediococcus屬、Streptococcus屬、Leuconostoc屬、Megasphaera屬、Pectinatus屬、Zymomonas屬，并且確認(rèn)其為能夠種特異性地檢測Lactobacillus brevis、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus curvatus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus casei(包括Lactobacillusparacasei)、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae(包括Lactobacillus casei的標(biāo)準(zhǔn)株)、Enterococcusdurans及Lactococcus lactis的細(xì)菌檢測器具。
被檢細(xì)菌Lactobacillus brevis
被檢細(xì)菌Lactobacillus coryniformis
被檢細(xì)菌Lactobacillus curvatus

被檢細(xì)菌Lactobacillus delbrueckii

被檢細(xì)菌Lactobacillus fermentum
被檢細(xì)菌Lactobacillus lindneri
被檢細(xì)菌Lactobacillus malefermentans
被檢細(xì)菌Lactobacillus casei
被檢細(xì)菌Lactobacillus rhamnosus
被檢細(xì)菌Lactobacillus buchneri
被檢細(xì)菌Lactobacillus plantarum
被檢細(xì)菌Lactobacillus psittaci
被檢細(xì)菌Lactobacillus sakei
被檢細(xì)菌Lactobacillus zeae
被檢細(xì)菌Pediococcus damnosus
被檢細(xì)菌Pediococcus acidilactici
被檢細(xì)菌Pediococcus claussenii
被檢細(xì)菌Pediococcus dextrinicus
被檢細(xì)菌Pediococcus urinaeequi
被檢細(xì)菌Streptococcus alactolyticus
被檢細(xì)菌Leuconostoc mesenteroides
被檢細(xì)菌Megasphaera cerevisisae
被檢細(xì)菌Megasphaera elsdenii
被檢細(xì)菌Megasphaera micronuciformis
被檢細(xì)菌Pectinatus cerevisiiphilus
被檢細(xì)菌Pectinatus frisingensis
被檢細(xì)菌Zymomonas mobilis
被檢細(xì)菌Zymomonas pomaceae
被檢細(xì)菌Enterococcus durans
被檢細(xì)菌Lactococcus lactis

此外，在用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式項(xiàng)中的具體實(shí)施方式
或?qū)嵤├?，只不過是使本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容更明確的部分，而不應(yīng)該狹義地理解為僅限于這些具體例，只要是在本發(fā)明的精神和所述的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可以實(shí)施各種變更。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，可以檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。因此，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的效果是能夠準(zhǔn)確且簡便地檢測、鑒定細(xì)菌。
此外，如果在基板表面固定多數(shù)根據(jù)細(xì)菌種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸，則可產(chǎn)生能夠進(jìn)行全面檢查的效果。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒，因?yàn)楹猩鲜黾?xì)菌檢測器具及必要的試劑，所以可產(chǎn)生提高操作性、更加簡便地檢測、鑒定細(xì)菌的效果。
本發(fā)明可以在食品制造業(yè)、飲食產(chǎn)業(yè)、藥品產(chǎn)業(yè)等的衛(wèi)生管理、過程管理、質(zhì)量管理方面利用。
序列表<110>三得利株式會社(Suntory Limited)日清紡織株式會社(Nisshinbo Industries Inc.)<120>細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒(Bacteria detectinginstrument，bacteria detecting method，and bacteria detecting kit)<130>SU0501<150>JP 2004-050523<151>2004-02-25<160>72<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>13<212>DNA<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>1gcgaactggt gag 13<210>2<211>16<212>DNA<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>2aaggcaatga tgcgta 16<210>3<211>16<212>DNA
<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>3aactgagagg ttgatc 16<210>4<211>17<212>DNA<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>4ccttaagtgg gggataa 17<210>5<211>16<212>DNA<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>5atagtaactg atcagg 16<210>6<211>14<212>DNA<213>乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)<400>6aggcgatgat gcat14<210>7
<211>16<212>DNA<213>短乳桿菌(Lactobacillus brevis)<400>7tgaaaggtgg cttcgg 16<210>8<211>16<212>DNA<213>短乳桿菌(Lactobacillus brevis)<400>8taactgttca agggtt 16<210>9<211>18<212>DNA<213>短乳桿菌(Lactobacillus brevis)<400>9taaagaagaa cacctttg18<210>10<211>20<212>DNA<213>Lactobacillus coryniformis<400>10cgaagctgct tgcagtggac 20
<210>11<211>15<212>DNA<213>Lactobacillus coryniformis<400>11aacggcttac caaga 15<210>12<211>17<212>DNA<213>Lactobacillus coryniformis<400>12gcactgacgt cgaccga 17<210>13<211>21<212>DNA<213>彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)<400>13cactctcgtt agattgaaga a21<210>14<211>17<212>DNA<213>彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)
<400>14ctgattgata acatttg 17<210>15<211>16<212>DNA<213>彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)<400>15gaacgtattt gatagt 16<210>16<211>16<212>DNA<213>德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)<400>16atctgcccta aagact 16<210>17<211>17<212>DNA<213>德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)<400>17actttaggat gagcccg 17<210>18<211>16<212>DNA
<213>德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)<400>18cgagctgaat tcaaag 16<210>19<211>16<212>DNA<213>發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)<400>19ttcgcatgaa caacgc 16<210>20<211>14<212>DNA<213>發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)<400>20ctcgctatca cttc14<210>21<211>15<212>DNA<213>發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)<400>21ttctggatgg acctg 15<210>22<211>17
<212>DNA<213>Lactobacillus lindneri<400>22agagcaactg ctcacgg 17<210>23<211>17<212>DNA<213>Lactobacillus lindneri<400>23gcttgacgat agatctg 17<210>24<211>17<212>DNA<213>Lactobacillus lindneri<400>24gcttttatgc tatcgct 17<210>25<211>19<212>DNA<213>Lactobacillus malefermentans<400>25catcccgttg atttgaagt 19<210>26
<211>20<212>DNA<213>Lactobacillus malefermentans<400>26actgataatt aacatcggat 20<210>27<211>14<212>DNA<213>Lactobacillus malefermentans<400>27ttggatagac ccgc14<210>28<211>17<212>DNA<213>干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)<400>28cgagattcaa catggaa 17<210>29<211>21<212>DNA<213>干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)<400>29agttctcgtt gatgatcggt g21
<210>30<211>16<212>DNA<213>干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)<400>30gagattcgac ttaaaa 16<210>31<211>17<212>DNA<213>干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)<400>31ttttggtcga tgaacgg 17<210>32<211>19<212>DNA<213>鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)<400>32gttctgatta ttgaaaggt 19<210>33<211>20<212>DNA<213>鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)<400>33
atcttgattt aattttgaac 20<210>34<211>17<212>DNA<213>布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)<400>34cgcgtctccg ttaatga 17<210>35<211>20<212>DNA<213>布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)<400>35aaagatttaa cattgagacg 20<210>36<211>16<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>36tttagggtcg taaaac 16<210>37<211>21<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)
<400>37accgtataac agagaaaacc g21<210>38<211>18<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>38tatttggtag taactggc18<210>39<211>21<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>39gcatggaagg agattgaaag a21<210>40<211>20<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>40ttccgttaaa agaatcagaa 20<210>41<211>16<212>DNA
<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>41ctgctcatgc agtgac 16<210>42<211>17<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>42gagattttaa cacgaag 17<210>43<211>15<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>43ttgcacggaa gatga 15<210>44<211>17<212>DNA<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>44agtcttgacg gtatctt 17<210>45<211>17<212>DNA
<213>片球菌屬(Pediococcus sp.)<400>45gtgcttgcac caactga 17<210>46<211>16<212>DNA<213>鏈球菌屬(Streptococcus sp.)<400>46atggacctgc gttgta 16<210>47<211>15<212>DNA<213>鏈球菌屬(Streptococcus sp.)<400>47acgcgtaggt aacct 15<210>48<211>13<212>DNA<213>明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)<400>48gtgtgatgaa ggc 13<210>49<211>16
<212>DNA<213>明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)<400>49cggtaccata ccagaa 16<210>50<211>18<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>50aaaagatggc cactgaat18<210>51<211>18<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>51ggaggctctt cggagctt18<210>52<211>19<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>52ccgaaagtcg catgactgg 19<210>53
<211>17<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>53tggtcaatac ccatacg 17<210>54<211>19<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>54tacccataag aagtgacgg 19<210>55<211>16<212>DNA<213>巨球形菌屬(Megasphaera sp.)<400>55cctgcccttc agatgg 16<210>56<211>16<212>DNA<213>梳狀菌屬(Pectinatus sp.)<400>56tgacggtacc ctgtta 16<210>57
<211>20<212>DNA<213>梳狀菌屬(Pectinatus sp.)<400>57gtagtgttaa taccactatt 20<210>58<211>20<212>DNA<213>梳狀菌屬(Pectinatus sp.)<400>58ctatagccaa taagtatagt 20<210>59<211>17<212>DNA<213>發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas sp.)<400>59gaataactag gggaaac 17<210>60<211>17<212>DNA<213>發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas sp.)<400>60gagctaatac cgtatga 17<210>61
<211>18<212>DNA<213>耐久腸球菌(Enterococcus durans)<400>61aaagaaaagg agtggcga 18<210>62<211>19<212>DNA<213>耐久腸球菌(Enterococcus durans)<400>62acgctttttc tttcaccgg 19<210>63<211>18<212>DNA<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)<400>63aaggttggta cttgtacc 18<210>64<211>18<212>DNA<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)<400>64actggatgag cagcgaac 18<210>65
<211>15<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的陽性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Positive ControlCaptuer Oligonucleotide)<400>65actcctacgg gaggc 15<210>66<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的陰性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Negative ControlCaptuer Oligonucleotide)<400>66ctaatcggct tagcgtag 18<210>67<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>67gagtttgatc ctggctcag 19<210>68<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>68gtattaccgc ggctgctg 18<210>69<211>100<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的對照探針序列(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Control Probe Sequence)<400>69gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcatgcc tacctaatcg cgatagcgta 60ggagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 100
<210>70<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的陽性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Positive ControlCaptuer Oligonucleotide)<400>70cctaatcgcg atagcgtagg20<210>71<211>16<212>DNA<213>短乳桿菌(Lactobacillus brevis)<400>71gggttgacgg tattta16<210>72<211>15<212>DNA<213>明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)<400>72tgcatagccg agttg 1權(quán)利要求
1.細(xì)菌檢測器具，用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，其特征在于，對象細(xì)菌是從下述(1)～(5)中所述的細(xì)菌中選擇的至少2種或2種以上的細(xì)菌，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。(1)屬于短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的細(xì)菌(2)屬于Lactobacillus lindneri的細(xì)菌(3)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌(4)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌(5)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，所述對象細(xì)菌還包括下述(6)～(19)中所述的細(xì)菌。(6)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌(7)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌(8)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌(9)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌(10)屬于Lactobacillus coryniformis的細(xì)菌(11)屬于彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的細(xì)菌(12)屬于德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的細(xì)菌(13)屬于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的細(xì)菌(14)屬于Lactobacillus malefermentans的細(xì)菌(15)屬于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群的細(xì)菌(16)屬于鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的細(xì)菌(17)屬于布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的細(xì)菌(18)屬于耐久腸球菌(Enterococcus durans)的細(xì)菌(19)屬于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的細(xì)菌
3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號1所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號2所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號3所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號4所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號7所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號8所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號9所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號71所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
5.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)Lactobacilluscoryniformis的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號10所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號11所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號12所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
6.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號13所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號14所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
7.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號16所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號17所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號18所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
8.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號19所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號20所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號21所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
9.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)Lactobacilluslindneri的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號22所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號23所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號24所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
10.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)Lactobacillusmalefermentans的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號25所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號26所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號27所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
11.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號28所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號29所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號30所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號31所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
12.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號32所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號33所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
13.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號34所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號35所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
14.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號36所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號37所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號38所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號39所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號40所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號41所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號42所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號43所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號44所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號45所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
15.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號46所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號47所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
16.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號48所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號49所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
17.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號50所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號51所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號52所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號53所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號54所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號55所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
18.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號56所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號57所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號58所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
19.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號59所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號60所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
20.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)耐久腸球菌(Enterococcus durans)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號61所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號62所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
21.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測器具，其為根據(jù)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號63所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號64所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
22.如權(quán)利要求1～21中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，所述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，并且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進(jìn)行反應(yīng)形成共價鍵。
23.細(xì)菌檢測器具，用于檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，其特征在于，含有屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌及/或?qū)儆谌樗釛U菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對應(yīng)的序列中的序列號72所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
24.細(xì)菌檢測方法，其為檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的方法，其特征在于，包括制備被檢試料中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、使所述探針和權(quán)利要求1～23中任一項(xiàng)所述的在細(xì)菌檢測器具的基板表面固定的寡核苷酸進(jìn)行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。
25.如權(quán)利要求24所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述被檢試料是食品。
26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述食品是麥芽酒精飲料。
27.細(xì)菌檢測試劑盒，其用于實(shí)施權(quán)利要求24～26中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測方法。
28.細(xì)菌檢測試劑盒，其為用于實(shí)施權(quán)利要求24～26中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測方法的試劑盒，其特征在于，包含所述雜交步驟及/或信號檢測步驟使用的試劑。
29.如權(quán)利要求28所述的細(xì)菌檢測試劑盒，其還包含所述探針制備步驟及/或所述核酸制備步驟使用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供用簡便操作可快速準(zhǔn)確地判斷混入被檢試料中的細(xì)菌的細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒。本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具是微陣列型器具，其中根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板表面。根據(jù)從被檢試料中制備的探針和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否發(fā)生雜交，可簡便、快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
文檔編號C12M1/34GK1926245SQ20058000611
公開日2007年3月7日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者兒玉由紀(jì)子, 畑中一成, 田中幸一, 中川浩子, 守屋彰悟, 小佐野薰 申請人:三得利株式會社, 日清紡織株式會社