專利名稱：檢測微生物的質(zhì)量保證體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的檢測的領(lǐng)域和可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品的定性檢查以及生產(chǎn)裝置的衛(wèi)生狀態(tài)的評(píng)定。
背景技術(shù)：
僅通過耗時(shí)的培養(yǎng)和隨之而來的擴(kuò)增來鑒定產(chǎn)品中的微生物需花費(fèi)長時(shí)間，其中所需結(jié)果要在1-2周后才得出。例如對(duì)細(xì)菌、真菌和單細(xì)胞藻類要在各有利的營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。
在監(jiān)控中要檢查在成品中每單位體積有多少微生物和哪種微生物。這時(shí)特別關(guān)注的是會(huì)引起中間產(chǎn)品或成品有害污染的可繁殖的微生物。
經(jīng)典的方法例如是膜濾法，其中該樣品經(jīng)培養(yǎng)和過濾，并且微生物保留在膜上。在該膜上繁殖和鑒定該微生物。其它方法是載體樣品法(Standprobe)和有時(shí)也是PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法。但因?yàn)镻CR法對(duì)”裸”DNA會(huì)呈陽性，所以這時(shí)常會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的陽性結(jié)果。
所有這些方法的缺點(diǎn)在于，樣品的處理非常耗時(shí)，并且最快也得幾天至幾周后才能知結(jié)果。
己知方法的繼續(xù)研究例如導(dǎo)致一些方法，這些方法通過所謂的“直接表面熒光過濾器技術(shù)(DEFT)”可直接鑒定可過濾的產(chǎn)品如飲料中的活細(xì)胞，方法中將可連結(jié)在DNA上并阻斷RNA合成的熒光染料引入細(xì)胞中，并通過表面熒光顯微鏡術(shù)檢測該細(xì)胞(Kroll，R.；Methods in Molecular Biology；1995；46；S 113-121)。在EP 386051或DE 19841588中例如描述如何可通過應(yīng)用誘導(dǎo)體以在存活的微生物中形成某些酶并接著加入可通過與所形成的酶反應(yīng)而發(fā)生熒光的熒光劑并然后可進(jìn)行檢測而改型DEFT方法。但這種方法僅針對(duì)大腸菌或乳桿菌的檢測進(jìn)行描述的。此外，在所有己知的變型中的DEFT-方法僅應(yīng)用于可過濾的產(chǎn)品，這是一個(gè)大的缺點(diǎn)。在該方法中還存在檢出極限問題。每單位表面積必須至少數(shù)出10-1000個(gè)細(xì)菌。但在樣品中這樣高的微生物數(shù)不符合現(xiàn)今的衛(wèi)生要求，以致需要一種能快速而又無需高耗費(fèi)地檢測出樣品中較少量的微生物的體系。
對(duì)不可過濾的產(chǎn)品，在現(xiàn)有技術(shù)中存在一種方法，該方法通過就地與發(fā)熒光的核酸探針相雜交以檢測特定的微生物。稱為“FISH-熒光就地雜交法”的這種方法可用于檢測和定位細(xì)胞中的各類核酸。借助于標(biāo)記的RNA-探針或DNA-探針進(jìn)行與染色體中存在的DNA/RNA的分子雜交。(FISH；Amann，R.L.，W.Ludwig und K.-H.Schleifer，1995.Phylogenetic identificationand in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbial.Rev.59，S.143-169；也可參看DE 10160666)。該探針的特定雜交是通過熒光顯微鏡技術(shù)證實(shí)，如描述于DE 19936875中。
該FISH-技術(shù)基于在細(xì)菌細(xì)胞中存在某種分子，該分子由于其在進(jìn)化過程中的極其重要的功能僅很少突變16S和23S核蛋白體核糖核酸(rRNS)。該兩者是核糖體的成分，即蛋白生物合成的位點(diǎn)，并且由于其到處生長的蔓延、其大小和其結(jié)構(gòu)和功能性常數(shù)可用作特異性標(biāo)記。因此可應(yīng)用rRNA數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建種類特異和種屬特異的基因探針。這時(shí)可相互比較所有可用的rRNA序列，并擬定某些序列位置探針，其特異地檢測一種細(xì)菌類、細(xì)菌種屬或細(xì)菌族。
在FISH-技術(shù)中，將在核糖體的靶序列上的某區(qū)域進(jìn)行互補(bǔ)的基因探針引入該細(xì)胞中。該基因探針通常是小的即16-20個(gè)堿基長度的單股脫氧核糖核酸段，并對(duì)準(zhǔn)對(duì)細(xì)菌類或細(xì)菌族是典型的靶區(qū)。如果熒光標(biāo)記的基因探針在細(xì)菌細(xì)胞中找到靶序列，則在其上結(jié)合，并該細(xì)胞由于其熒光就可在熒光顯微鏡中檢測。
但研究證明，在此方法中會(huì)由于大的種群波動(dòng)出現(xiàn)取樣時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)問題。這里還存在檢出極限的困難，因?yàn)檫@里每單位面積必須至少數(shù)出10-1000個(gè)細(xì)菌，以得到有說服力的結(jié)果。但在樣品中這樣高的微生物數(shù)目不符合現(xiàn)今的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。
雖然按國際藥典(歐洲藥典)＜100CFU/g的檢出極限還是合格的并對(duì)產(chǎn)品銷售是足夠的，但現(xiàn)今工業(yè)生產(chǎn)商和用戶期望低得多的檢出極限或現(xiàn)今對(duì)產(chǎn)品的衛(wèi)生要求是如此高，以使檢出極限＜10CFU/g是不可避免的，并應(yīng)力求檢出極限為＜1CFU/g。
用于檢測和定量微生物的方法必需是越來越靈敏和操作更合意，以對(duì)盡可能多的不同微生物滿足其具有高效的、低檢出極限和低耗費(fèi)的快速檢測方法的要求。如果首先僅進(jìn)行“篩除檢驗(yàn)(Abwesenheitstest)”(是/否-檢驗(yàn))和在確定分類前檢驗(yàn)在樣品中是否含有主要微生物，則這常常是足夠的。如果對(duì)不同的微生物必需應(yīng)用許多檢測方法或必需從市場上提供的不同方法中選用各最有效的，則就太耗時(shí)和要求太多的實(shí)驗(yàn)室工作量。
本發(fā)明的目的在于提供一種體系，其既可檢驗(yàn)可過濾的也可檢驗(yàn)不可過濾的樣品和產(chǎn)品，并可通過快速方法定量檢測不同的存活的和死亡的微生物。本體系在所選的樣品量中以＜10CFU/g的檢出極限檢測微生物。該體系不僅應(yīng)特異地用于生物，也對(duì)樣品和產(chǎn)品中的微生物提供一般檢測，用這體系也可檢測生產(chǎn)設(shè)備的衛(wèi)生狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于檢測可繁殖的微生物的質(zhì)量保證體系，其包括a)一種按國際藥典(例如歐洲藥典)、食品法規(guī)、化妝品規(guī)定或按市場通用的間接方法如測定微生物生長時(shí)產(chǎn)生的CO2的間接方法，在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)相當(dāng)于8-24小時(shí)的“過夜培養(yǎng)”以在樣品中濃集微生物的體系，b)用于檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中的存活的、受損的或死亡的微生物的試劑盒(來自英語＝組裝合，組裝套)，其包括i)至少一種試劉，其含有一種誘導(dǎo)體和一種在活細(xì)胞情況下導(dǎo)致形成某種酶的熒光劑，該酶通過與特異性熒光劑反應(yīng)釋放出可檢測的熒光色素，ii)至少一種經(jīng)就地雜交的用于檢測微生物的核酸探針，其中該核酸探針結(jié)合在熒光標(biāo)記物上，其對(duì)可繁殖的微生物的檢出極限達(dá)到＜10CFU/g。
在通常的檢驗(yàn)方法中，一般取樣為0.1g和最大為1g，并進(jìn)行檢驗(yàn)。這時(shí)出現(xiàn)極限的統(tǒng)計(jì)問題，并在理想情況下應(yīng)檢驗(yàn)盡可能大的試樣體積。但通常的檢驗(yàn)方法僅可取上述數(shù)量級(jí)的樣品量。
以“過夜培養(yǎng)”的培養(yǎng)相應(yīng)于在國際藥典、食品法、化妝品規(guī)定所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。過夜培養(yǎng)特別是指將樣品培養(yǎng)8-24小時(shí)，優(yōu)選10-20小時(shí)，尤其是12-15小時(shí)。該培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件取自有關(guān)法律文本。但用于培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法的微小偏差例如在營養(yǎng)介質(zhì)成分的濃度、溫度或其它參數(shù)方面的偏差應(yīng)包括在本發(fā)明的質(zhì)量保證體系中。在法律文本中的可能改變也可用于本發(fā)明的體系。但該條件必需各以文件證明，由此可確定可繁殖微生物的檢出極限。因此使用的樣品量是很重要的。
作為代替國際藥典、食品法、化妝品規(guī)定所規(guī)定方法的標(biāo)準(zhǔn)方法本發(fā)明也可應(yīng)用市場通用的間接濃集方法。一種示例性的間接方法是通過在膜上吸附和在培養(yǎng)盒中的比色測定來測定微生物在生長時(shí)產(chǎn)生的CO2。該方法例如由BioMerieux公司以牌號(hào)BacT/ALERT市售。
該方法是非常靈敏的，并至遲在過夜培養(yǎng)后表明可能的污染，因此使分析結(jié)果最遲在24小時(shí)后得出。
在此方法中，在營養(yǎng)介質(zhì)安瓿中加入經(jīng)消毒的待檢驗(yàn)(需要時(shí)經(jīng)稀釋)的材料。該安瓿置于可加熱的培養(yǎng)盒內(nèi)的樣品槽中。
該安瓿配有通過與檢測盒相連接的透氣膜。在檢測盒中存在有指示劑，該指示劑通過膜吸附細(xì)胞生長時(shí)形成的CO2，并用比色法測定在培養(yǎng)盒中該指示劑的突變。
對(duì)每個(gè)樣品槽所得的測量信號(hào)以電子學(xué)方法記錄并轉(zhuǎn)換成“生長曲線”(時(shí)間與CO2含量的關(guān)系)。
該方法現(xiàn)今己在醫(yī)學(xué)中用于血庫樣品、保存的血液、骨、組織件和其它與醫(yī)學(xué)相關(guān)的材料的消毒監(jiān)控。
對(duì)本發(fā)明樣品的微生物的質(zhì)量保證的應(yīng)用尚未描述和按本發(fā)明檢驗(yàn)。
該方法適用于所有水可混溶和水不可混溶的液體以及適于乳狀液、含蠟的珠光劑、油、膏和固體中。
將通常1g定義量的待檢樣品在消毒條件下放入液體盒中，并在15--40℃，優(yōu)選在30℃下培養(yǎng)。只要該樣品含有細(xì)菌，則發(fā)育繁殖并釋放CO2。在1-100個(gè)細(xì)菌/ml的侵襲情況下，經(jīng)約10個(gè)增殖周期后和約自2小時(shí)起可記錄形成的氣體。在陽性情況下，借助于b i)或b ii)的試劑和相應(yīng)的方法可立刻繼續(xù)分析該材料。一旦出現(xiàn)有污染的陽性指示，就可證實(shí)該污染的類型。
按本發(fā)明，將1-10g，優(yōu)選5g待檢樣品或待檢產(chǎn)品懸浮于100-1000ml標(biāo)準(zhǔn)溶液中，并經(jīng)過夜培養(yǎng)進(jìn)行濃集。這種處理常常是需要的，因?yàn)樵摌悠繁旧碛袝r(shí)可具有對(duì)微生物的阻礙作用。為能檢測在較長貯存時(shí)會(huì)有損于產(chǎn)品在衛(wèi)生要求方面的所需質(zhì)量的非常少的細(xì)菌種群，需要一種在樣品經(jīng)稀釋后仍可檢測該細(xì)菌的方法。但這時(shí)存在檢出極限的問題，因?yàn)橄♂尯笤撐⑸锏目倲?shù)對(duì)立即應(yīng)用檢驗(yàn)方法DEFT或FISH是太少了，以致不可進(jìn)行篩除檢測。對(duì)質(zhì)量保證體系的第一要求即提供一種適于可繁殖的微生物的篩除檢測或換句話說提供一種進(jìn)行適于可繁殖的微生物的是/否-測定方法它是通過過夜培養(yǎng)達(dá)到檢出極限＜10CFU/g而給出的。特別是通過應(yīng)用由在100-1000ml標(biāo)準(zhǔn)溶液中的5-10g樣品的樣品制備而達(dá)到＜1CFU/g或＜1CFU/5g的檢出極限。這明顯低于國際藥典中所要求的＜100CFU/g的最小檢出極限。所以符合用戶和工業(yè)生產(chǎn)的許多產(chǎn)品所要求的現(xiàn)今的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檠邪l(fā)了一種可快速檢測可繁殖微生物的最少種群的質(zhì)量保證體系。
通過在試劑盒中組合兩種檢測方法，應(yīng)用者可直接和同時(shí)檢驗(yàn)不同的樣品、中間產(chǎn)品和成品。因此在生產(chǎn)過程中可在每一階段對(duì)不涉及濃度的中間產(chǎn)品檢測微生物的存在。
在本發(fā)明中微生物的檢測一方面意指“是/否-測定”以回答在待檢驗(yàn)的樣品或產(chǎn)品中是否存在有害的微生物，另一方面意指接著對(duì)各檢驗(yàn)的樣品或產(chǎn)品準(zhǔn)確鑒定該待檢測的微生物。提供何種檢測，與該樣品或產(chǎn)品的濃度有關(guān)，并由此與其中要應(yīng)用的試劑和待應(yīng)用的核酸探針有關(guān)。
本發(fā)明中的術(shù)語樣品和產(chǎn)品意指中間產(chǎn)品和成品。此外，術(shù)語“樣品”也可意指中間產(chǎn)品或成品的分額或部分，例如按各限定的反應(yīng)時(shí)間取的非均相產(chǎn)品或中間產(chǎn)品的液態(tài)或固態(tài)部分特別用于監(jiān)控整個(gè)制備過程。本發(fā)明中的“樣品”例如也可意指對(duì)生產(chǎn)裝置清洗過程的殘余物。本發(fā)明中的成品意指適于用戶的成品和用于銷售和用于制備適于用戶的成品的粗制產(chǎn)品。
樣品也可來自工業(yè)裝置經(jīng)消毒后檢查其有效性。工業(yè)裝置通常用蒸汽或化學(xué)介質(zhì)(次氯酸鹽或過氧化氫)進(jìn)行消毒。該有效性檢查至今主要由經(jīng)典方法進(jìn)行。但有效性常基于經(jīng)驗(yàn)值，因?yàn)榻?jīng)典檢查太耗費(fèi)。用本發(fā)明的體系和方法可快速和高效地檢查消毒的結(jié)果。
在本發(fā)明中“可過濾的”樣品或產(chǎn)品意指可通過0.45μm孔徑的過濾器的樣品或產(chǎn)品。其不應(yīng)含有油滴或固體顆粒等。
在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，使用由本發(fā)明的試劑盒的b i)試劑用于可過濾的液態(tài)樣品和產(chǎn)品或待檢驗(yàn)樣品和產(chǎn)品的可過濾的液態(tài)組成部分以檢測存活的微生物。也可間接檢測死亡的微生物。在此檢測方法中，通過吸收特異性物質(zhì)可研究從誘導(dǎo)到形成一種酶的代謝途徑。該誘導(dǎo)通過包含誘導(dǎo)劑的試劑和熒光試劑而發(fā)生，該試劑可穿過細(xì)胞膜，由此在細(xì)胞內(nèi)該誘導(dǎo)酶可形成高熒光性化合物。沒有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞或有效的代謝不能形成熒光性反應(yīng)產(chǎn)品，并不顯示熒光。通過應(yīng)用其它著色試劑，該試劑在死亡細(xì)胞上濃集，因通過誘導(dǎo)酶不能發(fā)生反應(yīng)，就可區(qū)分死亡細(xì)胞和存活細(xì)胞。
首先在通過熒光反應(yīng)產(chǎn)品形成酶時(shí)的檢測是確證的，這是這種代謝途徑起作用，并由此將這種細(xì)胞歸因于可起作用的代謝和可繁殖性的。經(jīng)約1小時(shí)就可出結(jié)果。為從可過濾的樣品或產(chǎn)品中分離該細(xì)胞，優(yōu)選利用膜過濾器，特別是孔大小為0.2-1.20μm，優(yōu)選0.45μm的聚碳酸酯膜。如有可能，可將待檢驗(yàn)的樣品和產(chǎn)品用合適方法進(jìn)行液化。將需求的酶的誘導(dǎo)劑加到該樣品中，并接著加入一種熒光試劑，它在與待測的和誘導(dǎo)的酶反應(yīng)而顯示出熒光。
例如用于檢測通過半乳糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的半乳糖苷酶的雙半乳糖苷熒光素屬此種特異性熒光試劑。用這種誘導(dǎo)劑和熒光試劑可檢測乳桿菌素和大腸桿菌類如大腸桿菌、氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌、腸桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬、假單胞菌類和其它與工藝水相關(guān)的細(xì)菌。
按本發(fā)明，4-甲基傘形酮-衍生物屬熒光劑，其是特別用于測定某些酶而衍生的。例如為檢測脂酶或酯酶應(yīng)用4-甲基傘形酮庚酸酯。為檢測半乳糖苷酶也可應(yīng)用4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷。然后該溶液經(jīng)所述微過濾器過濾，并用表面熒光顯微鏡進(jìn)行熒光光學(xué)檢驗(yàn)。
在另一實(shí)施方案中，將指示劑和熒光劑加到過濾器的殘?jiān)小?br> 在另一實(shí)施方案中，使用試劑盒中的b ii)的核酸探針不僅對(duì)可過濾的液態(tài)樣品和產(chǎn)品以及不可過濾的樣品和產(chǎn)品以及可濾的和不可過濾的樣品和產(chǎn)品的混合物進(jìn)行檢測存活的微生物。
本發(fā)明中的核酸探針可以是DNA-探針或RNA-探針，其通常包含12-1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選12-500，更優(yōu)選12-200，特別優(yōu)選12-50-和15-40，最優(yōu)選17-25個(gè)核苷酸。該核酸探針的選擇是根據(jù)在待檢測的微生物中是否存在互補(bǔ)序列為要點(diǎn)。通過選擇一個(gè)限定的序列可由此檢測包括細(xì)菌類、細(xì)菌屬或整個(gè)細(xì)菌族。對(duì)15個(gè)核苷酸的探針互補(bǔ)應(yīng)超過100％的序列。在有多于15個(gè)核苷酸的低聚核苷酸的情況下，允許1至多個(gè)缺失成對(duì)位置(Fehlpaarungsstellen)。
本發(fā)明試劑盒的核酸探針的情況是可以通過非特異性的核酸探針檢測非特異性的微生物。由此可以說明常提及的在樣品或產(chǎn)品中是否存在有害微生物，而不準(zhǔn)確地鑒定該微生物。
雜交條件和雜交的時(shí)間長短各根據(jù)產(chǎn)品并取決于核酸探針對(duì)待檢驗(yàn)的樣品的適配。
作為適于核酸探針的可檢測標(biāo)記物可應(yīng)用例如產(chǎn)生熒光的基團(tuán)如CY2(由Amersham Life Sciences公司得到，Arlington Heights，USA)、CY3(也可由Amersham Life Sciences公司得到)、CY5(也可由Amersham Life Sciences公司購得)、FITC(Molecular Probes公司，Eugene，USA)、FLUOS(由RocheDiagnostics GmbH公司得到，Mannheim，德國)、TRITC(由Molecular Probes公司得到，Eugene，USA)、6-FAM或FLUOS-PRIME。
本發(fā)明的質(zhì)量保證體系可用于檢測革蘭氏陽性細(xì)菌和/或革蘭氏陰性細(xì)菌和/或酵母和/或霉菌和/或藻類。
除與環(huán)境相關(guān)的細(xì)菌外，與醫(yī)學(xué)相關(guān)的細(xì)菌如葡萄球菌、鏈球菌、炭疽病菌、破傷風(fēng)菌、乳酸菌、白喉菌、豬丹毒菌或枯草桿菌也屬革蘭氏陽性菌。同樣除與環(huán)境相關(guān)的細(xì)菌外，醫(yī)學(xué)相關(guān)的細(xì)菌如淋球菌、腦膜炎球菌、軍團(tuán)菌、大腸菌、斑疹傷寒菌、Rurbakterien和鼠疫菌也屬革蘭氏陰性菌。特別是工藝廢水特有的細(xì)菌如假單胞菌、伯克霍爾德氏菌、Raoultellen、克雷白氏桿菌、棒狀糖菌和芽孢桿菌屬屬環(huán)境相關(guān)和與人類有關(guān)的細(xì)菌。
在成品的微生物釋放中，通過本發(fā)明方法用試劑盒的b i)試劑可得出在按需接種過疫苗的產(chǎn)品中微生物的重新檢出率。除細(xì)菌外，通過應(yīng)用本發(fā)明方法也可檢出酵母和霉菌。作為常用的用于按需接種疫苗的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌，其部分也在國際藥典中提及并檢測假單胞菌銅綠菌素、大腸桿菌、陰溝腸桿菌屬、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、沙門氏菌屬、枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明的另一目的是應(yīng)用本發(fā)明的質(zhì)量保證體系以檢測微生物和并以定性檢查可過濾的和/或不可過濾的樣品或產(chǎn)品以及用于評(píng)價(jià)生產(chǎn)裝置的衛(wèi)生狀態(tài)。待檢驗(yàn)的可過濾的和/或不可過濾的樣品或產(chǎn)品選自粗制產(chǎn)品、化妝產(chǎn)品、藥物制劑、食品、食品補(bǔ)充劑、紡織助劑、洗滌劑及清潔劑以及顏料和漆。
本發(fā)明中的粗制產(chǎn)品意指用于制備適于用戶的成品的產(chǎn)品。這里包括表面活性劑、油體、乳化劑、珠光蠟、增稠劑、增濃劑、涂脂劑、穩(wěn)定劑、聚合物、硅化合物、油脂、蠟、卵磷脂、磷脂、UV-光防護(hù)因子、抗氧化劑、除臭劑、止汗劑、止屑劑、成膜劑、膨脹劑、殺蟲劑、自成褐色劑(Selbstbraeuner)、酪氨酸酶抑止劑(去著色劑)、水溶助長劑、增溶劑、防腐劑、香料油、不可過濾的O/W乳化劑和W/O乳化劑。工藝水也視為粗制產(chǎn)品。
化妝產(chǎn)品可例如包括軟膏、霜、洗液、香波、護(hù)發(fā)劑、淋浴凝膠、洗浴添加劑、裝飾性化妝品如化妝油、眼瞼膏、唇膏、指甲油等。該藥物制劑可以汁、霜狀、軟膏、洗液、懸浮液、酊劑、滴劑等形式存在。
食品優(yōu)選是乳或乳制品、烤制品或肉制品、飲料如礦泉水、啤酒、汽水或果汁。作為食品補(bǔ)充劑優(yōu)選是維生素溶液、不飽和脂肪酸將別是共軛的亞油酸、防腐劑或抗氧化劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種應(yīng)用本發(fā)明的質(zhì)量保證體系來檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中的微生物的方法，其中a)在按國際藥典、食品法規(guī)、化妝品規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)相當(dāng)于8-24小時(shí)的“過夜培養(yǎng)”以濃集微生物，b)應(yīng)用試劑盒以檢測可過濾的和/或不可過濾的樣品或產(chǎn)品中的存活的、受損的或死亡的微生物，其中，使經(jīng)濃集的樣品i)用含誘導(dǎo)體和熒光劑的試劑培養(yǎng)，該試劑在細(xì)胞中誘導(dǎo)形成特定的酶，并因此由熒光劑形成產(chǎn)生熒光的化合物，和/或ii)細(xì)菌固定后，該細(xì)菌和加有熒光標(biāo)記物的核酸探針共培養(yǎng)，以導(dǎo)致雜交，和c)檢測樣品的熒光，并與細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)聯(lián)，這時(shí)細(xì)胞的數(shù)目是可測定的，并在使用b)i)時(shí)可區(qū)分死亡細(xì)胞和存活細(xì)胞。
在本發(fā)明中，細(xì)菌的“固定”意指一種使細(xì)菌殼適于核酸探針穿透的處理。通常應(yīng)用乙醇來固定。但也可使用甲醇、醇的混合物、低百分?jǐn)?shù)的低聚甲醛溶液或稀釋的甲醛溶液、酶處理等。
本發(fā)明中，“雜交”是指經(jīng)固定的細(xì)菌用熒光標(biāo)記的核酸探針培養(yǎng)。由低聚核苷酸和其上結(jié)合的標(biāo)記物組成的核酸探針可穿透細(xì)胞殼，并在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合在與核酸探針相當(dāng)?shù)陌行蛄猩?。本發(fā)明的核酸探針可以使用各種雜交溶液。各種有機(jī)溶劑可以0-80％的濃度使用。通過保持嚴(yán)格的雜交條件，可確保該核酸探針實(shí)際上也與靶序列雜交。本發(fā)明中的中等條件是例如在雜交緩沖液中的0％的甲酰胺，如下面所述的。本發(fā)明中的嚴(yán)格條件是如在雜交緩沖液中的20-80％的甲酰胺。
典型的雜交溶液含0-80％的甲酰胺，優(yōu)選含20-60％的甲酰胺，特別優(yōu)選含35％的甲酰胺。此外，該雜交溶液的鹽濃度為0.1-1.5mol/l，優(yōu)選為0.5-1.0mol/l，更優(yōu)選為0.7-0.9mol/l，特別優(yōu)選為0.9mol/l，其中，鹽優(yōu)選為氯化鈉。該雜交溶液通常還含有洗滌劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)，其濃度為0.001-0.2％，優(yōu)選濃度為0.005-0.05％，更優(yōu)選為0.01-0.03％，特別優(yōu)選濃度為0.01％。為緩沖該雜交溶液，可應(yīng)用各種化合物如Tris-HCl、檸檬酸鈉、PIPES或HEPES，其通常的濃度為0.01-0.1mol/l，優(yōu)選為0.01-0.08mol/l，pH-值范圍為6.0-9.0，優(yōu)選7.0-8.0。本發(fā)明特別優(yōu)選的雜交溶液的實(shí)施方案含有0.02mol/l Tris-HCl，pH為8.0。
探針的濃度可按標(biāo)記和所預(yù)計(jì)的靶結(jié)構(gòu)的數(shù)目而有很大波動(dòng)。為進(jìn)行快速而有效地雜交，該探針量應(yīng)超過靶結(jié)構(gòu)的數(shù)目幾個(gè)數(shù)量級(jí)、但在熒光就地-雜交(FISH)情況下要注意，經(jīng)熒光標(biāo)記的雜交探針的量太高會(huì)導(dǎo)致本底熒光增加。因此探針量應(yīng)為0.5ng/l-500ng/l，優(yōu)選為1.0ng/l-100ng/l，特別優(yōu)選為1.0-50ng/l。
雜交的時(shí)間通常尚10分鐘-12小時(shí)；優(yōu)選該雜交進(jìn)行約1.5小時(shí)。該雜交溫度優(yōu)選為44--48℃，特別優(yōu)選46℃，這時(shí)雜交溫度的參數(shù)以及在雜交溶液中的鹽和洗滌劑的濃度可依據(jù)核酸探針，特別是其與在待檢測的細(xì)胞中的靶序列的互補(bǔ)性的長度和程度而進(jìn)行最佳化。實(shí)現(xiàn)雜交后，將該未經(jīng)雜交的和過量的核酸探針分子用通常的洗滌溶液去除或洗去。需要時(shí)該洗滌溶液可含0.001-0.1％，優(yōu)選濃度為0.01％的洗滌劑如SDS，以及濃度為0.001-0.1mol/l，優(yōu)選0.01-0.05mol/l，特別優(yōu)選0.02mol/l的Tris-HCl。該洗滌溶液通常還含有NaCl，其濃夜按所需嚴(yán)格條件為0.003-0.9mol/l，優(yōu)送0.01-0.9mol/l。該洗滌溶液還可含濃度不大于0.01mol/l的EDTA，該濃度優(yōu)選為0.005mol/l。此外，在洗滌溶液中還可加入緩沖溶液，該緩沖溶液相應(yīng)于在較小鹽濃度下的雜交緩沖液。
該未結(jié)合的核酸探針分子的“洗去”通常在30--50℃，優(yōu)選44--50℃，特別優(yōu)選46℃下進(jìn)行10-40分鐘，優(yōu)選15分鐘。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒時(shí)的結(jié)果在24-48小時(shí)后得出。接著借助于顯微鏡，優(yōu)選表面熒光顯微鏡以光學(xué)檢測各經(jīng)熒光試劑或熒光標(biāo)記物處理過的樣品或產(chǎn)品。
實(shí)施例實(shí)施例1用所述組合方法對(duì)可過濾產(chǎn)品的定性分析分析時(shí)間通常為10-24小時(shí)。
1.樣品制備所有工作必需在消毒/無菌條件下進(jìn)行。
在無菌條件下稱取10g待檢驗(yàn)的樣品，并按歐洲藥典2.6.12或2.6.13將該樣品均勻混合在90ml的THLCL-肉湯中。該溶液經(jīng)0.45μm的膜過濾器無菌過濾，棄去濾液。該過濾器經(jīng)200ml的無菌緩沖溶液再?zèng)_洗。在該過濾器上滯留了所有的在10g產(chǎn)品中所含的細(xì)菌。
接著取下過濾器并將其完全轉(zhuǎn)移到含20ml CASO-肉湯(用于細(xì)菌濃集)或Sabouraud肉湯(用于酵母和霉菌的濃集)的無菌容器中(典型的過夜培養(yǎng))或轉(zhuǎn)移到BacT/ALERT瓶(含20ml各自肉湯的Lym-瓶)中。該BacT/ALERT體系不適合于眾所周知的易于自催化釋放CO2同時(shí)不存在微生物相互作用的樣品。在大部分化妝品原料和工業(yè)上使用的原料情況下均非這種情況。
這樣制備的樣品在30±5℃下培養(yǎng)過夜。有懷疑有緩慢生長的有機(jī)體污染時(shí)一般可先富集8小時(shí)也可持續(xù)24小時(shí)。
2.濃集培養(yǎng)的光學(xué)檢查或Bact Alert體系的評(píng)價(jià)只要通過在濃集肉湯中的微生物-生長出現(xiàn)混濁或在Bact/ALERT體系中測到有CO2釋出，則該樣品再經(jīng)FISH技術(shù)分析，并開始粗略分類成革蘭氏陽性和革蘭氏陰性有機(jī)體，也許直到能分析到細(xì)菌的種類(參看實(shí)施例2不可過濾的產(chǎn)品)。當(dāng)在濃集中未發(fā)現(xiàn)生長或在Bact/ALERT-體系中無CO2釋出，則用DEFT方法驗(yàn)證結(jié)果。
3.DEFT檢查微生物的存在用無菌注射器由濃集培養(yǎng)物中取出10ml，其相當(dāng)于5g原始產(chǎn)品量，并經(jīng)0.45μm的聚碳酸酯過濾器過濾。將其上存在有濃集的細(xì)胞的聚碳酸酯過濾器置于含熒光色素的DEFT-墊上，并在20--37℃下于濕腔中培養(yǎng)8-15分鐘。這時(shí)色素從墊轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上，而該聚碳酸酯過濾器的本底并未著色。
經(jīng)培養(yǎng)后，從墊上取下該過濾器，并置于載片上。接著用固定液體停止該著色反應(yīng)。
接著在100倍放大的熒光顯微鏡中檢查該標(biāo)本的經(jīng)著色的細(xì)胞的存在。這時(shí)完全掃描該過濾器。該過濾器的背景必需是暗的。該得出的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照必需提供明確的結(jié)果。
4.結(jié)果如果檢測到紅細(xì)胞，則該標(biāo)本混入有己死亡的細(xì)胞。通常這種細(xì)胞來自環(huán)境，并對(duì)標(biāo)本的質(zhì)量不重要。對(duì)腸胃外-應(yīng)用的產(chǎn)品除外。這時(shí)該標(biāo)本應(yīng)不含紅的也不含綠的產(chǎn)生熒光的細(xì)胞體。
如果檢測到綠細(xì)胞，則涉及在產(chǎn)品中存在可繁殖的細(xì)胞。該產(chǎn)品是定級(jí)為微生物污染。
因?yàn)榫G細(xì)胞存在時(shí)通過前面的濃集步驟不能推斷在原始產(chǎn)品中的細(xì)菌數(shù)，所以該方法應(yīng)列為是/否法或按現(xiàn)有的相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)列為半定量法。這通常對(duì)定性評(píng)定是足夠的，因?yàn)楦匾哪康氖恰白C實(shí)沒有可繁殖的細(xì)菌”。
5.在DEFT方法中用菌種檢查·樣品制備類似于1進(jìn)行(產(chǎn)品樣品Texapon NSO，IMQ 418935)·一起進(jìn)行所應(yīng)用的濃集-介質(zhì)的陰性對(duì)照·在產(chǎn)品中存在下放入用于檢測菌種的1個(gè)樣品系列-加0.2ml菌種溶液(相當(dāng)于10-100KBE/10ml的稀釋液)到20ml樣品溶液中-產(chǎn)品或陰性對(duì)照，并均勻混合·用過濾法(HIPCO-法)將用于經(jīng)典檢測細(xì)菌數(shù)的10ml和該過濾器在CASO-介質(zhì)中于30--35℃下培養(yǎng)3-5天·放入用于濃集的其余的量并DEFT24小時(shí)·類似于第1點(diǎn)進(jìn)行濃集和評(píng)定試驗(yàn)·無生長渾濁或CO2形成-DEFT檢查5.1結(jié)果-濃集后菌種的檢測

實(shí)施例2用所述組合方法對(duì)不可過濾產(chǎn)品的定性分析1.樣品制備所有工作必需在消毒/無菌條件下進(jìn)行。
在無菌條件下稱取10g待檢驗(yàn)的樣品，并按歐洲藥典2.6.12或2.6.13將該樣品用合適輔助工具，優(yōu)選一種市售的細(xì)菌分離器(Stomacher Gerat)均勻混入90ml的THLCL-肉湯中。從該懸浮粉中移取相當(dāng)于1g待檢驗(yàn)樣品的10ml樣品到100ml CASO或Sabouraud-肉湯中。
也可將10ml懸浮物轉(zhuǎn)移到BacT/ALERT瓶(含20ml各自肉湯的Lym-瓶)中和只要該樣品不易自催化釋出CO2就加到該BacT/ALERT體系中。
該樣品在30--35℃下培養(yǎng)過夜即最大至24小時(shí)，以使微生物生長。
2.濃集培養(yǎng)物的光學(xué)檢查或Bact/ALERT體系的評(píng)定只要檢測到微生物污染(肉湯-渾濁或在Bact/ALERT體系中釋出CO2)，則進(jìn)行定性的FISH-檢驗(yàn)，并開始區(qū)分革蘭氏-陽性細(xì)胞和革蘭氏-陰性細(xì)胞，這已可給出污染源的首次證實(shí)。對(duì)細(xì)菌種類的另一種區(qū)分可用選擇性介質(zhì)涂片或以PCR方法進(jìn)行。
3.實(shí)施用于檢查革蘭氏陽性微生物和革蘭氏陰性微生物的存在的FISH檢驗(yàn)(相應(yīng)于制造商資料)樣品制備·吸取100μl樣品到Eppendor容器中·滴入4滴溶液B2，并與樣品混合(＝固定)·每次吸取10μl經(jīng)固定的樣品到載片上的5個(gè)反應(yīng)腔中(區(qū)1，2，3以及陽性對(duì)照區(qū)和陰性對(duì)照區(qū))·在35--37℃下培養(yǎng)載片30-60分鐘(干燥)·吸取24μlBreaker溶液到反應(yīng)區(qū)3中，并在室濫下培養(yǎng)5-10分鐘·滴1滴Breaker溶液4到區(qū)3中和滴1滴Breaker溶液2到區(qū)2中，并在室溫下培養(yǎng)5-10分鐘·向VIT反應(yīng)器充以去離子水，并洗滌載片·在35--37℃下培養(yǎng)載片30-60分鐘(干燥)·滴入1滴溶液B2·在35--37℃下培養(yǎng)載片30-60分鐘與探針接觸·在區(qū)1，2和3中滴入1滴“陽性對(duì)照”·在陰性對(duì)照區(qū)滴入1滴“陰性對(duì)照”·在陽性對(duì)照區(qū)滴入1商“陽性對(duì)照G”·將載片推入VIT反應(yīng)器中，并在44--46℃下培養(yǎng)1.5-2小時(shí)洗滌·由反應(yīng)器中取出載片·向反應(yīng)器充以溫?zé)嵯礈炀彌_液，推入載片并在44--46℃下洗滌15-30分鐘·棄去洗滌緩沖液
·向反應(yīng)器充以去離子水，并再洗滌載片·在44--46℃下干燥載片15-120分鐘顯微鏡評(píng)定·用固定液體(停止劑)停止反應(yīng)·放上玻璃蓋片，并在熒光燈中于放大100倍的顯微鏡下以SCAN方法檢查·背景必需是暗的，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照必需提供明確結(jié)果，發(fā)紅光的細(xì)胞表明是存活的細(xì)菌結(jié)果區(qū)1＝檢測紅細(xì)胞＝革蘭氏陰性微生物(如假單胞菌屬，腸桿菌)區(qū)2＝檢測紅細(xì)胞＝革蘭氏陽性微生物(如乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、李斯特菌屬)區(qū)3＝檢測紅細(xì)胞＝革蘭氏陽性微生物(如葡萄球菌屬)在樣品中出現(xiàn)自發(fā)熒光時(shí)，必需重復(fù)該程序，并加入陽性對(duì)照D。然后該細(xì)胞著綠色，但其它方面未有改變。
結(jié)果的數(shù)據(jù)是按每g產(chǎn)品和按對(duì)產(chǎn)品特異的限值計(jì)算表示。
4.用FISH方法檢測菌株·樣品制備類似第1點(diǎn)進(jìn)行(產(chǎn)品樣品化合物，IMQ 322015)·在產(chǎn)品存在下加入1用于檢測菌株的樣品系列-加入菌株溶液(相當(dāng)于10-100KBE/1g樣品的稀釋液)到100ml CASO-肉湯中-產(chǎn)品樣品或陰性對(duì)照，并均勻混合·試樣的濃集和評(píng)定類似于第2點(diǎn)進(jìn)行

5.評(píng)定因?yàn)榧?xì)胞存在時(shí)通過前面的濃集步驟不能推斷在原始產(chǎn)品中的細(xì)菌數(shù)，所以該方法應(yīng)列為是/否法。這通常對(duì)定性評(píng)定是足夠的，因?yàn)楦匾哪康氖恰白C實(shí)可繁殖病菌的不存在”。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測可繁殖的微生物的質(zhì)量保證體系，其包括a)按國際藥典(例如歐洲藥典)、食品法規(guī)、化妝品規(guī)定或按市場通用的間接方法，在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)相當(dāng)于8-24小時(shí)的“過夜培養(yǎng)”以濃集在樣品中的微生物，b)用于檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中的存活的、受損的或死亡的微生物的試劑盒，其包括i)至少一種試劑，其含有誘導(dǎo)體和在有存活細(xì)胞情況下導(dǎo)致形成某種酶的熒光劑，該酶通過與特異性熒光劑反應(yīng)釋放出可被檢測的熒光色素，ii)至少一種經(jīng)就地雜交用于檢測微生物的核酸探針，其中該核酸探針結(jié)合在熒光標(biāo)記物上，其對(duì)可繁殖的微生物的檢出極限＜10CFU/g。
2.權(quán)利要求1的質(zhì)量保證體系，其特征在于，可繁殖的微生物的檢出極限＜1CFU/g。
3.權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，由b i)的試劑可用于可過濾的液態(tài)樣品和產(chǎn)品或待檢驗(yàn)的樣品和產(chǎn)品的可過濾的液態(tài)組成部分以檢出存活的微生物和間接檢測死亡的微生物。
4.權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，由b ii)核探針可用于檢測可過濾的液態(tài)樣品和產(chǎn)品以及不可過濾的樣品和產(chǎn)品以及可過濾和不可過濾的樣品和產(chǎn)品的混合物的存活的微生物。
5.權(quán)利要求1-4之一的質(zhì)量保證體系，其特征在于，用于檢測革蘭氏陽性細(xì)菌和/或革蘭氏陰性細(xì)菌和/或酵母和/或霉菌和/或藻類。
6.權(quán)利要求1-5之一的質(zhì)量保證體系的用途，其用于檢測微生物和定性檢查可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品以及評(píng)定生產(chǎn)裝置的衛(wèi)生狀態(tài)，其可檢出極限＜10CFU/g。
7.權(quán)利要求1-5之一的質(zhì)量保證體系的用途，其用于檢測微生物以定性檢查可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品，該產(chǎn)品選自粗制產(chǎn)品、化妝產(chǎn)品、藥物制劑、食品、食品補(bǔ)充劑、飲料、紗織助劑、洗滌劑和凈化劑以及顏料和漆。
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求1-5之一的質(zhì)量保證體系來檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中的微生物的方法，其中a)在按國際藥典、食品法規(guī)、化妝品規(guī)定或按市場通用的間接方法的標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)相當(dāng)于8-24小時(shí)的“過夜培養(yǎng)”以濃集微生物，b)應(yīng)用一種用于檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中的存活的、受損的或死亡的微生物的試劑盒，其中使經(jīng)濃集的樣品i)與一種含誘導(dǎo)體和熒光劑的試劑一起培養(yǎng)，該試劑在細(xì)胞中誘導(dǎo)形成特定的酶，并由熒光劑形成產(chǎn)生熒光的化合物，和/或ii)在細(xì)菌固定后，該細(xì)菌用配有熒光標(biāo)記物的核酸探針培養(yǎng)，以導(dǎo)致雜交，和c)檢測樣品的熒光，并與細(xì)胞數(shù)相關(guān)聯(lián)，這時(shí)細(xì)胞數(shù)是可測定的，并在使用b)i)時(shí)可區(qū)分死亡細(xì)胞和存活細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測可繁殖的微生物的質(zhì)量保證體系，其包括a)按國際藥典(例如歐洲藥典)、食品法規(guī)、化妝品規(guī)定或按市場通用的間接方法，在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)相當(dāng)于8－24小時(shí)的“過夜培養(yǎng)”以濃集在樣品中的微生物，b)用于檢測可過濾的和/或不可過濾的產(chǎn)品中存活的、受損的或死亡的微生物的試劑盒，其包括i)至少一種試劑，其含有誘導(dǎo)體和在活細(xì)胞情況下導(dǎo)致形成特異性酶的熒光劑，該酶通過與特異性熒光染色劑反應(yīng)釋放出可被檢測的熒光色素，ii)至少一種經(jīng)就地雜交的用于檢測微生物的核酸探針，其中該核酸探針結(jié)合在熒光標(biāo)記物上，其對(duì)可繁殖的微生物的檢出極限＜10CFU/g。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的質(zhì)量保證體系的應(yīng)用和使用本發(fā)明的質(zhì)量保證體系來檢測可過濾的和/或不可過濾的樣品或產(chǎn)品中的活的、受損的或死亡的微生物的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1934268SQ200580007790
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者貝蒂納·科普－霍爾特威希, 伊麗莎白·沃爾夫, 沃爾夫?qū)げ剪敔?申請(qǐng)人:考格尼斯知識(shí)產(chǎn)權(quán)管理有限責(zé)任公司