專利名稱：修飾的溶瘤病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的溶瘤小RNA病毒以及治療受試者的方法。
背景技術(shù)：
病毒與細(xì)胞表面分子的結(jié)合是病毒復(fù)制的啟動(dòng)步驟，因此，特異性細(xì)胞病毒受體是病毒組織嗜性的主要決定因素。衰變加速因子(DAF/CD55)是一種由四個(gè)細(xì)胞外短共有重復(fù)序列(SCRs)組成的70kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它起到多種人類腸病毒膜結(jié)合蛋白的作用，其包括幾種腸病毒(EV)、B型柯薩奇病毒(CVB)和柯薩奇病毒A21(CVA21)。通常，病毒單獨(dú)與DAF結(jié)合并不足以使腸病毒感染，與DAF的相互作用不誘導(dǎo)產(chǎn)生135S異常(A)顆粒，后者被認(rèn)為是侵入細(xì)胞的必要條件。DAF的腸病毒感染生理作用被認(rèn)為是一種膜結(jié)合受體，其結(jié)合感染性病毒并使其集中，通過與第二功能性細(xì)胞侵入受體的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞侵入的可能性增加。
類似許多其它的小RNA病毒受體(脊髓灰質(zhì)炎病毒、主要受體組(major receptor group)鼻病毒和B型柯薩奇病毒使用)，CVA21細(xì)胞內(nèi)化受體細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1/CD54)是免疫球蛋白超家族成員，其結(jié)合在圍繞五重軸的外殼峽谷內(nèi)。峽谷底病毒受體之間的相互作用使外殼不穩(wěn)定，并誘導(dǎo)病毒脫殼的前奏——構(gòu)象變化。
CVA21(Kuykendall)的原型病毒株是呼吸道感染的元兇，其既與ICAM-1結(jié)合，又與DAF結(jié)合。但是，CVA21原型病毒株與表面表達(dá)的DAF的結(jié)合不足以啟動(dòng)生產(chǎn)性感染或A-顆粒的形成，它與ICAM-1的相互作用是侵入細(xì)胞所必需的。當(dāng)表面DAF通過導(dǎo)向DAF非病毒性結(jié)合區(qū)的單克隆抗體(mAb)交聯(lián)時(shí)，在CVA21感染過程中觀察到DAF的更多功能，使得感染在不存在ICAM-1的情況下發(fā)生。
本申請(qǐng)人以前開發(fā)了使用識(shí)別ICAM-1的溶瘤病毒治療惡性腫瘤的新方法(WO01/37866)。通過在許多類型的癌細(xì)胞上使用多種A型柯薩奇病毒株，獲得了出色的治療結(jié)果。為了擴(kuò)大可能的癌癥治療并提供更有效的治療，本發(fā)明者已經(jīng)通過修飾和生物選擇獲得了新的溶瘤和殺傷特性提高的溶瘤病毒。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
優(yōu)選地，選擇的小RNA病毒能夠通過細(xì)胞上的衰變加速因子(DAF)溶解性地感染細(xì)胞。
優(yōu)選地，小RNA病毒選自腸病毒的原型病毒株和臨床分離物，所述的腸病毒包括柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒(Paraechovirus)、肝病毒和心病毒。
在一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選地，柯薩奇病毒為A或B型，更優(yōu)選為A型柯薩奇病毒，更加優(yōu)選地，柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A21。
在一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒為艾柯病毒。優(yōu)選地，艾柯病毒為艾柯病毒6、7、11、12、13或29。
在一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒為脊髓灰質(zhì)炎病毒。優(yōu)選地，脊髓灰質(zhì)炎病毒為1、2或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。
在一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒為鼻病毒。優(yōu)選地，鼻病毒是主要組鼻病毒或次要組鼻病毒的成員。
在一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒是通過下列方法生物選擇的將表達(dá)DAF、無ICAM-1的細(xì)胞系中的不能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒傳代，并回收選擇的能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒。
在另一個(gè)優(yōu)選方式中，小RNA病毒可以通過任何已知方法(例如定點(diǎn)誘變，或者在使用抗ICAM-1抗體阻斷ICAM-1入口的細(xì)胞中進(jìn)行傳代)被改變、突變或修飾。
優(yōu)選地，與野生型病毒相比，選擇的小RNA病毒的一個(gè)或多個(gè)外殼蛋白發(fā)生了改變。例如在，柯薩奇病毒中，外殼蛋白選自VP1、VP2和VP3。更優(yōu)選地，突變選自VP3R96H；VP3E101A；VP3A239S；VP2S164L和VP2V209中的一種或多種。
優(yōu)選地，細(xì)胞為腫瘤，更優(yōu)選地，腫瘤為表達(dá)DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢、胃癌和腸癌。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的分離的小RNA病毒的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子可以來自小RNA病毒，并可以是病毒的單鏈RNA或互補(bǔ)DNA。優(yōu)選地，核酸分子包括選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的核酸序列。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種對(duì)能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒進(jìn)行生物選擇的方法，該方法包括將不能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒培養(yǎng)在合適的細(xì)胞系中進(jìn)行足夠多次的傳代，選擇能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒。
優(yōu)選地，細(xì)胞系選自人類癌，例如橫紋肌肉瘤、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。更優(yōu)選地，細(xì)胞系為不表達(dá)ICAM-1的表達(dá)DAF的細(xì)胞系。
典型地，足夠多的傳代次數(shù)通常為大約10代。但是，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)小RNA病毒和細(xì)胞類型，可以使用1至100或更多次的傳代。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用4次傳代。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用5次傳代。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，使用6、7或8次傳代。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第三個(gè)方面的方法得到的小RNA病毒。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)或第四個(gè)方面的分離的小RNA病毒、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的病毒核酸的病毒核酸分子或互補(bǔ)DNA拷貝(copy)、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療患腫瘤哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，該方法包括在導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解的條件下，用有效量的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)或第五個(gè)方面的分離的小RNA病毒為哺乳動(dòng)物給藥。
優(yōu)選地，腫瘤為表達(dá)DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療患腫瘤哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，該方法包括在導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解的條件下，用有效量的根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的病毒核酸的核酸分子或互補(bǔ)DNA拷貝或者根據(jù)本發(fā)明第六個(gè)方面的藥物組合物為哺乳動(dòng)物給藥。
優(yōu)選地，腫瘤為表達(dá)DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌和卵巢癌。
在第九個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)或第五個(gè)方面的分離的小RNA病毒在治療方法或治療中的用途。
在第十個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的核酸分子在治療方法或治療中的用途。
在第十一個(gè)方面，本發(fā)明提供本文所定義的CVA21-DAFv形式的分離、選擇的小RNA病毒、或其修飾或變化形式。
在第十二個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離篩選的小RNA病毒在制造治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物中的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供產(chǎn)生本發(fā)明的小RNA病毒的接種物在制造用小RNA病毒治療哺乳動(dòng)物腫瘤以殺死一些腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
在本發(fā)明的第十三個(gè)方面，提供一種將接種物提供給哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生治療哺乳動(dòng)物腫瘤的病毒的施用器，其中所述的施用器包括充滿接種物的區(qū)域，使得接種物可以與哺乳動(dòng)物接觸，所述的病毒是能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
本文所述的病毒樣品根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏在AustralianGovernment Analytical Laboratories(澳大利亞國(guó)家分析實(shí)驗(yàn)室)(National Measurement Institute，1Suakin Street(PO Box385)PymbleNSW2073Australia)。分離物CVA21#272101(編號(hào)NM05/43993)、CVA21#275238(編號(hào)NM05/43991)、和CVA21#272598(編號(hào)NM05/43992)的保藏日為2005年1月14日。CVA21-DAFv的保藏日為2005年1月17日，編號(hào)為NM05/43996。
在本說明書中，除非上下文另外指出，詞語“包括(comprise)”或其變化形式如“comprises”或“comprising”應(yīng)當(dāng)理解成表示包含所述的要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟，但是不排除任何其它的要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟。
在本說明書中所包括的文件、條例、材料、裝置、文章或類似物的任何論述，目的僅在于為本發(fā)明提供文字內(nèi)容。不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為任何一項(xiàng)或所有這些內(nèi)容形成現(xiàn)有技術(shù)的一部分，或者在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之前為本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域所普遍公知。
為更清晰地理解本發(fā)明，參考下列附圖和實(shí)施例對(duì)優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說明。


圖1.在存在和不存在抗-ICAM-1抗體的情況下，[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的CVA21原型(Kuykendall)和三種CVA21的臨床分離物(#272101、#275238、#272598)與下列細(xì)胞的結(jié)合(A)表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞和(B)表達(dá)ICAM-1的CHO細(xì)胞。[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的結(jié)合水平通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結(jié)合的病毒(cpm x102)。
圖2.在存在和不存在抗-DAF SCR1MAb、抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)域1MAb、和/或PI-PLC處理的情況下，[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的CVA21原型Kuykendall(A)和臨床分離物#272101(B)與HeLa細(xì)胞的結(jié)合。[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的結(jié)合水平通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結(jié)合的病毒(cpm x102)。
圖3.[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的CVA21原型(Kuykendall)和三種CVA21臨床分離物(#272101、#275238、#272598)與單獨(dú)表達(dá)DAF、或ICAM-1、或同時(shí)表達(dá)二者的CHO細(xì)胞的結(jié)合。(A)表面DAF和ICAM-1表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析。轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞與單獨(dú)的綴合物、抗-DAF MAb(IH4)或抗-ICAM-1MAb(WEHI)一起培育，在FACStar分析儀上測(cè)定特異性結(jié)合。封閉直方圖表示綴合物的結(jié)合，空心直方圖代表抗-DAF MAb的結(jié)合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1MAb的結(jié)合。(B)[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的結(jié)合水平通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結(jié)合的病毒(cpm x102)。
圖4.在存在抗-DAF MAbs IA10(SCR1)、VIIIA7(SCR2)、IH4(SCR3)和IIH6(SCR4)的情況下，CVA21原型(Kuykendall)和臨床分離物(#272101、#275238、#272598)對(duì)ICAM-1陰性RD細(xì)胞的溶解性感染。向培養(yǎng)于96孔板的RD細(xì)胞單層中加入抗-DAF MAbs(20μg/ml)。在37℃下培育1h后，用大約103TCID50/孔的CVA21分離物攻擊細(xì)胞，在37℃下培育48h。用結(jié)晶紫/甲醇溶液對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行染色，然后在540nm處測(cè)量吸光度，對(duì)細(xì)胞溶解進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表示成兩個(gè)孔的平均溶解百分比。
圖5.原型CVA21Kuykendall病毒株和臨床分離物#272101、#275238和#272598的VP1、VP2和VP3外殼蛋白的多序列排比。臨床分離物相對(duì)于Kuykendall病毒株的氨基酸變化以黑體表示。使用Clustal X程序進(jìn)行序列排比。構(gòu)成CVA21-ICAM-1結(jié)合足跡的單個(gè)氨基酸用閉合框突出顯示。
圖6.CVA21親代和CVA21-DAFv對(duì)SkMel28和RD細(xì)胞的感染。(A)RD和SkMel28細(xì)胞上ICAM-1和DAF表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析。實(shí)線直方圖代表單獨(dú)的綴合物的結(jié)合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1mAb的結(jié)合，實(shí)心直方圖表示抗-DAF mAb的結(jié)合。(B)96孔板中的SkMel28和RD細(xì)胞單層用CVA21親代和CVA21-DAFv的10倍稀釋液進(jìn)行接種。培育72h后，固定單層，用結(jié)晶紫溶液染色。+表示通過顯微鏡觀察檢測(cè)到的CPE。(C)典型的CVA21親代和CVA21-DAFv在SkMel28細(xì)胞上的噬斑形態(tài)學(xué)與CVA21-DAF變體在RD細(xì)胞上的形態(tài)學(xué)的比較。將細(xì)胞用病毒的連續(xù)稀釋液感染，感染后1h，用含0.7％瓊脂糖的DMEM覆蓋。培養(yǎng)板在37℃下培育，并在感染后48h用結(jié)晶紫染色。
圖7.抗-DAF和抗-ICAM-1mAb對(duì)CVA21-DAFv結(jié)合和溶解性感染的影響。(A)CHO、CHO-DAF、CHO-ICAM-1和DOV13細(xì)胞上DAF和ICAM-1表面水平的流式細(xì)胞儀分析。實(shí)線直方圖代表僅有綴合體的結(jié)合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1mAb的結(jié)合，實(shí)心直方圖顯示抗-DAF mAb的結(jié)合。與CHO、CHO-ICAM-1、CHO-DAF、RD和DOV13細(xì)胞上表面表達(dá)的ICAM-1(B)和DAF(C)結(jié)合的放射性同位素標(biāo)記的病毒通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品+SD。(D)DAF的mAb交聯(lián)對(duì)RD和DOV13細(xì)胞的CVA21溶解性感染的影響。在用CVA21親代和CVA21-DAFv(1-106TCID50/孔)攻擊之前，將96孔板中的單層與抗-DAF SCR3mAb預(yù)培育。在37℃下培育72h后，固定細(xì)胞單層，并用結(jié)晶紫溶液染色。+表示通過顯微鏡檢查檢測(cè)的CPE。*病毒效價(jià)小于101TCID50/ml。
圖8.從DAF洗脫CVA21-DAFv。(A)比較CVA21親代和CVA21-DAFv與表面DAF結(jié)合的嚴(yán)格性。將CHO-DAF細(xì)胞與放射性同位素標(biāo)記的病毒在4℃下培育2h，然后將與細(xì)胞結(jié)合的病毒用不同濃度的抗-DAF SCR1mAb(IA10)在冰上洗脫1h。監(jiān)測(cè)上清液中洗脫病毒的水平，結(jié)果表示成放射性同位素標(biāo)記的病毒被洗脫的細(xì)胞的％。(B)結(jié)合DAF和ICAM-1的CVA21-DAFv病毒體的沉淀。將CHO-DAF和CHO-ICAM-1細(xì)胞與放射性同位素標(biāo)記的CVA21-DAFv病毒體在4℃下培育2h，將與細(xì)胞結(jié)合的病毒在37℃下洗脫2h。洗脫的病毒體沉淀在5-30％蔗糖梯度上進(jìn)行分析。使用成熟病毒體(160S)和原病毒體(125S)作為內(nèi)遷移參照。
圖9.CVA21-DAFv溶解性感染被抗DAF SCR1mAb和可溶性DAF(sDAF)抑制。(A)用CVA21-DAFv感染之前，將成片的RD單層細(xì)胞與抗-DAF SCR1mAb IA10培育。在37℃下培育24h后，觀察細(xì)胞的溶解情況并拍照。(B)將CVA21-DAFv與sDAF(85μg/m)在37℃下培育1h，并將其加入至RD細(xì)胞單層。在37℃下培育48h后，觀察細(xì)胞的溶解情況并拍照。
圖10.預(yù)計(jì)的CVA21的受體-病毒結(jié)合表面的近觀。(A)表示成等值面的一個(gè)CVA21啟動(dòng)子的俯視圖，其中VP1繪成黃色，VP2繪成粉紅色，VP3繪成紫紅色。數(shù)字表示二十面體5-、3-、和2-重軸的相應(yīng)位置。相互作用的ICAM-1和DAF分子顯示成蠕蟲樣圖，DAF為麥色，與峽谷結(jié)合的ICAM-1為綠色。CVA21親代(空間填充模式)中VP3 R96殘基的位置被VP1C-端環(huán)所部分覆蓋，僅有精氨酸側(cè)鏈上的一個(gè)氮原子(緊靠星號(hào)的藍(lán)色表面)可以從病毒表面上看到。(B)CVA21啟動(dòng)子的側(cè)視圖，蛋白上的顏色如上述，VP3殘基R96和E101用以空間填充模式突出顯示。圖像用pymol程序(http://www.pymol.org)生成。
圖11.放射性同位素標(biāo)記的CVA21與嵌合DAF/CD46受體的結(jié)合。(A)野生型DAF、CD46和DAF/CD46嵌合分子的示意圖。(B)mAbs與DAF和CD46的單個(gè)SCR結(jié)合的流式細(xì)胞儀分析?？?DAFmAbs為IA10(SCR1)、IH4(SCR3)、IIH6(SCR4)，抗-CD46mAb(SCR1)為MCI20.6。與合適的mAbs培育后，將細(xì)胞用PBS沖洗，重新懸浮在100μl PBS(DAKO A/S，Denmark)中的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段中，在冰上培育20min。如上文所述對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗并沉淀，重新懸浮在PBS中，并使用FACStar分析儀(Becton Dickenson，Sydney，Australia)對(duì)DAF和CD46表達(dá)進(jìn)行分析。(C)放射性同位素標(biāo)記的CVA21與表達(dá)DAF、CD46或嵌合DAF/CD46分子的結(jié)合。將細(xì)胞與大約2×105cpm35S-標(biāo)記的CVA21在37℃下培育1h，然后用PBS沖洗四次。與細(xì)胞結(jié)合的CVA21的量通過液體閃爍來測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品的平均值+SD。
圖12.從表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞洗脫CVA21對(duì)時(shí)間、溫度和培養(yǎng)基pH的反應(yīng)。(A)CVA21與細(xì)胞表面表達(dá)的DAF在4℃下結(jié)合，溫度升高至37℃后2h繼續(xù)洗脫0、1、5、15、30和60分鐘。洗脫的CVA21的水平通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。(B)CVA21與細(xì)胞表面表達(dá)的DAF在4℃下結(jié)合2h，然后在適當(dāng)溫度下培育，繼續(xù)洗脫30分鐘。(C)CVA21與細(xì)胞表面表達(dá)的DAF在4℃下結(jié)合2h，在適當(dāng)pH的培養(yǎng)基中在37℃下培育，繼續(xù)洗脫30分鐘。
圖13.自DAF和ICAM-1洗脫后CVA21的感染性。(A)與細(xì)胞表面表達(dá)的DAF和ICAM-1在4℃下結(jié)合的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的CVA21的水平，隨后在37℃下培育后從每個(gè)受體上洗脫放射性同位素標(biāo)記的病毒。結(jié)合的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的水平在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成三份樣品+SD。(B)與從細(xì)胞表面表達(dá)的DAF和ICAM-1結(jié)合并洗脫后CVA21對(duì)RD-ICAM-1細(xì)胞的溶解性感染。通過用結(jié)晶紫/甲醇溶液染色，從四個(gè)孔對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行定量，染色細(xì)胞單層的相對(duì)吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)平板讀數(shù)儀(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進(jìn)行讀數(shù)。使用Reed和Muench法計(jì)算50％終點(diǎn)效價(jià)，如果吸光度小于無病毒對(duì)照物減去標(biāo)準(zhǔn)誤差的3倍，則該孔被記為陽性。
圖14.自交聯(lián)DAF洗脫后CVA21的感染性。(A)在0℃下和37℃下，從RD細(xì)胞上細(xì)胞表面表達(dá)的ICAM-1(RD-ICAM-1)和RD細(xì)胞上mAb交聯(lián)的DAF上洗脫[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的CVA21。洗脫的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的水平在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示成從三份樣品上洗脫的病毒的百分比+SD。(B)與對(duì)照CVA21相比，與ICAM-1或mAb交聯(lián)DAF結(jié)合并洗脫后CVA21對(duì)RD-ICAM-1細(xì)胞的溶解性感染。通過用結(jié)晶紫/甲醇溶液染色，從四個(gè)孔對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行定量，染色細(xì)胞單層的相對(duì)吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)平板讀數(shù)儀(FlowLaboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進(jìn)行讀數(shù)。如圖13所述計(jì)算50％終點(diǎn)效價(jià)。(C)CVA21與ICAM-1或交聯(lián)DAF結(jié)合的嚴(yán)格性。將RD-ICAM-1細(xì)胞或DAF-交聯(lián)RD-細(xì)胞[與抗-DAFSCR3(IH4)mAb預(yù)培育的RD細(xì)胞]與大約2×105cpm35S-標(biāo)記的CVA21在0℃下培育2h。用冷PBS沖洗4次后，將細(xì)胞分在多個(gè)管中，并與不同濃度(0-100μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb或抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)域1mAb在0℃下培育1h。通過液體閃爍計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞和上清液的放射活性，結(jié)果表示成35S-標(biāo)記CVA21被洗脫的細(xì)胞的％。
圖15.在延遲誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)后，CVA21誘導(dǎo)的RD細(xì)胞溶解性感染。(A)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。通過用2.5×107TCID50/ml含人ICAM-1cDNA的重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)RD細(xì)胞表達(dá)人ICAM-1。在腺病毒接種后的不同時(shí)間，通過流式細(xì)胞儀使用抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)域mAb(IH4)測(cè)定細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)。(B)在偽轉(zhuǎn)導(dǎo)或用含人ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)后的24h，對(duì)顯示DAF、ICAM-1和CD36表面表達(dá)的RD細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。閉合直方圖表示DAF表達(dá)，粉紅色直方圖表示ICAM-1表達(dá)，藍(lán)色直方圖表示CD36表達(dá)。使用Adeno-quest試劑盒(QuantumBiotechnologies Inc)，根據(jù)制造商的說明書構(gòu)建含有ICAM-1cDNA或CD36cDNA的重組腺病毒。(C)經(jīng)由遲至24h后的ICAM-1表達(dá)的延遲，RD細(xì)胞的CVA21溶解性感染。在CVA21(moi＝1.0TCID50)與DAF結(jié)合后的0、6和24h，通過用2.5×107TCID50/ml含有ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)RD細(xì)胞表達(dá)ICAM-1或CD36受體。以未轉(zhuǎn)導(dǎo)的RD細(xì)胞作為對(duì)照物。通過用結(jié)晶紫/甲醇溶液染色，從四個(gè)孔對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行定量，染色細(xì)胞單層的相對(duì)吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)平板讀數(shù)儀(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進(jìn)行讀數(shù)。。使用Reed和Muench法計(jì)算50％終點(diǎn)效價(jià)，如果吸光度小于無病毒對(duì)照物減去標(biāo)準(zhǔn)誤差的3倍，則該孔被記為陽性。(D)CVA21誘導(dǎo)的溶解性感染。在與CVA21(moi＝1.0TCID50)培育后立即進(jìn)行偽轉(zhuǎn)導(dǎo)或用含有人ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)后的24h，對(duì)RD細(xì)胞單層進(jìn)行顯微拍照(X200)。
圖16.乳腺、卵巢、前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的受體表達(dá)。在3種人乳腺、卵巢、前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞系中對(duì)ICAM-1和DAF的表達(dá)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。黑色實(shí)線直方圖代表僅有綴合物，灰色直方圖表示ICAM-1的表達(dá)，黑色空心直方圖表示DAF的表達(dá)。
圖17.CVA21-DAFv的體內(nèi)溶瘤作用。對(duì)CVA21-DAFv-誘導(dǎo)的人乳腺、卵巢、前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞體外培養(yǎng)物的感染進(jìn)行顯微拍照。細(xì)胞單層用CVA21親代或CVA21-DAFv感染，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞的病變效應(yīng)。感染后的72小時(shí)，對(duì)單層進(jìn)行拍照。
圖18.對(duì)CVA21-DAFv在人乳腺、卵巢、前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的溶瘤能力進(jìn)行定量。將96孔板中的單層癌細(xì)胞用CVA21親代或CVA21-DAFv母液的10倍稀釋液進(jìn)行接種。培育72小時(shí)后，觀察細(xì)胞單層中病變效應(yīng)的存在。將顯微鏡下可檢測(cè)到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的孔記為陽性，使用Reed和Muench法計(jì)算50％感染終點(diǎn)效價(jià)。
圖19.CVA21-DAFv對(duì)人前列腺異源移植物的體內(nèi)溶瘤作用。對(duì)注射2×106PC3細(xì)胞后攜帶有生長(zhǎng)于側(cè)腹部的皮下PC3腫瘤(大約50-100mm3)的SCID(嚴(yán)重的合并免疫缺陷)小鼠靜脈內(nèi)注射單次劑量的CVA21親代、CVA21-DAFv或PBS。使用卡鉗從外部測(cè)量平均腫瘤大小，使用球體公式估計(jì)腫瘤的體積。腫瘤體積表示成6只被處理小鼠的平均值+/-SE。
圖20.CVA21#272598分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。
圖21.CVA21#275238分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3和SEQ IDNO4。
圖22.CVA21#272101分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5和SEQ IDNO6。
圖23.CVA210-DAFv的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO7和SEQ IDNO8。
具體實(shí)施例方式
盡管已知一些天然的小RNA病毒和其它病毒如呼腸病毒適用于治療有限種類的癌癥，但仍需要開發(fā)改良的治療方法。為擴(kuò)大可能的癌癥治療范圍，并提供更有效的治療，通過修飾和生物選擇，當(dāng)前的發(fā)明人獲得了溶瘤特性提高的新的溶瘤小RNA病毒。
如本文所述，當(dāng)前發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，野生型小RNA病毒可以加以生物選擇，以溶解性地感染表達(dá)DAF但不表達(dá)ICAM-1的細(xì)胞，這種細(xì)胞通常對(duì)野生型小RNA病毒感染有抗性。細(xì)胞對(duì)小RNA病毒感染的“抗性”表示用病毒感染細(xì)胞不引起顯著的病毒產(chǎn)生或收率?！耙赘小钡募?xì)胞是表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)、病毒蛋白合成、和/或病毒產(chǎn)生的細(xì)胞。
基于這些發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前發(fā)明人已開發(fā)出獲得適用于治療哺乳動(dòng)物腫瘤的新的小RNA病毒的方法。哺乳動(dòng)物可以是人，或者是有社會(huì)、經(jīng)濟(jì)或研究意義的任何種屬的個(gè)體，這些種屬包括但不限于小鼠、狗、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、非人靈長(zhǎng)類和人。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人。
小RNA病毒可以是天然的或修飾的。當(dāng)從天然來源中分離并且沒有在實(shí)驗(yàn)室中被人刻意修飾過時(shí)，小RNA病毒是“天然的”。例如，小RNA病毒可以獲自“野生來源(field source)”即，來自人類患者。
小RNA病毒可以是修飾的，但其仍能夠溶解性地感染表達(dá)DAF和/或ICAM-1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？梢酝ㄟ^下列方法對(duì)小RNA病毒進(jìn)行生物選擇將天然的小RNA病毒在細(xì)胞系中培養(yǎng)傳代多次，直至獲得修飾的小RNA病毒。合適的細(xì)胞系包括表達(dá)DAF的細(xì)胞，如癌細(xì)胞系。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，其它細(xì)胞系也是合適的。
小RNA病毒可以在為受試者細(xì)胞給藥之前進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)上的預(yù)處理(例如，用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶處理)。用蛋白酶預(yù)處理除去病毒的外殼或外殼，可以增強(qiáng)病毒的感染性。小RNA病毒可以包覆在脂質(zhì)體或微團(tuán)中，以減少或防止對(duì)小RNA病毒已產(chǎn)生免疫性的哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)。例如，可以在形成烷基硫酸鹽去垢劑濃縮物的微團(tuán)的存在下，將病毒體用糜蛋白酶處理，以產(chǎn)生新的感染性亞病毒體顆粒。
小RNA病毒可以是來自兩種或多種類型的具有不同致病表型的小RNA病毒的重組小RNA病毒，使得它就含有不同的抗原決定子，從而減少或防止之前暴露于小RNA病毒亞型的哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)。這種重組病毒體可以通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞與不同亞型的小RNA病毒共感染產(chǎn)生，生成的不同亞型的外殼蛋白重新分選并結(jié)合到生成的病毒體外殼中。
小RNA病毒可以通過參入突變外殼蛋白來進(jìn)行修飾，例如VP1、VP2和VP3進(jìn)入病毒體外外殼。蛋白可通過置換、插入或缺失而突變。置換包括插入不同的氨基酸來代替天然氨基酸。插入包括在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)將額外的氨基酸殘基插入到蛋白中。缺失包括蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失。這些突變可通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。例如，其中一個(gè)外殼蛋白的編碼基因的寡核苷酸定點(diǎn)誘變可以導(dǎo)致生成所需的突變外殼蛋白。在感染小RNA病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中體外表達(dá)突變蛋白將導(dǎo)致突變蛋白參入小RNA病毒病毒體顆粒。
小RNA病毒還可以修飾成減小或消除對(duì)小RNA病毒的免疫反應(yīng)。這樣修飾的小RNA病毒被稱為“免疫保護(hù)的小RNA病毒”。這種修飾可以包括將小RNA病毒包裝在脂質(zhì)體、微團(tuán)或其它載體中，使小RNA病毒被掩蔽不受哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)影響。另外可選地，小RNA病毒體顆粒的外外殼可以去除或改變，因?yàn)榇嬖谟谕馔鈿ど系牡鞍资撬拗黧w液和細(xì)胞反應(yīng)的主要決定因素。
在本發(fā)明的方法中，用小RNA病毒為個(gè)體哺乳動(dòng)物的腫瘤給藥?？梢允褂玫娜诵NA病毒的代表類型包括腸病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒、肝病毒和心病毒。在優(yōu)選的方式中，小RNA病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選地，柯薩奇病毒為A型，更優(yōu)選為柯薩奇病毒A21?？梢允褂貌煌逍秃?或不同病毒株的小RNA病毒的組合，例如來自不同動(dòng)物種屬的小RNA病毒。小RNA病毒是“天然的”即，它是從天然來源中分離的，并且沒有在實(shí)驗(yàn)室中被人刻意修飾過。例如，小RNA病毒可以是從“野生來源”生物選擇的即，來自人類患者。如果需要的話，在為腫瘤給藥之前可以對(duì)小RNA病毒進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)上的預(yù)處理(例如，用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶處理)。這種預(yù)處理除去了病毒的外殼或外殼，可以增強(qiáng)病毒的感染性。
腫瘤可以是實(shí)體腫瘤(例如，肉瘤或癌)，或者是影響造血系統(tǒng)的癌性生長(zhǎng)物(“造血系腫瘤”；例如淋巴瘤或白血病)。腫瘤是一種異常組織生長(zhǎng)物，它通常形成明顯的塊狀，并通過遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于正常組織生長(zhǎng)的速度進(jìn)行細(xì)胞增殖而生長(zhǎng)。腫瘤部分或完全地表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)組織和與正常組織功能協(xié)調(diào)的缺乏。如本文所用，“腫瘤”也指“瘤(tumor)”，其用來包括造血系腫瘤和實(shí)體腫瘤。至少腫瘤的一些細(xì)胞表達(dá)DAF和/或ICAM-1。對(duì)本發(fā)明方法的治療特別易感的一種腫瘤是黑色素瘤。其它對(duì)本發(fā)明方法的治療特別易感的腫瘤包括乳癌、腦癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌、胃癌和腸癌等。
通常將小RNA病毒在生理學(xué)可接受的載體或媒介(如磷酸鹽緩沖鹽水)中為腫瘤給藥?！盀槟[瘤給藥”是指小RNA病毒的給藥方式是使其與腫瘤的細(xì)胞接觸(本文也稱為“腫瘤細(xì)胞”)。小RNA病毒給藥的途徑、劑型、載體或媒介取決于腫瘤的位置及類型?？梢圆捎梅秶軐挼慕o藥途徑。例如，對(duì)于可觸及的實(shí)體腫瘤，可以通過注射將小RNA病毒直接為腫瘤給藥。對(duì)于造血系腫瘤，例如，可以將小RNA病毒靜脈內(nèi)或血管內(nèi)給藥。對(duì)于體內(nèi)不容易觸及的腫瘤，例如轉(zhuǎn)移灶或腦腫瘤，小RNA病毒的給藥方式是使其可以通過哺乳動(dòng)物機(jī)體全身輸送，從而到達(dá)腫瘤(例如，鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))。另外可選地，可以將小RNA病毒為單個(gè)實(shí)體腫瘤直接給藥，然后它通過機(jī)體經(jīng)全身輸送至轉(zhuǎn)移灶。小RNA病毒也可以經(jīng)皮下、腹膜內(nèi)、局部(例如對(duì)黑色素瘤)、口服(例如口腔或食管腫瘤)、經(jīng)直腸(例如對(duì)于結(jié)直腸腫瘤)、經(jīng)陰道(例如，宮頸或陰道腫瘤)、經(jīng)鼻或通過噴霧吸入(例如對(duì)于肺腫瘤)給藥。
通常，可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法制備合適的組合物，因此可以包括藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
這些組合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)途徑來給藥。通常，組合物可通過胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、椎管內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))、口服或局部途徑給藥。更優(yōu)選地，通過胃腸外途徑給藥。
就與組合物的其它成分相容而言，載體、稀釋劑和佐劑必須是“可接受的”，對(duì)其接受者是無害的。
藥物可接受載體或稀釋劑的例子是去離子水或蒸餾水；鹽水溶液；植物油如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油類，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮類；礦物油，如液狀石蠟、凡士林或角鯊?fù)椋焕w維素衍生物，如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、或羥丙基甲基纖維素；低級(jí)烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級(jí)芳烷醇(aralkanol)；低級(jí)聚烷撐二醇或低級(jí)烷撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；黃蓍膠或阿拉伯樹膠、和礦脂。典型地，一種或多種載體可以占組合物重量的10％至99.9％。
本發(fā)明的組合物可以是適合注射給藥的形式、適合口服攝取的形式(如膠囊、片劑、囊片、酏劑)、適合局部給藥的軟膏劑、霜?jiǎng)┗蛳磩┑男问?、適合作為滴眼液輸送的形式、適合吸入給藥(如通過經(jīng)鼻吸入或經(jīng)口吸入)的氣霧劑形式、適合胃腸外給藥(即皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射)的形式。
對(duì)于以可注射溶液或懸液給藥，胃腸外可接受的無毒稀釋劑或載體可以包括林格氏溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1，2-丙二醇。
一些口服使用的合適載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的例子包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。此外，這些口服劑型可以包含合適的調(diào)味劑和著色劑。當(dāng)以膠囊形式使用時(shí)，膠囊可以用延緩崩解的化合物(如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)包覆。
佐劑典型地包括潤(rùn)滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。
口服給藥的固體劑型可以含有人類和獸醫(yī)制藥領(lǐng)域中可接受的粘合劑、甜味劑、崩解劑、稀釋劑、調(diào)味劑、包衣劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、和/或延時(shí)劑。合適的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤(rùn)土、藻酸、或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸氫鈣。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃味、橙味、或樹莓味調(diào)味劑。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠、或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適的延時(shí)劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服給藥的液體劑型除上述試劑以外還可以包括液體載體。合適的液體載體包括水、油類，例如橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、或其混合物。
口服給藥的懸液可以進(jìn)一步包括分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉、或乙酰基醇。合適的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸的聚氧乙烯酯，如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇單或二油酸酯、-硬脂酸酯、或-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇單或二油酸酯、-硬脂酸酯、或-月桂酯和類似物。
口服給藥的乳液可以進(jìn)一步包括一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上文例舉的分散劑或天然樹膠，如瓜爾膠、阿拉伯樹膠或黃蓍膠。
胃腸外給藥組合物的方制備法對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員是顯而易見的，例如，更詳細(xì)地見述于Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，在此將其引入作為參考。
本發(fā)明的局部用藥制劑包括活性成分以及一種或多種可接受的載體，任選地包括任何其它治療成分。適合局部用藥的制劑包括適合透過皮膚到達(dá)需治療部位的液體或半液體制劑，例如擦劑、洗劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑或糊劑，以及適合眼、耳或鼻給藥的滴劑。
根據(jù)本發(fā)明的滴劑可包括無菌水性或油性溶液或懸液?？梢酝ㄟ^將活性成分溶解在殺菌劑和/或抗真菌劑和/或任何其它合適防腐劑的水溶液(其任選地包括表面活性劑)中來制備這些。然后可以將得到的溶液通過過濾澄清，轉(zhuǎn)移到合適的容器中并消毒。消毒可以通過下列方法完成高壓滅菌法，或者在90℃-100℃下維持半小時(shí)，或者通過過濾、然后通過無菌技術(shù)轉(zhuǎn)移至容器中。適合包含在滴劑中的殺菌劑和抗真菌劑的例子是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯銨(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。油性溶液制劑的合適溶劑包括甘油、稀釋的乙醇和丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明的洗劑包括適合用于皮膚或眼部的劑型。眼洗劑可包括無菌水溶液，其可任選地含有殺菌劑，可以通過與上述滴劑制備相似的方法進(jìn)行制備。用于皮膚的洗劑或擦劑還可以包括加速干燥和使皮膚涼爽的試劑，例如乙醇或丙酮、和/或潤(rùn)濕劑如甘油、或油類如蓖麻油或花生油。
根據(jù)本發(fā)明的霜?jiǎng)?、軟膏劑或糊劑是外用的活性成分的半固體劑型。它們可以通過下列方法制備將單獨(dú)的、或者水性或非水性液體的溶液或懸液中的磨碎或粉末形式的活性成分與油質(zhì)或非油質(zhì)基質(zhì)混合?；|(zhì)可以包括碳?xì)浠衔铮缬彩灐④浭灮蛞后w石蠟，甘油、蜂蠟、金屬皂；膠漿劑；天然來源的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油、或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸如硬脂酸或油酸，以及醇，如丙二醇或聚乙二醇。
組合物中可以加入任何合適的表面活性劑如陽離子、陰離子或非離子型表面活性劑，例如去水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。還可以包括懸浮劑，例如天然樹膠、纖維素衍生物或無機(jī)物如硅酸鹽，以及其它成分如羊毛脂。
將小RNA病毒或者獲自或源自小RNA病毒的核酸以足夠治療腫瘤的量(例如，“有效量”)給藥。用小RNA病毒為腫瘤細(xì)胞給藥實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞溶解，引起腫瘤的大小減少、或腫瘤完全消失時(shí)，腫瘤得以“治療”。腫瘤大小的減少、或優(yōu)選的腫瘤消失通常是腫瘤細(xì)胞被小RNA病毒溶解(“溶瘤作用”)造成的。有效量可以根據(jù)個(gè)體的情況確定，可以至少部分考慮小RNA病毒的類型；個(gè)體的大小、年齡、性別；以及腫瘤的大小和其它特征。例如，對(duì)于人類的治療，根據(jù)存在腫瘤的類型、大小和數(shù)量，可以使用大約102至1012蝕斑形成單位(PFU)的小RNA病毒。優(yōu)選地，接種物含有大于約105PFU，例如，在大約105至106PFU之間、或大約106至107PFU之間。更優(yōu)選地，接種物可以含有大約1×106至大約5×106PFU，如大約3×106PFU。例如，對(duì)于人黑色素瘤的治療，可以使用一種或多種大約3×106PFU的接種物?？梢詫⑿NA病毒以單次劑量或多次劑量(即，劑量超過一次)給藥。多次劑量可以同時(shí)給藥，或連續(xù)給藥(例如，在幾天或幾周的時(shí)間內(nèi))。典型地，在治療性應(yīng)用中，治療要根據(jù)疾病狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間維持一段時(shí)間，例如，至少直至通過常規(guī)手段檢查不到腫瘤。還應(yīng)當(dāng)考慮到，在檢查不到腫瘤以后可能需要繼續(xù)進(jìn)行治療，例如，治療醫(yī)師懷疑存在有未檢查到的腫瘤。也可以將小RNA病毒或核酸為同一個(gè)體內(nèi)的一個(gè)以上的腫瘤給藥。
需要用小RNA病毒多次給藥時(shí)，可以每次用不同的病毒給藥，以避免對(duì)之前所給藥病毒的任何免疫反應(yīng)的影響或?qū)⑦@種影響降至最低，治療周期可以持續(xù)1至2周或更長(zhǎng)時(shí)間，這一點(diǎn)可以由主治醫(yī)生確定。最優(yōu)選地，可以用哺乳動(dòng)物之前未接觸過的病毒或者哺乳動(dòng)物對(duì)其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相對(duì)較小的病毒給藥，這一點(diǎn)可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。
本發(fā)明包括能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的分離的小RNA病毒核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子可以源自小RNA病毒，也可以是來自病毒的單鏈RNA或互補(bǔ)DNA。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的核酸序列包括來源于小RNA病毒的核酸序列，例如，包括編碼病毒基因組的核酸序列、或者其足以使病毒產(chǎn)生或能夠在細(xì)胞內(nèi)引起溶解性感染的序列。例如，核酸分子可以包括單個(gè)病毒RNA或DNA分子，例如互補(bǔ)DNA分子、或編碼不同病毒序列的多種上述分子。
本文所用的術(shù)語“聚核苷酸”是指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基、已知的類似物、或天然核苷酸、或其混合物的聚合物。
應(yīng)當(dāng)理解到，在本說明書的上下文中，術(shù)語“源自”包括序列可以是直接從小RNA病毒分離的病毒RNA、合成的RNA、對(duì)應(yīng)于所分離序列的cDNA。該術(shù)語還包括與野生型序列或親代序列相比在序列上包括一個(gè)或多個(gè)突變(其包括，例如外殼蛋白的突變)的合成聚核苷酸。
可以使用任何合適的分離病毒RNA的方法，其包括基于使用苯酚/氯仿提取的方法，例如市售的病毒RNA分離試劑盒如TrizolLSreagent(GIBCO BRL，Life Technologies Grand Island，NY，USA)所提供的方法；采用基于磁珠分離的分離方法，例如Ambion MagMaxTM病毒RNA分離試劑盒。病毒RNA的分離方法通常見述于例如，Ausubel，F(xiàn).等人主編，Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法).1992，Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience，JohnWileyand SonsNew York和Sambrook等人，(1989)，Molecular CloningALaboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，無論核酸序列(如病毒RNA)是從病毒中直接分離的、合成的、呈現(xiàn)為質(zhì)粒分子、還是在體外產(chǎn)生(如使用噬菌體T7RNA聚合酶從cDNA模板產(chǎn)生)，本發(fā)明不要求其不含污染物質(zhì)(如細(xì)胞碎片)，其在本說明書的文中被認(rèn)為是“分離的”。因此，在本說明書的上下文中，當(dāng)原料中的非RNA成分(如細(xì)胞蛋白)已經(jīng)部分或全部地從RNA中除去時(shí)，RNA被視為是分離的。例如，當(dāng)超過50％的非RNA物質(zhì)被除去時(shí)，RNA被視為是“分離的”。優(yōu)選超過60％的非RNA物質(zhì)被除去，更優(yōu)選超過70％、80％或90％的非RNA物質(zhì)被除去。典型地，RNA含有小于10％的污染物質(zhì)，更典型地，小于5％的污染物質(zhì)。因此，優(yōu)選地，病毒RNA的RNA純度大于95％，更優(yōu)選純度大于97％或純度大于99％。
優(yōu)選地，核酸分子包括選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5和SEQ ID NO7的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，這些聚核苷酸分子之間可能有相當(dāng)大的序列上的變化。
本發(fā)明還提供與在此公開的聚核苷酸(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7)基本相似的分離的聚核苷酸序列，這些序列包括或提供能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒。聚核苷酸序列變體與SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的一個(gè)或多個(gè)具有性質(zhì)相同的生物學(xué)活性。本文所用的術(shù)語“基本相似”是指與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的任意一個(gè)所示序列的序列同一性為至少大約60％、更優(yōu)選為至少大約70％、再更優(yōu)選為至少大約80％的序列。典型地，這種序列與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的任意一個(gè)的同一性更優(yōu)選為至少大約90％，最優(yōu)選為至少大約95％或更高。
本文所用的“序列同一性”是指當(dāng)通過本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序(例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version8，August1996，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)提供的GAP)在特定的比較窗中進(jìn)行最大一致性排比時(shí)，兩個(gè)序列中的殘基是相同的。
除上文對(duì)本發(fā)明序列的描述以外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的序列包括變異的序列，例如，對(duì)于多肽序列來說，序列包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或改變(如保守氨基酸的改變)，對(duì)于聚核苷酸序列來說，序列編碼包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或改變的(如一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的改變)的多肽序列。優(yōu)選地，這些改變的性質(zhì)微小，即，保守氨基酸的置換和其它置換不會(huì)顯著影響到序列的活性，例如使病毒能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞。保守氨基酸的置換及其引入方法是本領(lǐng)域公知的，通常，是指將多肽鏈(蛋白的一級(jí)序列)中的一個(gè)氨基酸置換或替換性質(zhì)相似的另一個(gè)氨基酸。例如，帶電的谷氨酸(Glu)替換成帶有相似電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)便為保守氨基酸取代。可以使用下列表格作為指導(dǎo)表1保守氨基酸置換

變異的序列包括，例如，本文所述的外殼蛋白變更的保守置換。例如，可以預(yù)計(jì)包括突變體VP3R96H的保守置換(如VP3R96K)的序列具有所需的特性。類似地，可以預(yù)計(jì)包括突變體VP3E101A的保守置換(如VP3E101G、VP3E101T、VP3E101S、或VP3E101M)的一個(gè)或多個(gè)序列具有所需的特性。作為其它例子，可以預(yù)計(jì)包括突變體VP3A239S的保守置換(如VP3A239G、VP3A239T、或VP3A239M)的一個(gè)或多個(gè)序列具有所需的特性。仍然是其它例子，可以預(yù)計(jì)包括突變體VP2S164L的保守置換(如VP2S1641或VP2S164V)的一個(gè)或多個(gè)序列具有所需的特性。
如本文所述，根據(jù)本發(fā)明，很容易檢測(cè)變異序列的功能性。
還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過使用RNA基因組或基因組的互補(bǔ)DNA拷貝而將小RNA病毒間接給藥。給藥時(shí)，小RNA病毒仍然能夠在細(xì)胞中復(fù)制，并造成期望的溶解性感染和致死。
因此，除完整病毒之外，可以將參入產(chǎn)生病毒的核酸的病毒或其它質(zhì)?；虮磉_(dá)載體注射到腫瘤中，以被腫瘤細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生完整的病毒以發(fā)揮治療作用。合適的表達(dá)載體包括能夠表達(dá)編碼產(chǎn)生病毒所必需的病毒蛋白的DNA(例如基因組DNA或cDNA)插入片斷的質(zhì)粒。表達(dá)載體典型地包括與插入的核酸可操作式連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列?！翱刹僮魇竭B接”是指核酸插入片斷與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列連接，使得插入的序列可以在不進(jìn)行插入片斷讀框移位的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列包括促進(jìn)RNA聚合酶的結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、以及使核糖體能夠與轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合的表達(dá)控制元件。
更具體地，本文所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)控制序列”應(yīng)當(dāng)理解成包括任何參與驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄和控制(即調(diào)節(jié))指定DNA序列轉(zhuǎn)錄水平的DNA。例如，5′調(diào)節(jié)控制序列是位于編碼序列上游的DNA序列，其可以包括啟動(dòng)子和5′不翻譯的前導(dǎo)序列。3′調(diào)節(jié)控制序列是位于編碼序列下游的DNA序列，其可以包括合適的包括一個(gè)或多個(gè)加A信號(hào)的轉(zhuǎn)錄終止(和/或)調(diào)節(jié)信號(hào)。如本文所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”包括任何在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)過程中被依賴DNA的RNA聚合酶所識(shí)別并與其結(jié)合結(jié)合(直接或間接)的DNA序列。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，其可以包括各種可以結(jié)合基因表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白的其它位點(diǎn)或序列(如增強(qiáng)子)。
大量適于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的。適于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體包括pSV2neo、pEF-PGk.Puro、pTk2、和參入聚腺苷酸化位點(diǎn)和延伸因子1-x啟動(dòng)子的非復(fù)制腺病毒穿梭載體、和更優(yōu)選參入巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的基于pAdEasy的表達(dá)載體(例如，見He等人，1998)。還可以使用采用多肽延伸因子-α2作為啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEFBOS。編碼產(chǎn)生病毒所必需的病毒蛋白的cDNA可以通過下列方法制備使用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)，例如Sambrook等人(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York和Ausubel等人，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法)，USA，Vol.1and2中所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組或其片段，并參入到合適的載體中。
除cDNA之外，細(xì)胞可以用自純化的病毒體中提取的病毒RNA轉(zhuǎn)染，或者，例如，如Ansardi，D.C.等人，2001所述，在體外使用噬菌體T7RNA聚合酶從cDNA模板產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。
類似地，可以以單個(gè)質(zhì)?；騌NA分子給藥，以表達(dá)病毒蛋白和產(chǎn)生病毒，或者以編碼不同病毒蛋白的多種質(zhì)?；騌NA分子給藥，以轉(zhuǎn)染細(xì)胞和產(chǎn)生病毒。
可以將質(zhì)粒或RNA通過，例如局部給藥或注射，為腫瘤給藥，以便在不存在促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體媒介或與這種媒介結(jié)合的情況下被腫瘤細(xì)胞攝取。合適的載體媒介包括脂質(zhì)體，典型地提供成本領(lǐng)域公知的水包油乳劑。脂質(zhì)體典型地包括脂類、特別是磷脂的組合，例如相變溫度高的磷脂，其通常具有一個(gè)或多個(gè)類固醇或類固醇前體(如膽固醇)，以便為脂質(zhì)體提供膜穩(wěn)定性。用于提供脂質(zhì)體的脂類的例子包括磷脂?；衔?，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。特別合適的是磷脂酰甘油二酯(diacyl phosphateidylglycerol)，其中脂質(zhì)部分含有14至18個(gè)碳原子，更優(yōu)選為16至18個(gè)碳原子，并且是飽和的。
可以將小RNA病毒或包括小RNA病毒的組合物可以脂質(zhì)體的形式給藥。脂質(zhì)體通常來源于磷脂或其它脂類物質(zhì)，由分散在水相介質(zhì)中的單層或多層水合液晶形成?？梢允褂萌魏文軌蛐纬芍|(zhì)體的無毒、生理可接受、且可代謝的脂類。脂質(zhì)體形式的組合物可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑和類似物。優(yōu)選的脂類是天然或合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域公知的，與此相關(guān)可以查閱以下文獻(xiàn)Prescott主編，Methods in Cell Biology(細(xì)胞生物學(xué)方法)，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33頁以后，在此并入其內(nèi)容作為參考。
脂質(zhì)體與靶細(xì)胞的相互作用可以是被動(dòng)的或主動(dòng)的。主動(dòng)靶向涉及在脂質(zhì)體膜中引入與靶細(xì)胞表達(dá)的相應(yīng)配體結(jié)合或相互作用的特異性配體對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾。這種配體包括，例如，單克隆抗體或其結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab′)2片段)、糖或糖脂部分、或者特別優(yōu)選的對(duì)DAF有特異性的病毒蛋白或單克隆抗體。
可以將小RNA病毒與其它的治療劑結(jié)合給藥。例如，可以將小RNA病毒可與一種或多種不同血清型或病毒株的小RNA病毒結(jié)合給藥。其它血清型或病毒株的小RNA病毒對(duì)細(xì)胞感染的受體要求與本發(fā)明的小RNA可以是相同的，也可以是不同的。
作為其它例子，可以小RNA病毒或其組合與一種或多種能夠調(diào)節(jié)或抑制被治療個(gè)體的免疫反應(yīng)的藥物結(jié)合給藥。以這種方式，個(gè)體對(duì)病毒感染的天然免疫反應(yīng)可以被改變，因此優(yōu)選地使病毒感染和/或溶瘤結(jié)果更有效。典型地，能夠改變免疫反應(yīng)的藥物是能夠抑制免疫反應(yīng)的藥物。能夠調(diào)節(jié)或抑制個(gè)體(如人類個(gè)體)免疫反應(yīng)的藥物見述于例如，The Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc，WhitehouseStation，NJ，USA.，再次并入其內(nèi)容作為參考。
小RNA病毒或其組合可以與一種或多種化療藥物(也稱為抗腫瘤藥)聯(lián)合使用?？鼓[瘤藥見述于例如，The Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA。例如，可以將小RNA病毒與下列化療藥物結(jié)合給藥，例如阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、美法侖(melphalan)、順鉑(cisplatin)、α-干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、甲氨喋呤和強(qiáng)的松)、依托泊甙(etoposide)、mBACOD(甲氨喋呤、博來霉素、多柔比星(doxorubicin)、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、地塞米松)、PROMACE/MOPP(強(qiáng)的松、甲氨喋呤(w/leucovin rescue)、多柔比星、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/mechlorethamine、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松和甲基芐肼)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、血管抑制素(angioinhibins)、TNP-470、硫酸戊聚糖鹽(pentosan polysulfate)、血小板因子4、血管抑制素(angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙立度胺(thalidomide)、SP-PG、和類似物。其它的化療藥物包括烷化劑，例如，氮芥，包括mechloethamine、melphan、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺；亞硝脲，包括卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、和鏈脲霉素；烷基磺酸鹽，包括白消安(busulfan)；三嗪類，包括達(dá)卡巴嗪；ethyenimines，包括硫替派(thiotepa)和六甲蜜胺；葉酸類似物，包括甲氨喋呤；嘧啶類似物包括5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌呤類似物，包括6-巰基嘌呤和6-硫代鳥嘌呤；抗腫瘤抗生素，包括放線菌素D；蒽環(huán)類，包括多柔比星、博來霉素、絲裂霉素C、和methramycin；激素和激素拮抗劑，包括他莫西芬(tamoxifen)和皮質(zhì)醇(cortiosteroids)；混雜藥物，包括順鉑和布喹那(brequinar)。小RNA病毒可以與博來霉素、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春新堿、dactamycin、丙卡巴肼、洛莫司汀或達(dá)卡巴嗪中的一種或多種結(jié)合給藥，以治療，例如，黑色素瘤。小RNA病毒可以與順鉑和卡鉑中的一種或多種結(jié)合給藥，以治療，例如，卵巢癌。其它可以與小RNA病毒結(jié)合使用以治療，例如乳腺癌的化療藥物的例子包括環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、甲氨喋呤(Amethopterin、Mexate、Folex)、和氟尿嘧啶(Fluorouracil、5-FU、Adrucil)[縮寫為CMF]；環(huán)磷酰胺、多柔比星(Adriamycin)、和氟尿嘧啶[縮寫為CAF]；多柔比星(Adriamycin)和環(huán)磷酰胺[縮寫為AC]；多柔比星(Adriamycin)和環(huán)磷酰胺及紫杉醇(Taxol)；多柔比星(Adriamycin)，然后是CMF；環(huán)磷酰胺、表柔比星(Ellence)、和氟尿嘧啶。用于治療例如女性乳腺癌的其它化療藥物包括，例如，多烯紫杉醇(Taxotere)、長(zhǎng)春瑞賓(Navelbine)、吉西他汀(Gemzar)、和卡培他汀(Xeloda)。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，小RNA病毒與一種或多種其它藥物(如一種或多種其它的小RNA病毒、一種或多種能夠調(diào)節(jié)或刺激免疫反應(yīng)的藥物、或一種或多種抗腫瘤藥物)的“結(jié)合”使用給藥，是指以小RNA病毒和其它藥物具有治療作用(如重疊暫時(shí)作用)的方式使用或給藥。可以將結(jié)合的成員同時(shí)給藥，或者以任何次序單獨(dú)給藥，以達(dá)到所需的治療作用。當(dāng)考慮結(jié)合治療時(shí)，小RNA病毒和其它藥物可以是物理混合物的形式，或者單獨(dú)提供，例如，以帶有或不帶有使用說明書的試劑盒的形式。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒還可以包括其它實(shí)施本發(fā)明的方法所需的成分，如緩沖液和/或稀釋液。典型地，試劑盒包括容納多種組件的容器或和使用本發(fā)明方法中試劑盒成分的說明書。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的藥物組合物包括小RNA病毒與一種或多種其它治療藥物物理混合的組合物，以及僅包括小RNA病毒作為治療活性藥物的組合物。
還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明的方法中，小RNA病毒可以與其它的腫瘤治療方法結(jié)合使用，例如腫瘤的外科減積或切除和/或化療和/或放療。例如，需要治療實(shí)體腫瘤時(shí)，小RNA病毒可以作為腫瘤外科減積或切除的輔助用藥使用。
如本文所用，無論是天然病毒還是人類刻意或非刻意修飾的病毒，“分離的”病毒是指已經(jīng)除去和其一起被發(fā)現(xiàn)的某些或所有的成分，或者從和其一起被發(fā)現(xiàn)的某些或所有成分中除去。這些成分是指污染的成分。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，“分離的”病毒并不需要是病毒的純制劑，純制劑的含義是所有污染成分已經(jīng)被除去。因此，當(dāng)非病毒成分已經(jīng)部分或全部地從病毒中除去時(shí)，病毒將被視為是“分離的”。例如，當(dāng)超過大約50％的污染物質(zhì)被除去時(shí)，病毒將被視為是“分離的”。優(yōu)選超過60％的污染物質(zhì)被除去，更優(yōu)選超過70％的污染物質(zhì)被除去。典型地，分離的病毒超過大約80％或超過大約90％的污染物質(zhì)被除去。更典型地，超過大約95％、或大約97％污染物質(zhì)被除去。在一個(gè)實(shí)施方式中，超過99％的污染物質(zhì)被除去。
如本文所用，用于細(xì)胞時(shí)，“在基本上不存在ICAM-1的情況下”是指細(xì)胞表達(dá)很少的ICAM-1，或不表達(dá)ICAM-1。特別地，應(yīng)當(dāng)理解到，這種細(xì)胞表達(dá)的ICAM-1不足以為細(xì)胞被病毒溶解性感染提供基礎(chǔ)，所述病毒的感染要求存在有ICAM-1。
如本文所用，使細(xì)胞與病毒“接觸”是指將病毒置于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使病毒有機(jī)會(huì)與細(xì)胞接觸，這可以導(dǎo)致病毒成功地細(xì)胞或通過凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
如本文所用，“病毒感染”是指病毒侵入細(xì)胞，隨后病毒在細(xì)胞中復(fù)制或通過凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
如本文所用，“感染復(fù)數(shù)”是指當(dāng)病毒與細(xì)胞接觸時(shí)，病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比例。
如本文所用，“細(xì)胞溶解”是指細(xì)胞的細(xì)胞膜破壞，隨后釋放出細(xì)胞的所有或部分內(nèi)容物，或者通過凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
如本文所用，“完全溶解”是指多細(xì)胞培養(yǎng)物中的每個(gè)細(xì)胞的溶解。
如本文所用，“培養(yǎng)條件”是指培養(yǎng)細(xì)胞所用的條件，包括單不限于溫度、培養(yǎng)容器的種類、濕度、CO2或任何培養(yǎng)容器中使用的其它氣體的濃度、培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)細(xì)胞的初始密度、以及細(xì)胞是否被病毒感染、初始的感染復(fù)數(shù)。
如本文所用，“細(xì)胞關(guān)聯(lián)”的病毒是指吸附于其中已經(jīng)生成病毒的細(xì)胞的一部分中或包繞在其中的病毒。因此，宿主細(xì)胞溶解前病毒是細(xì)胞關(guān)聯(lián)的。當(dāng)細(xì)胞開始溶解時(shí)，病毒可以仍然吸附于破裂細(xì)胞的一部分或包繞在其中，保持與細(xì)胞關(guān)聯(lián)。但是，當(dāng)病毒被釋放至培養(yǎng)基中時(shí)，便不再與細(xì)胞關(guān)聯(lián)。
如本文所用，當(dāng)細(xì)胞膜破裂，并且從細(xì)胞中釋放出至少一些細(xì)胞內(nèi)容物時(shí)，細(xì)胞被“破壞”。例如，可以通過冷凍-復(fù)溫、超聲或去污劑處理來破壞細(xì)胞。
如本文所用，“收取”病毒是指從之前已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中收集生成的病毒的行為。如果病毒仍然與細(xì)胞關(guān)聯(lián)，回收病毒可以涉及破壞宿主細(xì)胞。可選擇但并非優(yōu)選地，可以從培養(yǎng)基中收取已經(jīng)釋放至培養(yǎng)基中的病毒粒子。
如本文所用，細(xì)胞變得腫脹、外觀呈顆粒狀、細(xì)胞膜破壞表示“細(xì)胞病變作用”。顯示細(xì)胞病變作用的細(xì)胞在活細(xì)胞計(jì)數(shù)染色時(shí)為陰性，因?yàn)樗鼈償z取了染色染料，或者細(xì)胞DNA發(fā)生降解。
如本文所用，“粘附細(xì)胞”是在細(xì)胞培養(yǎng)中粘附于培養(yǎng)容器的細(xì)胞。粘附細(xì)胞的例子包括單層細(xì)胞，其為在培養(yǎng)容器表面上形成細(xì)胞單層的細(xì)胞?！皯腋〖?xì)胞”或“懸浮的細(xì)胞”是指在細(xì)胞培養(yǎng)中不粘附于培養(yǎng)容器的細(xì)胞。懸浮細(xì)胞可以“旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)”的方式生長(zhǎng)，這是一種在培養(yǎng)過程中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)攪拌的培養(yǎng)方法。
如本文所用，“細(xì)胞的生存力”或“活細(xì)胞百分比”是指在種群中未顯示細(xì)胞病變作用的細(xì)胞的百分比。
如本文所用，“收取時(shí)間”是指收集和純化小RNA病毒的時(shí)間點(diǎn)。優(yōu)選地，當(dāng)效價(jià)足夠高、病毒仍然與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的時(shí)候收取病毒。盡管即使在細(xì)胞完全溶解后也可以收取病毒，仍需在病毒從細(xì)胞釋放之前收取病毒，以簡(jiǎn)化純化過程。因此，對(duì)細(xì)胞生存力進(jìn)行定期測(cè)量，以作為病毒是否仍與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的指征。通常，當(dāng)至少5％的細(xì)胞存活時(shí)收取病毒。優(yōu)選地，當(dāng)20-95％的細(xì)胞存活、更優(yōu)選為35-90％的細(xì)胞存活、最優(yōu)選為50-80％的細(xì)胞存活時(shí)收取病毒。
為更清晰地理解本發(fā)明，參考下列實(shí)施例和附圖對(duì)優(yōu)選方式進(jìn)行描述，其不應(yīng)當(dāng)理解成對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。
材料和方法細(xì)胞和病毒柯薩奇病毒A21(CVA21)原型病毒株Kuykendall和三個(gè)臨床分離株(#272101、#272598和#275238)從Dr Margery Kennett，Entero-respiratory Laboratory，F(xiàn)airfield Hospital，Melbourne，Victoria，Australia處獲得。分離株#272101從一名26歲的男性HIV感染者中獲得，分離株#275238從一名死于嬰兒猝死綜合癥的3個(gè)月嬰兒中獲得，分離株#272598從一名患有急性哮吼的8歲男孩中分離。臨床CVA21分離株在Hela細(xì)胞和/或人肺成纖維細(xì)胞或HeLa-T細(xì)胞中大約傳代三次，在表達(dá)ICAM-1的橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞(RD-ICAM-1)中傳代一次(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，R.A.Ingham，G.F.Burns和R.D.Barry.1997.Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor butrequires intercellular adhesion molecule1for cell entry(柯薩奇病毒A21與衰變加速因子結(jié)合但需要細(xì)胞間粘附分子1以侵入細(xì)胞).J.Virol.714736-4743)。CVA21的原型病毒株在HeLa和/或人肺成纖維細(xì)胞或HeLa-T細(xì)胞中大約傳代10次，在RD-ICAM-1細(xì)胞中傳代3-4次。
CVA21原型病毒株(Kuykendall，GenBank編號(hào)AF465515)從Dr Margery Kennett處獲得，在SkMel28(在此指定為CVA21親代)細(xì)胞中進(jìn)行雙噬斑純化。對(duì)CVA21-DAFv進(jìn)行生物選擇，通過如本文所述在RD細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代在ICAM-1陰性細(xì)胞中生長(zhǎng)。體內(nèi)研究用的病毒在SkMel28(CVA21親代)或RD細(xì)胞(CVA21-DAFv)的單層中制備，并如上文所述，通過以5-30％的蔗糖梯度進(jìn)行速度離心來純化，將峰值餾分匯集在一起，使用PBS透析，并儲(chǔ)存在-80℃下。使用Reed和Muench終點(diǎn)法，在SkMel28細(xì)胞上測(cè)定病毒母液(CVA21親代和CVA21-DAFv)的效價(jià)。
HeLa細(xì)胞從American Type Culture Collection(美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心)Manassas，VA，USA獲得；同時(shí)，中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞從Dr Bruce Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia處獲得。
人黑色素瘤細(xì)胞系SkMel28從Dr.S.J.Ralph(Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Monash University，Victoria，Australia)獲得；橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞從Dr Margery Kennett(Entero-respiratory Laboratory，F(xiàn)airfield Hospital，Melbourne，Victoria，Australia)處獲得；中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞從Dr Bruce Loveland(Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia)處獲得；卵巢癌細(xì)胞系DOV13從Dr lan Campbell(Peter MacCallum Cancer Centre，Melbourne，Australia)處獲得。CHO細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)ICAM-1或DAF(CHO-DAF和CHO-ICAM-1細(xì)胞)。CVA21原型病毒株(Kuykendall，GenBank編號(hào)AF465515)從Dr Margery Kennett處獲得，并在SkMel28細(xì)胞中繁殖。
人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)、上皮卵巢癌細(xì)胞系(OVHS-1、OAW-42、DOV13)和無限增殖化的正常人卵巢表面上皮細(xì)胞系(HOSE)從Peter MacCallum Cancer Centre(Melboume，Australia)獲得；人前列腺細(xì)胞系(PC3和DU145)從Garvan Institute，Sydney，Australia處獲得，LNCaP細(xì)胞從ElizabethWilliams，Bernard O′Brien Institute of Microsurgery，Melbourne，Australia處獲得；人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW620)從Peter MacCallumCancer Centre獲得，HT-29從John Hunter Hospital(Newcastle，Australia)獲得。
抗體對(duì)ICAM-1的第一個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)有特異性的抗-ICAM-1MAbWEHI(Berendt，A.R.，A.McDowell，A.G.Craig，P.A.Bates，M.J.E.Sternberg，K.Marsh，C.1.Newbold，和N.Hogg.1992.The binding siteon ICAM-1 for Plasmodium faiparum-infected erythrocytes overlaps，butis distinct from the LFA-1 binding site(惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞的ICAM-1結(jié)合位點(diǎn)覆蓋LFA-1結(jié)合位點(diǎn)，但與其不同).Cell6871-81)由Dr Andrew Boyd，Queensland Institute of Medical Research，Queensland，Australia提供?？?DAF MAb IA10(IgG2a)識(shí)別DAF的第一個(gè)短共有重復(fù)片斷(SCR)，VIIIA7(IgG1)識(shí)別第三個(gè)SCR和第二個(gè)SCR的一部分(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber和V.Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in theperipheral blood of normal individuals and patients with paroxysmalnocturnal hemoglobinuria(正常個(gè)體和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者外周血中衰變加速因子的分布).J.Exp.Med.16275-92)，IH4(IgG1)識(shí)別DAF的第三個(gè)SCR(Coyne，K.E.，E.S.Hall，M.A.Thompson，M.A.Arce，T.Kinoshoita，T.Fujita，D.J.Anstee，W.Rosse，和D.M.Lublin.1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatorydomains in human decay accelerating factor(人衰變加速因子表位、糖基化位點(diǎn)、和補(bǔ)體調(diào)解功能結(jié)構(gòu)區(qū)的分析).J.Immunol.1492906-2913)，而IIH6(IgG1)識(shí)別第四個(gè)SCR(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber和V.Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in theperipheral blood of normal individuals and patients with paroxysmalnocturnal hemoglobinuria(正常個(gè)體和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者外周血中衰變加速因子的分布).J.Exp.Med.16275-9)。MAbs IA10、VIIIA7和IIH6由Dr Taroh Kinoshita，Department of Immunoregulation，Osaka University，Osaka，Japan饋贈(zèng)。MAb IH4由Dr Bruce Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia饋贈(zèng)。
對(duì)DAF的SCR3有特異性的抗-DAF mAb IH4(Coyne，K.E.，S.E.Hall，S.Thompson，M.A.Arce，T.Kinoshita，T.Fujita，D.J.Anstee，W.Rosse，和D.M.Lublin.1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatory domains in human decay accelerating factor(人衰變加速因子表位、糖基化位點(diǎn)、和補(bǔ)體調(diào)解功能結(jié)構(gòu)區(qū)的基因定位分析).J.Immunol.1492906-2913)和人重組可溶性DAF(sDAF)由Dr Bruce Loveland饋贈(zèng)；指向SCR1的抗-DAF mAb IA10由Dr TarohKinoshita(Department of Immunoregulation，Osaka University，Osaka，Japan)饋贈(zèng)；抗-ICAM-1WEHI mAb指向ICAM-1的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)(Hoover-Litty，H.和J.M.Greve.1993.Formation of rhinovirus-solubleICAM-1complexes and conformational changes in the virion(形成鼻病毒可溶性ICAM-1復(fù)合體和病毒體中的構(gòu)象變化).J Virol.67390-397)，由Dr Andrew Boyd(Queensland Institute for Medical Research，Queensland，Australia)提供。
病毒純化和放射性同位素標(biāo)記結(jié)合試驗(yàn)將6孔組織培養(yǎng)板中的匯合成片的RD-ICAM-1細(xì)胞單層在37℃下用500μl合適的CVA21病毒株(1×105TCID50/ml)接種1h。用不含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM(ICN Biochemicals，Aurora，Ohio，USA)沖洗三次，除去未結(jié)合的病毒，然后加入不含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM，將細(xì)胞單層繼續(xù)培育2h，然后加入300μCi[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸Trans-Label(ICN Radiochemicals，Irvine，California，USA)。然后將感染的單層在37℃下在5％CO2的環(huán)境中培育12h。在三次冷凍/復(fù)溫循環(huán)后，將病毒溶解物在5-30％的蔗糖梯度下進(jìn)行純化(Shafren，D.R.，R.C.Bates，M.V.Agrez，R.L.Herd，G.F.Burns和R.D.Barry.1995.Coxsackieviruses B1，B3andB5use decay accelerating factor as a receptorfor cell attachment(柯薩奇病毒B1、B3和B5使用衰變加速分子作為細(xì)胞吸附的受體).J.Virol.693873～3877)。從各試管的底部收集餾分，并在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合試驗(yàn)中使用的160S峰餾分進(jìn)行定位。
使用HeLa細(xì)胞的放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合試驗(yàn)在24孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行(Shafren等人，1995)。使用細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的病毒結(jié)合試驗(yàn)。在存在300μl(大約1×105CPM)的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的情況下，在室溫下將大約1×106細(xì)胞在800μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中培育2小時(shí)。然后將細(xì)胞用溶解在200μl0.2MNaOH-1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中的無血清DMEM沖洗四次，然后通過液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的結(jié)合量。當(dāng)需要時(shí)，在加入放射性同位素標(biāo)記的病毒之前，將細(xì)胞與20μg/ml抗-DAF或抗-ICAM-1MAb或磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)(SigmaChemicals，Sydney，New South Wales，Australia)(每5×106細(xì)胞1.0U)(Davitz，M.A.，M.G.Low和V.Nussenzweig.1986.Release ofdecay-accelerating factor (DAF)from the cell membrane byphosphatidylinositol-specific phospholipase C(PI-PLC).Selectivemodification of a complement regulatory protein(通過磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)從細(xì)胞膜上釋放衰變加速因子(DAF)。補(bǔ)體調(diào)控蛋白的選擇性修飾).J.Exp.Med.1631150-1161)在37℃下預(yù)培育1小時(shí)。
病毒感染性測(cè)定在96孔組織培養(yǎng)板中，將匯合成片的RD和RD-ICAM-1細(xì)胞單層用含有1％胎牛血清(FCS)的DMEM中的CVA21的10倍連續(xù)稀釋液(100μtl/孔，四份)接種，并在37℃、5％CO2的環(huán)境下培育48小時(shí)。通過用100μl/孔結(jié)晶紫/甲醇溶液(0.1％結(jié)晶紫、20％甲醇、4.0％甲醛/PBS)對(duì)接種的單層染色24小時(shí)，對(duì)細(xì)胞生存力進(jìn)行定量。在蒸餾水中沖洗后，在multiscan酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定平板讀數(shù)儀(FlowLaboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處讀取染色細(xì)胞單層的相對(duì)吸光度。如果吸光度值小于對(duì)照無病毒孔的標(biāo)準(zhǔn)誤差的3倍，則該孔被記為陽性，使用Reed和Muench法計(jì)算50％終點(diǎn)效價(jià)(Reed，L.J.和H.A.Muench.1938.A simple method of estimating fifty per centendpoints(一種估計(jì)50％終點(diǎn)的簡(jiǎn)單方法).Am.J.Hyg.27493-497)。
需要用抗-受體MAb對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，將細(xì)胞在存在MAb(1μg/ml)的情況下在37℃下培育1h。然后將細(xì)胞單層用合適病毒的四份樣品接種，在37℃、5％CO2的環(huán)境中培育48h，然后如上文所述進(jìn)行染色。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染如上文所述，對(duì)CHO和RD細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以表達(dá)ICAM-1和/或DAF(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，S.J.Greive，G.F.Burns和R.D.Barry.1997.Mouse cells expressing human intercellular adhesionmolecule-1 are susceptible to infection by coxsackievirus A21(表達(dá)人細(xì)胞間粘附分子-1的小鼠細(xì)胞易于被柯薩奇病毒A21感染).J.Virol.71785-789)。簡(jiǎn)言之，將500μl等份細(xì)胞(5×106至1×107細(xì)胞/ml)重新懸浮在電穿孔緩沖液(20mM HEPES、137mM NaCI、5mM KCl、0.7mM Na2PO4、6mM葡萄糖，pH7.05)中，并與75μg編碼DAF或ICAM-1的pEF-BOS(Mizushima，S.和S.Nagata.1990.pEF-BOS，apowerful mammalian expression vector(一種強(qiáng)力的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEF-BOS，).Nucl.Acid.Res.185322)和5μg pcDNA.neo在電穿孔池(Bio-Rad，Richmond，California，USA)中混合。用Bio-Rad基因脈沖器在300V和250μF的條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖，然后接種在組織培養(yǎng)瓶中，在37℃下培育48h，直至形成匯合連片的單層。表達(dá)受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含有G-418(400μg/ml)的DMEM中進(jìn)行選擇，并使用合適的抗-受體MAb通過熒光活化細(xì)胞分選進(jìn)行進(jìn)一步富集。
流式細(xì)胞術(shù)通過流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的DAF和ICAM-1表面表達(dá)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，將分散的細(xì)胞(1×106)與適當(dāng)?shù)腗Abs(PBS中5μg/ml)在冰上培育20分鐘。然后將細(xì)胞用PBS沖洗，在1000xg下沉淀5分鐘，重新懸浮在100μl稀釋在PBS中的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段(DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分鐘。將細(xì)胞如上文所述進(jìn)行沖洗和沉淀，重新懸浮在PBS中，用FACStar分析儀(Becton Dickenson，Sydney，Australia)進(jìn)行DAF和ICAM-1表達(dá)的分析。
將分散的細(xì)胞(1×106)與抗-DAF IH4或抗-ICAM-1mAbs(5μg/ml，稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]中)在冰上培育20分鐘。然后將細(xì)胞用PBS沖洗，在1000xg下沉淀5分鐘，并重新懸浮在100μl PBS中以1∶100稀釋的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段(DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分鐘。將細(xì)胞如上文所述進(jìn)行沖洗和沉淀，重新懸浮在PBS中，用FACStar分析儀(BectonDickenson，Sydney，Australia)進(jìn)行DAF和ICAM-1表達(dá)的分析。
病毒RNA序列分析將CVA21分離株在RD-ICAM-1細(xì)胞的匯合單層中繁殖。將病毒細(xì)胞溶解物通過低速離心預(yù)澄清，通過在4℃下在SW41Ti旋轉(zhuǎn)器中以40000rpm超速離心3h，沉淀上清液中的病毒體。病毒沉淀重新懸浮在TE緩沖液(10mM Tris-HCI、1mM EDTA，pH7.5)中，使用TRIZOL Ls試劑(Gibco BRL Life Technologies)從每株中分離RNA，使用前述的長(zhǎng)距離策略對(duì)基因組的P1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增(Lindberg，A.M.，C.Polack和S.Johansson.1997.Amplification and cloning of completeenterovirus genomes by long distance PCR(通過長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增和克隆全部腸病毒基因組).J.Virol.Meth.65191-199)。使用引物步移策略，采用ABI Prism BigDyeTMterminator cycle sequencing ready reaction試劑盒(PE Biosystems，Sweden)(Lindberg等人1997)根據(jù)各制造商的說明書，從純化的PCR擴(kuò)增子測(cè)定CVA21P1區(qū)的核苷酸序列。使用Clustal X程序生成核苷酸序列排比(Thompson，J.D.，D.G.Higgins和T.J.Gobson.1994.Clustal_W-improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting，position-specificgap penalties and weight matrix choice(Clustal_W通過序列加權(quán)/位置特異性缺口補(bǔ)償和權(quán)矩陣選擇提高漸進(jìn)多序列排比的敏感性).NucleicAcids Res.224673-4680)。
核苷酸編號(hào)本研究中所述的CVA21臨床分離株#272101/#275238和#272598的P1區(qū)(外殼編碼區(qū))核苷酸序列已經(jīng)提交Genbank，指定的編號(hào)分別是AY319942、AY319943和AY319944。
病毒的分子特征和結(jié)構(gòu)模擬使用QlAamp病毒RNAmini試劑盒從CVA21親代和CVA21-DAFv病毒株中提取病毒RNA，使用CVA21特異性引物根據(jù)每個(gè)生產(chǎn)廠商的說明書用一步RT-PCR(Qiagen一步RT-PCR試劑盒)對(duì)外殼編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。使用ABI Prism BigDyeTMterminator cycle sequencing readyreaction試劑盒(PE Biosystems)，根據(jù)每個(gè)生產(chǎn)廠商的說明書，使用純化的PCR產(chǎn)物(QlAquick Gel提取試劑盒，QIAGEN GmbH)在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中測(cè)定核苷酸序列。
CVA21主要結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-3)的模型用Modeller程序在DEC-α工作站上建立，其方式類似于脊髓灰質(zhì)炎病毒受體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。CVA21親代序列與同源的腸病毒外殼蛋白進(jìn)行排比，后者的分子結(jié)構(gòu)此前已經(jīng)確定，并含有50％以上的序列同一性，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1、EV1、EV11、CVB3、CVA9和豬水泡病病毒(PDB代碼分別為1AR7、1EV1、1H8T、1COV、1D4M和1OOP)，通過FASTA生成排比。ICAM-1和DAF相對(duì)CVA21-DAFv外殼的位置分別根據(jù)其配體與人鼻病毒3和EV12的接觸進(jìn)行排比。
病毒感染性測(cè)定將96孔板中的匯合細(xì)胞單層用100μl病毒的10-倍連續(xù)稀釋液接種，在37℃下培育72小時(shí)。為了對(duì)細(xì)胞生存率進(jìn)行定量，在用結(jié)晶紫/甲醇溶液進(jìn)行固定之前，對(duì)通過顯微鏡對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行觀察。使用Reed和Muench法計(jì)算50％終點(diǎn)效價(jià)(Reed，L.J和H.A.Muench.1938.Asimple method of estimating fifty per cent endpoints(一種估計(jì)50％終點(diǎn)的簡(jiǎn)單方法).Am.J.Hyg.27493-497)。為了評(píng)價(jià)mAb對(duì)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的影響，在加入病毒之前，將細(xì)胞單層與50μl抗-DAF SCR3IH4(5μg/ml)mAb在37℃下培育1小時(shí)，如上文所述對(duì)細(xì)胞溶解進(jìn)行定量。對(duì)于用抗-DAF SCR1mAb阻斷的細(xì)胞溶解測(cè)定，在用病毒(106TCID50)攻擊前，將6孔板中的RD細(xì)胞單層用抗-DAF SCR1mAb(15μg/ml)進(jìn)行預(yù)處理。在37℃下培育1小時(shí)后，未結(jié)合的病毒被除去，將單層用Dulbecco′s Modified Eagle′s Media(DMEM)覆蓋。通過SkMel28細(xì)胞上的滴定研究病毒產(chǎn)量，評(píng)價(jià)抗-DAF SCR1 mAb的抑制作用。
放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合試驗(yàn)將親代和CVA21-DAFv病毒株分別在SkMel28和RD細(xì)胞中用35S-蛋氨酸進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記，并在5-30％的蔗糖梯度下純化。將分散的細(xì)胞(1×106)與mAb(20g/ml稀釋在含有1％牛血清白蛋白[BSA]的DMEM中)在室溫下預(yù)培育1小時(shí)，然后在含有2％胎牛血清(FCS)的DMEM中與35S-標(biāo)記的蔗糖純化病毒(5×105cpm)在室溫下培育1小時(shí)。用DMEM-2％FCS沖洗三次后，在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定35S-蛋氨酸標(biāo)記病毒的結(jié)合量。
結(jié)合DAF和ICAM-1的病毒體的沉淀將純化的放射性同位素標(biāo)記的160S CVA21-DAFv病毒體(2.5×106cpm)與CHO-DAF或CHO-ICAM-1細(xì)胞(2×107)在DMEM-1％BSA中在4℃下培育2小時(shí)。用DMEM-2％FCS沖洗四次，除去未結(jié)合的病毒體，在37℃下使結(jié)合細(xì)胞的病毒體洗脫2小時(shí)。離心除去細(xì)胞，被洗脫的病毒體在5-30％蔗糖梯度上被分層，在SW41Ti旋轉(zhuǎn)器中在4℃下以36,000rpm離心95分鐘。從梯度底部收集餾分(～700μl)，通過液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定放射活性。
通過抗-DAF mAb洗脫結(jié)合細(xì)胞的病毒將CHO-DAF細(xì)胞(3×106)與放射性同位素標(biāo)記的病毒(4×105cpm)在4℃下培育2小時(shí)。用冰冷的DMEM-2％FCS沖洗四次，除去未結(jié)合的病毒體，將細(xì)胞重新懸浮在100μl DMEM-2％FCS中，并與不同濃度(0-50μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb(IA10)培育。在冰上mAb競(jìng)爭(zhēng)1小時(shí)后，細(xì)胞沉淀。收取上清液，監(jiān)測(cè)被洗脫病毒的水平，結(jié)果表示成放射性同位素標(biāo)記病毒被洗脫的細(xì)胞的百分比。
用可溶性DAF中和病毒將人重組sDAF(85μg/ml，稀釋在PBS中)與1,000 50％組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)的CVA21-DAFv培育。在37℃下培育1小時(shí)后，將病毒-DAF混合物提供給96孔板中的RD細(xì)胞單層，繼續(xù)培育48小時(shí)。
前列腺腫瘤異種移植物的CVA21-DAFv治療根據(jù)University ofNewcastle Animal Care and Ethics Committee(紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)動(dòng)物中心和倫理委員會(huì))批準(zhǔn)的方案，將SCID小鼠在無病原體的條件下圈養(yǎng)。PC3細(xì)胞在體外生長(zhǎng)，收取，用PBS沖洗兩次，并懸浮在無菌PBS中。如臺(tái)盼藍(lán)染色法所評(píng)價(jià)，用于異種移植的細(xì)胞的95％以上是存活的。在異種移植之前，將動(dòng)物用3％的異熒烷(isofiuorane)麻醉。通過在側(cè)腹部皮下注射2×106PC3細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞異種移植到被麻醉的7周齡SCID小鼠側(cè)腹部。每天監(jiān)測(cè)異種移植物的生長(zhǎng)，并用卡鉗測(cè)量。使用球體公式計(jì)算腫瘤體積的估計(jì)值。一旦發(fā)展成可觸及的腫瘤(50-100mm3)，通過靜脈注射將CVA21親代、CVA21-DAFv(3×107TCID50)或PBS給予PC3腫瘤，并監(jiān)測(cè)42天。通過病毒感染性測(cè)定監(jiān)測(cè)血清中的病毒效價(jià)。
結(jié)果I.腸病毒外殼相互作用CVA21臨床病毒株與DAF和ICAM-1結(jié)合為了確定CVA21的臨床分離株與DAF和ICAM-1的結(jié)合方式與原型Kuykendall病毒株是相似還是不同，在放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)中使用被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成表達(dá)DAF或ICAM-1的CHO細(xì)胞。對(duì)于所有的CVA21分離株，在不存在DAF或ICAM-1的情況下沒有觀察到與CHO細(xì)胞的顯著結(jié)合(圖1)。所有的CVA21病毒株與表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞結(jié)合(圖1A)，該相互作用此前在原型CVA21 Kuykendall病毒株中得到證明。如預(yù)計(jì)，所有的臨床CVA21分離株還與CHO細(xì)胞表面上表達(dá)的ICAM-1結(jié)合(圖1B)。通過抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)功能區(qū)1特異性MAb完全消除病毒與ICAM-1結(jié)合的作用，證實(shí)了CVA21/ICAM-1相互作用的特異性(圖1B)。總之，這些結(jié)果證實(shí)，CVA21的臨床分離株以類似于原型病毒株的方式與兩種獨(dú)立的細(xì)胞受體DAF和ICAM-1結(jié)合。
為了進(jìn)一步表征CVA21臨床分離株與DAF/ICAM-1的相互作用，在廣泛共同表達(dá)DAF和ICAM-1的HeLa細(xì)胞上進(jìn)行CVA21病毒結(jié)合試驗(yàn)。通過獨(dú)立受體的MAb阻斷或結(jié)合的MAb阻斷對(duì)CVA21的結(jié)合進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖2)。將原型Kuykendall病毒株(圖2A)的細(xì)胞粘附與CVA21臨床分離株#272101(圖2B)進(jìn)行比較，在不存在MAb受體阻斷的情況下，二者均顯示出很高的與HeLa細(xì)胞的結(jié)合水平(圖2)。DAF SCR1的特異性MAb阻斷部分地阻斷了病毒結(jié)合，但是，由于與ICAM-1的相互作用，不能完全消除病毒的粘附。當(dāng)與ICAM-1的接觸被MAb阻斷抑制時(shí)，病毒結(jié)合降低，臨床分離株#272101比原型病毒株更明顯(圖2B)，但是由于病毒可選擇與DAF粘附，從而并未被完全抑制。抗-DAF SCR1和抗+ICAM-1結(jié)構(gòu)功能區(qū)1MAb抑制病毒粘附的能力可以達(dá)到與用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(其切割GPI-連接蛋白)和抗-ICAM-1MAb結(jié)合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理相同的程度，從而證明了CVA21臨床和原型病毒株對(duì)DAF和ICAM-1 N-端功能結(jié)構(gòu)區(qū)的特異性。綜合在一起，這些結(jié)果證實(shí)，臨床分離株#272101與原型病毒株類似，與DAF的第一個(gè)SCR和ICAM-1的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合。CVA21與DAF和ICAM-1的結(jié)合不是累加性的對(duì)CVA21臨床分離株與DAF或ICAM-1單獨(dú)結(jié)合或一起結(jié)合進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確定宿主細(xì)胞表面上兩種受體的存在是否會(huì)促成累加性病毒體細(xì)胞粘附。為解決這一問題，將CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染成單獨(dú)表達(dá)DAF或ICAM-1、或二者均表達(dá)。流式細(xì)胞儀分析顯示，在單獨(dú)表達(dá)受體或一起表達(dá)受體的細(xì)胞上DAF或ICAM-1表達(dá)水平是可比的(圖3A)。對(duì)于所有的CVA21病毒株，均觀察到與CHO細(xì)胞本底結(jié)合的最低水平。所有的CVA21病毒株均表現(xiàn)出與單獨(dú)表達(dá)的DAF或ICAM-1有顯著的結(jié)合水平(圖3B)。出人意料地，與這些受體單獨(dú)表達(dá)時(shí)的結(jié)合量相比，與共同表達(dá)DAF和ICAM-1的CHO細(xì)胞結(jié)合的放射性同位素標(biāo)記病毒的量顯著降低(圖3B)。
CVA21的臨床分離株可以通過與DAF的相互作用誘導(dǎo)ICAM-1陰性細(xì)胞的溶解性感染ICAM-1是CVA21原型病毒株成功侵入宿主細(xì)胞的主要決定子。但是，在存在MAb交聯(lián)DAF的情況下，CVA21介導(dǎo)的缺少ICAM-1表達(dá)的細(xì)胞溶解性感染是可能的。我們考察了CVA21臨床分離株是否能夠通過分立的與交聯(lián)DAF的相互作用而溶解性地感染ICAM-1陰性的細(xì)胞。在用單一導(dǎo)入復(fù)數(shù)(single input multiplicity)的CVA21攻擊之前，RD細(xì)胞單層不經(jīng)處理，或者用導(dǎo)向單個(gè)SCR 1、2、3、或4的特異性MAb或者抗-DAF SCR1和SCR3的組合進(jìn)行預(yù)處理。
在用導(dǎo)向DAF SCR2、3和4的MAb預(yù)處理過的RD細(xì)胞培養(yǎng)中觀察CVA21-介導(dǎo)的溶解性感染(圖4)。通過向用抗SCR3 DAF MAb預(yù)處理過的細(xì)胞中加入抗-SCR1 DAF MAb完全阻斷細(xì)胞溶解這一發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了特異性CVA21外殼/DAF相互作用確實(shí)介導(dǎo)著溶解性細(xì)胞感染。
有趣的是，兩種CVA21臨床分離株#275238和#272598能夠在不存在抗-DAF MAb交聯(lián)的情況下溶解性地感染ICAM-1陰性的RD細(xì)胞(圖4)。通常，腸病毒與DAF結(jié)合被認(rèn)為是病毒體因與其它內(nèi)化受體的相互作用而螯合，因此目前沒有闡明僅經(jīng)由與DAF的相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞溶解性感染的結(jié)論性報(bào)道。在不存在DAF和ICAM-1二者抗體交聯(lián)的情況下，CVA21臨床分離株#275238和#2727598溶解性地感染細(xì)胞的能力是該受體用途的首次發(fā)現(xiàn)。用抗DAF SCR1 MAb阻斷后，細(xì)胞溶解被完全抑制(圖4)，這些CVA21病毒株生成的子代病毒顯著減少，這進(jìn)一步證實(shí)了該發(fā)現(xiàn)的完整性。
為了進(jìn)一步分析這種新的DAF用途，在單獨(dú)表達(dá)DAF(RD)或共同表達(dá)ICAM-1(RD-ICAM-1)的單層細(xì)胞培養(yǎng)物上，對(duì)CVA21的臨床和原型病毒株的溶解感染性進(jìn)行滴定。所有的CVA21病毒株在表達(dá)DAF和ICAM-1二者的細(xì)胞中均表現(xiàn)出很高的細(xì)胞溶解活性水平，同時(shí)，僅有分離株#275238和#2727598被觀察到在僅表達(dá)DAF的RD細(xì)胞中誘導(dǎo)的溶解效價(jià)與RD-ICAM-1細(xì)胞中所得到的是可比的。實(shí)際上，分離株#275238在RD細(xì)胞中獲得的溶解效價(jià)比在RD-ICAM-1細(xì)胞中高大約20倍。有趣的是，在很高的病毒導(dǎo)入復(fù)數(shù)(viral inputmultiplicityes)下，分離株#272101對(duì)僅表達(dá)DAF的RD細(xì)胞另外顯示出水平顯著的溶解性感染。原型病毒株在RD細(xì)胞中的活性水平最小但可以檢出，這可能是由于它是DAF利用表型增強(qiáng)的病毒體的最小群體。
CVA21臨床分離株ICAM-1結(jié)合足跡的分析由于所有考察的CVA21病毒株均顯示出很強(qiáng)的ICAM-1吸附/內(nèi)化表型(圖1)，因此我們研究了它們是否具有保守的ICAM-1結(jié)合足跡。構(gòu)成CVA21-ICAM-1受體結(jié)合足跡的殘基之前已經(jīng)使用低溫電子顯微鏡用純化的ICAM-1和原型Kuykendall病毒體進(jìn)行了鑒定。所有CVA21病毒株P(guān)1編碼區(qū)的氨基酸序列分析表明存在有保守ICAM-1足跡，與之前公開的足跡相同，除了VP2168處的保守編碼變化，Ala改變?yōu)閂al(圖5)。
為了解釋CVA21臨床分離株相對(duì)于原型病毒株在不存在ICAM-1的情況下溶解性感染表達(dá)DAF的細(xì)胞的能力增強(qiáng)(圖4)，我們搜索了ICAM-1結(jié)合足跡之外的氨基酸差異(圖5)。在P1區(qū)檢測(cè)到三個(gè)CVA21臨床株和原型病毒株之間的大量氨基酸改變(圖5)。在VP4編碼區(qū)內(nèi)沒有檢測(cè)到任何CVA21病毒株之間的氨基酸改變。在VP3、VP2和VP1外殼蛋白中，所有的臨床分離株在相同位置檢測(cè)到13個(gè)相對(duì)于原型病毒株的相同改變。另外，分離株#272101在位點(diǎn)VP3 239顯示出不同的改變(Ser，相對(duì)的其它兩個(gè)臨床分離株為Ala)，并且與原型病毒株相比進(jìn)一步具有9個(gè)獨(dú)立的分散在VP1、VP2、VP3中的氨基酸改變(圖5)。分離株#272598和#272238在氨基酸水平上是相同的，而在核苷酸水平上檢測(cè)到二者之間有許多沉默突變。
II.柯薩奇病毒A21變異體的生物選擇和分子特征不依賴ICAM-1作用而溶解性地感染細(xì)胞的CVA21變異體的生物選擇CVA21原型病毒株的細(xì)胞吸附是通過與DAF和/或ICAM-1的結(jié)合介導(dǎo)的。僅有ICAM-1相互作用加速細(xì)胞內(nèi)化，CVA21和DAF之間的相互作用并不能誘導(dǎo)生產(chǎn)性的溶解性細(xì)胞感染，除非DAF被抗-DAFmAb交聯(lián)。當(dāng)細(xì)胞用ICAM-1轉(zhuǎn)染時(shí)，CVA21也可以溶解性地感染表達(dá)DAF的RD細(xì)胞，這表明CVA21不能在RD細(xì)胞中復(fù)制僅僅是在細(xì)胞侵入層面上。人黑色素瘤細(xì)胞系SkMel28支持CVA21原型病毒株生長(zhǎng)至很高的病毒效價(jià)，流式細(xì)胞分析顯示ICAM-1和DAF(幾何平均熒光強(qiáng)度[GMF]43.2)表面表達(dá)的水平都很高(圖6A)。
通過重復(fù)傳代(4代)，使SkMel28細(xì)胞(在此指定為CVA21親代)中雙噬斑純化的CVA21原型病毒株制劑適于產(chǎn)生RD細(xì)胞的快速溶解性感染。流式細(xì)胞分析表明，RD細(xì)胞表達(dá)的DAF水平(GMF64.0)較SkMel28細(xì)胞高，但不表達(dá)表面ICAM-1(圖6A)。親代CVA21在RD細(xì)胞中連續(xù)傳代，從親代群體中生物選擇出能夠在不存在ICAM-1的情況下導(dǎo)致快速溶解性感染的CVA21變異體(稱為CVA21-DAFv)。雙重表達(dá)ICAM-1和DAF的SkMel28細(xì)胞支持親代和CVA21-DAFv發(fā)生效價(jià)超過107TCID50/ml的溶解性感染，同時(shí)僅有CVA21-DAFv在RD細(xì)胞中誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)娜芙庑r(jià)(圖6B)。
CVA21-DAFv的表型特性對(duì)ICAM-1陰性RD細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)之后，CVA21-DAFv在SkMel28和RD細(xì)胞單層(5×107PFU/ml)上產(chǎn)生效率相似的噬斑。盡管病毒導(dǎo)入復(fù)數(shù)很高(SkMel28細(xì)胞上1×108PFU/ml)，RD細(xì)胞上并沒有觀察到親代病毒株的噬斑。在不同的細(xì)胞底物上，CVA21-DAFv誘導(dǎo)的噬斑有輕微的表型差異；在RD細(xì)胞上，在感染后2天內(nèi)觀察到混濁噬斑，而在SkMel28細(xì)胞上僅觀察到高清晰度的小噬斑(圖6C)。CVA21-DAFv在SkMel28細(xì)胞中連續(xù)回復(fù)傳代10次，未能選擇出CVA21-DAFv仍能夠在低感染復(fù)數(shù)(1TCID50/96孔，數(shù)據(jù)未顯示)下溶解性地感染RD細(xì)胞的親代表型回復(fù)體。因此，CVA21-DAFv的DAF利用增強(qiáng)似乎是一種穩(wěn)定和合意的表型。更有趣的是以下發(fā)現(xiàn)與親代病毒株(102TCID50)相比，CVA21-DAFv(102TCID50)需要集中更高水平的免疫球蛋白以被中和(1∶63與1∶178)，這表示CVA21-DAFv的血清特異性在RD細(xì)胞中生物選擇的過程中發(fā)生了部分改變。CVA21-DAFv與DAF和ICAM-1的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合CVA21原型病毒株與ICAM-1和DAF二者的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)均能結(jié)合。為了考察CVA21-DAFv是否以類似于原型病毒株的方式與ICAM-1和/或DAF直接結(jié)合，使用穩(wěn)定表達(dá)ICAM-1或DAF的CHO細(xì)胞、RD細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系DOV13進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記結(jié)合實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞研究顯示，在分別轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系上DAF或ICAM-1的表面表達(dá)水平很高(CHO-DAF細(xì)胞上DAF表達(dá)的GMF為296.2)，而RD和DOV13細(xì)胞表面上僅表達(dá)DAF(RD和DOV13細(xì)胞上DAF表達(dá)的GMF分別為64.0和84.0)(圖6A和圖7A)。CVA21親代病毒株與ICAM-1和DAF二者均結(jié)合(圖7B和7C)。CVA21-DAFv與CHO-DAF和CHO-ICAM-1細(xì)胞結(jié)合的水平均很顯著，而CHO細(xì)胞則僅僅觀察到本底結(jié)合(圖7B和7C)。通過病毒吸附的特異性抗-DAF和抗-ICAM-1mAb阻斷，證實(shí)了病毒與轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上表面表達(dá)的ICAM-1和DAF相互作用的特異性。由于抗-ICAM-1(WEHI)和抗-DAFSCR1(IA10)mAb阻斷將病毒的結(jié)合降低至本底水平，而抗-DAFSCR3(IH4)mAb阻斷不影響CVA21制劑與轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的病毒結(jié)合(圖7B和7C)，因而得出結(jié)論與親代病毒株類似，CVA21-DAFv可以與ICAM-1和DAF的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合。
抗體交聯(lián)DAF不增強(qiáng)CVA21-DAFv的細(xì)胞感染性為了考察CVA21親代和CVA21-DAFv病毒株之間在DAF結(jié)合/利用方面，如果有的話，是否存在輕微的差異，采用放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合試驗(yàn)評(píng)價(jià)在存在和不存在表面DAF交聯(lián)的情況下與RD和DOV13細(xì)胞吸附的相對(duì)水平。親代CVA21和CVA21-DAFv二者均與高水平表達(dá)表面DAF的CHO細(xì)胞結(jié)合(圖7)，而CVA21原型病毒株與表達(dá)DAF的ICAM-1陰性RD細(xì)胞的結(jié)合則很差。這最有可能是因?yàn)樵诒狙芯恐惺褂玫腃HO-DAF細(xì)胞上表面表達(dá)DAF的水平高于RD和DOV13細(xì)胞(圖6A和圖7A)。生物選擇的CVA21-DAFv顯示出與RD和DOV13細(xì)胞的吸附水平均很顯著，而親代病毒株則幾乎觀察不到或觀察不到與這些細(xì)胞的吸附(圖7C)。與CHO-DAF細(xì)胞類似，通過用抗-SCR1mAb進(jìn)行預(yù)處理，CVA21-DAFv與RD和DOV13細(xì)胞的特異性結(jié)合被降低至本底水平(圖7C)。
表面表達(dá)的DAF與導(dǎo)向DAF非病毒結(jié)合SCR3功能結(jié)構(gòu)區(qū)的mAb交聯(lián)增加了原型CVA21與RD細(xì)胞的結(jié)合，使該細(xì)胞更容易被溶解性感染。接下來，我們考察了CHO-DAF和DOV13細(xì)胞表面上的DAF的交聯(lián)是否如RD細(xì)胞所觀察的那樣，導(dǎo)致病毒結(jié)合的增加?？?SCR3預(yù)處理使RD細(xì)胞上的親代CVA21病毒結(jié)合增加了8倍，在DOV13細(xì)胞上則增加4倍(圖7C)。對(duì)于CVA21-DAFv，抗-DAF SCR3預(yù)處理對(duì)增強(qiáng)與RD或DOV13細(xì)胞的結(jié)合作用極小或沒有作用。實(shí)際上，觀察到CVA21-DAFv與DOV13細(xì)胞的結(jié)合有輕微的下降(圖7C)。在不存在mAb交聯(lián)DAF的情況下CVA21-DAFv與RD和DOV13細(xì)胞以顯著水平結(jié)合的能力表明，與親代病毒株相比，CVA21-DAFv的DAF結(jié)合表型增強(qiáng)。兩種病毒與CHO-DAF細(xì)胞的病毒吸附均不受抗-DAF SCR3mAb預(yù)處理的影響(圖7C)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DAF細(xì)胞上DAF表面表達(dá)的水平顯著高于瞬時(shí)表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞，為抗-DAF SCR3mAb預(yù)處理為什么不能增加親代CVA21的病毒吸附給出了一種可能的解釋。
為了確定抗-DAF SCR3mAb預(yù)處理對(duì)RD和DOV13細(xì)胞對(duì)溶解性感染的易感性是受CVA21親代還是CVA21-DAFv的影響，病毒攻擊之前，將RD和DOV13細(xì)胞的匯合單層與抗-DAF SCR3mAb預(yù)培育。在評(píng)價(jià)單層的溶解性感染之前，在37℃下使病毒感染進(jìn)行3天。在不存在抗-DAF SCR3mAb交聯(lián)的情況下，即使病毒導(dǎo)入復(fù)數(shù)很高(106TCID50/孔)，RD和DOV13細(xì)胞對(duì)CVA21親代病毒株的感染均有抵抗力。與此相反，通過用抗DAF SCR3mAb進(jìn)行預(yù)處理，RD和DOV13細(xì)胞均對(duì)親代CVA21的溶解性感染易感(圖7D)。CVA21-DAFv在ICAM-1陰性RD和DOV13細(xì)胞中均誘導(dǎo)溶解性病毒效價(jià)(＞105.5TCID50/ml)。出人意料地，與不存在mAb時(shí)觀察到的效價(jià)相比，抗-DAFSCR3mAb預(yù)處理將RD和DOV13細(xì)胞中的CVA21-DAFv的溶解效價(jià)減少～100倍(圖7D)。用抗-DAF SCR3mAb預(yù)處理未增強(qiáng)CVA21-DAFv與DAF表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合(圖7C)，對(duì)于DOV13，則引起吸附減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，DAF SCR3的mAb阻斷干擾了DAF SCR1結(jié)合CAV21-DAFv的細(xì)胞侵入機(jī)制(圖7)。ICAM-1而不是DAF的相互作用誘導(dǎo)CVA21-DAFv的外殼構(gòu)象變化針對(duì)CVA21-DAFv與DAF結(jié)合和溶解性感染ICAM-1陰性細(xì)胞的能力增強(qiáng)的本底(圖6和圖7)，我們比較了親代CVA21病毒株和CVA21-DAFv的DAF相對(duì)結(jié)合嚴(yán)格性。將放射性同位素標(biāo)記的病毒體在4℃下與CHO-DAF細(xì)胞結(jié)合2小時(shí)，然后除去未結(jié)合的病毒體，將與細(xì)胞結(jié)合的病毒體用濃度漸增的抗-DAF SCR1mAb從細(xì)胞中洗脫。與CVA21親代病毒體相比，從CHO-DAF細(xì)胞表面將CVA21-DAFv病毒體移位需要大約10倍以上濃度的抗-DAF SCR1mAb(圖8A)。這一發(fā)現(xiàn)表明，與CVA親代相比，CVA21-DAFv與DAF在更易接近的外殼位點(diǎn)上結(jié)合，或者與DAF結(jié)合的親合性更高。
假定DAF起到腸病毒螯合受體的作用，通常，DAF-腸病毒相互作用不能誘導(dǎo)形成可檢測(cè)的外殼構(gòu)象改變。為了考察CVA21-DAFv A-顆粒的形成是否是由與表面表達(dá)的DAF或ICAM-1的相互作用誘導(dǎo)的，將純化的160S病毒體與CHO-DAF或CHO-ICAM-1細(xì)胞在4℃下培育2小時(shí)。除去未結(jié)合的病毒體之后，與細(xì)胞結(jié)合的病毒體在37℃下洗脫2小時(shí)，然后在5-30％的蔗糖梯度上進(jìn)行速度離心。從ICAM-1洗脫的CVA21-DAFv病毒體表現(xiàn)出沉降系數(shù)減少，表明A顆粒的形成，感染性保留極少或未保留感染性，這與CVA21原型病毒株觀察到的情況類似。盡管CVA21-DAFv的DAF相互作用增強(qiáng)，但是從DAF洗脫的CVA21-DAFv病毒體沒有任何可檢測(cè)的構(gòu)象變化(圖8B)，病毒體保留著高水平感染性。
DAF阻斷抑制RD細(xì)胞中CVA21-DAFv的溶解性感染溶解性細(xì)胞感染和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，與親代CVA21病毒株相比，表面表達(dá)的DAF和CVA21-DAFv之間的相互作用增強(qiáng)(圖7和圖8)。由于這種觀察到的增強(qiáng)的相互作用，我們考察了與親代病毒株相比，抗-DAF SCR1mAb是否能阻斷CVA21-DAFv對(duì)RD細(xì)胞的溶解性感染。即使導(dǎo)入復(fù)數(shù)高達(dá)106TCID50/孔，抗-DAF SCR1mAb也能保護(hù)RD細(xì)胞完全免受CVA21-DAFv誘導(dǎo)的溶解性感染(圖9A)。而且，將RD細(xì)胞用抗-DAF SCR1mAb預(yù)處理顯著地抑制子代病毒的產(chǎn)生。
為了進(jìn)一步證實(shí)CVA21-DAFv的細(xì)胞感染性需要直接與表面DAF相互作用，對(duì)人重組sDAF(Dr.Bruce Loveland，未公開的交流)抑制RD細(xì)胞感染的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)?？扇苄訢AF與CVA21-DAFv的相互作用顯著地抑制了細(xì)胞的溶解性感染，但是對(duì)于降低非DAF結(jié)合的CVA20的感染則沒有可檢測(cè)的降低作用。盡管CVA20也與ICAM-1結(jié)合，它需要一種未得到確認(rèn)的受體來侵入細(xì)胞(圖9B)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明，CVA21-DAFv溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb和sDAF抑制，證實(shí)了DAF相互作用在CVA21-DAFv侵入中的重要性。使CVA21-DAFv具有DAF表型的分子決定子為了進(jìn)一步研究擴(kuò)展的細(xì)胞向性和CVA21-DAFv的DAF利用增強(qiáng)顯型，對(duì)CVA親代病毒株和CVA21-DAFv的外殼編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定。將外殼蛋白序列與CVA21Kuykendall原型病毒株相比，后者與DAF和ICAM-1的相互作用已經(jīng)被充分闡明。對(duì)雙噬斑純化的親代病毒株外殼編碼區(qū)的序列分析表明，與CVA21原型序列(GenBankAF465515)相比，在VP2(S164L)處有一個(gè)編碼置換。與原型病毒株相比，CVA親代病毒株的DAF和ICAM-1結(jié)合特性(圖7)并沒有被這一VP2氨基酸置換所改變。在RD細(xì)胞中進(jìn)行生物選擇后，VP2L164殘基保留在CVA21-DAFv中，而VP3中檢測(cè)到兩處其它的氨基酸置換(R96H和E101A)，VP2中有一處沉默突變(V209)。由于VP2L164氨基酸置換在親代病毒株和CVA21-DAFv中均存在，它不可能參與增強(qiáng)CVA21-DAFv的DAF結(jié)合表型。CVA21-DAFv在核苷酸位點(diǎn)2038(VP3 101)處表現(xiàn)出混合種群(C/A)，導(dǎo)致Ala/Glu，而該位點(diǎn)僅有A(Glu)由親代CVA21編碼。
因?yàn)镃VA21的分子結(jié)構(gòu)尚未在原子分辨度下得到確定，在與之前確定的相關(guān)小RNA病毒結(jié)構(gòu)相似的基礎(chǔ)上，我們模擬了親代CVA21的結(jié)構(gòu)，以試圖解釋CVA親代和CVA21-DAFv之間在DAF結(jié)合上的差異?？赡茉鰪?qiáng)CVA21-DAFv DAF結(jié)合顯型的突變(VP3 R96H和E101A)預(yù)測(cè)被包埋在外殼蛋白VP1、VP2和VP3的界面處(圖5和圖10)。VP3殘基R96和E101被一側(cè)的VP3C-端和頂部的VP1C-端覆蓋，僅有精氨酸(R96)的側(cè)鏈氮原子可以與溶劑接觸(圖10A中的藍(lán)色球體)。假設(shè)CVA21-DAFv與DAF的吸附發(fā)生在外殼峽谷的外部，如EV12中那樣。盡管CVA21-DAFv的VP3H96和A101突變并不是直接位于提出的EV12-DAF結(jié)合位點(diǎn)，它定位仍然可以使DAF結(jié)合足跡具有增強(qiáng)的構(gòu)象，或者容易接觸，導(dǎo)致其與DAF的親合力比親代病毒株提高(圖8A)。
III.DAF和柯薩奇病毒A21介導(dǎo)的細(xì)胞感染CVA21與DAF的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合對(duì)DAF的獨(dú)立短共有重復(fù)片斷(SCR)的初步抗體阻斷研究表明CVA21與DAF SCR1結(jié)合。但是，對(duì)腸病毒DAF結(jié)合表位定位的分析可能受與DAF結(jié)合的mAb的空間位阻的間接影響這一可能性是存在的。為了解決這些問題，表面表達(dá)的嵌合DAF分子和DAF缺失構(gòu)建體被用來對(duì)EV70的DAF結(jié)合結(jié)構(gòu)功能區(qū)至SCR1(Karnauchow，T.M.，S.Dawe，D.M.Lublin，K.Dimock 1998，Short consensus repeatdomain 1 of decay-accelerating factor is required for enterovirus 70binding(衰變加速因子的短共有重復(fù)結(jié)構(gòu)功能區(qū)1是腸病毒70結(jié)合所必需的).J.Virol.729380-9383)、CVB3SCR2-3(Bergelson，J.M.，J.G.Mohanty，R.L.Crowell，N.F.St.John，D.M.Lublin，R.W.Crowell 1995.Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor(CD55)(適應(yīng)在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的柯薩奇病毒B3與衰變加速因子(CD55)結(jié)合).J.Virol.691903-1906)和EV7至SCR3(Powell，R.M.，T.Ward，D.J.Evans，J.W.Almond 1997.Interactionbetween echovirus 7 and its receptor，decay-accelerating factor(CD55)evidence for a secondary cellular factor in A-particle formation(艾柯病毒7及其受體衰變加速因子(CD55)之間的相互作用A顆粒形成中第二種細(xì)胞因子的證據(jù)).J.Virol.719306-9312)進(jìn)行分析。在試圖對(duì)CVA21-DAF結(jié)合區(qū)定位進(jìn)行證實(shí)的嘗試中，我們采用了嵌合DAF/CD46受體(圖11A)，其中CD46膜輔因子蛋白(MCP[CD46])結(jié)構(gòu)功能區(qū)被相應(yīng)的結(jié)構(gòu)功能區(qū)DAF替換，并評(píng)價(jià)了它們與放射性同位素標(biāo)記CVA21結(jié)合的能力。使用對(duì)單個(gè)DAF SCR和對(duì)CD46有特異性的mAb通過流式細(xì)胞分析對(duì)嵌合和野生型受體的表面表達(dá)相對(duì)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖11B)?？?DAF SCR1(IA10)、SCR3(IH4)和SCR4(IIH6)mAb僅與野生型DAF和分別攜帶DAF SCR1/2、SCR3或SCR4的DAF/CD46嵌合受體結(jié)合?？?DAF mAb中無一與野生型CD46結(jié)合。識(shí)別CD46的SCR1的抗-CD46mAb(MCI20.6)僅與野生型CD46或攜帶CD46的SCR1的DAF/CD46嵌合受體結(jié)合。放射性同位素標(biāo)記的CVA21與野生型DAF和DAF SCR1/CD46嵌合受體均有顯著水平的結(jié)合，但是與野生型CD46或其它嵌合構(gòu)建體不結(jié)合(圖11C)。通過用抗-DAF SCR1mAb進(jìn)行抗體阻斷，CVA21與野生型DAF和嵌合DAF SCR1/CD46分子二者的結(jié)合均被抑制。盡管本項(xiàng)研究沒有獲得DAF SCR2/CD46嵌合受體，但是上述發(fā)現(xiàn)清楚地證明類似于EV70，CVA21的外殼結(jié)合表位最可能位于DAF分子的第一個(gè)SCR上。
CVA21與DAF的結(jié)合和從其上洗脫小RNA病毒細(xì)胞吸附和隨后侵入細(xì)胞的特征是在初始吸附之后很高水平的病毒顆?？蓮钠涮禺愋约?xì)胞表面受體上洗脫，表明受體介導(dǎo)的病毒洗脫在小RNA病毒感染的發(fā)病機(jī)理中具有重要地位。與許多小RNA病毒類似，當(dāng)CVA21從其天然內(nèi)化受體(在本文的情況下為ICAM-1)上脫落時(shí)，它的感染性顯著降低，因此使其啟動(dòng)隨后感染的能力降至最低。但是，直接從表面表達(dá)的DAF上洗脫的CVA21顆粒的相對(duì)動(dòng)力學(xué)特征和感染性之前并未闡明。因此，我們的研究集中在時(shí)間、溫度和pH對(duì)CVA21從DAF上洗脫的影響，在此使用表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞作為CVA21結(jié)合底物進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)。15分鐘時(shí)CVA21從DAF上洗脫達(dá)到最高水平，在此之后洗脫沒有進(jìn)一步的明顯增加(圖12A)。從DAF上洗脫的CVA21的量隨著溫度從4℃逐漸升高至42℃而不斷增加，其間洗脫時(shí)間保持恒定的30分鐘(圖12B)。在這種環(huán)境中，在42℃下CVA21的洗脫達(dá)到最高水平。并不出乎意料地，42℃下洗脫的病毒的感染性顯著低于37℃下洗脫的病毒。溫度高于37℃對(duì)病毒體的完整性可能有負(fù)面影響，導(dǎo)致受體結(jié)合減少，從而使感染能力降低。將洗脫環(huán)境的pH從pH5.5升高至pH8.0，其間保持洗脫時(shí)間為30分鐘、溫度為37℃，導(dǎo)致CVA21從DAF上洗脫的水平持續(xù)升高(圖12C)。
從DAF上洗脫的CVA21保持感染性由于結(jié)合細(xì)胞的病毒體發(fā)生特異性受體介導(dǎo)的外殼構(gòu)象變化，大部分洗脫的小RNA病毒體通常被認(rèn)為無感染性。為了比較與表面表達(dá)的DAF或ICAM-1結(jié)合和從其上洗脫對(duì)CVA21感染性的相對(duì)影響，使用CHO-DAF和CHO-ICAM-1表達(dá)細(xì)胞作為CVA21結(jié)合底物，進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合試驗(yàn)和細(xì)胞溶解試驗(yàn)。流式細(xì)胞分析顯示，在合適的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表面上DAF和ICAM-1表達(dá)的水平很高。放射性同位素標(biāo)記的CVA21與轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面上的DAF和ICAM-1結(jié)合以及從其上洗脫的水平相似(圖13A)。與從ICAM-1上洗脫的病毒相反，僅有從DAF上洗脫的CVA21表現(xiàn)出顯著的感染性保留(＞105TCID50/100CPM)(圖13B)。為了確定從交聯(lián)DAF上脫落之后CVA21是否保留著高水平感染性，采用相似的試驗(yàn)方案，DAF通過用抗-DAFSCR3mAb(IH4)預(yù)處理進(jìn)行交聯(lián)。從用ICAM-1轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞(RD-ICAM-1)評(píng)價(jià)ICAM-1上的洗脫。在0℃下從兩種受體上洗脫的CVA21水平最低，而在37℃下，15％至20％的結(jié)合病毒從兩種受體上洗脫(圖14A)。但是，如上文中觀察到的(圖13A)，從ICAM-1上洗脫的CVA21感染性極低(＜1.0TCID50/100CPM)，而從交聯(lián)DAF上洗脫的CVA21則表現(xiàn)出顯著的感染性(＞102.5TCID50/100CPM)(圖14B)。盡管RD-ICAM-1細(xì)胞表面上存在有低水平的DAF，病毒洗脫物中不存在感染性CVA21表明當(dāng)兩種受體在細(xì)胞表面上共同表達(dá)時(shí)，CVA21優(yōu)先結(jié)合ICAM-1，其次才是DAF。
為了評(píng)價(jià)CVA21與表面DAF和ICAM-1結(jié)合的相對(duì)嚴(yán)格性，放射性同位素標(biāo)記的病毒體在0℃下與RD-ICAM-1細(xì)胞上的ICAM-1、或者RD細(xì)胞表面上的mAb交聯(lián)DAF結(jié)合。除去未結(jié)合的病毒體之后，向適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)交聯(lián)DAF或ICAM-1的細(xì)胞懸液中加入濃度漸增的阻斷mAb(抗-DAF SCR1或抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)功能區(qū)1)的CVA21受體。向RD-ICAM-1細(xì)胞中加入抗-ICAM-1結(jié)構(gòu)功能區(qū)1mAb對(duì)代替與ICAM-1結(jié)合的CVA21影響極小或沒有影響(圖14C)。與此相反，用濃度低至0.1μg/ml的抗-DAF SCR1mAb對(duì)交聯(lián)DAF的RD細(xì)胞進(jìn)行處理促使釋放出大約50％的與DAF結(jié)合的CVA21，當(dāng)mAb濃度增加至1.0μg/ml時(shí)，導(dǎo)致基本上所有與DAF結(jié)合的病毒被排出(圖14C)。CVA21可以與DAF結(jié)合，保留感染性，并在ICAM-1的延遲表達(dá)后引發(fā)生產(chǎn)性感染已經(jīng)確定，從表面表達(dá)的DAF上洗脫的CVA21保留了很高的感染性水平(圖13和圖14)，研究集中于DAF洗脫的病毒是否在天然CVA21感染的發(fā)病機(jī)理中具有積極作用。需要解決的具體問題是被表面表達(dá)的DAF螯合的病毒是否可以通過采用細(xì)胞表面ICAM-1的延遲誘導(dǎo)來引發(fā)生產(chǎn)性感染。通常人們認(rèn)為，人體中內(nèi)源性ICAM-1的表面表達(dá)相對(duì)較低，要等待炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的作用來誘導(dǎo)。為了模擬這種環(huán)境，在CVA21與表面DAF結(jié)合后的0、6和24小時(shí)，將正常情況下對(duì)CVA21溶解性感染有抵抗力的表達(dá)DAF的RD細(xì)胞(ICAM-1陰性)轉(zhuǎn)導(dǎo)成表達(dá)ICAM-1或CD36(使用重組腺病毒載體)。流式細(xì)胞分析表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的4小時(shí)有水平顯著的表面ICAM-1表達(dá)，大約在腺病毒接種后的16小時(shí)這種表達(dá)的水平達(dá)到最高(圖15A)。另外的流式細(xì)胞分析(圖15B)和蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)證實(shí)，通過攜帶重組腺病毒的適當(dāng)受體轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)，RD細(xì)胞的ICAM-1和CD36二者的表達(dá)水平均很高，而所有細(xì)胞之間的內(nèi)源性DAF表達(dá)是相當(dāng)?shù)?。進(jìn)行病毒感染性實(shí)驗(yàn)，以比較病毒與內(nèi)源性DAF結(jié)合后的0、6或24小時(shí)在存在轉(zhuǎn)導(dǎo)ICAM-1和CD36受體表達(dá)的情況下繁殖的子代CVA21的水平。最初用CVA21接種后的0、6或24小時(shí)，誘導(dǎo)成表達(dá)ICAM-1的RD細(xì)胞產(chǎn)生的病毒產(chǎn)量顯著高于(大約200-倍)誘導(dǎo)成表達(dá)偽受體(CD36)的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的RD細(xì)胞(圖15C)。DAF結(jié)合后的0、6、24小時(shí)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)成表達(dá)ICAM-1的RD細(xì)胞中的多周期CVA21復(fù)制造成了細(xì)胞單層的完全溶解性破壞，而在表達(dá)CD36的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中沒有觀察到細(xì)胞溶解(圖15D)。
IV.柯薩奇病毒A21DAF變異體(CVA21-DAFv)體外溶解人乳腺、前列腺、結(jié)腸和卵巢癌細(xì)胞CVA21原型病毒株能夠快速地靶向和溶解表達(dá)高水平CVA21細(xì)胞受體、細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)和衰變加速因子(DAF)的惡性黑色素瘤細(xì)胞。最近，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物選擇的CVA21-DAFv病毒株表現(xiàn)出更強(qiáng)的受體特異性，并且能夠快速地感染和溶解表達(dá)ICAM-1或DAF或這二者結(jié)合的細(xì)胞。在本研究中，對(duì)一組12個(gè)不同組織來源的人癌細(xì)胞系進(jìn)行了病毒受體表達(dá)方面的研究；三個(gè)腫瘤細(xì)胞系來自人乳腺癌(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)，三個(gè)卵巢癌細(xì)胞系(DOV13、OAW-42、OVHS-1)，三種前列腺癌細(xì)胞(DU145、LNCaP、PC3)和三種人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116、HT-29、SW620)。如通過流式細(xì)胞儀所測(cè)定，在3/3乳腺、1/3卵巢、2/3前列腺和3/3結(jié)腸癌細(xì)胞系上檢測(cè)到水平顯著的ICAM-1，而發(fā)現(xiàn)所有12個(gè)細(xì)胞系均表達(dá)高水平的DAF(圖16)。
為了研究CVA21-DAFv是否顯示出比CVA21親代病毒株更廣泛的溶瘤能力，CVA21-DAFv被用來攻擊一組乳腺、卵巢、前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞。顯微鏡觀察表明，所有12種用CVA21-DAFv攻擊的體外培養(yǎng)物均表現(xiàn)出圓形表型(細(xì)胞病變作用的特征)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與此相反，用親代CVA21病毒株攻擊的癌細(xì)胞系中僅有7/12觀察到細(xì)胞病變作用(圖17)。對(duì)CVA21-DAFv的溶瘤作用進(jìn)行定量，證明了CVA21-DAFv對(duì)所有12個(gè)被測(cè)體外培養(yǎng)物均引起效價(jià)＞103TCID50/ml的溶解性感染，而CVA21親代病毒株僅在7/12個(gè)癌細(xì)胞系(2/3乳腺、1/3卵巢、2/3前列腺和2/3結(jié)腸癌細(xì)胞)中引發(fā)顯著的溶解性感染(＞104TCID50/ml)(圖18)。據(jù)觀察，表面ICAM-1表達(dá)量可忽略不計(jì)的細(xì)胞系(ZR-75-1、DOV13、OAW-42、LNCaP和HCT116)不能維持CVA21親代病毒株的復(fù)制，而這些細(xì)胞系很容易被CVA21-DAFv感染。由于生物篩選的CVA21-DAFv病毒株進(jìn)行溶解性感染僅需要存在有表面DAF，而不是ICAM-1，因此顯然該病毒株較親代CVA21病毒株能更有效地殺死范圍更廣泛的人癌細(xì)胞系。
V.CVA21-DAFv在體內(nèi)溶解人前列腺腫瘤異種移植物體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，CAV21-DAFv特異性且有效地靶向細(xì)胞表面上表達(dá)ICAM-1和/或DAF的人癌細(xì)胞。為了考察體外觀察到的對(duì)一組癌細(xì)胞的溶瘤作用是否預(yù)示CVA21-DAFv可作為體內(nèi)抗癌藥物，我們?cè)u(píng)價(jià)了CVA21-DAFv對(duì)前列腺腫瘤異種移植物的治療作用。攜帶已形成的PC3前列腺異種移植物(50-100mm3)的SCID小鼠接受單次靜脈劑量的CVA21-DAFv、CVA21親代、或PBS，對(duì)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行為期42天的評(píng)價(jià)(圖19)。在用病毒給藥后早期的11天，用CVA21-DAFv或CVA21親代治療的小鼠均觀察到腫瘤體積的顯著減小。出于倫理學(xué)原因，由于其腫瘤負(fù)荷達(dá)到University Animal Ethics committee(大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì))強(qiáng)制規(guī)定的上限，治療后的14天對(duì)用PBS治療的小鼠進(jìn)行安樂死。如溶解性病毒感染性檢驗(yàn)所測(cè)定(數(shù)據(jù)未顯示)，CVA21-DAFv和CVA21親代治療的小鼠均觀察到相似的血清病毒載量(大約105至107TCID50/ml)。這些結(jié)果證明，CVA21-DAFv與CVA21親代病毒株在降低人前列腺異種移植物腫瘤負(fù)荷方面同樣有效。
討論I.腸病毒外殼相互作用CVA21原型病毒株的生產(chǎn)性細(xì)胞感染是由分立的與表面表達(dá)的DAF和ICAM-1的獨(dú)立作用介導(dǎo)的。在這種關(guān)系中，DAF的作用是將CVA21螯合在細(xì)胞表面，以便隨后與誘導(dǎo)外殼構(gòu)象改變并侵入細(xì)胞的ICAM-1相互作用。但是，體外多次細(xì)胞傳代是否對(duì)這種受體利用模式起積極作用的問題是倍受關(guān)注的主題。具體地，考慮到種系發(fā)生相關(guān)的原型A型柯薩奇病毒A13、A15、A18和A20(其同樣采用ICAM-1作為細(xì)胞內(nèi)化受體，與表面表達(dá)的DAF不結(jié)合)，DAF結(jié)合表型是一個(gè)頗受猜測(cè)的領(lǐng)域。因此，進(jìn)行了許多研究，以觀察CVA21原型病毒株Kuykendall的DAF結(jié)合表型在體外低代數(shù)CVA21臨床分離株中是否是保守的，或者僅僅是細(xì)胞培養(yǎng)物多次傳代的人工產(chǎn)物。
在此所述的放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，CVA21的三種臨床分離株顯示出與原型CVA21病毒株(Kuykendall)相似的受體吸附方式，其特征在于能夠獨(dú)立地與DAF或ICAM-1結(jié)合(圖1)。MAb對(duì)DAF或ICAM-1的阻斷不能完全抑制病毒結(jié)合(圖2)，這表明兩種受體在CVA21臨床分離株的吸附/感染過程中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)，對(duì)高水平DAF和ICAM-1共同表達(dá)的環(huán)境中的CVA21結(jié)合的研究表明，病毒結(jié)合程度較在兩種受體單獨(dú)表達(dá)的環(huán)境中低(圖3)。這些發(fā)現(xiàn)表明，多個(gè)受體的高水平共同表達(dá)確實(shí)可以對(duì)最佳溶解性感染有抑制作用。在宿主細(xì)胞表面上被共同表達(dá)時(shí)，DAF和ICAM-1的密切接近可能引起空間位阻，導(dǎo)致有效的受體結(jié)合位點(diǎn)減少。如果是這樣的話，可以推斷，盡管兩種受體在宿主細(xì)胞上的高水平表達(dá)并不需要與吸附水平的增加相關(guān)，兩種不同細(xì)胞受體對(duì)一種病毒的表達(dá)水平不同的環(huán)境可能潛在地是有益的。這種環(huán)境可能發(fā)生在人腸道的粘膜表面，在此DAF的表達(dá)是廣泛存在的，其水平顯著高于ICAM-1，后者的內(nèi)源性表達(dá)水平相對(duì)較低，等待被適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子誘導(dǎo)。
本項(xiàng)研究一個(gè)出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，通過在不存在抗體交聯(lián)的情況下僅經(jīng)由DAF結(jié)合而溶解性地感染RD細(xì)胞，低代數(shù)臨床CVA21分離株能夠以更具有功能性的作用利用DAF相互作用(圖4)。對(duì)這些新的發(fā)現(xiàn)的一種可能的解釋是臨床CVA21分離株的病毒外殼能夠以比原型病毒株更重要的方式與DAF交聯(lián)，使病毒內(nèi)化，其機(jī)制類似于抗-DAF MAb的人工交聯(lián)作用(圖4)。類似地，在CVB3原型和低代數(shù)臨床分離株之間也觀察到受體利用方面的差異。最近，有報(bào)道稱口蹄疫病毒(FMDV)的實(shí)驗(yàn)室和野外病毒株之間存在著不同αv整合蛋白利用方面的差異，說明病毒分離株對(duì)其細(xì)胞受體的親合性可以發(fā)生改變。
在此，我們證實(shí)了在不存在ICAM-1的情況下，MAb交聯(lián)的DAF的作用是原型和臨床CVA21分離株的功能性內(nèi)化受體(圖4)。之前已經(jīng)提出，MAb交聯(lián)的DAF介導(dǎo)的CVA21侵入經(jīng)由細(xì)胞窖發(fā)生，與ICAM-1病毒相互作用中采用的網(wǎng)格蛋白-有被小窩侵入途徑相反。CVA21通過含有交聯(lián)DAF的細(xì)胞窖侵入的假設(shè)由以下證據(jù)支持MAb集聚的DAF在募集至細(xì)胞窖后被胞吞。DAF相互作用在細(xì)胞窖介導(dǎo)的CVA21侵入中的可能作用已經(jīng)被最近的報(bào)道證實(shí)，該報(bào)道稱EV11的DAF結(jié)合株經(jīng)由脂筏和/或細(xì)胞窖被細(xì)胞內(nèi)化。
DAF在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的廣泛表達(dá)為與DAF親合性較高并利用該受體進(jìn)行內(nèi)化的病毒提供了適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)。由于在紅細(xì)胞上進(jìn)行DAF表達(dá)，為DAF結(jié)合病毒提供了一種現(xiàn)成的向人體全身輸送的運(yùn)載體，因此這種病毒與其他病毒株相比致病性更高。有趣的是，柯薩奇病毒B3和B5分離株在極性上皮細(xì)胞(其天然的內(nèi)化受體柯薩奇和腺病毒受體位于細(xì)胞-細(xì)胞緊密連接處，DAF位于上表面)中的連續(xù)傳代可以選擇DAF結(jié)合變異體，表明DAF在上皮細(xì)胞粘膜表面感染中的重要作用。
編碼外殼結(jié)構(gòu)蛋白的基因組P1區(qū)的遺傳分析，在臨床CVA21分離株和原型病毒株的推算氨基酸序列之間檢測(cè)到許多差異(圖5)。所觀察到的編碼變化無一定位成之前確定的ICAM-1足跡，差異散布在VP1、VP2和VP3中。構(gòu)成ICAM-1足跡的殘基在原型Kuykendall病毒株和所有的臨床分離株中都是保守的，除了VP2中的氨基酸168(圖5)。VP2的168位點(diǎn)處，Val至Ala的氨基酸置換是保守的，可能在ICAM-1結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象中意義極少。臨床分離株#272101在僅表達(dá)DAF的RD細(xì)胞中顯示出顯著的溶解活性，但是不如其余臨床分離株的活性大，其具有所有臨床分離株相對(duì)于原型病毒株之間觀察到的14個(gè)編碼改變中的13個(gè)。與其它臨床分離株相比，#272101中進(jìn)一步存在有9處其它改變，這可能對(duì)分離株#275238和#2727598所顯示的DAF利用增強(qiáng)顯型具有某種類型的抑制作用。在DAF和ICAM-1二者水平都高的環(huán)境中DAF利用顯型升高的臨床CVA21分離株的體外重復(fù)細(xì)胞傳代可以對(duì)ICAM-1利用增強(qiáng)的病毒體的生物選擇施加壓力，其代價(jià)是功能性DAF相互作用降低。產(chǎn)生這種病毒體群體可以確定決定受體利用改變顯型的關(guān)鍵P1氨基酸改變。
分離株#272101的DAF利用降低的一種可能解釋由下列報(bào)道提供其中生物選擇的喪失其DAF結(jié)合顯型的EV11變異體在VP1的BC環(huán)和VP2的疏松區(qū)(puff region)具有特異性的氨基酸改變。我們的序列分析顯示，#272101在VP1的BC環(huán)和VP2的疏松區(qū)存在有這些獨(dú)特差異，在其它CVA21臨床分離株的相同外殼區(qū)則不存在這種差異(圖5)。盡管不是結(jié)論性的，但是在病毒吸附/侵入細(xì)胞的環(huán)境中，這些所有臨床分離株和原型株之間觀察到的13處氨基酸改變可能在DAF利用增強(qiáng)顯型的發(fā)展過程中具有潛在的作用。但是，盡管沒有在本研究中解決，不能排除位于病毒基因組其他區(qū)(如5′未翻譯區(qū))的其它改變參與介導(dǎo)細(xì)胞的溶解性感染。
但是，DAF/EV7、DAF/CVB3相互作用和DAF/CVA21相互作用之間的顯著差異是DAF SCR2、3或4參與EV和CVB結(jié)合，而DAFSCR1參與CVA21吸附。假定EV7、CVB3和CVA21外殼之間的整體結(jié)構(gòu)相似，則CVA21外殼上分別具有其各自結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)獨(dú)立受體(即DAF和ICAM-1)的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)在感染過程中的任何階段均可以參與。但是，DAF SCR2-4參與EV7/CVB3的結(jié)合表明，對(duì)于CVB3來說，與其它受體(如CAR)的相互作用可以在DAF相互作用之后發(fā)生，使得對(duì)與病毒外殼上特異性DAF結(jié)合表位接觸的干擾將至最低。令人感興趣的一個(gè)發(fā)現(xiàn)可能是，檢測(cè)到原型病毒株VP1相對(duì)于能夠溶解性地感染ICAM-1陰性RD細(xì)胞的臨床分離株的遷移的微小差異。同樣，在RD細(xì)胞中連續(xù)傳代后產(chǎn)生的CVB3原型的變異體(CB3-RD)與原型相比VP1遷移率發(fā)生變化，與親代病毒株相比與DAF的受體特異性發(fā)生變化。
綜合在一起，本研究的結(jié)果表明，臨床分離株與其細(xì)胞受體的總體結(jié)合能力對(duì)于原型病毒株是保守的，但是在臨床CVA21分離株利用這些受體的能力方面存在一些個(gè)別的差異。與CVB3野生病毒株類似，臨床CVA21分離株具有在細(xì)胞溶解性感染中促進(jìn)DAF利用增加的顯型，這最可能是在人類中傳代的結(jié)果。CVA21利用DAF和ICAM-1對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行吸附和/或感染的能力表明，有益顯型的保守性使得單個(gè)和/或多個(gè)受體得以利用，從而擴(kuò)大病毒的組織嗜性，并顯著增加了生產(chǎn)性感染的機(jī)會(huì)。
II.柯薩奇病毒A21變異體的生物選擇和分子特性盡管生產(chǎn)性CVA21感染需要有ICAM-1，如同許多其它腸病毒那樣，DAF起到CVA21原型病毒株吸附受體的作用。在本研究中，我們描述了在ICAM-1陰性細(xì)胞中體外生物選擇的CVA21變異體，其獲得了改變且擴(kuò)大的細(xì)胞嗜性(圖6和7)。本文所示的放射性同位素標(biāo)記病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，盡管在ICAM-1陰性RD細(xì)胞中進(jìn)行多次傳代，CVA21-DAFv仍然保留了獨(dú)立結(jié)合ICAM-1的N-端結(jié)構(gòu)功能區(qū)或DAFSCR1的能力(圖7)。在表面表達(dá)DAF水平極高的環(huán)境中(即，選擇表達(dá)水平最高的CHO-DAF細(xì)胞)，親代和CVA21-DAFv與DAF結(jié)合的水平相似，而CVA21-DAFv僅與RD細(xì)胞和內(nèi)源性DAF表面表達(dá)顯著減少的DOV13細(xì)胞吸附。根據(jù)之前的研究，抗-DAF SCR3mAb與DAF的mAb交聯(lián)顯著地增加了親代CVA21與表達(dá)DAF的RD和DOV13細(xì)胞的結(jié)合，并在不存在ICAM-1的情況下促進(jìn)溶解性感染(圖7)。但是，沒有觀察到CVA21-DAFv與mAb交聯(lián)RD或DOV13細(xì)胞的病毒結(jié)合或溶解性感染。這一發(fā)現(xiàn)表明，與親代病毒株相比，生物選擇的CVA21-DAFv與DAF的相互作用已經(jīng)被優(yōu)化，使得這種相互作用不會(huì)進(jìn)一步被mAb交聯(lián)DAF增強(qiáng)。數(shù)據(jù)表明，在與表位競(jìng)爭(zhēng)性抗-DAF SCR1mAb培育的過程中，親代CVA21病毒體較CVA21-DAFv更容易從表面表達(dá)的DAF上移位，這進(jìn)一步支持了CVA21-DAFv的DAF結(jié)合顯型比親代病毒株增強(qiáng)的假說(圖8)。
推測(cè)對(duì)于CVA21原型病毒株來說，DAF的作用是將病毒保持在感染狀態(tài)，等待與侵入受體ICAM-1相互作用，僅與DAF的直接結(jié)合并不能引發(fā)CVA21原型病毒株的生產(chǎn)性感染。盡管轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表面上的DAF或ICAM-1表面表達(dá)水平很高(圖7A)，但是觀察不到可檢測(cè)的細(xì)胞被親代CVA21或CVA21-DAFv感染(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，ICAM-1陰性RD和DOV13細(xì)胞的溶解性感染提供了CVA21-DAFv的DAF利用增強(qiáng)的證據(jù)，這種溶解性感染即使在病毒導(dǎo)入值很高時(shí)也可以被單獨(dú)的抗-DAF SCR1mAb阻斷所完全阻斷(圖9)。而在DAF和ICAM-1共表達(dá)的多受體環(huán)境中使用的CVA21原型株中觀察到的被同樣的mAb部分阻斷則與此相反，其中需要DAF和ICAM-1二者的mAb來完全阻斷感染。這些發(fā)現(xiàn)支持了以下假設(shè)CVA21-DAFv采用表面DAF作為功能性細(xì)胞受體。CVA21-DAFv感染在與之前顯示對(duì)腸病毒感染有抑制作用的濃度相當(dāng)?shù)臐舛认卤籹DAF抑制，這一觀察結(jié)果進(jìn)一步突出了DAF在RD細(xì)胞的CVA21-DAFv感染中的重要性(圖9)。另外，它提供了推翻以下可能性的證據(jù)在生物選擇過程中，CVA21-DAFv在不存在ICAM-1的情況下適于使用其它尚未確定的另一種細(xì)胞受體參與細(xì)胞內(nèi)化。與親代CVA21相比，不僅在RD細(xì)胞中，而且在表達(dá)DAF的卵巢癌細(xì)胞(DOV13)中，CVA21-DAFv的DAF結(jié)合顯型增強(qiáng)(圖7和8)似乎已經(jīng)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞的溶解性感染增強(qiáng)(圖7)。
許多人腸病毒與DAF的結(jié)合作用中有大量不同的差異。CVB3、EV7和EV12病毒體上的DAF結(jié)合位點(diǎn)推測(cè)位于二十面體二重對(duì)稱軸上的外殼峽谷外部。盡管EV11也與峽谷區(qū)的外部的DAF相互作用，DAF結(jié)合足跡被推測(cè)位于病毒體5重軸附近。在與DAF吸附的人類腸病毒當(dāng)中，僅有腸病毒70和CVA21與DAF N末端SCR1結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合，其它的DAF結(jié)合腸病毒則與中央結(jié)構(gòu)功能區(qū)(SCR2-4)相互作用。除與DAF結(jié)合的腸病毒位于峽谷外部這一事實(shí)之外，據(jù)報(bào)道這些相互作用并不會(huì)引起細(xì)胞感染或A顆粒的形成。對(duì)于EV11(其與DAF的結(jié)合已經(jīng)被定量評(píng)價(jià)過)，與DAF的相互作用親和力很低，這與在峽谷結(jié)合鼻病毒的ICAM-1分子相反，后者的親和力相近，但動(dòng)力學(xué)較慢。
盡管CVA21-DAFv顯示了DAF結(jié)合增強(qiáng)的顯型，在外殼編碼區(qū)僅有兩處氨基酸與親代病毒株不同。在生物選擇過程中，CVA21-DAFv保留了與ICAM-1結(jié)合的能力(圖7)。因此，并不出乎意料，觀察到的外殼突變無一位于之前確定的ICAM-1結(jié)合足跡中，后者被假定為橫跨北部和南部的峽谷邊緣。觀察到的CVA21-DAFv突變據(jù)推測(cè)位于被VP2EF-環(huán)和VP1和VP3的C-端圍繞的VP3α-螺旋(CD-環(huán))中外殼峽谷的外部(圖10)。兩個(gè)突變據(jù)推測(cè)通過VP1R270和VP3H329的相互作用與VP1和VP3的C-端緊密接觸。我們提出CVA21-DAFvVP3中觀察到的突變可能參與了增強(qiáng)VP3α-螺旋和VP1C-端區(qū)的構(gòu)象，后者對(duì)應(yīng)于EV12表面上的DAF結(jié)合足跡。這種構(gòu)象上的變化將使得CVA21-DAFv外殼和DAF之間更好地接觸。由于VP3H96和A101的存在使DAF和CVA21-DAFv病毒體雙重凹陷之間的親和力增加這一假設(shè)與下列發(fā)現(xiàn)相一致通過用抗-DAF SCR1mAb攻擊，CVA21-DAFv比親代病毒體更難以從表面表達(dá)的DAF上移位(圖8A)。低代數(shù)CVA臨床分離株在不存在mAb交聯(lián)DAF和ICAM-1表達(dá)的情況下可以不同程度地溶解感染表達(dá)DAF的RD細(xì)胞，它們也編碼在CVA21-DAFv中觀察到的VP3H96，但沒有A101突變。與之相比，原型CVA21病毒株編碼VP3R96。放射性同位素標(biāo)記的CVA21-DAFv病毒體與表面DAF吸附能力的增強(qiáng)反映了在外殼編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生了突變，而不是有其它的病毒基因組區(qū)參與。
交聯(lián)DAF介導(dǎo)的原型CVA21細(xì)胞溶解性感染發(fā)生的速率比經(jīng)由ICAM-1相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞溶解性感染慢，因此認(rèn)為細(xì)胞侵入經(jīng)由不同的侵入機(jī)制發(fā)生。交聯(lián)DAF介導(dǎo)的原型CVA21侵入無需形成可檢測(cè)的A顆粒便可以發(fā)生，推測(cè)其與細(xì)胞窖有關(guān)，這是最近發(fā)現(xiàn)的EV1和EV11的DAF結(jié)合株的侵入所涉及的一種新的侵入途徑。EV1與其受體α2β1在細(xì)胞表面上的吸附引起整合蛋白的集聚，被認(rèn)為以與原型CVA21通過交聯(lián)DAF介導(dǎo)侵入相似的方式促進(jìn)病毒侵入。在mAb交聯(lián)之后，推測(cè)DAF以更有利的構(gòu)象被呈遞在細(xì)胞表面上，從而使細(xì)胞容易被原型CVA21感染。CVA21-DAFv與表面DAF的結(jié)合似乎是在不形成可檢測(cè)A顆粒的情況下發(fā)生的(圖8B)。對(duì)這一發(fā)現(xiàn)的一種可能的解釋是以與之前假設(shè)的低代數(shù)臨床CVA21分離株(也具有VP3H96殘基)相似的方式，CVA21-DAFv病毒體可以有效地交聯(lián)DAF，從而通過與交聯(lián)mAb人工作用有關(guān)的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。表觀上缺乏從細(xì)胞表面洗脫的可檢測(cè)CVA21-DAFv A顆粒并不能證明沒有A顆粒的形成。如果隨后的脫殼發(fā)生速度比初始DAF介導(dǎo)的160S至135S顆粒的轉(zhuǎn)變快，A顆粒將不能積聚。使用α2β1整合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的EV1與外殼峽谷中α2β1整合蛋白的功能性α21結(jié)構(gòu)功能區(qū)結(jié)合。盡管是一種典型的峽谷結(jié)合受體，EV1與α21的相互作用并不能引起病毒脫殼，這與可溶形式的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體與脊髓灰質(zhì)炎病毒、ICAM-1與鼻病毒的結(jié)合相反。表達(dá)α2β1的細(xì)胞和EV1之間的相互作用已經(jīng)提示介導(dǎo)了病毒體的構(gòu)象變化，但是EV1脫殼是否還需要其它的細(xì)胞分子尚不清楚。同樣，不能排除CVA21-DAFv脫殼需要其它的細(xì)胞蛋白，或者如果病毒外殼中存在突變則可能使外殼不穩(wěn)定，因而便不再需要受體介導(dǎo)的構(gòu)象變化。
CVA21-DAFv溶解性感染兩種顯型和組織來源不同的癌細(xì)胞系(RD和DOV13)的能力突出說明，使用DAF作為功能受體并不限于生物選擇過程中所用的特定細(xì)胞底物。相對(duì)于正常細(xì)胞，DAF和其它補(bǔ)體調(diào)控蛋白在許多不同來源的腫瘤細(xì)胞表面上的表達(dá)都得到增強(qiáng)，以保護(hù)細(xì)胞不受補(bǔ)體介導(dǎo)的攻擊。因此我們認(rèn)為，由于DAF結(jié)合顯型增強(qiáng)，CVA21-DAFv介導(dǎo)的經(jīng)由外殼與表面表達(dá)的DAF之間的特異性相互作用的溶瘤作用潛在可以有效地控制一些人類惡性腫瘤。經(jīng)由ICAM-1和DAF(二者均在惡性黑色素瘤細(xì)胞表面上過度表達(dá))靶向的原型病毒株CVA21(其有效地控制黑色素腫瘤)的成功應(yīng)用支持了這一策略。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是病毒的生物選擇可能是一種有生命力的可選方法，以便在新型腫瘤靶向溶瘤性腸病毒的開發(fā)中對(duì)基因操作進(jìn)行指導(dǎo)。
III.柯薩奇病毒A21-DAF介導(dǎo)的細(xì)胞感染性原型和臨床分離株之間的腸病毒與DAF的相互作用似乎有所不同。在不存在ICAM-1表達(dá)和抗體交聯(lián)DAF的情況下，CVA21的臨床分離株可能是經(jīng)由特異性病毒外殼作用通過DAF交聯(lián)而不同程度地引起宿主細(xì)胞的溶解性感染。然而，盡管詳細(xì)描述了許多臨床腸病毒分離株的DAF相互作用，溶解性感染中DAF的直接功能性作用尚未闡明。許多對(duì)腸病毒-DAF相互作用的研究一致認(rèn)為DAF起到病毒螯合受體的作用，從而增強(qiáng)了病毒向其他功能性內(nèi)化受體的呈遞。
在本研究中我們證實(shí)，與結(jié)合DAF的艾柯病毒和B型柯薩奇病毒不同，CVA21與DAF的N-端SCR結(jié)合(圖11)?？疾炝松镂锢韰?shù)如時(shí)間、溫度和pH對(duì)從DAF洗脫CVA21的影響，結(jié)果顯示，CVA21顆粒相對(duì)較快地從DAF上洗脫，這種洗脫對(duì)溫度和pH的增加是易感的(圖12)。CVA21從ICAM-1上洗脫的特征在于與從DAF洗脫的病毒體相比，病毒的感染性大幅度下降(圖13和圖14)。由于受體的結(jié)合，從ICAM-1上洗脫的CVA21病毒粒子經(jīng)歷了不可逆的外殼構(gòu)象改變，使它們失去了結(jié)合和引發(fā)溶解性感染的能力。與此相反，CVA21與mAb交聯(lián)DAF的相互作用則不會(huì)引起A顆粒的形成。受體結(jié)合時(shí)非感染性A顆粒的構(gòu)象變化是許多小RNA病毒(如PV、主要組HRV和CVB3)的特征。DAF洗脫顆粒能夠保持感染性最可能的原因是DAF不能誘導(dǎo)CVA21外殼的構(gòu)象變化。從表達(dá)DAF的CHO細(xì)胞上洗脫的CVA21顆粒在蔗糖梯度中的沉降系數(shù)與感染性160S顆粒相似，而從表達(dá)ICAM-1的CHO細(xì)胞上洗脫的CVA21顆粒表現(xiàn)出的沉降系數(shù)減小，更接近于135S改變的顆粒。CVA21的感染性在DAF相互作用之后仍然保持的原因可能在于與參與ICAM-1結(jié)合的情況相比，病毒體外殼的不同區(qū)域參與了DAF結(jié)合。CVA21峽谷是ICAM-1的附著位點(diǎn)，而DAF據(jù)推測(cè)在更容易接觸到的外殼雙重凹陷(twofold depression)內(nèi)結(jié)合，這一提議最近在EV7中使用低溫電子顯微鏡重建得到證實(shí)。同樣，推測(cè)EV11也在峽谷外部的外殼區(qū)域與DAF結(jié)合，但是在這種情況下，結(jié)合被認(rèn)為涉及二十面體5重軸。這些發(fā)現(xiàn)支持了以下理論由于推測(cè)雙重凹陷中的結(jié)合并不能引起外殼構(gòu)象的可檢測(cè)變化，主要由DAF參與細(xì)胞吸附。
DAF與腸病毒外殼結(jié)合的特性被認(rèn)為是親和力很低，其原因在于解離速率常數(shù)非?？?。相反，ICAM-1與結(jié)構(gòu)相似的病毒外殼的相互作用親和力相當(dāng)，但在動(dòng)力學(xué)上顯著變慢，這與結(jié)合位點(diǎn)外殼峽谷相對(duì)較難接近相符合。在與mAb接觸競(jìng)爭(zhēng)其受體結(jié)合表位的過程中，DAF-結(jié)合的病毒體比ICAM-1結(jié)合的病毒體更容易移位，這一結(jié)果表明與ICAM-1的結(jié)合比DAF更嚴(yán)格。因此，mAb介導(dǎo)的DAF結(jié)合CVA21移位的明顯差異是外殼表面上受體結(jié)合位點(diǎn)的各個(gè)位置的相對(duì)接近造成的，即，由于mAb接近雙重凹陷(twofold depression)內(nèi)的可能性增加，病毒的DAF結(jié)合更容易解離，由于mAb與外殼峽谷的接近受限制，病毒的ICAM-1結(jié)合難以解離。
(ICAM-1陰性細(xì)胞上)CVA21與DAF結(jié)合并保持感染狀態(tài)直至24小時(shí)的能力突出了CVA21與DAF相互作用的可逆性質(zhì)。當(dāng)出現(xiàn)ICAM-1表達(dá)延遲時(shí)，感染性的保留使得結(jié)合DAF的病毒粒子能夠進(jìn)入細(xì)胞并隨后溶解細(xì)胞(圖15)。在不存在可檢測(cè)細(xì)胞病理學(xué)變化的情況下，在研究過程中RD細(xì)胞單層和用腺-CD36(圖15C)轉(zhuǎn)導(dǎo)的RD細(xì)胞上的感染性CVA21始終保持相對(duì)較高的水平；最有可能是由于與DAF結(jié)合的保留感染性的殘余病毒接種物造成的(圖13和圖14)。另一種解釋是，在CVA21原型制劑中存在顯型DAF利用增強(qiáng)的病毒體亞群，使DAF交聯(lián)，并引發(fā)隨后的緩慢感染，這是之前對(duì)CVA21臨床分離株所述的一個(gè)發(fā)現(xiàn)。
假定DAF在哺乳動(dòng)物體內(nèi)特別是在紅細(xì)胞上廣泛分布，CVA21利用DAF作為吸附受體并保持高度感染性的能力是一種非常有益的機(jī)制。在這種情況下，表達(dá)DAF的紅細(xì)胞為病毒提供了一種現(xiàn)成的運(yùn)輸載體向全身輸送，感染性病毒可以離開紅細(xì)胞表面，與表達(dá)ICAM-1的細(xì)胞相互作用進(jìn)行溶解性感染。在存在炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的情況下，細(xì)胞表面的ICAM-1表達(dá)得以強(qiáng)。在天然人鼻病毒感染過程中，被感染的細(xì)胞釋放處這些介導(dǎo)周圍細(xì)胞ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)胞因子。
在此給出的數(shù)據(jù)證實(shí)，CVA21溶解性感染過程中DAF的主要作用是作為螯合受體，使病毒保持在感染狀態(tài)，等待經(jīng)由ICAM-1相互作用進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會(huì)。相對(duì)較短的結(jié)合和洗脫循環(huán)周期表明，細(xì)胞感染過程中CVA21最有可能與DAF結(jié)合并從其上洗脫許多次。我們認(rèn)為，從DAF上洗脫并不會(huì)損害CVA21在后期引發(fā)生產(chǎn)性感染的能力，實(shí)際上它增加了該病毒通過至少兩種不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)侵入宿主細(xì)胞的可能。首先，病毒可以與DAF結(jié)合并洗脫，同時(shí)仍然保持受體結(jié)合能力，從而保持細(xì)胞感染性。其次，CVA21可以與DAF結(jié)合，等待在同一細(xì)胞或鄰近細(xì)胞上達(dá)到顯著水平的ICAM-1表達(dá)，從而使病毒內(nèi)化，隨后發(fā)生溶解性感染。就病毒進(jìn)化和發(fā)病機(jī)理兩個(gè)方面而言，結(jié)合DAF的能力必須被認(rèn)為最有利于CVA21原型株和其他DAF結(jié)合腸病毒使細(xì)胞感染性最大，在有毒力的臨床CVA21分離株中保留甚至增強(qiáng)的顯型。
IV.柯薩奇病毒A21DAF變異體(CVA21-DAFv)體外溶解人乳腺、前列腺、結(jié)腸和卵巢癌細(xì)胞在此展現(xiàn)的工作描述了通過體外選擇方法分離的CVA21-DAFv的特異性溶瘤能力。使用一組12個(gè)人癌細(xì)胞系，我們已經(jīng)證明，這種生物選擇的病毒株迅速地感染所有來源于腫瘤的被測(cè)細(xì)胞。相反，CVA21-DAFv所源自的CVA21親代病毒株，僅僅在被測(cè)的12個(gè)癌細(xì)胞系中的7個(gè)中介導(dǎo)著溶瘤作用。重要的是，CVA21-DAFv相對(duì)于親代CVA21更出色的溶瘤活性并不限于產(chǎn)生該生物選擇病毒株的RD細(xì)胞，而是在大多數(shù)被測(cè)的來源于不同組織的其它人癌細(xì)胞系中均有觀察到(圖18)。我們觀察到，與需要存在ICAM-1來進(jìn)入細(xì)胞的親代CVA21相比，CVA21-DAFv溶解性地感染大量被測(cè)腫瘤細(xì)胞系可能具有深遠(yuǎn)的臨床意義。人類實(shí)體腫瘤通常是一大團(tuán)聚集的細(xì)胞，其往往不表達(dá)ICAM-1。而且，已經(jīng)顯示ICAM-1的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，即，與轉(zhuǎn)移性較小的LNCaP細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)的細(xì)胞系DU145和PC3上表達(dá)有ICAM-1。在研究中我們已顯示，LNCaP細(xì)胞對(duì)CVA21的親代病毒株的感染有抵抗力，該細(xì)胞系以及DU145和PC3則被生物選擇的變異體CVA21-DAFv溶解。
V.CVA21-DAFv對(duì)人前列腺腫瘤異種移植物的體內(nèi)溶瘤作用盡管CVA21-DAFv比CVA21親代病毒株針對(duì)范圍更寬的癌細(xì)胞系表現(xiàn)出溶瘤活性，在人前列腺腫瘤異種移植物的體內(nèi)模型中，生物選擇的病毒株的單次劑量同樣有效地減小腫瘤的負(fù)荷?？傊?，在此所展現(xiàn)的證據(jù)表明，CVA21-DAFv具有用作多種異種癌細(xì)胞種類的有效生物治療藥物的潛力。
摘要已經(jīng)顯示，低細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)的CVA21臨床分離株除與ICAM-1結(jié)合之外，還與DAF結(jié)合，具有DAF結(jié)合顯型，因此，不可能從細(xì)胞培養(yǎng)物的多次傳代得到。越來越多的證據(jù)表明，DAF在腸病毒感染中發(fā)揮更多的功能作用，這種臨床CVA21分離株的DAF利用增強(qiáng)顯型在不存在抗-DAF mAb交聯(lián)或ICAM-1表面表達(dá)的情況下，具有溶解性地感染DAF表達(dá)細(xì)胞的能力。
我們研究了生物選擇成溶解性地感染ICAM-1陰性橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞的CVA21變異體CVA21-DAFv的受體利用性質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)DAF的RD細(xì)胞中進(jìn)行多次傳代后，與親代病毒株相比，CVA21-DAFv表現(xiàn)出的結(jié)合DAF的能力增強(qiáng)，同時(shí)還保留著結(jié)合ICAM-1的潛力。RD細(xì)胞的溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb阻斷完全消除，這表明單是與DAF的相互作用介導(dǎo)了溶解性感染。為了更好地認(rèn)識(shí)CVA21-DAFv細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)，對(duì)CVA21-DAFv外殼編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，并與親代CVA21的序列進(jìn)行比較。序列比較顯示，CVA21-DAFv的VP3中有兩個(gè)獨(dú)特的氨基酸取代，預(yù)計(jì)這使得病毒外殼與DAF的相互作用得以增強(qiáng)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以在不偏離本發(fā)明精神或廣義描述范圍的前提下，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行大量的變動(dòng)和/或修改。因此，本文的實(shí)施方式在所有方面均應(yīng)被視為是說明性的，而絕不是限制性的。
序列表<110>維若塔歌私人有限公司<120>修飾的溶瘤病毒<130>699860C<150>US60/552,095<151>2004-03-11<160>8<170>PatentIn version3.2<210>1<211>2637<212>DNA<213>柯薩奇病毒A<400>1atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct 60aatggatcca ccattaatta tactactatc aattactaca aagatagcgc gagtaattcg 120gccactagac aagatctttc ccaagatcca tcaaaattca cggaaccggt taaggactta 180atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac 240cgtgtaagac aaattaccct gggtaactca accattacca cacaagaagc agctaatgct 300attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat 360gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg 420aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg 480tttggtcaga acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag 540tgcaatgcct caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt 660gagaggggcg gtgagttcac aaacacctac aacccatcaa acacagatgc tagtgagggc 720agacaattcg cagcactaga ctatctgctg ggttctggcg ttctagctgg aaacgcattt 780gtgtacccgc accagatcat taacttgcgt accaataaca gtgcaacaat cgtggtgcca 840tatgtgaact cacttgtcat tgattgcatg gcaaaacata ataactgggg cattgtcatt 900ctaccactgg cacccttggc ctttgctgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg 960accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat1020caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc1080cagtcaccct gcgccttacc caattttgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa1140
gtgaagaaca tgatggaact ggctgaaatt gacacgctga tcccaatgaa tgcagtggac1200ggaaaggtga acactatgga aatgtatcaa ataccattaa atgacaattt gagcaaggca1260cccatatttt gcctatctct gtcgcctgct tctgacaaac gattaagtca tacaatgttg1320ggtgaaattc taaattatta cacccattgg acagggtcca ttaggttcac ctttctattt1380tgtggtagta tgatggctac tggtaagcta cttctcagtt attccccacc aggagctaaa1440ccaccaacca atcgcaaaga tgcaatgttg ggcacacaca tcatctggga cctggggtta1500caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctctaata cagtatacag gcggtgcgca1560cgtgatgact tcacagaagg cgggtttata acttgctttt atcaaactag aattgttgtg1620cctgcttcaa ctcctaccag tatgtttatg ttaggctttg tgagtgcatg tccagatttc1680agtgtcagac tgcttaggga cacttcccac attagtcaat caaaactaat agcacgctca1740caaggcattg aagaccttat tgactcagcg ataaagaatg ctttgagagt gtctcaacca1800tctacggccc agtcaactga agcaaccagt ggagcaaata gtcaggaagt gccagcacta1860actgctgtgg aaacaggagc atctggtcag gcaatcccca gtgacgtgat ggaaaccaga1920cacgtgataa attacaaaac taggtctgaa tcatgccttg agtcattctt tgggagagct1980gcgtgtgtca caatcctatc tctgaccaac tcttccaaga gtggcgagga gaaaaagcat2040ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attagagttt2100ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctaccccagt2160acagctagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca2220ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt2280tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc2340tattcacact tctatgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct2400ggtgatacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca2460gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaaaccaaaa2520cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgcgctgtat tatacagagg agaaggagta2580gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actaaagtgg actcaattac cactttt 2637<210>2<211>879<212>PRT<213>柯薩奇病毒A<400>2
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu85 90 95Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn100 105 110Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser115 120 125Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser130 135 140Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met145 150 155 160Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr165 170 175Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly180 185 190Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys195 200 205Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly210 215 220Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly225 230 235 240Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala245 250 255Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn260 265 270Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp275 280 285Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala290 295 300Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val305 310 315 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr325 330 335Ile Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn340 345 350Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn355 360 365Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met370 375 380Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp385 390 395 400Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn405 410 415Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp420 425 430Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr435 440 445His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met450 455 460Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys465 470 475 480Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp485 490 495Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser500 505 510Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly515 520 525Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr530 535 540Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe545 550 555 560Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu565 570 575Ile Ala Arg Ser Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys580 585 590Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala595 600 605Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu610 615 620Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg
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gcgtgtgtca caatcctatc tctgaccaac tcttccaaga gtggcgagga gaaaaagcat2040ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attagagttt2100ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctaccccagt2160acagctagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca2220ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt2280tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc2340tattcacact tctatgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct2400ggtgatacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca2460gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaaaccaaaa2520cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgcgctgtat tatacagagg agaaggagta2580gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actaaagtgg actcaattac cactttt 2637<210>4<211>879<212>PRT<213>柯薩奇病毒A<400>4Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu85 90 95Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn100 105 110Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser115 120 125Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser130 135 140Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met145 150 155 160
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Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys465 470 475 480Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp485 490 495Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser500 505 510Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly515 520 525Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr530 535 540Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe545 550 555 560Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu565 570 575Ile Ala Arg Ser Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys580 585 590Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala595 600 605Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu610 615 620Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg625 630 635 640His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe645 650 655Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser660 665 670Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr675 680 685Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser690 695 700Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser705 710 715 720Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile725 730 735Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln740 745 750Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro755 760 765
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accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat1020caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc1080cagtcgccct gcgccttgcc caatttcgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa1140gtgaagaaca tgatggaact ggctgaaatt gacacactga tcccaatgaa tgcagtggac1200ggaaaggtga acactatgga aatgtatcaa ataccattaa atgacaattt gagcaaggca1260cccatatttt gcctatctct gtcgcctgct tctgacagac gactacgtca tacaatgttg1320ggtgaaattc taaattatta cacccattgg acagggtcca ttaggttcac ctttctattt1380tgtggtagta tgatggctac tggtaagcta cttctcagtt attccccacc aggagctaaa1440ccaccaacca atcgcaaaga tgcaatgttg ggcacacaca tcatctggga cctgggatta1500caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctctaata cagtatacag gcggtgcgca1560cgtgatgact tcacagaagg cgggtttata acttgctttt atcaaactag aattgttgtg1620cctgcttcaa ctcctaccag tatgtttatg ttaggctttg tgagtgcatg tccagatttc1680agtgtcagac tgcttaggga cacttcccat attagtcaat caaaattaat agcacgcgca1740caaggcattg aagaccttat tgactcagcg ataaagagtg ctttgagagt gtctcaacca1800tctacggccc agtcaactga agcaaccagt ggagcaaata gtcaggaagt gccagcacta1860actgctgtgg aaacaggagc atctggtcag gcaatcccca gtgacgtgat ggaaaccaga1920cacgtgataa attacaaaac caggtctgaa tcatgccttg agtcattctt tgggagagct1980gcgtgtgtca caatcctatc tctgactaac tcttccgaga gaggggagga gaggaagcat2040ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attggagttt2100ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctatcccagt2160acagccagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca2220ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt2280tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc2340tattcacact tctacgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct2400ggtgacacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca2460gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaagccaaaa2520cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgtgctgtat tatacagagg agaaggagta2580gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actgaagtgg actcaattac cactttt 2637<210>6<211>879
<212>PRT<213>柯薩奇病毒A<400>6Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu85 90 95Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn100 105 110Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser115 120 125Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser130 135 140Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met145 150 155 160Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr165 170 175Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly180 185 190Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys195 200 205Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly210 215 220Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asp Thr Asp Ala Asn Glu Gly225 230 235 240Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala245 250 255Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn260 265 270Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp275 280 285
Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala290 295 300Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val305 310 315 320Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr325 330 335Ile Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn340 345 350Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn355 360 365Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met370 375 380Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp385 390 395 400Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn405 410 415Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp420 425 430Arg Arg Leu Arg His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr435 440 445His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met450 455 460Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys465 470 475 480Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp485 490 495Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser500 505 510Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly515 520 525Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr530 535 540Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe545 550 555 560Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu565 570 575Ile Ala Arg Ala Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys580 585 590Ser Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala
595 600 605Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu610 615 620Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg625 630 635 640His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe645 650 655Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser660 665 670Glu Arg Gly Glu Glu Arg Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr675 680 685Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser690 695 700Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser705 710 715 720Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile725 730 735Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln740 745 750Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro755 760 765Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe770 775 780Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala785 790 795 800Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu805 810 815Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser820 825 830Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg835 840 845Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser850 855 860Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Glu Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe865 870 875<210>7<211>2637<212>DNA<213>柯薩奇病毒A
<400>7atgggggctc aagtttcaac gcaaaagacc ggtgcgcac9 agaatcaaaa cgtggcagcc 60aatggatcca ccattaatta cactactatc aactattaca aagacagtgc gagtaattcc 120gctactagac aagacctctc ccaagatcca tcaaaattca cagaaccggt taaggactta 180atgttgaaaa cagcaccagc tctaaactcg cctaacgtgg aagcatgtgg gtacagtgac 240cgtgtgaggc aaatcacttt aggcaactcg actattacta cacaagaagc agccaatgct 300attgttgctt acggtgaatg gcccacttac ataaatgatt cagaagctaa tccggtagat 360gcacccactg agccagatgt tagtagcaac cggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg 420aagaccactt caaggggatg gtggtggaag ttaccagatt gtttgaagga catgggaatg 480tttggtcaga atatgtacta tcactacttg gggcgctctg gttacaccat tcatgtccag 540tgcaacgctt caaaatttca ccaaggggcg ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600atggcttgca acactgagag taaaacgtca tacgtttcat acatcaatgc aaatcctggt 660gagagaggcg gtgagtttac gaacacctac aatccgttaa atacagacgc cagtgagggc 720agaaagtttg cagcattgga ttatttgctg ggttctggtg ttctagcagg aaacgccttt 780gtgtacccgc accagatcat caacctacgt accaacaaca gtgcaacaat tgtggtgcca 840tacgtaaact cacttgtgat tgattgtatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcata 900ttaccactgg cacccttggc ctttgccgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg 960accattgcac ccatgtgtac agaattcaat gggttgagaa acatcaccgt cccagtacat1020caagggttgc cgacaatgaa cacacctggt tccaatcaat tccttacatc tgatgacttc1080cagtcgccct gtgccttacc taattttgat gttactccac caatacacat acccggggaa1140gtaaagaata tgatggaact agctgaaatt gacacattga tcccaatgaa cgcagtggac1200gggaaggtga acacaatgga gatgtatcaa ataccattga atgacaattt gagcaaggca1260cctatattct gtttatccct atcacctgct tctgataaac gactgagcca caccatgttg1320ggtgmaatcc taaattatta cacccattgg acggggtcca tcaggttcac ctttctattt1380tgtggtagta tgatggccac tggtaaactg ctcctcagct attccccacc gggagctaaa1440ccaccaacca atcgcaagga tgcaatgcta ggcacacaca tcatctggga cctagggtta1500caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctccaaca cagtgtacag acggtgtgca1560cgtgatgact tcactgaggg cggatttata acttgcttct atcaaactag aattgtggta1620cctgcttcaa cccctaccag tatgttcatg ttaggctttg ttagtgcgtg tccagacttc1680agtgtcagac tgcttaggga cactccccat attagtcaat cgaaactaat aggacgtaca1740caaggcattg aagacctcat tgacacagcg ataaagaatg ccttaagagt gtcccaacca1800
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<221>misc_feature<222>(442)..(442)<223>Xaa可是是任何天然氨基酸<400>8Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80
Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu85 90 95Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn100 105 110Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser115 120 125Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser130 135 140Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met145 150 155 160Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr165 170 175Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly180 185 190Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys195 200 205Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly210 215 220Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Leu Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly225 230 235 240Arg Lys Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala245 250 255Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn260 265 270Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp275 280 285Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala290 295 300Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val305 310 315 320Thr Ile Ala Pro Met Cys Thr Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr325 330 335Val Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn340 345 350Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn355 360 365Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met370 375 380Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp385 390 395 400
Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn405 410 415Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp420 425 430Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Xaa Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr435 440 445His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met450 455 460Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys465 470 475 480Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp485 490 495Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser500 505 510Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly515 520 525Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr530 535 540Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe545 550 555 560Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Pro His Ile Ser Gln Ser Lys Leu565 570 575Ile Gly Arg Thr Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Thr Ala Ile Lys580 585 590Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Pro Ser Thr Gln Ser Thr Glu Ala595 600 605Thr Ser Gly Val Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu610 615 620Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Val Glu Thr Arg625 630 635 640His Val Val Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe645 650 655Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser660 665 670Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe ASn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr675 680 685Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser690 695 700
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1.一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述選擇的小RNA病毒能夠通過細(xì)胞上的衰變加速因子(DAF)溶解性地感染細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒選自腸病毒的原型和臨床分離株，所述的腸病毒包括柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒、肝病毒和心病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為柯薩奇病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小RNA病毒，其中所述的柯薩奇病毒為A型柯薩奇病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小RNA病毒，其中所述的柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A21。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為艾柯病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小RNA病毒，其中所述的艾柯病毒為艾柯病毒6、7、11、12、13或29。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為脊髓灰質(zhì)炎病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的小RNA病毒，其中所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒為1、2或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為鼻病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的小RNA病毒，其中所述的鼻病毒是主要組鼻病毒或次要組鼻病毒的成員。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒是通過以下方法生物選擇的將表達(dá)DAF、無ICAM-1的細(xì)胞系中的不能在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒傳代，并回收選擇的能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒通過例如定點(diǎn)誘變或者在使用抗-ICAM-1抗體阻斷ICAM-1入口的細(xì)胞中進(jìn)行傳代被改變、突變或修飾。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的選擇的小RNA病毒與野生型病毒相比在一個(gè)或多個(gè)外殼蛋白中發(fā)生了改變。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒是包括選自VP1、VP2和VP3的外殼蛋白的改變的柯薩奇病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的小RNA病毒，其中所述的突變選自VP3 R96H；VP3 E101A；VP3 A239S；VP2 S164L和VP2 V209中的一種或多種。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的選擇的小RNA病毒包括由選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的核酸序列編碼的外殼蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的細(xì)胞為腫瘤。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的小RNA病毒，其中所述的腫瘤為表達(dá)DAF的腫瘤。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的小RNA病毒，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
22.一種源自能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的核酸分子，其中所述的核酸分子是單鏈RNA或互補(bǔ)DNA。
24.一種對(duì)能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒進(jìn)行生物選擇的方法，該方法包括將不能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒培養(yǎng)在合適的細(xì)胞系中進(jìn)行足夠多次的傳代，選擇能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞的小RNA病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的細(xì)胞系選自人類癌，例如橫紋肌肉瘤、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的細(xì)胞系是不表達(dá)ICAM-1、表達(dá)DAF的細(xì)胞系。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法得到的小RNA病毒。
28.一種藥物組合物，其包括能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
29.一種藥物組合物，其包含能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的小RNA病毒的病毒核酸分子、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
30.一種治療患腫瘤哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，該方法包括在導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶瘤作用的條件下，用有效量的能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒為哺乳動(dòng)物給藥。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的腫瘤是表達(dá)DAF的腫瘤。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
33.一種治療患腫瘤哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，該方法包括在導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶瘤作用的條件下，用有效量的源自能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子為哺乳動(dòng)物給藥。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的腫瘤是表達(dá)DAF的腫瘤。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細(xì)胞、食管癌、乳癌、腦癌和卵巢癌。
36.一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒在治療方法或治療中的用途。
37.一種源自能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子在治療方法或治療中的用途。
38.一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒在治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物制造中的用途。
39.一種將接種物提供給哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生治療哺乳動(dòng)物腫瘤的病毒的施用器，其中所述的施用器包括充滿接種物的區(qū)域，使得接種物可以與哺乳動(dòng)物接觸，所述的病毒是能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
40.一種本文所定義的CVA21-DAFv形式的分離、選擇的小RNA病毒。
41.一種本文所定義的CVA21病毒株形式的分離、選擇的小RNA病毒，其選自CVA21#272101、275238和272598。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細(xì)胞間粘附分子－1(ICAM－1)的情況下溶解性地感染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒；以及治療受試者的方法。
文檔編號(hào)C12N9/50GK101027394SQ200580007825
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者E·S·周翰生, D·R·雪弗倫 申請(qǐng)人:維若塔歌私人有限公司