專利名稱：水解核糖核酸(RNAs)的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水解核酸的方法和化合物。特別地，本發(fā)明涉及用于優(yōu)先切割RNA中特定位點(diǎn)的磷酸二酯鍵的化合物。因此本發(fā)明特別是從反義策略(antisense strategies)的角度為研究與分子生物學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一個(gè)有用工具。
背景技術(shù)：
反義技術(shù)(antisense technology)是在發(fā)現(xiàn)DNA和/或RNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯能使用連接到靶核酸上的寡核苷酸進(jìn)行調(diào)控的基礎(chǔ)上建立起來的。這樣的反義寡核苷酸被認(rèn)為是與有意義的DNA或RNA靶核酸互補(bǔ)并且具有反向序列的寡核苷酸。當(dāng)天然寡核苷酸被應(yīng)用于反義策略時(shí)，即具有標(biāo)準(zhǔn)的、天然堿基和主鏈的寡核苷酸，其一般應(yīng)該包含至少17個(gè)堿基才能有效激活RNaseH活性，從而具有向下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的效果。
隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，已提出多種對(duì)于寡核苷酸的修飾，以使它們?cè)诒皇褂脮r(shí)更加穩(wěn)定。特別地，如果將反義寡核苷酸引入到完整細(xì)胞中時(shí)，它們會(huì)暴露在RNA和DNA特異的核酸酶的攻擊之下從而失去活性。已描述過的能抑制由核酸酶引起的降解的修飾體有2’-O-烷基或烯基(烯丙基)或炔基(alkynyl)核苷酸，封閉核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，硫代磷酸酯，嗎啡啉寡核苷酸等。
在另一方向上，人工核糖核酸酶因?yàn)槠湓诨虿倏v上潛在的應(yīng)用而受到重視。尤其是將RNA-切割分子連接到寡核苷酸(DNAs)的末端。這種寡核苷酸與靶RNA的特異序列雜交后切割RNA上的特定位點(diǎn)。在這方面，特別是使用了通過分子內(nèi)酸堿的協(xié)同作用對(duì)水解敏感的胞嘧啶和腺嘌吟(CA)間的磷酸二酯鍵。水解發(fā)生在胞嘧啶核苷酸的3’-端上。
Komiyama等在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1995，77-78中報(bào)道了將二乙烯三胺(DETA)通過氨基甲酸鍵錨定到19聚DNA的5’-末端的雜交體可以選擇性的水解線性RNA胞嘧啶3’-末端，以產(chǎn)生具有3’-磷酸末端的22聚RNA片段。選擇性切斷是因?yàn)镈NA-DETA加合物中乙二胺[-N(CH2)2NH2]部分中銨陽(yáng)離子和中性胺中的分子內(nèi)酸堿協(xié)作造成的。在溫度50℃，pH值為8的條件下，孵育4小時(shí)后，只有10mol％的RNA被水解。
為了在這方面取得發(fā)展，Verheijen描述了一種具有10聚PNA的DETA加合物(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。因?yàn)镻NA能抵抗生物降解，同時(shí)由于PNAs和RNA(或DNA)鍵結(jié)合力比天然寡核苷酸更強(qiáng)，10個(gè)PNA單體的寡聚物長(zhǎng)度足以用來雜交，因此PNA被選為寡核苷酸。DETA切割部分與PNA通過尿素鍵耦合。在靶RNA中，通過用胞嘧啶取代鳥嘌呤而引入另一個(gè)切割位點(diǎn)。實(shí)際上，靶RNA會(huì)在兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生水解，并且在pH7，40℃孵育4小時(shí)后，RNA水解的總轉(zhuǎn)化率大概為29％(需要注意的是這些條件相比komiyama試驗(yàn)中使用的條件能夠更好的代表生理?xiàng)l件)。
下面就是兩篇現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的示意性說明。第一個(gè)是Komiyama等所用到的RNA(30聚)和DNA-DETA的復(fù)合體，接下來的是Verheijen所用到的RNA(25聚)和PNA-DETA的復(fù)合體。DETA代表NH(CH2)2NH(CH2)2NH2。核苷酸單元由大寫字母寫出，PNA單元由小寫字母寫出。箭頭標(biāo)注了RNA通過DNA-DETA或PNA-DETA發(fā)生水解的切割位點(diǎn)。注意KomiyamaRNA中的19位的鳥嘌呤被Verheijen RNA中的胞嘧啶所替代。
Komiyama↓[RNA]5’-GGAGGUCCUGUGUUCGAUCCACAGAAUUCG-3’●●●●●●●●●●●●●●●●●●●[DNA-DETA] 3’-TCCAGGACACAAGCTAGGT-O(C＝O)-DETAVerheijen6↓17↓19↓[RNA]5’-UCCUGUGUUCGAUCCACACAAUUCG-3’●●●●●●●●●●[PNA-DETA] 3’-caagctaggt-NH(C＝O)-DETA前面已經(jīng)提到，Verheijen RNA在兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生水解，即在C17和C19的3’-端。在孵育7小時(shí)后，RNA∶PNA-DETA的比例是1∶33，大約50％的RNA被水解了其中大約15％是水解于C17的3’-端，35％水解于C19的3’-端。此外，Verheijen注意到，因U6的3’-端的斷裂產(chǎn)生了少量的降解產(chǎn)品。此處斷裂是因?yàn)?0聚PNA寡聚體相當(dāng)于1個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角，位于與U6和G7間的磷酸二酯鍵相鄰的RNA·PNA-DETA復(fù)合體的乙二胺殘基處。
要考慮的該領(lǐng)域的其他現(xiàn)有技術(shù)是Komiyama等發(fā)表于Nucleic Acids SymposiumSeries No.29，1993，197-198.的“人工水解核酸酶和核糖核酸酶的分子設(shè)計(jì)(Moleculardesign of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases)”，該文獻(xiàn)表明從靶tRNA中的兩個(gè)可水解磷酸二酯鍵來看，距離末端水解核苷酸三個(gè)核苷酸的較遠(yuǎn)的鍵比距離末端水解核苷酸一個(gè)核苷酸的鍵更容易被水解。然而，需要應(yīng)當(dāng)注意的是，Komiyama等得到的人工水解核酸酶是分子建模研究的結(jié)果。有經(jīng)驗(yàn)的讀者應(yīng)該知道，這些核酸酶是對(duì)雜交位點(diǎn)和發(fā)生水解的位點(diǎn)已進(jìn)行了優(yōu)化后得到的結(jié)果。
Verheijen等人的研究(前文所述)和Vlassov等人的研究，參見Antisense andNucleic Acid Drug Development，1997，vol.7，39-42，實(shí)際都上是建立在Komiyama得到的核酸酶基礎(chǔ)上的。Verheijen等人和Vlassov等人都得到了和Komiyama同樣地結(jié)論，即距離越遠(yuǎn)的可水解的磷酸二酯鍵越易被水解。Valssov等指出，可以通過優(yōu)化將多聚酰胺基切割基團(tuán)(polyamine-based cleaving group)和寡核苷酸連接起來的連接手臂的結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和硬度，以及優(yōu)化與寡核苷酸連接的連接手臂的位點(diǎn)來提高水解或者切割效率的機(jī)會(huì)。不建議進(jìn)一步改變寡核苷酸和靶RNA雜交的位點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是通過提供提高水解效率的化合物通過多胺介導(dǎo)的切割而提高現(xiàn)有技術(shù)化合物水解核酸的狀況，尤其是提高水解的速率。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)核酸水解的多聚酰胺部分(polyamine moiety)到達(dá)連接多聚酰胺的寡核苷酸的距離和優(yōu)化核酸水解的位點(diǎn)之間存在一種關(guān)系。在下文中，負(fù)責(zé)水解的多聚酰胺部分也被稱為切割系統(tǒng)(Cutter)。與所述切割系統(tǒng)連接的寡核苷酸在下文中也被縮寫為寡核酸(Oligo)。切割系統(tǒng)和寡核苷酸之間的距離由共價(jià)連接二者的結(jié)構(gòu)元素確定，并且在下文中被稱為間隔區(qū)(Spacer)。更為方便地，由間隔區(qū)確定的距離用從寡核苷酸到切割系統(tǒng)的原子數(shù)目來描述。被計(jì)算在內(nèi)的原子是從寡核苷酸到切割系統(tǒng)間構(gòu)成直鏈的那些原子。該鏈上可能的取代基或者直鏈上的分枝都不能計(jì)算到由間隔區(qū)定義的原子數(shù)目中。
如果相對(duì)于將被水解的隆起位點(diǎn)，寡核苷酸復(fù)合體距離至少4個(gè)核苷酸遠(yuǎn)，那么相比現(xiàn)有技術(shù)的化合物的狀況，令人驚訝地是，底物RNA在胞嘧啶-腺嘌呤序列中胞嘧啶的3’-末端的水解加倍了，負(fù)責(zé)水解的多聚酰胺部分與寡核苷酸之間的距離至少為在直鏈上的兩個(gè)原子。
因此本發(fā)明涉及一種核糖核酸水解的方法，其中寡核苷酸或其類似物與包括至少兩個(gè)氮原子的切割系統(tǒng)耦合，所述核糖核酸水解中涉及所述的兩個(gè)氮原子，且間隔區(qū)包括連接所述寡核苷酸的末端核苷酸或其類似物和所述切割系統(tǒng)的直鏈上至少2個(gè)原子，在距離將被水解的隆起位點(diǎn)至少4個(gè)或者最多8個(gè)核苷酸處進(jìn)行雜交。
本發(fā)明的另一方面涉及一種水解核糖核酸的化合物，所述化合物具有的結(jié)構(gòu)是寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)其中，寡核苷酸是具有至少8個(gè)核苷酸的核糖核酸或其類似物，它能夠以這樣一種方式與靶核酸雜交以使末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點(diǎn)至少4個(gè)核苷酸處且至多8個(gè)核苷酸處的核苷酸雜交，間隔區(qū)將切割系統(tǒng)與所述寡核苷酸的所述末端核苷酸共價(jià)連接，并且從寡核苷酸到切割系統(tǒng)的直鏈上包括至少2個(gè)原子，切割系統(tǒng)是具有至少兩個(gè)氮原子的多聚酰胺。
發(fā)明詳述在尋找有效并可靠操縱基因表達(dá)的方法中，本發(fā)明人研究了選擇性水解靶核糖核酸的可能性。在這方面，關(guān)注點(diǎn)針對(duì)于通過多聚酰胺介導(dǎo)的切割磷酸二酯鍵起作用的人工核酸酶。
盡管Verheijen報(bào)道的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)(見上文)中，孵育7小時(shí)后水解了大約50％的靶核酸，這個(gè)量還是令人滿意的，但孵育24小時(shí)后也只有85％靶核酸被水解。除此之外，我們注意到靶核酸含有兩個(gè)用于水解的隆起位點(diǎn)，而且出現(xiàn)了第三個(gè)意外的水解位點(diǎn)。因此該現(xiàn)有技術(shù)中的人工核酸酶水解的效率距離要求還有差距，尤其對(duì)于沒有兩個(gè)或三個(gè)而只有一個(gè)可選的水解位點(diǎn)的靶核酸?；谏鲜龅默F(xiàn)有技術(shù)中的靶核酸，我們使用下列合成的RNA序列
15 10 15 20 255’-UCCUGUGUUCGAUCCGCAGAAUUCG-3’隆起水解位點(diǎn)由下劃線標(biāo)出。水解發(fā)生在下劃線標(biāo)出的胞嘧啶的3’-末端。當(dāng)計(jì)算距離將被水解的位點(diǎn)的核苷酸數(shù)目時(shí)，胞嘧啶或者腺嘌呤中任意一個(gè)都可包括在內(nèi)，寡核苷酸可以根據(jù)方向與5’-末端或3’-末端的任一方向分別進(jìn)行雜交。因此，在上述給出的RNA序列的例子中，寡核苷酸的末端核苷酸或類似物與距離將被水解的位點(diǎn)至少4個(gè)核苷酸處雜交，該末端核苷酸與沿5’-末端方向的第一個(gè)尿嘧啶(U13)雜交。沿3’-末端方向，距離將被水解位點(diǎn)4個(gè)核苷酸處是位點(diǎn)22的尿嘧啶(U22)。
為了水解上面所述的靶核酸的隆起位置，使用乙二胺(ethylene diamine)作為切割系統(tǒng)。為改變間隔區(qū)的長(zhǎng)度，將甘氨酸殘基插入寡核苷酸和切割系統(tǒng)之間。
寡核苷酸與距離將被水解的位點(diǎn)兩個(gè)或三個(gè)核苷酸進(jìn)行雜交，水解速率相似，且與間隔區(qū)中有沒有、有一個(gè)或者兩個(gè)甘氨酸殘基無關(guān)。在pH7，溫度為40℃，RNA與寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)比率為1∶33孵育7小時(shí)，得到10-20％的中度水解。孵育24小時(shí)后，水解率在25-30％間變化。
然而，寡核苷酸與將被水解的位點(diǎn)距離四個(gè)位置處發(fā)生雜交，卻出現(xiàn)了明顯的靶核糖核酸水解量增加的現(xiàn)象。尤其是對(duì)于間隔區(qū)包含5個(gè)原子的化合物來說，當(dāng)RNA∶寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)比例為1∶33，pH值為7，溫度40℃下，孵育7小時(shí)后，水解率大于50％，24小時(shí)后，水解率超過95％。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指核糖核酸或其類似物。這包括使寡核苷酸在生理環(huán)境中更為穩(wěn)定的核糖核酸的衍生物。合適的衍生物的實(shí)例是2’-O-烷基，烯烴(烯丙基)或炔基核苷酸，2’-脫氧核糖核酸(DNA)，和/或2’-脫氧-2’-氟代核苷酸.優(yōu)選的是2’-氧-甲基和2’-氧-烯丙基核苷酸.可供選擇地或可替換的是磷酸二酯鍵的衍生物，如O-烷基化磷酸二酯或優(yōu)選硫代磷酸酯。包含核苷酸類似物的寡核苷酸是指包括封閉核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，和嗎啡啉核苷酸的寡核苷酸等。
寡核苷酸中合適的堿基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷、2，6-氨基嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤，以及這些堿基的進(jìn)一步的衍生物，如烷基、氨基、疊氮和/或鹵素取代的堿基或脫氮堿基。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠知道的并且對(duì)堿基的進(jìn)一步的修飾體也同樣是適合的。
本發(fā)明中的寡核苷酸具有至少8個(gè)核苷酸或其類似物的長(zhǎng)度。一般而言，為了充分雜交，多于25個(gè)核苷酸(或其類似物)的長(zhǎng)度將沒有必要。至少10個(gè)核苷酸(或其類似物)的長(zhǎng)度是優(yōu)選的。
寡核苷酸具有兩個(gè)位點(diǎn)可連接間隔區(qū)。該間隔區(qū)連接在5’-O或者3’-O的任一原子上。如果寡核苷酸在其任一端包括核苷酸的類似物，則該間隔區(qū)則連接到與5’-O或3’-O原子相應(yīng)的核苷酸類似物內(nèi)的原子上。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“間隔區(qū)”用于定義寡核苷酸和切割系統(tǒng)之間的距離，用原子數(shù)目表示。原子數(shù)目是計(jì)算直鏈內(nèi)從與寡核苷酸的末端核苷酸或其類似物上5’-O或3’-O原子相連的第一個(gè)原子開始，到與切割系統(tǒng)耦合的最后一個(gè)原子。間隔區(qū)的末端位于切割靶RNA磷酸二酯鍵中所涉及的切割系統(tǒng)的第一個(gè)氮原子。間隔區(qū)中的原子可以是熟悉本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何合適原子，優(yōu)選間隔區(qū)中的原子選自C，O，S，N和P，可以相同或不同。
間隔區(qū)可以是帶支鏈的和/或間隔區(qū)中的原子可以被官能團(tuán)的基團(tuán)所取代。這些取代基可具有能檢測(cè)本發(fā)明的化合物的官能團(tuán)，例如間隔區(qū)可被熒光標(biāo)記取代。這類標(biāo)記眾所周知?？晒┻x擇地或進(jìn)一步的，間隔區(qū)也可以被能促進(jìn)細(xì)胞膜通透性的基團(tuán)所取代。這些基團(tuán)可以是與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層易于發(fā)生相互作用的疏水基，和/或可以是與穿過細(xì)胞膜有關(guān)的受體或酶相互作用的的基團(tuán)。
應(yīng)當(dāng)理解間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分例如可以完全包括聚乙胺(polyetheleneamine)。因?yàn)榕c寡核苷酸中末端核苷酸或其類似物連接的前兩個(gè)原子被認(rèn)為與磷酸二酯鍵的水解無關(guān)，所以它們不是切割系統(tǒng)的一部分。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“切割系統(tǒng)”指含有至少兩個(gè)氮原子的多聚酰胺。切割系統(tǒng)包含至少一個(gè)二級(jí)氮原子或者三級(jí)氮原子，可任選的，切割系統(tǒng)也可以再有至少一個(gè)二級(jí)或三級(jí)氮原子，優(yōu)選的是切割系統(tǒng)包含至少另一個(gè)一級(jí)氮原子。多聚酰胺介導(dǎo)的磷酸二酯的切割在本領(lǐng)域是眾所周知的，熟練的技術(shù)人員能夠運(yùn)用合適的切割系統(tǒng)部分。舉例而言，合適的切割系統(tǒng)包括乙二胺、二乙烯三胺(diethylenetriamine)，三(2-氨基乙基)胺，乙胺基的樹枝狀聚合物(ethyleneamine based dendrimers)，季戊四醇胺(pentaerythrityltetraamine)，精胺，亞精胺，二氮-、三氮-、或者四氮環(huán)烷(tetraazacycloalkyl)化合物，如對(duì)二氮己環(huán)，環(huán)烯，四氮茂基癸烷(tetraazacyclopentadecane)，四氮環(huán)十四碳烷(tetraazacyclotetradecane)，四氮十一碳烷(tetraazaundecane)，三氮環(huán)壬烷(triazacyclononane)，三氮環(huán)十二烷(triazacyclododecane)等，以及它們的衍生物。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明化合物中的寡核苷酸包含作為核苷酸類似物的PNA。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明化合物中的寡核苷酸是2’-O-烷基，優(yōu)選甲基或烯丙基，硫代磷酸酯作為核苷酸類似物。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明化合物是這樣一個(gè)化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點(diǎn)的四個(gè)核苷酸處發(fā)生雜交，直鏈內(nèi)從寡核苷酸到達(dá)切割系統(tǒng)的原子數(shù)目為4-6，優(yōu)選是5。
當(dāng)寡核苷酸與距離隆起位置超過4個(gè)位置處進(jìn)行雜交時(shí)，優(yōu)選是增加間隔區(qū)的長(zhǎng)度，其中所述的隆起位置是核糖核酸被水解的地方。在一個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸與距離被水解的隆起位置超過4個(gè)位置每一個(gè)位置進(jìn)行雜交時(shí)，間隔區(qū)的長(zhǎng)度至少增加6個(gè)原子。因此對(duì)于寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)與距離將被水解的隆起位置5個(gè)原子處雜交時(shí)，間隔區(qū)優(yōu)選含有至少8個(gè)原子，對(duì)寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)與距離將被水解的隆起位置6個(gè)原子處雜交時(shí)，間隔區(qū)優(yōu)選含有至少14個(gè)原子，對(duì)寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)距離將被水解的隆起位置7個(gè)原子處雜交時(shí)，間隔區(qū)優(yōu)選含有至少20個(gè)原子，對(duì)寡核苷酸-間隔區(qū)-切割系統(tǒng)距離將被水解的隆起位置8個(gè)原子處雜交時(shí)，間隔區(qū)優(yōu)選含有至少26個(gè)原子，以此類推。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物是這樣一個(gè)化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點(diǎn)5個(gè)位置處進(jìn)行雜交時(shí)，直鏈內(nèi)從寡核苷酸到達(dá)切割系統(tǒng)的原子數(shù)目為10-12，優(yōu)選是11。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物是這樣一個(gè)化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點(diǎn)6個(gè)位置處進(jìn)行雜交時(shí)，直鏈內(nèi)從寡核苷酸到達(dá)切割系統(tǒng)的原子數(shù)目為16-18，優(yōu)選是17。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物是這樣一個(gè)化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物在距離被水解的位點(diǎn)7個(gè)位置的地方進(jìn)行雜交時(shí)，直鏈內(nèi)從寡核苷酸到達(dá)切割系統(tǒng)的原子數(shù)目為22-24，優(yōu)選是23。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物是這樣一個(gè)化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物在距離被水解的位點(diǎn)6個(gè)位置的地方進(jìn)行雜交時(shí)，直鏈內(nèi)從寡核苷酸到達(dá)切割系統(tǒng)的原子數(shù)目為28-30，優(yōu)選是29。
末端核苷酸或其類似物的雜交位點(diǎn)距離將被水解的隆起位置的上限是8，優(yōu)選7，更優(yōu)選6。間隔區(qū)最大長(zhǎng)度是30個(gè)原子。
本發(fā)明中的化合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的工藝合成。優(yōu)選的是，該化合物通過自動(dòng)化的程序合成。舉例而言，指定長(zhǎng)度和組成成分的寡核苷酸可以在DNA/RNA合成器中程序化的生產(chǎn)出來。對(duì)于熟練操作員而言，制備間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分也是日常工作，該部分包括將所需長(zhǎng)度的間隔區(qū)耦合到所需的切割系統(tǒng)上。具體實(shí)例可參看Verheijen等(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。這樣的間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分具有與末端核苷酸或核苷上的3’-O或5’-O(優(yōu)選)耦合的合適的官能團(tuán)?？晒┻x擇地，對(duì)于熟練的技術(shù)人員來說，用5’-N代替5’-O并與具有合適官能團(tuán)的間隔區(qū)-切割系統(tǒng)通過氮耦合是一件日常工作，例如參看上文所述Komiyama描述的方法。合適的方法請(qǐng)參看文獻(xiàn)J.Org.Chem.2000，65，4900-4907，Angew.Chem.hit.Ed.，2001，40，2004-2021和更詳細(xì)的介紹參看J.Org.Chem.，2003，68，609-612，Bioconjug.Chem.，2003，14，276-28?？晒┻x擇地，可以使用二硫橋跨接(scan)，這需要引入5’-S或通過傳統(tǒng)的馬來酰亞胺耦合。可供選擇地，使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺(phosphoramidite)化學(xué)方法使間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分與核苷耦合。這使得任意類型的核糖核酸(相似物)或其類似物可結(jié)合到本發(fā)明中的化合物中，實(shí)例參考Bioconjugate Chem.2002，13(5)，1071。
制備包含PNA作為核苷酸結(jié)構(gòu)單元的本發(fā)明的化合物的一種合適的方法由Verheijen提出并已在上文中討論。
本發(fā)明提供了能在各種治療，診斷，農(nóng)業(yè)，靶識(shí)別，基因發(fā)現(xiàn)，基因工程以及基因藥物方面進(jìn)行應(yīng)用的有用的化合物和方法。
一方面，本發(fā)明涉及一種使核糖核酸在預(yù)定的位置進(jìn)行水解的方法，在該位置處，靶核糖核酸和本發(fā)明的化合物相接觸。
可以將本發(fā)明的化合物設(shè)計(jì)成通過靶向各種RNA分子以抑制基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，使用本發(fā)明的化合物靶向與靶基因?qū)?yīng)的多種RNAs。這種RNAs的不受限的例子包括信使RNA(mRNA)、靶基因的各種選擇性RNA剪接變體(alternate RNA splice variants)、靶基因轉(zhuǎn)錄后的修飾的RNA、靶基因的mRNA前體。若選擇性的剪接產(chǎn)生一組使用合適的外顯子可被識(shí)別的轉(zhuǎn)錄片段，本發(fā)明可用于通過適當(dāng)?shù)耐怙@子特異性的抑制而抑制基因的表達(dá)或區(qū)別基因家庭成員間的功能。
本發(fā)明的化合物可被用作診斷劑，治療劑并作為研究試劑和試劑盒。通過將有效量的本發(fā)明化合物加入到合適的藥物上可接受的稀釋劑或載體而將它們應(yīng)用到藥物組合物中。進(jìn)一步地，可以將它們應(yīng)用于治療以產(chǎn)生非需要蛋白質(zhì)為特征的疾病的生物機(jī)體中。該機(jī)體可以和本發(fā)明化合物接觸，其中本發(fā)明的化合物含有的序列能夠與編碼非需蛋白質(zhì)的靶核酸鏈特異地雜交。因此，為了調(diào)控基因表達(dá)，優(yōu)選預(yù)先選擇將被調(diào)控的RNA部分包括編碼其形成需要被調(diào)控的蛋白質(zhì)的RNA部分。因此，將所使用的寡核苷酸設(shè)計(jì)成能與預(yù)先選擇的靶RNA部分進(jìn)行特異的雜交。在一個(gè)實(shí)施例中，將寡核苷酸設(shè)計(jì)成與mRNA特異連接的化合物，其中所述的mRNA所編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生需要調(diào)控。
治療組合物的配方和它們隨后的給藥屬于本領(lǐng)域的范疇。一般而言，對(duì)治療學(xué)而言，需要這種治療的病人服用本發(fā)明的化合物，通常是通過藥物上可接受的載體，根據(jù)病人的年齡、治療狀況的病情嚴(yán)重性，從0.01微克到100克每千克體重來確定具體劑量。進(jìn)一步地，治療可以是單一劑量，也可以是需要一段時(shí)間的治療方案，這都需要基于具體的病癥，病情嚴(yán)重程度以及病人總體的情況來判斷，最終由專業(yè)醫(yī)生來確定。有些情況下將本發(fā)明中的化合物和其他傳統(tǒng)治療方法的結(jié)合起來能達(dá)到更好的治療效果。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種方法給藥，這取決于是局部或者系統(tǒng)治療的需要，及治療的范圍決定。給藥可以是局部性的(包括眼，陰道，直腸，鼻內(nèi)，皮膚)，口服或腸胃外給藥，腸胃外給藥包括靜脈點(diǎn)滴，皮下注射，腹膜注射，肌內(nèi)注射，或膜內(nèi)給藥或心室內(nèi)給藥。
局部給藥配方主要包括皮膚外敷片，油膏，乳液，霜類，凝膠，滴露，栓劑，噴霧劑，液體及粉末。傳統(tǒng)藥物載體，水，粉，油基，稠化劑等是必需和讓人滿意的，避孕套、手套等也是可用的。
口服給藥組合物主要包括粉和顆粒，水或其他非水介質(zhì)的懸液或者溶液，膠囊，袋或藥片?？墒褂贸砘瘎?，調(diào)味劑，稀釋劑，乳化劑，分散劑或粘接劑。
膜內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物可以包括無菌水溶液，其中可以含有緩沖劑，稀釋劑和其他合適的添加劑。
腸胃外給藥配方可以包括無菌水溶液，其中可以含有緩沖劑，稀釋劑和其他合適的添加劑。
本發(fā)明可以應(yīng)用于多種生物機(jī)體，其范圍包括單細(xì)胞原核和真核有機(jī)體到多細(xì)胞真核有機(jī)體。任何利用DNA-RNA轉(zhuǎn)錄或RNA-蛋白翻譯作為其遺傳，新陳代謝或細(xì)胞機(jī)制的基本部分的有機(jī)體都可以使用這樣的治療和/或預(yù)防方法?？雌饋硇问蕉鄻拥挠袡C(jī)體，如細(xì)菌，酵母，原生動(dòng)物，藻類，植物和高等動(dòng)物，包括恒溫動(dòng)物，都可以通過該方法來進(jìn)行治療。進(jìn)一步的，因?yàn)槎嗉?xì)胞真核生物中的每個(gè)細(xì)胞都包含DNA-RNA轉(zhuǎn)錄和RNA蛋白質(zhì)的翻作為其細(xì)胞活動(dòng)的主要部分，上述治療和/或診斷方法也能應(yīng)用于這樣的細(xì)胞群體上。更進(jìn)一步的，很多細(xì)胞器，如真核細(xì)胞中的線粒體和葉綠體，也包含轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制。同樣地，單細(xì)胞，細(xì)胞群體，細(xì)胞器都可以被涵蓋在能夠接受本發(fā)明中化合物治療、診斷的有機(jī)體定義中。如這里所用的治療包括對(duì)病的根除，殺死某有機(jī)體，如細(xì)菌，原生動(dòng)物或其他傳染病，或?qū)σ恍┊惓；虿恍枰募?xì)胞生長(zhǎng)或表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
實(shí)施例實(shí)施例1作為在自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)DNA/RNA合成器中所使用的合適的結(jié)構(gòu)單元，使用下面所表示的亞磷酰胺。在左下的結(jié)構(gòu)圖中，連接手臂為上文所述間隔區(qū)的一部分，因此可從下面所示的通式結(jié)構(gòu)圖中省略掉。PG代表保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選不穩(wěn)定的基團(tuán)。連接手臂可以是甘氨酸部分，并且PG也可以是如下結(jié)構(gòu)中所示的Fmoc。所述的亞磷酰胺可以結(jié)合到任何類型的RNA(寡核苷酸)或其類似物中。
在將上述的間隔區(qū)具有10個(gè)原子的亞磷酰胺與寡核苷酸結(jié)合后，得到了下面左圖所表示的結(jié)構(gòu)。這個(gè)例子中，間隔區(qū)有10個(gè)原子。為了說明寡核苷酸類似物2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA和PNA分別表示在中間和右邊。
作為替代，使用了能夠結(jié)合到5’-末端的間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分，如下所示。在該間隔區(qū)-切割系統(tǒng)部分中間隔區(qū)的長(zhǎng)度是變化的。在下面詳細(xì)描述的實(shí)施例中間隔區(qū)分別含4個(gè)和10個(gè)原子?？梢院芮宄目闯?，間隔區(qū)的長(zhǎng)度是很容易改變的。
實(shí)施例2合成的RNA(tRNAPhe部分具有一個(gè)點(diǎn)突變G-16取代了C-16)用于切割實(shí)驗(yàn)(下劃線切割位置)5’-UCC UGU GUU CGA UCC GCAGAA UUC G-3’合成了下面的PNA-切割系統(tǒng)序列，其中Glv代表甘氨酸，n＝0-2.切割系統(tǒng)是 3’-H2NCO-ca caa gct agg(Gly)n-COCH2-切割系統(tǒng)(2)3’-H2NCO-aca caa gct ag(Gly)n-COCH2-切割系統(tǒng)(3)3’-H2NCO-g aca caa gct a(Gly)n-COCH2-切割系統(tǒng) (4)3’-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)n-COCH2-切割系統(tǒng)(5)3’-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)3-COCH2-切割系統(tǒng)(5)數(shù)字(2)、(3)、(4)和(5)指寡核苷酸距離將被水解的隆起位點(diǎn)進(jìn)行雜交的位置數(shù)目。每個(gè)(2)、(3)、(4)和(5)結(jié)合0，1或2個(gè)甘氨酸殘基，間隔區(qū)長(zhǎng)度變化。
PNA合成本研究中使用的PNAs由PNA合成器(Perseptive生物系統(tǒng)，加速核酸合成系統(tǒng))通過固相合成法生產(chǎn)。所有溶劑(Biosolve)都使用原溶液。固相合成是在作為固支撐的PEG-PS珠上使用rink-amide作為鏈接劑進(jìn)行的(上樣量0.17微mol/毫克)。按照合成手冊(cè)上描述的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)現(xiàn)PNAs的合成，使用Fmoc化學(xué)和環(huán)外胺受Bhoc保護(hù)(Perseptive生物系統(tǒng))的單體，以0.2umol為起始合成量。首先耦合是雙倍的。將Fomc-苷氨酸和diBoc保護(hù)的切割系統(tǒng)結(jié)構(gòu)單元耦合到仍在樹脂上的PNA寡聚體的N-末端(5’)上，在遵循標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議的情況下，通過合成器上的可用位置實(shí)現(xiàn)雙耦合。diBoc保護(hù)的切割系統(tǒng)結(jié)構(gòu)單元(HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc)是通過直接液相有機(jī)化學(xué)方法合成得到的，質(zhì)譜及1H-和13C核磁共振光譜為其全部特征。
寡聚體從樹脂上切割下來，在酸性環(huán)境(TFA/TIS/H2O，9/1/1，v/v/v)中被完全去保護(hù)。并在裝備Altima C18柱(10×250mm)的JASCO HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行反相高效液體色譜提純和分析。在40攝氏度條件下進(jìn)行梯度洗脫，以緩沖液A(0.1％TFA的水溶液)，并采用緩沖液B(0.1％TFA乙腈/水，3/1，v/v)流速為4毫升/分鐘的梯度開始。得到的PNAs被冷凍干燥，并利用矩陣激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)量光譜測(cè)定(MALDI-TOF MS)和反相高效液體色譜分析確定特征。
切割實(shí)驗(yàn)在含有NaCl(100mM)及EDTA(0.1mM)的TRIS緩沖液(10mM，pH 7)中用PNA-切割系統(tǒng)處理32P 5’-標(biāo)記的25聚RNA得到以下濃度[RNA]＝60nM，[PNA-切割系統(tǒng)]＝2μM。于40℃下將樣本(70μL)孵育7或24小時(shí)。在此之后，添加NaOAc(3M，pH 5，7μL)、EtOH(225μL)和10μg/μL tRNA(1μL)，RNA立即發(fā)生沉淀。沉淀后的RNA通過離心過濾，干燥和在水(5μL)和上樣緩沖液(5μL)中再溶解進(jìn)行復(fù)性。溶液在90攝氏度被加熱1分鐘，離心，在含有8M尿素的20％變性的聚丙烯酰胺電泳凝膠上進(jìn)行分析。使用的對(duì)照有RNA，RNA堿基梯和T1消化的RNA。
結(jié)果對(duì)照RNA在孵育7小時(shí)后和24小時(shí)后水解了大約10％。對(duì)化合物序列號(hào)(2)和(3)，RNA在孵育7小時(shí)后水解了20％左右或更少，孵育24小時(shí)后為40％或更少。
只有從化合物序列號(hào)(4)得到了合理的RNA速率水解，即，對(duì)N＝0，1，2，RNA在孵育7小時(shí)后至少水解30％。對(duì)化合物(4)n＝1，在孵育24小時(shí)后獲得了幾乎可以量化的水解速率。
對(duì)化合物(4)，n＝1的優(yōu)化顯示孵育2小時(shí)后，在RNA/本發(fā)明的化合物比例為1∶10大約50％RNA被水解。當(dāng)比例為1∶40，孵育2小時(shí)后有75％發(fā)生水解。比例為1∶10和1∶20時(shí)，分別孵育8小時(shí)和6小時(shí)后，75％或更多RNA發(fā)生水解。對(duì)于后者比例，孵育24小時(shí)后水解速率幾乎可進(jìn)行量化。
(5)號(hào)化合物最佳水解開始于n＝2。
實(shí)施例3合成RNA(E.Coli AcpP mRNA部分)用于切割實(shí)驗(yàn)(下劃線切割位置)5’-A UUU AAG AGU A UG AGC ACU AUC GAA-3’合成下列PNA-切割系統(tǒng)序列，其中Gly代表甘氨酸，切割系統(tǒng)是 3’-H2NCO-aaa ttc tca t-Cys(NHR)S-CH2CO-Gly-NHCH2CH2-切割系統(tǒng)其中R＝Ac或 (A)CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2或(B)CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2(C)注意化合物B和C的間隔區(qū)中包含能幫助化合物穿過細(xì)胞膜的肽Lys(PhePheLys)3。
體外RNA降解的研究所有緩沖液均由高純度MilliQ水經(jīng)消毒在使用前制成。將放射活性標(biāo)記的25聚RNA和待測(cè)的耦合體(A，B，C作為對(duì)照RNA并且C中沒有切割系統(tǒng))混和于三羥甲基氨基甲烷和鹽酸(Tris-HCl)的緩沖液(10mM，pH 7)中，其中含有氯化鈉(100mM)及乙二胺四乙酸(0.1mM)，得到以下濃度[RNA]＝60nM，[耦合體]＝2uM，這由A260值標(biāo)定。樣品(70uL)在40攝氏度孵育16個(gè)小時(shí)。孵育之后，添加3M NaOAc(pH 5，7uL)，EtOH(225uL)和10ug/uL的tRNA(1uL)，RNA立即沉淀。通過離心，干燥，然后重新溶解于5uL水和5uL上樣緩沖液使沉淀后的RNA的復(fù)性。溶液在80攝氏度被加熱1分鐘，離心，并在20％變性電泳凝膠上進(jìn)行分析。將凝膠暴露于磷屏(分子動(dòng)力學(xué))下，同時(shí)RNA碎片的密集度由Personal Molecular Imager FX分子成像系統(tǒng)(Bio-Rad)通過掃描所暴露的屏進(jìn)行量化，然后通過Quangtity One軟件(Bio-Rad)進(jìn)行電腦分析。
結(jié)果化合物A、B和C和陰性對(duì)照與25聚32P標(biāo)記的RNA一起孵育，所述RNA的序列和E.ColiAcpP mRNA的部分序列一樣。在40攝氏度，pH 7的條件下，孵育16小時(shí)后，RNA片段被沉淀，而后施加到20％變性電泳凝膠上并被定量。
令人滿意的是，將RNA和耦合體B、C以及不含肽的PNA-DETA A的共同孵育，產(chǎn)生了兩種主要的RNA降解產(chǎn)品，由在標(biāo)記的CA和UA點(diǎn)的切割而產(chǎn)生。切割位點(diǎn)通過將T1消化的RNA帶與和基本的水解階梯的帶移動(dòng)來確定。片段點(diǎn)的密集度揭示了與陰性對(duì)照(如，PNA-肽耦合體沒有切割系統(tǒng)和RNA沒有任何附加的耦合)相比，RNA和PNA-DETA A孵育產(chǎn)生了顯著的RNA切割(20％)，本底(background)切割只有約3.5％。發(fā)現(xiàn)耦合體B、C水解效率之間的顯著差異。相比于陽(yáng)性對(duì)照18(20％)，耦合體B表現(xiàn)出切割效率(30％)得到提高，而耦合體C切割了10％的靶RNA。
實(shí)施例4在3’-末端包含間隔區(qū)-切割系統(tǒng)的寡核苷酸使用商業(yè)上可購(gòu)的包含Dde鏈接劑的樹脂被進(jìn)行PNA合成。
從這個(gè)樹脂開始，后續(xù)的PNA合成產(chǎn)生下面的寡核苷酸
3’-切割系統(tǒng)-CH2CH2NH-(Gly)n-CO-PNA序列-NHAc-5’切割系統(tǒng)的定義如下 “CO”是PNA-寡核苷酸的3’-末端和NHAc是5’-末端。
對(duì)間隔區(qū)-切割系統(tǒng)，基于DNA/RNA的3’-末端的寡核苷酸應(yīng)用了在實(shí)施例1中描述的策略。
權(quán)利要求
1.用于核酸水解的化合物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)寡核苷酸—間隔區(qū)—切割系統(tǒng)其中，所述寡核苷酸是具有至少8個(gè)核苷酸的核糖核酸或其類似物，它能以這樣一種方式與靶核酸雜交，其末端核苷酸或其類似物與距離將被水解的位點(diǎn)至少4個(gè)核苷酸和最多8個(gè)核苷酸處的核苷酸雜交，所述間隔區(qū)將所述的切割系統(tǒng)共價(jià)連接到所述寡核苷酸的所述末端核苷酸上，并且包括從寡核苷酸到切割系統(tǒng)的直鏈上的至少2個(gè)原子，所述的切割系統(tǒng)是含有至少2個(gè)氮原子的多聚酰胺。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括肽核酸作為核苷酸類似物。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括2’-O-烷基，優(yōu)選甲基，硫代磷酸酯作為核苷酸類似物。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述間隔區(qū)包括一個(gè)或者多個(gè)氨基酸，特別是甘氨酸。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述間隔區(qū)通過酰胺鍵與所述寡核苷酸耦合。
6.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述切割系統(tǒng)是乙二胺。
7.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物距離將被水解的位點(diǎn)4個(gè)位點(diǎn)，并且從寡核苷酸到切割系統(tǒng)的直鏈上原子數(shù)目為4-6，優(yōu)選5。
8.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其類似物距離將被水解的位點(diǎn)5個(gè)位點(diǎn)，并且從寡核苷酸到切割系統(tǒng)的直鏈上原子數(shù)目為10-12，優(yōu)選11。
9.在預(yù)定位點(diǎn)水解核糖核酸的方法，其中靶核糖核酸與前述任一權(quán)利要求所述的化合物接觸。
10.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述核糖核酸是RNA，特別是信使核糖核酸。
11.一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑。
12.權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求中所述的化合物作為藥劑的用途。
13.權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的化合物做為診斷工具的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于水解核酸的方法和化合物。特別地，本發(fā)明涉及用于優(yōu)先切割RNA中特定位點(diǎn)的磷酸二酯鍵的化合物。
文檔編號(hào)C12N9/22GK1946845SQ200580007832
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者伯瑞吉特·汪納爾, 杰勒德·約翰尼斯·普藍(lán)特伯格 申請(qǐng)人:蒲羅森薩有限公司