專利名稱：發(fā)展用于血栓形成傾向識(shí)別的方法(mert)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及預(yù)測(cè)個(gè)體的靜脈血栓形成的遺傳易感性的方法，以及可用于實(shí)施該公開(kāi)方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
僅在美國(guó)，靜脈血栓形成每年侵害每1000個(gè)個(gè)體中的1人，并且是引起每年大約300,000例住院治療和50,000例死亡的死亡率和發(fā)病率的一個(gè)主要原因(Rosendaal，Thromb.Haemost.781-6，1997；Nordstrom等.，J.Inter.Med.232155-60，1992；和Hansson等.，Arch.Intern.Med.1571665-70，1997)。
許多環(huán)境使個(gè)體預(yù)先傾向于靜脈血栓形成。所述危險(xiǎn)因素的實(shí)例包括妊娠、產(chǎn)后期、口服避孕藥和/或激素替代治療的使用、創(chuàng)傷、手術(shù)、骨折、延長(zhǎng)的固定術(shù)、老齡、抗磷脂類抗體、以前的血栓形成史、脊髓增生病、惡性腫瘤和輕度-中度的高半胱氨酸血癥(Abramson等.，Southern Med.J.941013-20，2001；以及Seligsohn和Lubetsky，N.Engl.J.Med.3441222-31，2001)。靜脈血栓形成常常以深靜脈血栓形成(DVT)形式存在于下肢，其常導(dǎo)致通常致死的肺栓塞。尤其不幸的是所述血栓栓塞現(xiàn)象常常發(fā)生在于生理學(xué)上已受損傷的患者體內(nèi)。
除了后天的靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因素，許多表面看來(lái)單基因的、常染色體顯性的、可變外顯的遺傳突變或多態(tài)性引起增加靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。所述突變或多態(tài)性的實(shí)例為編碼促凝血蛋白質(zhì)(凝血因子V、凝血酶原和纖維蛋白原)、天然的抗凝血?jiǎng)┑鞍踪|(zhì)(蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和抗凝血酶III)及其他血栓形成相關(guān)蛋白質(zhì)(血管緊張素-I轉(zhuǎn)化酶和亞甲基四氫葉酸還原酶)那些基因。因此，靜脈血栓形成為復(fù)雜的遺傳病癥。導(dǎo)致凝血系統(tǒng)過(guò)分活躍的遺傳缺陷存在于一大部分患有靜脈血栓形成的患者中。60％以上的血栓形成傾向可歸因于遺傳組分(Souto等.，Am.J Hum.Genet.671452-9，2000)。
之前的報(bào)道描述了篩選與血栓形成有關(guān)的一或多種多態(tài)性，例如通過(guò)利用PCR(Harrington等.，Clin.Chem.Lab.Med.41496-500，2003)，或微量平板陣列對(duì)角線凝膠電泳(Bauer等.，Thromb.Haemost.84396-400，2000)。盡管已建議利用微陣列技術(shù)篩選尤其是參與靜脈血栓形成的基因中的突變，這些微陣列由于其具有低預(yù)測(cè)值并且僅檢測(cè)白種人(Caucasians)群體中普遍的突變而受到限制(例如參見(jiàn)Pecheniuk等.，Blood Coagul.Fibrinolysis 11683-700，2000；Pollak等.，Ital.Heart J.2568-72，2001；Evans和Lee-Tataseo，Clin.Chem.481406-11，2002；Schrijver等.，Am.J.Clira.Pathol.119490-6，2003；Erali等.，Clin.Chem.49732-9，2003)。其他人已指出微陣列技術(shù)用于篩選參與血栓形成的大量遺傳突變和多態(tài)性之前需要經(jīng)歷進(jìn)一步的發(fā)展(Grody，Annu.Rev.Med.，54473-90，2003)。
因此，目前存在對(duì)可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)展靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的方法的需要，所述方法可用于篩選多種種族的人群。

發(fā)明內(nèi)容
盡管靜脈血栓形成為發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因，但是通過(guò)利用現(xiàn)行的抗凝血?jiǎng)┤缥捶逐s的肝素、低分子量肝素、乙酰水楊酸和香豆靈/丙酮芐羥香豆素的預(yù)防性治療是一種可避免的疾病。因此，評(píng)估個(gè)體血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)從而開(kāi)發(fā)分層方案用于個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)-適應(yīng)的預(yù)防而避免靜脈血栓栓塞的發(fā)展是很有利的。對(duì)于該分層法，評(píng)估與止血的單一或組合危險(xiǎn)因素有關(guān)的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明人已鑒定了靜脈血栓形成-有關(guān)分子中突變和多態(tài)性的組合，可以在若干種族人群中以高準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)展靜脈血栓形成的遺傳易感性。在一個(gè)實(shí)例中，與靜脈血栓形成統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的分子中回復(fù)突變和多態(tài)性的組合可以在若干種族人群中以高準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)展靜脈血栓形成的總的遺傳易感性?；貜?fù)突變和多態(tài)性為在一個(gè)以上家族中存在，如至少兩個(gè)遺傳上顯著差異的家族。例如，僅在一個(gè)家族中觀察到的突變或多態(tài)性不是回復(fù)突變或多態(tài)性。
例如，利用公開(kāi)的方法進(jìn)行的關(guān)于至少十種靜脈血栓形成相關(guān)遺傳變異的并行檢驗(yàn)所公開(kāi)的統(tǒng)計(jì)分析表明靜脈血栓形成的預(yù)測(cè)在白種人中準(zhǔn)確度至少為99％，在亞洲人中至少為85％，在非洲人群中至少為88％。所公開(kāi)的方法，在此稱為發(fā)展用于血栓形成傾向識(shí)別的方法(MERT)，提供了快速且經(jīng)濟(jì)的測(cè)定法，可在與靜脈血栓形成易感性統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的分子中并行遺傳檢驗(yàn)，例如抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和血管緊張素1-轉(zhuǎn)化酶(ACE)。
在一個(gè)實(shí)例中，所述方法包括確定受試者在靜脈血栓形成-相關(guān)分子中是否具有一或多處突變、多態(tài)性或兩者，所述分子包括、基本上由或由來(lái)自抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的序列組成。在一個(gè)實(shí)例中，在其暴露于引起血栓形成的高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境之前或期間時(shí)篩選無(wú)癥狀的個(gè)體，所述環(huán)境如妊娠、產(chǎn)后期、口服避孕藥或激素替代治療的使用、先前的血栓形成史、延長(zhǎng)的固定術(shù)、脊髓增生病、惡性腫瘤、外科手術(shù)、骨折、老齡、抗磷脂類抗體或其組合。
盡管已有用于篩選上至六種血栓形成傾向易感性單核苷酸多態(tài)性的現(xiàn)有檢驗(yàn)，它們具有有限潛能以及1.7％的最大預(yù)測(cè)值。所述檢驗(yàn)具有僅允許檢測(cè)只在白種人群體中普遍存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的篩選能力(Erali等.，Clin.Chem.495，2003；Evans等.，Clin.Chem481406-11，2002)。相比之下，本發(fā)明公開(kāi)的方法和陣列例如通過(guò)篩選與靜脈血栓形成統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的那些基因中的突變和多態(tài)性(不僅用于SNP而且用于插入和缺失)而首次提供了高度準(zhǔn)確的、總的靜脈血栓形成遺傳易感性預(yù)測(cè)。在具體的實(shí)例中，篩選與靜脈血栓形成統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的所有已知的回復(fù)突變和多態(tài)性，或所有所述已知的突變和多態(tài)性的亞型。在一些實(shí)例中，如果具有小于0.005的p值，突變或/和多態(tài)性與靜脈血栓形成統(tǒng)計(jì)上相關(guān)。
在具體的實(shí)例中，該方法利用基因組DNA微陣列技術(shù)檢測(cè)受試者對(duì)靜脈血栓形成的總的遺傳易感性，并且將微陣列數(shù)據(jù)與用于適合各種種族人群的VT小組相關(guān)易感性基因的組合似然比直接關(guān)聯(lián)。
在一具體的實(shí)例中，該方法包括擴(kuò)增獲自受試者的核酸分子以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物可包括、基本上由或由來(lái)自抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和血管緊張素I-轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因的序列組成。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與陣列接觸或應(yīng)用于陣列。陣列包括寡核苷酸探針，其能雜交至包含一或多處突變、一或多種多態(tài)性或其組合的抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE序列。具體的突變和多態(tài)性的實(shí)例在表1中提供。在一些實(shí)例中，陣列進(jìn)一步包括能雜交至野生型抗凝血酶III、野生型蛋白質(zhì)C、野生型蛋白質(zhì)S、野生型纖維蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE的寡核苷酸。擴(kuò)增產(chǎn)物與陣列溫育足以使擴(kuò)增產(chǎn)物和寡核苷酸探針之間雜交的時(shí)間段，由此形成擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物。隨后分析擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物以確定擴(kuò)增產(chǎn)物在抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE中是否包括一或多處突變、多態(tài)性或兩者。
一或多處突變或一或多種多態(tài)性的存在表明受試者具有靜脈血栓形成的遺傳傾向性。在具體的實(shí)例中，一處以上突變或多態(tài)性的存在表明該受試者比僅具有一處突變或多態(tài)性的受試者處于靜脈血栓形成的更大風(fēng)險(xiǎn)中。
所公開(kāi)的方法可準(zhǔn)確地評(píng)估發(fā)展靜脈血栓形成的總的遺傳風(fēng)險(xiǎn)并且因此例如通過(guò)在合適狀況下開(kāi)始合適的預(yù)防性治療而實(shí)現(xiàn)避免靜脈血栓形成。在此給出的結(jié)果表明，當(dāng)用于檢測(cè)靜脈血栓形成或向其發(fā)展的傾向時(shí)，用于至少八種與靜脈血栓形成相關(guān)分子的遺傳檢驗(yàn)組的并行使用使陽(yáng)性預(yù)測(cè)值提高30倍以上。因此，公開(kāi)了選擇靜脈血栓形成治療的方法，其包括利用此處公開(kāi)的方法檢測(cè)受試者的至少一種VT-相關(guān)分子中的突變、多態(tài)性或其組合(如一或多處取代、缺失或插入)并且如果鑒定了所述突變或多態(tài)性，選擇治療法以避免靜脈血栓形成、延緩靜脈血栓形成的發(fā)病或?qū)⑵浜蠊档偷阶畹统潭取?br> 此外公開(kāi)的為陣列，其能實(shí)現(xiàn)對(duì)靜脈血栓形成遺傳易感性，如總的靜脈血栓形成遺傳易感性的快速、經(jīng)濟(jì)的多個(gè)遺傳檢驗(yàn)。所述陣列包括寡核苷酸，其與抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、凝血因子V、凝血因子II、纖維蛋白原、MTHFR和ACE的野生型或突變序列或兩者互補(bǔ)。還公開(kāi)了包含用于檢測(cè)受試者靜脈血栓形成遺傳傾向性的所述陣列的試劑盒。
所公開(kāi)內(nèi)容的上述及其他特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)下列幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明而將變得更加明顯。
序列表附隨序列表中的核酸序列表利用標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸堿基字母縮寫(xiě)顯示。僅顯示每一核酸序列的一條鏈，但是可理解參照所顯示的任一鏈也包擴(kuò)其互補(bǔ)鏈。
ATIIISEQ ID NO1為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列2770位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO2為可用于探測(cè)抗凝血酶III中2770 insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO3為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5311-5320位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO4為可用于探測(cè)抗凝血酶III 5311-5320 del6bp的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO5為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5356-5364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO6為可用于探測(cè)抗凝血酶III中5356-5364，delCTT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO7為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5381C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO8為可用于探測(cè)抗凝血酶III中5381C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO9為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5390C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO10為可用于探測(cè)抗凝血酶III中5390C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO11為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5493A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO12為可用于探測(cè)抗凝血酶III中5493A/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO13為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列α(16)ArgCGT6490C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO14為可用于探測(cè)抗凝血酶III中6490C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO15為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列α(16)ArgCGT9788G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO16為可用于探測(cè)抗凝血酶III中9788G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO17為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列α(19)ArgAGG9819C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO18為可用于探測(cè)抗凝血酶III中9819C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO19為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13342位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO20為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13342 insA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO21為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13380T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO22為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13380T/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO23為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列β(14)ArgCGT6460A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO24為可用于探測(cè)抗凝血酶III中6460A/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO25為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列β(68)Ala，GCT13262G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO26為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13262G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO27為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列β(255)Arg，CGT13268G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO28為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13268G/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO29為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列γ(275)Arg，CGT13268G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO30為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13268G/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO31為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列γ(275)Arg，CG13295C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO32為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13295C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO33為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列γ(292)Gly，GGC13296G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO34為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13296G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO35為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列γ(308)Asn，AAT13299C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO36為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13299C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO37為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列γ(318)Asp，GAC2484T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO38為可用于探測(cè)抗凝血酶III中γ(318)Asp/GlyGAC/GGC2484T/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO39為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列Thr312，ACT2586C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO40為可用于探測(cè)抗凝血酶III中2586C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO41為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列2603C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO42為可用于探測(cè)抗凝血酶III中2603C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO43為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列2604G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO44為可用于探測(cè)抗凝血酶III中2604G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO45為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列2759C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO46為可用于探測(cè)抗凝血酶III中2759C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO47為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列5382G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO48為可用于探測(cè)抗凝血酶III中5382G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO49為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13324C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO50為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13324C/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO51為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13328G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO52為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13328G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO53為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13333C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO54為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13333C/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO55為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13337C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO56為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13337C/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO57為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13338C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO58為可用于探測(cè)抗凝血酶III中13338C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO59為可用于探測(cè)野生型抗凝血酶III序列13392G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO60為可用于探測(cè)抗凝血酶III13392G/C替換的寡核苷酸序列。
蛋白質(zhì)CSEQ ID NO61為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C41G中野生型蛋白質(zhì)C序列3363/3364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO62為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中41G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO63為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列1357C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO64為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中1357C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO65為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列1381C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO66為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中1381C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO67為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3103C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO68為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3103C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO69為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3169T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO70為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3169T/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO71為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3217G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO72為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3217G/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO73為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3222G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO74為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3222G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO75為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3222G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO76為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3222G/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO77為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3359G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO78為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3359G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO79為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3360C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO80為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3360C/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO81為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中野生型蛋白質(zhì)C序列3363/3364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO82為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3363/4 insC的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO83為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列3438C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO84為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中3438C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO85為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6128T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO86為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6128T/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO87為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6152C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO88為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6152C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO89為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6182C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO90為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6182C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO91為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6216C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO92為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6216C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO93為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6245C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO94為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6245C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO95為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6246G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO96為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6246G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO97為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6265G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO98為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6265G/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO99為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列6274C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO100為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6274C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO101為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列7176G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO102為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中7176G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO103為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列7253C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO104為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中7253C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO105為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8403C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO106為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8403C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO107為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)8481A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO108為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8481A/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO109為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8485-7位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO110為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8485/6 delAC或8486/7delCA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO111為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8551C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO112為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8551C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO113為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8559G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO114為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8559G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO115為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8571C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO116為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8571C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO117為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8572G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO118為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8572G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO119為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8589G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO120為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8589G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO121為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8604G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO122為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8604G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO123為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8608C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO124為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8608C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO125為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8631C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO126為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8631C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO127為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8678-80位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO128為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8678-80 del3nt的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO129為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8689T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO130為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8689T/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO131為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8695C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO132為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8695C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO133為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列84708763G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO134為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8763G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO135為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8857位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO136為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8857 delG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO137為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8895A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO138為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8895A/C替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO139為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8924C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO140為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8924C/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO141為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列1387C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO142為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中1387C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO143為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列1388G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO144為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中1388G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO145為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列1432C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO146為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中1432C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO147為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列-34TG6218C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO148為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中-34，delG6218C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO149為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列-24GTG(其中24為密碼子核苷酸位點(diǎn))6219G的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO150為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中6219G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO151為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列7219C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO152為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中7219C/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO153為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8470G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO154為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8470G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO155為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列448744G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO156為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8744G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO157為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8769C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO158為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8769C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO159為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8790G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO160為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8790G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO161為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列8886G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO162為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中8886G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO163為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列-1654C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO164為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中-1654C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO165為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列-1641A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO166為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中-1641A/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO167為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)C序列-1476A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO168為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)C中-1476A/T替換的寡核苷酸序列。
蛋白質(zhì)SSEQ ID NO169為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列-34，TGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO170為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中-34，delG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO171為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列-24，GTG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO172為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中-24，GTG/GAG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO173為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列19，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO174為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中19，GAA/TAA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO175為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列26，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO176為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中26，GAA/TAA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO177為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列44位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO178為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中44，delCTTA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO179為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列46，GTT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO180為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中46，GTT/CTT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO181為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列內(nèi)含子d，外顯子4，+1位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO182為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中內(nèi)含子d，G/A，外顯子4，+1替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO183為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列155，AAG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO184為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中155，AAG/GAG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO185為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列217，AAT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO186為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中217，AAT/AGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO187為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列238，CAG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO188為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中238，CAG/TAG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO189為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列265位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO190為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中265，insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO191為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列293位，TCA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO192為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中293，TCA/TGA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO193為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列295，GGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO194為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中295，GGC/GTC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO195為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列內(nèi)含子j，外顯子10，+5位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO196為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中內(nèi)含子j，G/A，外顯子10，+5替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO197為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列349，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO198為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中349，GAA/AAA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO199為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列372位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO200為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中372，delCTTTTT，insAA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO201為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列中內(nèi)含子k，外顯子12，-9位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO202為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列中內(nèi)含子k，A/G，外顯子12，-9替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO203為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列-25405，CTA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO204為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中405，CTA/CCA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO205為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列410，CGA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO206為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中410，CGA/TGA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO207為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列431位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO208為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中431，insA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO209為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列465，TGG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO210為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中465，TGG/TGA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO211為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列474，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO212為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中474，CGT/TGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO213為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列內(nèi)含子b，外顯子2，+5522位，CAG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO214為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中522，CAG/TAG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO215為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列534，CTG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO216為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中534，CTG/CGG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO217為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列中內(nèi)含子k，外顯子11，+54625，TGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO218為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中625，TGT/CGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO219為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列-2，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO220為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中-2，CGT/CTT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO221為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列9，AAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO222為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中9，AAA/GAA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO223為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列中內(nèi)含子e，外顯子5，+5位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO224為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中內(nèi)含子e，G/A，外顯子5，+5替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO225為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列外顯子15，終止密碼子-25后520nt位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO226為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中-25，insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO227為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列467，GTA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO228為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中467，GTA/GGA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO229為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列633位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO230為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中633，delAA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO231為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列636，TAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO232為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中636，TAA/TAT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO233為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列內(nèi)含子k，外顯子11+54位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO234為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中內(nèi)含子k，C/T，外顯子11+54替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO235為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列460，TCC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO236為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中460，TCC/CCC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO237為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列626，CCA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO238為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中626，CCA/CCG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO239為可用于探測(cè)野生型蛋白質(zhì)S序列外顯子15，終止密碼子后520nt位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO240為可用于探測(cè)蛋白質(zhì)S中外顯子15，終止密碼子后520ntC/A替換的寡核苷酸序列。
纖維蛋白原SEQ ID NO241為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列α(16)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO242為可用于探測(cè)纖維蛋白原中α(16)Arg/CysCGT/TGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO243為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列α(16)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO244為可用于探測(cè)纖維蛋白原中α(16)Arg/HisCGT/CAT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO245為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列α(19)Arg，AGG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO246為可用于探測(cè)纖維蛋白原中α(19)Arg/GlyAGG/GGG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO247為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列α(461)Lys，AAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO248為可用于探測(cè)纖維蛋白原中α(461)Lys/終止子AAA/TAA替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO249為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列α(554)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO250為可用于探測(cè)纖維蛋白原中α(554)Arg/CysCGT/TGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO251為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列β(14)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO252為可用于探測(cè)纖維蛋白原中β(14)Arg/CysCGT/TGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO253為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列β(68)Ala，GCT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO254為可用于探測(cè)纖維蛋白原中β(68)Ala/ThrGCT/ACT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO255為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列β(255)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO256為可用于探測(cè)纖維蛋白原中β(255)Arg/CysCGT/TGT替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO257為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列γ(275)Arg，CGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO258為可用于探測(cè)纖維蛋白原中γ(275)Arg/CysCGC/TGC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO259為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列γ(275)Arg，CGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO260為可用于探測(cè)纖維蛋白原中γ(275)Arg/HisCGC/CAC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO261為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列γ(292)Gly，GGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO262為可用于探測(cè)纖維蛋白原中γ(292)Gly/ValGGC/GTC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO263為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列γ(308)Asn，AAT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO264為可用于探測(cè)纖維蛋白原中γ(308)Asn/LysAAT/AAG替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO265為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列γ(318)Asp，GAC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO266為可用于探測(cè)纖維蛋白原中γ(318)Asp/GlyGAC/GGC替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO267為可用于探測(cè)野生型纖維蛋白原序列Thr312，ACT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO268為可用于探測(cè)纖維蛋白原中Thr312AlaACT/GCT替換的寡核苷酸序列。
凝血因子V
SEQ ID NO269為可用于探測(cè)野生型凝血因子V序列1691G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO270為可用于探測(cè)凝血因子V中1691G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO271為可用于探測(cè)野生型凝血因子V序列1628G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO272為可用于探測(cè)凝血因子V中1628G/A替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO273為可用于探測(cè)野生型凝血因子V序列4070A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO274為可用于探測(cè)凝血因子V中5382G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO275為可用于探測(cè)野生型凝血因子V序列1090A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO276為可用于探測(cè)凝血因子V中1090A/G替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO277為可用于探測(cè)野生型凝血因子V序列1091G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO278為可用于探測(cè)凝血因子V中1091G/C替換的寡核苷酸序列。
凝血因子IISEQ ID NO279為可用于探測(cè)野生型凝血酶原序列20210G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO280為可用于探測(cè)凝血酶原中20210G/A替換的寡核苷酸序列。
MTHFRSEQ ID NO281為可用于探測(cè)野生型MTHFR序列677C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO282為可用于探測(cè)MTHFR中677C/T替換的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO283為可用于探測(cè)野生型MTHFR序列1298A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO284為可用于探測(cè)MTHFR中1298A/C替換的寡核苷酸序列。
ACESEQ ID NO285為可用于探測(cè)內(nèi)含子16中具有288bp插入的野生型ACE序列開(kāi)始部分的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO286為可用于探測(cè)內(nèi)含子16中具有288bp插入的野生型ACE序列中間部分的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO287為可用于探測(cè)內(nèi)含子16中具有288bp缺失的突變型ACE序列的寡核苷酸序列。
幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ)以下提供了下列術(shù)語(yǔ)和方法的注解以更好地描述本發(fā)明并且指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。例如，術(shù)語(yǔ)“包括核酸”包含單個(gè)或多個(gè)核酸并且認(rèn)為相當(dāng)于短語(yǔ)“包括至少一種核酸”。除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式的“a”，“an”以及“the”是指一個(gè)或者一個(gè)以上。除非上下文另有明確規(guī)定，術(shù)語(yǔ)″或″指所述可選擇要素的單個(gè)要素或兩個(gè)或更多要素的組合。如此處所用的，“包括”指“包含”。因此，“包括A或B”指“包含A、B或A和B”而不排除另外的要素。例如，短語(yǔ)“突變或多態(tài)性”或“一或多處突變或多態(tài)性”指突變、多態(tài)性或其組合，其中“a”可指一種以上。
除非另外解釋，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意思。雖然與此處所述的類似的或等同的方法和材料可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，合適的方法和材料描述如下。材料、方法和實(shí)施例僅是解釋性的而并不試圖作為限制。
非洲人包含具有任何非洲黑色人種群血統(tǒng)的人的人種族類別。一些實(shí)例中，包括深色-皮膚的人，其為非洲的本地人或居民，以及非洲人血統(tǒng)的人，如美裔非洲人人，其中這種人還保留與非洲的本地人或居民顯著的遺傳相似性。在具體的實(shí)例中，非洲人為至少1/64非洲人。
擴(kuò)增核酸分子為了增加核酸分子的拷貝數(shù)，如基因或基因片段，例如靜脈血栓形成(VT)-相關(guān)的基因。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物稱為擴(kuò)增產(chǎn)物。
體外擴(kuò)增的一個(gè)實(shí)例為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其中獲自受試者的生物樣品與寡核苷酸引物對(duì)在允許引物與樣品中核酸分子雜交的條件下接觸。引物在合適的條件下延伸，從模板分離，并且隨后重新退火、延伸，以及分離以擴(kuò)增核酸分子的拷貝數(shù)。體外擴(kuò)增技術(shù)的其他實(shí)例包括定量實(shí)時(shí)PCR、鏈置換擴(kuò)增(參見(jiàn)USPN 5,744,311)；無(wú)轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增(參見(jiàn)USPN 6,033,881)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)WO90/01069)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)EP-A-320 308)；缺口填充連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)USPN5,427,930)；偶聯(lián)的連接酶檢測(cè)和PCR(參見(jiàn)US PN6,027,889)；以及NASBATMRNA無(wú)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見(jiàn)USPN6,025,134)。
血管緊張素I-轉(zhuǎn)化酶(ACE)將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管收縮血管緊張素II，并且參與緩激肽降解的酶。包括任何ACE基因、cDNA、RNA或來(lái)自任何生物體的蛋白質(zhì)，如人。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)BC048144公開(kāi)的的序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
人ACE的至少一種變異與靜脈血栓形成有關(guān)由內(nèi)含子16中288-bp片段的插入(ins)或缺失(del)組成的多態(tài)性。
抗凝血?jiǎng)┙档突蝾A(yù)防異常血凝結(jié)的制劑?？鼓?jiǎng)┛衫缤ㄟ^(guò)降低或終止血液凝固所需的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生而避免新凝塊的形成，并且預(yù)防現(xiàn)有的凝塊生長(zhǎng)(擴(kuò)大)。實(shí)例包括，但不限于，阿斯匹林、肝素和丙酮芐羥香豆素。
抗凝血酶III(AT III)蛋白質(zhì)serpin(絲氨酸蛋白酶抑制劑)超家族的成員。AT III為主要的凝血抑制因子，并且具有對(duì)其他凝血因子如因子IXa、Xa、XIa和XIIa的抑制作用。此外，AT III加速因子VIIa-組織因子復(fù)合物的解離并且防止其重新結(jié)合。包括任何AT III基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的AT III蛋白。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)NM_000488公開(kāi)的的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。編碼人AT III的基因定位于染色體lq23-25，跨越13.4kb的DNA并且具有七個(gè)外顯子。
雜合的AT III缺陷與提高的靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。AT III缺陷的分子基礎(chǔ)為高度異種的。AT III缺陷分為I型(功能性和免疫性AT III的低血漿水平)和II型(血漿中的AT III變體)。II型進(jìn)一步細(xì)分為RS(缺陷的反應(yīng)位點(diǎn))、HBS(缺陷的肝素-結(jié)合位點(diǎn))和PE(多效的，即，對(duì)功能的多重效應(yīng))。
存在至少127種與AT III缺陷有關(guān)的不同缺陷對(duì)于I型AT III缺陷的92種突變(40種點(diǎn)突變、40種小的插入或缺失以及12種大的缺失)和對(duì)于II型AT III缺陷的35種突變(12種RS、12種HBS和11種PE突變，均為點(diǎn)突變)。I型突變中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中至少11種不同的突變(7種點(diǎn)突變和4種缺失或插入)，并且剩下的突變?yōu)閱蝹€(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。II型中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中的35種突變的19種(七種RS、六種HBS和六種PE突變)并且已報(bào)道剩下的為個(gè)體突變。
與靜脈血栓形成有關(guān)的典型的回復(fù)AT III基因突變?cè)诒?中顯示。
陣列分子，如生物學(xué)大分子(如多肽或核酸)或生物樣品(如組織切片)以可尋址的位置在基質(zhì)上或基質(zhì)中的排列?！逦㈥嚵小鍨樾⌒突员阋蠡蛲ㄟ^(guò)顯微鏡觀察輔助用于評(píng)估或分析的陣列。陣列有時(shí)稱為DNA芯片或生物芯片。
分子的陣列(″特征″)使得一次對(duì)樣品進(jìn)行很大數(shù)量的分析成為可能。在某些實(shí)例陣列中，一或多種分子(如寡核苷酸探針)將多次(如兩次)出現(xiàn)在陣列上，例如用以提供內(nèi)對(duì)照。陣列上可尋址的位置的數(shù)目可以變化，例如從幾個(gè)(如三個(gè))至至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)、至少300個(gè)、至少500個(gè)、至少600個(gè)、至少1000個(gè)、至少10,000個(gè)或更多。在具體的實(shí)例中，陣列包括核酸分子，如至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸序列，如約15-40個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，如至少18個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，或甚至至少25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)例中，分子包括通過(guò)其5′或3′-末端附著于陣列的寡核苷酸。
在具體的實(shí)例中，陣列包括SEQ ID NO1-287，或其亞型，如奇數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO1-285和SEQ ID NO286(用以檢測(cè)野生型VT-相關(guān)的序列)，或偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287(用以檢測(cè)突變或多態(tài)性的VT-相關(guān)序列)，以及SEQ ID NO1-287中所示序列的至少20個(gè)，如SEQ ID NO1-287中所示序列的至少50個(gè)、至少75個(gè)、至少100個(gè)、至少150個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)或至少260個(gè)。
陣列內(nèi)，每種排列的樣品為可尋址的，以致能在該陣列的至少二維空間內(nèi)可靠和一致地確定其位置。位于排列上的特征應(yīng)用可呈現(xiàn)不同的形狀。例如，陣列可以是規(guī)則的(如以均一的行和列排列的)或不規(guī)則的。因此，在有序的陣列中每一樣品的位置在其應(yīng)用于陣列時(shí)指定給樣品，并且提供密鑰以使得每一位置與合適的靶標(biāo)或特征位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。常常，有序陣列以對(duì)稱的網(wǎng)格模式排列，但樣品可以其他的模式排列(如以輻射狀分布的線、螺旋線或有序的簇)?？蓪ぶ返年嚵型ǔ橛?jì)算機(jī)可讀的，因?yàn)橛?jì)算機(jī)可程序化以使得具有在該位點(diǎn)樣品信息(如雜交或結(jié)合數(shù)據(jù)，包括例如信號(hào)強(qiáng)度)的陣列上特定的地址相關(guān)聯(lián)。在一些計(jì)算機(jī)可讀形式的實(shí)例中，陣列中的各個(gè)特征有規(guī)則地排列，例如以笛卡爾的網(wǎng)格型式，其可通過(guò)計(jì)算機(jī)與地址信息相關(guān)聯(lián)。
此處還關(guān)注的為基于蛋白質(zhì)的陣列，其中探針?lè)肿訛榛虬ǖ鞍踪|(zhì)，或其中靶分子為或包括蛋白質(zhì)，并且陣列包括蛋白質(zhì)/多肽結(jié)合之的核酸，或反之亦然。
亞洲人包含具有任何遠(yuǎn)東、東南亞、印度次大陸或太平洋島嶼原始人血統(tǒng)的人的人種族類別。該區(qū)域包括，例如中國(guó)、印度、日本、朝鮮、菲律賓群島和薩摩亞。在具體的實(shí)例中，亞洲人包括亞洲血統(tǒng)的人，如美裔亞洲人人，其保留與亞洲的本地人或居民顯著的遺傳相似性。在具體的實(shí)例中，亞洲人為至少1/64亞洲人。
結(jié)合或穩(wěn)定的結(jié)合兩種物質(zhì)或分子之間的結(jié)合，如一種核酸分子雜交至另一種(或本身)以及抗體與肽的結(jié)合。如果足夠量的寡核苷酸分子形成堿基對(duì)或雜交至其靶核酸分子，則寡核苷酸分子結(jié)合或穩(wěn)定結(jié)合至靶核酸分子以允許結(jié)合的檢測(cè)。結(jié)合可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法檢測(cè)，如通過(guò)靶標(biāo)寡核苷酸復(fù)合物的物理或功能性質(zhì)。例如，結(jié)合可通過(guò)確定結(jié)合在如基因的表達(dá)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等等的生物合成過(guò)程后是否具有可觀察到的效果而從功能上檢測(cè)。
檢測(cè)核酸分子互補(bǔ)鏈結(jié)合的物理方法包括但不限于，如DNase I或化學(xué)足跡法、凝膠轉(zhuǎn)移(shift)和親和裂解測(cè)定法、Northern印跡法、斑點(diǎn)印跡和光吸收檢測(cè)過(guò)程的方法。例如，一種方法包括觀察在溫度緩慢升高時(shí)含有寡核苷酸(或類似物)和靶核酸的溶液在220至300nm處光吸收的變化。如果寡核苷酸或類似物已結(jié)合其靶標(biāo)，當(dāng)寡核苷酸(或類似物)和靶標(biāo)相互解離或解鏈時(shí)在特征溫度處存在吸收的急劇提高。在另一個(gè)實(shí)例中，該方法包括檢測(cè)信號(hào)，如在一條或兩條互補(bǔ)鏈上存在的可檢測(cè)標(biāo)記。
寡聚物和其靶核酸間的結(jié)合經(jīng)常通過(guò)溫度(Tm)表征，在該溫度50％的寡聚物從其靶標(biāo)解鏈。更高的(Tm)指相對(duì)于具有較低(Tm)的復(fù)合物的更強(qiáng)或更穩(wěn)定的復(fù)合物。
白種人傳統(tǒng)地通過(guò)身體特征如非常輕微的至褐色的皮膚色素沉著和直的至波狀的或卷發(fā)而區(qū)分的人種族類別，其包括具有任何歐洲、北非或中東的原始人血統(tǒng)的人。通俗地，在北美洲單詞″白人″與″白種人″同義使用。所述人也保留與歐洲、北非或中東的本地人或居民顯著的遺傳相似性。在具體的實(shí)例中，白種人為至少1/64白種人。
cDNA(互補(bǔ)DNA)缺乏內(nèi)部的、非-編碼片段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列的一段DNA。cDNA可通過(guò)從提取自細(xì)胞的信使RNA反轉(zhuǎn)錄而合成。
互補(bǔ)性和百分比互補(bǔ)性當(dāng)鏈通過(guò)形成Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen堿基對(duì)而相互結(jié)合(雜交)時(shí)，具有互補(bǔ)核酸的分子形成穩(wěn)定的雙鏈體或三鏈體。當(dāng)寡核苷酸分子在所需條件下保持可檢測(cè)地結(jié)合至靶核酸序列時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的結(jié)合。
互補(bǔ)性為一條核酸鏈的堿基與第二條核酸鏈的堿基的堿基配對(duì)程度?；パa(bǔ)性通過(guò)百分比方便地描述，即，形成兩條鏈間或兩條鏈的特定區(qū)域或結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成堿基對(duì)的核苷酸比例。例如，如果15-核苷酸的寡核苷酸的10個(gè)核苷酸與DNA分子的靶區(qū)形成堿基對(duì)，則認(rèn)為該寡核苷酸具有與靶DNA區(qū)域66.67％的互補(bǔ)性。
本說(shuō)明書(shū)中，“足夠的互補(bǔ)性”指寡核苷酸分子和靶核酸序列(如抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE)之間存在足夠數(shù)目的堿基對(duì)以實(shí)現(xiàn)可檢測(cè)結(jié)合。當(dāng)通過(guò)形成的堿基對(duì)的百分比表示或測(cè)定時(shí)，滿足該目的的百分比互補(bǔ)性可在少至約50％互補(bǔ)性至完全(100％)互補(bǔ)的范圍內(nèi)。通常，足夠的互補(bǔ)性為至少約50％，例如至少約75％的互補(bǔ)性、至少約90％的互補(bǔ)性、至少約95％的互補(bǔ)性、至少約98％的互補(bǔ)性，或甚至至少約100％的互補(bǔ)性。
在確定結(jié)合條件中涉及定性和定量考慮的周密處理，其允許本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)用于所需條件下的合適的寡核苷酸，由Beltz等.Methods Enzymol 100266-285，1983，以及由Sambrook等.(ed.)，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989提供。
DNA(脫氧核糖核酸)包括大多數(shù)活的生物體的遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)鏈聚合物(一些病毒具有包括核糖核酸、RNA的基因)。DNA聚合物中的重復(fù)單元為四種不同的核苷酸，每種包括結(jié)合至脫氧核糖的四種堿基，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種，磷酸基附著于脫氧核糖。核苷酸的三聯(lián)體稱為DNA分子中編碼多肽中的氨基酸的密碼子。術(shù)語(yǔ)密碼子還用于DNA序列轉(zhuǎn)錄為的mRNA中三個(gè)核苷酸的對(duì)應(yīng)(和互補(bǔ))序列。
缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸從核酸序列的除去(或一個(gè)或多個(gè)氨基酸從蛋白質(zhì)序列的除去)，所除去序列兩邊的區(qū)域連接在一起。
凝血因子V(FV)在凝血酶原通過(guò)因子X(jué)a和α-凝血酶轉(zhuǎn)化至凝血酶中可充當(dāng)輔因子的蛋白質(zhì)。包括任何FV基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的FV蛋白。FV核酸序列的實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)No.NM_000130公開(kāi)的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
FV在血漿中作為330-kD單鏈糖蛋白循環(huán)?；罨腇V(FVa)促凝血活性的下調(diào)通過(guò)活化的蛋白質(zhì)C(APC)-介導(dǎo)的FVa在三個(gè)不同順序切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)水解而實(shí)現(xiàn)。凝血因子V首先在Arg 506裂解，隨后在Arg 306裂解，并且最后在Arg 679裂解。Arg 506處肽鍵的裂解對(duì)于隨后Arg 306和Arg 679處切割位點(diǎn)的最理想的暴露是必須的。肽鍵在Arg 306處的裂解是最初70％活性喪失的原因，并且隨后在Arg679處的裂解造成殘留活性的喪失。
人FV基因中至少五個(gè)單核苷酸取代與提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)導(dǎo)致Arg506Gln多態(tài)性的1691G→A轉(zhuǎn)變；導(dǎo)致R485K多態(tài)性的1628G→A轉(zhuǎn)變；導(dǎo)致Arg306Thr突變的1091G→C轉(zhuǎn)變；導(dǎo)致Arg306Gly突變的1090A→G轉(zhuǎn)變以及導(dǎo)致His1299Arg多態(tài)性的4070A→G轉(zhuǎn)變。
纖維蛋白原在血凝結(jié)中，如血纖蛋白凝結(jié)形成、凝血因子X(jué)III-介導(dǎo)的血纖蛋白交聯(lián)、無(wú)底物的凝血酶結(jié)合、血小板聚集以及纖維蛋白溶解中具有多重功能的血漿蛋白質(zhì)。包括任何纖維蛋白原基因、cDNA、RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的纖維蛋白原蛋白。纖維蛋白原核酸序列的實(shí)例包括分別以GenBank登錄號(hào)No.NM_021871.1、BC007030和NM_021870公開(kāi)的亞基(對(duì)應(yīng)于α、β和γ)，以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列。
人纖維蛋白酶原為340-kD的糖蛋白，由通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)相同的亞基組成。每一亞基包括三個(gè)多肽鏈(α、β和γ)，其由人染色體4長(zhǎng)臂上三個(gè)獨(dú)立的基因編碼。血纖維蛋白原異常由纖維蛋白原分子中導(dǎo)致纖維蛋白原功能異常的各種結(jié)構(gòu)異常引起。
至少25種單纖維蛋白原突變(22種單核苷酸取代，一種插入和兩種缺失)與提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，并且包括Thr312Ala多態(tài)性。已在多個(gè)報(bào)道中描述了來(lái)自不同的無(wú)關(guān)家族的至少13種突變，并且剩下的突變已是單個(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。
與靜脈血栓形成有關(guān)的典型的回復(fù)血栓形成纖維蛋白原基因突變和一種共同的多態(tài)性在表1中顯示。
遺傳傾向性患上遺傳疾病，如靜脈血栓形成的易感性。然而，所述易感性可能或可能不導(dǎo)致該疾病實(shí)際上的發(fā)展。
雜交DNA、RNA的兩條鏈的互補(bǔ)區(qū)域之間或DNA和RNA之間形成堿基對(duì)，由此形成雙鏈體分子。產(chǎn)生特定嚴(yán)謹(jǐn)程度的雜交條件將根據(jù)雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸序列的組成和長(zhǎng)度而變化。通常，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(如Na+濃度)決定雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度。關(guān)于獲得特定嚴(yán)謹(jǐn)程度的雜交條件的計(jì)算論述在Sambrook等.，(1989)Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY(第9和11章)中。下列為雜交條件的典型組，并且不是限制性的非常高的嚴(yán)謹(jǐn)度(檢測(cè)共有至少90％同一性的序列)雜交5×SSC，65℃16小時(shí)洗滌兩次每次在室溫下(RT)2×SSC中15分鐘洗滌兩次每次在65℃0.5×SSC中20分鐘高嚴(yán)謹(jǐn)度(檢測(cè)共有至少80％同一性的序列)雜交5-6×SSC，65-70℃16-20小時(shí)洗滌兩次每次在RT下2×SSC中5-20分鐘洗滌兩次每次在55℃-70℃1×SSC中30分鐘低嚴(yán)謹(jǐn)度(檢測(cè)共有至少50％同一性的序列)雜交6×SSC，RT至55℃16-20小時(shí)洗滌至少兩次每次在RT至55℃2-3×SSC中20-30分鐘。
插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加至核酸序列，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加至蛋白質(zhì)序列。
分離的“分離的”生物組分(如核酸分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)已基本上與生物體細(xì)胞中(該組分天然存在于其中)的其他生物學(xué)組分分開(kāi)或純化，如其他的染色體和外染色體DNA以及RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。已″分離的″核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包含通過(guò)在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)而制備的核酸分子和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸分子和蛋白質(zhì)。
標(biāo)記物能例如通過(guò)ELISA、分光光度測(cè)定法、流細(xì)胞計(jì)數(shù)法或顯微鏡檢查檢測(cè)的試劑。例如，標(biāo)記可附著于核酸分子，由此允許核酸分子的檢測(cè)。標(biāo)記的實(shí)例包括，但不限于放射性同位素、酶底物、輔因子、配體、化學(xué)發(fā)光試劑、熒光基團(tuán)、半抗原、酶和其組合。用于標(biāo)記的方法和選擇適于不同目的的標(biāo)記的指南例如在Sambrook等.(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)和Ausubel等.(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1998)中論述。
亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)參與胞內(nèi)高半胱氨酸代謝的再次甲基化途徑的蛋白質(zhì)。在由甲硫氨酸合酶催化的再次甲基化途徑中，鈷胺素作為輔因子而甲基由5-甲基-四氫葉酸供給，其源自5，10-亞甲基四氫葉酸通過(guò)MTHFR的還原。包括任何MTHFR基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物，或來(lái)自任何生物體，如人的MTHFR蛋白質(zhì)。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)No.NM_005957公開(kāi)的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
人MTHFR基因位于染色體1p36.3，包括～17kb的DNA并且具有11個(gè)外顯子。人MTHRF中至少兩個(gè)多態(tài)性與靜脈血栓形成有關(guān)677C→T多態(tài)性和1298A→C多態(tài)性。
突變作為遺傳變異來(lái)源的核酸序列的任何改變。例如，突變可存在于基因或染色體內(nèi)，包括染色體非編碼區(qū)的特定的改變，例如基因調(diào)控區(qū)中或接近基因調(diào)控區(qū)的改變。突變的類型包括，但不限于堿基取代點(diǎn)突變(如轉(zhuǎn)變或易位)、缺失和插入。錯(cuò)義突變?yōu)閷⒉煌陌被釋?dǎo)入所編碼蛋白質(zhì)的序列中的突變；無(wú)義突變?yōu)閷?dǎo)入新的終止密碼子的突變；并且沉默突變?yōu)閷?dǎo)入常常在密碼子第三個(gè)位點(diǎn)具有堿基改變的相同氨基酸的突變。在插入或缺失的情況下，突變可為讀框內(nèi)的(不改變?nèi)蛄械淖x框)或?yàn)橐瓶蛲蛔?，其可以?dǎo)致大量密碼子的錯(cuò)譯(并且常常導(dǎo)致所編碼產(chǎn)物由于另一讀框中終止密碼子的存在而異常終止)。
核酸陣列核酸分子(如DNA或RNA)在基質(zhì)上指定位置的排列，如cDNA陣列或寡核苷酸陣列中發(fā)現(xiàn)的排列。
核酸分子代表基因具有適合用作探針或其他指示分子的任何長(zhǎng)度的任何核酸分子，例如DNA(內(nèi)含子或外顯子或兩者)，cDNA或RNA，并且其為相應(yīng)的基因提供信息。
核酸分子脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括不限于cDNA、mRNA、基因組DNA和合成的(如化學(xué)合成的)DNA。核酸分子可以為雙-鏈或單鏈的。為單鏈時(shí)，核酸分子可以為有義鏈或反義鏈。此外，核酸分子可以為環(huán)狀的或線性的。
所公開(kāi)的包括分離的核酸分子，其包括指定長(zhǎng)度的VT-相關(guān)的核苷酸序列。所述分子可以包括這些序列的至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸或更多。
核苷酸包括但不限于，包括連接至糖的堿基的單體，如嘧啶、嘌呤或其合成的類似物，或連接至氨基酸的堿基，如在肽核酸(PNA)中。核苷酸為多核苷酸的一種單體。核苷酸序列指多核苷酸中堿基的序列。
寡核苷酸寡核苷酸為通過(guò)天然的磷酸二酯鍵連接的多個(gè)連接的核苷酸，在約6個(gè)和約300個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之間。寡核苷酸類似物指功能類似于寡核苷酸但具有非-天然存在部分的部分。例如，寡核苷酸類似物可以含有非-天然存在的部分，如改變的糖部分或糖內(nèi)鍵，如硫代磷酯寡脫氧核苷酸。
特定的寡核苷酸和寡核苷酸類似物可以包括上至約200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的線性序列，例如至少6個(gè)堿基的序列(如DNA或RNA)，例如至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)或甚至至少200個(gè)堿基長(zhǎng)，或從約6個(gè)至約50個(gè)堿基，例如約10-25個(gè)堿基，如12、15、20、21或25個(gè)堿基。
寡核苷酸探針核苷酸的短序列，如至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少25個(gè)或至少30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通過(guò)分子雜交用于檢測(cè)互補(bǔ)序列的存在。在具體的實(shí)例中，寡核苷酸探針包括標(biāo)記，其允許寡核苷酸探針靶序列雜交復(fù)合物的檢測(cè)。
可操作性連接的當(dāng)?shù)谝粋€(gè)核酸序列處于和第二個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，第一個(gè)核酸序列與第二個(gè)核酸序列可操作性連接。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子可操作性連接至編碼序列。通常，可操作性連接的DNA序列為連續(xù)的并且，需要時(shí)將兩個(gè)蛋白質(zhì)-編碼區(qū)連接在相同的閱讀框中。
開(kāi)放讀框(ORF)無(wú)任何內(nèi)部終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通?？煞g為肽。
多態(tài)性由于突變，個(gè)體中基因序列可不同。這些不同的序列稱為等位基因。存在于既定基因座的等位基因(染色體上基因的位置稱為基因座)稱為個(gè)體的基因型。一些基因座在個(gè)體中有很大的不同。如果基因座具有兩個(gè)或更多等位基因，群體中每一個(gè)的頻率超過(guò)1％，則該基因座稱為多態(tài)的。多態(tài)的位點(diǎn)稱為多態(tài)性。術(shù)語(yǔ)多態(tài)性還包括產(chǎn)生改變功能的基因產(chǎn)物的變異，即產(chǎn)生功能不等同基因產(chǎn)物的基因序列中的變體。該術(shù)語(yǔ)還包括不產(chǎn)生基因產(chǎn)物、產(chǎn)生無(wú)活性的基因產(chǎn)物或產(chǎn)生提高或降低活性或甚至無(wú)生物學(xué)作用的基因產(chǎn)物的變異。
多態(tài)性可例如指通過(guò)變異存在的核苷酸位點(diǎn)，通過(guò)由核苷酸變異造成的氨基酸序列的改變，或通過(guò)與該變異有關(guān)的核酸分子或蛋白質(zhì)的一些其他特征的改變。
引物短的核酸分子，例如10-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的DNA寡核苷酸，如約15、20、21、25、30或50個(gè)核苷酸或更多的長(zhǎng)度。引物可通過(guò)核酸雜交與互補(bǔ)的靶DNA鏈退火以在引物和靶DNA鏈間形成雜交物。引物對(duì)可用于核酸序列擴(kuò)增，如通過(guò)本領(lǐng)域已知的PCR或其他的核酸擴(kuò)增方法。
用于制備和使用核酸引物的方法例如在Sambrook等.(InMolecular CloningA Laboratory Manual，CSHL，New York，1989)，Ausubel等.(編)(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1998)，以及Innis等.(PCR Protocols，A Guide toMethods and Applications，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990)中描述。PCR引物對(duì)可源自已知序列，例如通過(guò)利用用于該目的的計(jì)算機(jī)程序如Primer(Version 0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解特定引物的特異性隨著其長(zhǎng)度而提高。因此，例如，包含VT-相關(guān)蛋白質(zhì)編碼核苷酸30個(gè)連續(xù)核苷酸的引物將以比僅15個(gè)核苷酸的相應(yīng)引物更高的特異性退火至靶序列，如指定的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的另一種同系物。因此，為了獲得更好的特異性，可選擇包含VT-相關(guān)蛋白質(zhì)-編碼核苷酸序列的至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)、至少50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的引物。
蛋白質(zhì)C(PC)在凝血酶結(jié)合至其內(nèi)皮受體，凝血調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)后PC被活化?；罨腜C通過(guò)裂解和滅活因子Va和VIIIa而抑制凝結(jié)形成。包括任何PC基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的PC蛋白。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)No.BC034377.1公開(kāi)的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
人PC基因定位于人染色體2q13-14；其跨越大約10kb并且含有九個(gè)外顯子。PC基因中功能喪失的突變導(dǎo)致PC的缺陷，其為公認(rèn)的VT的原因。PC缺陷分為I型(低的功能性和免疫學(xué)PC的血漿濃度)和II型(具有正常的抗原水平的低的功能蛋白的血漿水平)。
在與人中靜脈血栓形成有關(guān)的至少161種不同的PC基因突變中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中至少51種不同的突變(48種點(diǎn)突變，2種缺失和1種插入)，并且剩下的突變?yōu)閱蝹€(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。至少四十種回復(fù)突變與I型PC缺陷有關(guān)并且已在患有II型PC缺陷的患者中發(fā)現(xiàn)11種突變。
位于PC基因5′非翻譯區(qū)的三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(nt-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T)也對(duì)血漿的PC水平起作用。攜帶CGT等位基因的受試者具有比具有另一種基因型的受試者更低的血漿PC水平并且該等位基因?yàn)殪o脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)因素。
與靜脈血栓形成有關(guān)的典型的回復(fù)PC基因突變和多態(tài)性在表1中顯示。
蛋白質(zhì)S(PS)用于活化的PC在因子Va和VIIIa蛋白水解失活中的非-酶促輔因子。包括任何PS基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的PS蛋白。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)No.NM_000313.1公開(kāi)的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
人DNA包含兩種PS基因有活性的PROS1基因和假基因PRSO2，其定位于3p11.1-q11.2。PRSO1跨越80kb基因組DNA并且包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。PRSO1中功能喪失的突變導(dǎo)致PS的缺陷。根據(jù)血漿測(cè)量識(shí)別三種PS缺陷I型通過(guò)低的總量以及無(wú)PS抗原水平表征，II型通過(guò)降低的活性以及正常的總量和無(wú)PS抗原水平表征，并且III型通過(guò)游離PS水平的選擇性降低表征。
在與人中靜脈血栓形成有關(guān)的至少131種不同的PS基因突變中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中至少32種不同的突變(25種點(diǎn)突變，3種缺失，3種插入以及1種缺失和插入)，并且剩下的突變已是單個(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。已報(bào)道二十五種回復(fù)突變與定量(I型和/或III型)PS缺陷有關(guān)，3種突變與定性(II型)PS缺陷有關(guān)，并且由于缺少一種血漿測(cè)定法或由于受試者正進(jìn)行口服抗凝血療法，在剩下的4種突變中不能確定PS缺陷的類型。PS基因中四種回復(fù)多態(tài)性與患有遺傳PS缺陷家族中的缺陷表型共分離(cosegregate)。
與靜脈血栓形成有關(guān)的典型的回復(fù)PS基因突變和多態(tài)性在表1中顯示。
凝血酶原(凝血因子II，F(xiàn)II)絲氨酸蛋白酶凝血酶的前體，其為維生素K-依賴的糖蛋白。通過(guò)FXa活化(FVa和磷脂存在時(shí))，F(xiàn)IIa呈現(xiàn)促凝血的、抗凝血的和抗纖維蛋白溶解的活性。包括任何FII基因、cDNA或RNA的產(chǎn)物或來(lái)自任何生物體，如人的FII蛋白。實(shí)例包括以GenBank登錄號(hào)No.V00595.1公開(kāi)的mRNA序列(以及相應(yīng)的基因組和蛋白質(zhì)序列)。
編碼FII的人基因定位于染色體11，帶11p11-q12上并且跨越21kb的DNA。FII基因組織在14個(gè)外顯子中，通過(guò)13個(gè)內(nèi)含子分開(kāi)，具有5′和3′-非翻譯(UT)區(qū)。
人FII基因中至少一種單核苷酸取代與提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)核苷酸20210位G→A的多態(tài)性。
純化的術(shù)語(yǔ)“純化的”并不要求絕對(duì)的純度；相反，其只是作為相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的蛋白質(zhì)制備物為其中所指的蛋白質(zhì)比其在細(xì)胞內(nèi)的天然環(huán)境中更純的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)的制備物為純化的，使得該蛋白質(zhì)代表該制備物至少50％的總蛋白質(zhì)含量。同樣，純化的寡核苷酸制備物為其中寡核苷酸比在包含復(fù)雜的寡核苷酸混合物的環(huán)境中更純的寡核苷酸。
重組體重組核酸分子為具有不是天然存在序列的序列或具有通過(guò)兩種不同分離的序列片段的人工組合而制備的序列的核酸分子。該人工組合可通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)分離的核酸分子片段的人工操作實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)遺傳工程技術(shù)。
樣品生物樣本，如包含基因組DNA、RNA(包含mRNA)、蛋白質(zhì)或其組合的那些。實(shí)例包含但不限于，外周血、尿、唾液、活體組織、外科樣本、羊膜穿刺樣品和尸檢材料。
序列同一性/相似性兩個(gè)或更多核酸序列或兩個(gè)或更多氨基酸序列間的同一性/相似性根據(jù)序列間的同一性或相似性表示。序列同一性可根據(jù)同一性百分比衡量；百分比越高序列更同一。序列相似性可根據(jù)相似性百分比衡量(其考慮了保守的氨基酸取代)；百分比越高序列更相似。當(dāng)利用標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)時(shí)，核酸或氨基酸序列的同系物或直向同源物擁有比較高的序列同一性/相似性程度。相比更遠(yuǎn)相關(guān)的物種(如人和線蟲(chóng)序列)，當(dāng)直向同源蛋白質(zhì)或cDNA源自更密切相關(guān)的物種(如人和小鼠序列)時(shí)該同源性更加顯著。
用于比較的序列比對(duì)方法為本領(lǐng)域所熟知。以下描述了各種程序和比對(duì)算法Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443，1970；Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；Higgins & Sharp，Gene，73237-44，1988；Higgins & Sharp，CABIOS 5151-3，1989；Corpet等.，Nuc.Acids Res.1610881-90，1988；Huang等.Computer Appls.inthe Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等.，Meth.Mol.Bio.24307-31，1994。Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-10，1990記載了序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳盡介紹。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等，J Mol.Biol.215403-10，1990)可由以下幾個(gè)來(lái)源獲得，包括國(guó)家生物信息中心(NCBI，National Library of Medicine，Building 38A，Room8N805，Bethesda，MD 20894)和Internet，并結(jié)合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。附加信息可在NCBI網(wǎng)點(diǎn)獲得。
BLASTN用于比較核酸序列，而B(niǎo)LASTP用于比較氨基酸序列。為了比較兩條核酸序列，選項(xiàng)可設(shè)置如下-i設(shè)為包含用以比較的第一個(gè)核酸序列的文件(如C\seq1.txt)；-j設(shè)為包含用以比較的第二個(gè)核酸序列的文件(如C\seq2.txt)；-p設(shè)為blastn；-o設(shè)為任何想要的文件名(如C\output.txt)；-q設(shè)為-1；-r設(shè)為2；并且所有其他選項(xiàng)保留為其缺省設(shè)置。例如，下列命令可用于產(chǎn)生包含兩條序列間比較的輸出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastn-o c\output.txt-q-1-r2。
為了比較兩條氨基酸序列，B12seq選項(xiàng)可設(shè)置如下-i設(shè)為包含用以比較的第一個(gè)氨基酸序列的文件(如C\seq1.txt)；-j設(shè)為包含用以比較的第二個(gè)氨基酸序列的文件(如C\seq2.txt)；-p設(shè)為blastp；-o設(shè)為任何想要的文件名(如C\output.txt)；并且所有其他選項(xiàng)保留為其缺省設(shè)置。例如，下列命令可用于產(chǎn)生包含兩條氨基酸序列間比較的輸出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastp-o c\output.txt。如果兩條比較的序列具有同源性，則指定的輸出文件將以比對(duì)的序列呈現(xiàn)同源性的那些區(qū)域。如果兩條比較的序列不具有同源性，則指定的輸出文件不會(huì)呈現(xiàn)比對(duì)的序列。
一旦比對(duì)，通過(guò)計(jì)算存在于兩者序列中相同的核苷酸或氨基酸殘基的位點(diǎn)數(shù)目而確定匹配的數(shù)目。序列同一性百分比通過(guò)將匹配的數(shù)目除以所鑒定序列中所述的序列長(zhǎng)度或關(guān)連的長(zhǎng)度(如來(lái)自所鑒定序列中所述100個(gè)連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基)，隨后得到的值乘以100而確定。例如，當(dāng)與具有1154個(gè)核苷酸的檢驗(yàn)序列比對(duì)時(shí)具有1166個(gè)匹配，則核酸序列與該檢驗(yàn)序列75％相同(即，1166÷1554*100＝75.0)。序列同一性的百分比值四舍五入至最接近的十分之一位數(shù)。例如，75.11、75.12、75.13和75.14下舍至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19上舍至75.2。長(zhǎng)度值始終為整數(shù)。在另一個(gè)實(shí)例中，包含與來(lái)自如下已確定序列的20個(gè)連續(xù)核苷酸比對(duì)的20-核苷酸區(qū)域的靶序列包含具有與已確定序列75％序列同一性的區(qū)域(即，15÷20*100＝75)。
1 20靶序列AGGTCGTGTACTGTCAGTCA| || ||| |||| |||| |已確定序列ACGTGGTGAACTGCCAGTGA為了比較超過(guò)約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，采用Blast 2序列功能，缺省BLOSUM62矩陣設(shè)置成缺省參數(shù)(缺口存在值11，每個(gè)殘基缺口值1)。同系物通常通過(guò)擁有至少70％的序列同一性表征，其利用NCBI Basic Blast 2.0與數(shù)據(jù)庫(kù)如nr或swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有缺口的blastp而計(jì)數(shù)全長(zhǎng)比對(duì)的氨基酸序列。用blastn程序搜索的查詢序列用DUST過(guò)濾(Hancock和Armstrong，1994，Comput.Appl.Biosci.1067-70)。其他的程序使用SEG。此外，可進(jìn)行人工比對(duì)。當(dāng)通過(guò)該方法評(píng)估時(shí)具有甚至更大相似性的蛋白質(zhì)將顯示提高的同一性百分比，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
當(dāng)比對(duì)短肽(小于大約30個(gè)氨基酸)時(shí)，采用Blast 2序列功能，PAM30矩陣設(shè)置成缺省參數(shù)(開(kāi)放缺口9，延伸缺口1罰分)，進(jìn)行序列對(duì)比。當(dāng)通過(guò)該方法評(píng)估時(shí)，具有與參考肽更高相似性的蛋白質(zhì)將顯示提高的同一性百分比，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。當(dāng)少于全序列被比較序列同一性時(shí)，在10-20個(gè)氨基酸的短窗口，同系物通常將具有至少75％的序列同一性，并且可具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性，取決于其與參考序列的同一性。用于確定在所述短窗口的序列同一性的方法在NCBI網(wǎng)點(diǎn)描述。
如上所述，兩個(gè)核酸分子密切相關(guān)的一個(gè)指標(biāo)為兩個(gè)分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下相互雜交。然而由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不顯示高同一性程度的核酸序列可能編碼相同或類似的(保守的)氨基酸序列。可利用簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸序列的改變以產(chǎn)生多個(gè)核酸分子，所有的編碼基本上相同的蛋白質(zhì)。所述同源核酸序列可例如，具有通過(guò)該方法確定的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。兩條核酸序列基本上相同的另一種(并且未必累積的)指標(biāo)為第一個(gè)核酸編碼的多肽與第二個(gè)核酸編碼多肽是有免疫交叉反應(yīng)性的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解具體的序列同一性范圍僅用于指導(dǎo)性的提供；有可能在所提供范圍外可獲得很明顯的同系物。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)群體的個(gè)體中DNA序列的單堿基(核苷酸)差異。SNP可以是作為原因的(實(shí)際上參與或作用于SNP相關(guān)的情況或性狀)或相關(guān)的(與SNP相關(guān)的情況或性狀有關(guān)而不是具有任何直接的參與或作用)。
受試者活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，包括人和非-人哺乳動(dòng)物(如獸醫(yī)受試者)的種類。
靶序列位于基因組(如人基因組或任何哺乳動(dòng)物基因組)特定區(qū)域的核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)于一或多種特定的遺傳異常，如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失、插入、擴(kuò)增或其組合。該靶例如可為編碼序列；其還可以為對(duì)應(yīng)于編碼序列的非-編碼鏈。靶序列的實(shí)例包括與靜脈血栓形成有關(guān)的那些序列，如列于表1中的那些。
靜脈血栓形成(VT)靜脈內(nèi)形成的血液凝塊。在特定的實(shí)例中，VT與粘滯的血液流動(dòng)有關(guān)(例如在延長(zhǎng)的臥床休息、妊娠和外科手術(shù)期間出現(xiàn)的)或與血液的快速凝結(jié)有關(guān)。實(shí)例包括腿的深靜脈或骨盆靜脈中形成的深靜脈血栓形成(DVT)。所述血栓有時(shí)遷移至肺并且形成導(dǎo)致心肺衰竭以及死亡的肺栓。
靜脈血栓形成(VT)-相關(guān)的(或關(guān)聯(lián)的)分子參與靜脈血栓形成發(fā)展的分子。所述分子包括，例如核酸(如DNA、cDNA或mRNA)和蛋白質(zhì)。VT-相關(guān)分子的特定實(shí)例包括列于表1中的那些，以及全長(zhǎng)基因或cDNA的片段，其包括突變、多態(tài)性或兩者，負(fù)責(zé)提高個(gè)體對(duì)VT的易感性，以及因此編碼的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。
VT-相關(guān)分子可通過(guò)靜脈血栓形成以許多不同的方式參與或作用，包括成為原因的(因?yàn)閂T-相關(guān)分子的改變導(dǎo)致靜脈血栓形成的發(fā)生或發(fā)展)或結(jié)果性的(因?yàn)殪o脈血栓形成的發(fā)生或發(fā)展引起或?qū)е耉T-相關(guān)分子的改變)。
野生型相比突變體形式，生物體自然群體中占優(yōu)勢(shì)的基因型。
參與靜脈血栓形成的突變和多態(tài)性復(fù)雜的性狀如靜脈血栓形成可通過(guò)在候選的易感性基因中呈現(xiàn)不同突變、多態(tài)性之間的相互作用而了解。與每種遺傳缺陷有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)在隔離時(shí)可能相對(duì)較低，但幾個(gè)突變或多態(tài)性的同時(shí)存在可以顯著提高疾病易感性。此外，環(huán)境因素可與一或多種遺傳變異互相作用而進(jìn)一步增加風(fēng)險(xiǎn)。靜脈血栓形成表型的表現(xiàn)取決于來(lái)自幾個(gè)基因座的基因產(chǎn)物和環(huán)境或后天影響的相互作用。因此，VT為復(fù)雜的遺傳病癥。
與發(fā)展VT的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的基因中的幾個(gè)突變和多態(tài)性(如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、插入、缺失或其組合)是已知的。然而，之前還沒(méi)有鑒定出突變和多態(tài)性的組合(如在統(tǒng)計(jì)上與VT有關(guān)的基因中)，其允許在多個(gè)種族人群中準(zhǔn)確預(yù)測(cè)受試者對(duì)VT的總遺傳傾向性。
蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和抗凝血酶III參與靜脈血栓形成的幾個(gè)基因，包括蛋白質(zhì)C(PC)、蛋白質(zhì)S(PS)和抗凝血酶III參與抗凝血途徑。PC和PS缺陷導(dǎo)致活化的PC抗凝血系統(tǒng)的缺陷。
已報(bào)道了人中至少161種不同的有害PC基因突變(Reitsma等.，Thromb.Haemost.73876-89，1995)。在該161種不同的PC基因突變中，僅描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中51種不同的突變(48種點(diǎn)突變，2種缺失和1種插入)，并且剩下109種突變已是單個(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。四十種回復(fù)突變與I型PC缺陷有關(guān)并且已在患有II型PC缺陷的患者中觀察到11種突變。三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(nt-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T)位于對(duì)血漿的PC水平起作用的該基因5′非翻譯區(qū)。
PS缺陷具有至少131種不同突變的高度異種分子基礎(chǔ)(Gandrille等.，Thromb.Haemost.84918，2000)。在所有的PS基因有害突變中，已描述了無(wú)關(guān)的家族中僅32種不同的突變(25種點(diǎn)突變，3種缺失，3種插入以及1種缺失和插入)，并且剩下的100種突變已是單個(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。已報(bào)道二十五種回復(fù)突變與定量(I型和/或III型)PS缺陷有關(guān)，3種突變與定性(II型)PS缺陷有關(guān)。PS基因中四種回復(fù)多態(tài)性與患有遺傳PS缺陷家族中的缺陷表型共分離(cosegregate)。
總?cè)丝谥蠵C缺陷的發(fā)病率為大約1/300。PC和PS缺陷的攜帶者狀態(tài)與大約10倍的提高的VT血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。純合的PC和PS缺陷通常與稱為暴發(fā)性紫癜的嚴(yán)重的臨床表型有關(guān)，其以出生后早期微循環(huán)中大范圍的形成血栓為特征。
雜合的抗凝血酶III(AT III)缺陷與提高的VT風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。存在至少127種與AT III缺陷有關(guān)的不同缺陷(Lane等.，Thromb.Haemost.77197-211，1997)對(duì)于I型AT III缺陷的92種突變(40種點(diǎn)突變、40種小的插入或缺失以及12種大的缺失)和對(duì)于II型AT III缺陷的35種突變(12種RS、12種HBS和11種PE突變，均為點(diǎn)突變)。I型突變中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中僅11種不同的突變(7種點(diǎn)突變和4種缺失或插入)，并且剩下的81種突變?yōu)閱蝹€(gè)家族特有的，其使得它們成為個(gè)體突變。II型中，已描述了多個(gè)無(wú)關(guān)的家族中的35種突變的19種(七種RS、六種HBS和六種PE突變)并且已報(bào)道剩下16種為個(gè)體突變。
總?cè)丝谥蠥T III缺陷的發(fā)病率范圍從0.2/1000至18/1000。在基于群體的對(duì)照研究中，報(bào)道了與AT III缺陷關(guān)聯(lián)的五倍提高的VT風(fēng)險(xiǎn)。血栓形成患者中AT III缺陷的發(fā)病率范圍從1％至8％。
凝血因子V、凝血酶原和纖維蛋白原參與靜脈血栓形成的其他基因包括凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)和纖維蛋白原，其參與促凝血途徑。突變FV的改變的活性為最常見(jiàn)的遺傳血液凝固病癥，其影響VT的發(fā)展(Nicolaes等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.22530-8，2002)。活化的FV(FVa)促凝血活性的下調(diào)通過(guò)活化的蛋白質(zhì)C(APC)-介導(dǎo)的FVa在三個(gè)不同順序切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)水解而實(shí)現(xiàn)Arg 506、Arg 306和Arg 679(此處核苷酸或氨基酸的編號(hào)指人基因)。一個(gè)或多個(gè)這三個(gè)切割位點(diǎn)的缺陷可影響APC的失活過(guò)程，即使前凝結(jié)活性維持正常。
人FV基因中至少五種回復(fù)單核苷酸取代與提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。90％的病例中，對(duì)APC的抗性應(yīng)歸于導(dǎo)致Arg506由Gln替換(R506Q)的單核苷酸取代(FV Leiden；1691G→A)。白種人群體中其發(fā)病率為大約5％并且在VT患者中高達(dá)20％至40％。然而，其他人種中僅報(bào)道了極個(gè)別的FV Leiden病例，并且在東南亞和非洲沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，所以人們相信FV Leiden突變是對(duì)白種人特異的(Takamiya等.，Thromb.Haemost.74996，1995；Fujimura等.，Thromb.Haemost.741381-2，1995；Chan等.，Thromb.Haemost.75522-3，1996)。
FV基因中另一種單核苷酸取代，R485K，與遠(yuǎn)東人群提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(Hiyoshi等.，Thromb.Haemost.80705-6，1998；Le等.，Clin.Genet.57296-303，2000)。R485K多態(tài)性為核苷酸1628位出現(xiàn)的G→A的轉(zhuǎn)變并且導(dǎo)致Arg 485的密碼子AGA由推定為L(zhǎng)ys殘基的AAA密碼子的替換。盡管白種人中K485等位基因的頻率較低而在亞洲人和非洲人中較高，該多態(tài)性證實(shí)與遠(yuǎn)東和白種人群提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(Faisel等.，Eur.J.Hum.Genet.12187-91，2004)。
三種其他的單核苷酸取代與不同人群提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。人FV基因的外顯子7中兩種突變影響Arg306APC切割位點(diǎn)。這兩種突變也具有異種的種族分布。FV Cambridge突變?yōu)楹塑账?091位G→C的轉(zhuǎn)變以及推定氨基酸306位精氨酸由蘇氨酸的替換(Arg306Thr)。僅在白種人群體中描述了該突變(Francoetal.，Thromb.Haemost.81312-3，1999)。第二種突變，F(xiàn)V Hong Kong，為核苷酸1090位A→G的轉(zhuǎn)變以及Arg306至Gly的改變。雖然該突變最初在中國(guó)人群中描述，其在白種人中具有0.4％的發(fā)病率(Franco等.，Thromb.Haemost.81312-3，1999)。
稱為R2等位基因的人FV基因外顯子13中的另一種單核苷酸取代為核苷酸4070位A→G的轉(zhuǎn)變，其在1299位由Arg替換His(H1299R)。R2等位基因的發(fā)病率在VT患者中明顯高于健康對(duì)照，各自的值分別為18.5％和11.4％(Alhenc-Gelas等.，Thromb.Haemost.81193-7，1999)。美國(guó)白種人中該多態(tài)性具有11.9％的發(fā)病率，美裔非洲人人中為5.6％，亞洲人或太平洋島民中為13.4％以及拉丁美洲人中為11.3％(Benson等.，Thromb.Haemost.861188-92，2001)。
凝血酶原(凝血因子II，F(xiàn)II)基因中至少一種單核苷酸取代與提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。凝血酶原基因3′-UT區(qū)20210位核苷酸G→A的多態(tài)性為第二個(gè)最參見(jiàn)的靜脈血栓形成遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素(Poort等.，Blood 883698-703，1996)。FII G20210A與血凝血酶原過(guò)多和二至五倍提高的VT風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。其在健康受試者中發(fā)現(xiàn)1％-3％的患者以及在白種人群體中發(fā)現(xiàn)6％-18％的VT患者(Rosendaal等.，Thromb.Haemost.79706-8，1998)，但其在美裔非洲人和來(lái)自巴西的美國(guó)印地安人中相當(dāng)罕見(jiàn)(Dilley等.Blood 90652a，1997；Arruda等.，Thromb.Haemost.781430-3，1997)。該突變?cè)谖鞣侨?、亞馬遜河區(qū)的印第安人、澳大拉西亞人、拉丁美洲人、日本人或中國(guó)人受試者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(Ferraresi等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172418-22，1997；Rahimy等.，Thromb.Haemost.79444-5，1998；Isshiki等.，Blood Coagul.Fibrinol.9105-6，1998；Miyata等.，Blood Coagul.Fibrinol.9451-2，1998，Rees等.Br.J Haematol.105564-566，1999)。
至少25種血栓形成纖維蛋白原突變(22種單核苷酸取代，1種插入和2種缺失)與VT有關(guān)(De Stefano等.，Br.J.Haematol.106564-8，1999)。至少13種突變來(lái)自不同的無(wú)關(guān)家族；剩下的突變是單一家族特有的，使得其成為個(gè)體突變。總?cè)丝谥羞z傳血纖維蛋白原異常的發(fā)病率還未知；然而，具有靜脈血栓形成病史的患者中的發(fā)病率為0.8％(Carter等.，Blood 961177-9，2000)。導(dǎo)致纖維蛋白原Aα鏈羧基端內(nèi)312位密碼子蘇氨酸由丙氨酸取代的常見(jiàn)的多態(tài)性(Thr312Ala多態(tài)性)通過(guò)影響凝塊穩(wěn)定性以及使凝塊在靜脈血管樹(shù)中傾向于栓塞而與靜脈血栓栓塞有關(guān)(Carter等.，Blood 961177-9，2000；Standeven等.，Circulation 1072326-30，2003；Hayes，Arch.Pathol.Lab.Med.1261387-90，2002)。該多態(tài)性在51％的肺栓塞患者中以及在40％的健康受試者中觀察到。已發(fā)現(xiàn)白種人和亞洲人中Thr312Ala多態(tài)性的遺傳型分布無(wú)差異并且該多態(tài)性與兩種群體中提高的纖維蛋白原水平有關(guān)(Liu等.，J.Med.Genet.3831-5，2001；Kain等.，Am.J.Epidemiol.156174-9，2002)。
血管緊張素I-轉(zhuǎn)化酶和亞甲基四氫葉酸還原酶參與靜脈血栓形成的另外的基因包括但不限于，血管緊張素I-轉(zhuǎn)化酶(ACE)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)。
腎素血管緊張素系統(tǒng)通過(guò)不同的機(jī)理影響止血。人ACE基因的內(nèi)含子16中，已知由288-bp片段的插入或缺失組成的多態(tài)性(Rigat等.，Nuc.Acids Res.201433，1992)。白種人和美裔非洲人的ACE DD基因型與循環(huán)酶的提高的水平以及3至10倍提高的靜脈血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。還在日本人群體中報(bào)道了ACE DD基因型。
輕微的-至-中等的高半胱氨酸血癥(總高半胱氨酸在15和100μmol/之間的禁食水平(fasting)水平)為確定的VT風(fēng)險(xiǎn)因素并且與2至4倍提高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。雖然其可由一些后天的原因，包括維生素B12、維生素B6和葉酸營(yíng)養(yǎng)缺陷、老年、慢性腎衰竭以及抗-福利奇(folic)藥物的使用而引起，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因中兩種常見(jiàn)的多態(tài)性與輕微的-至中等的高半胱氨酸血癥有關(guān)(Cattaneo，Thromb.Haemost.81165-76，1999；Franco和Reitsma，Hum.Genet.109369-84，2001)。
MTHFR 677C→T多態(tài)性位于人外顯子4的葉酸結(jié)合位點(diǎn)，將丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸。在其雜合狀態(tài)，C677T多態(tài)性與MTHFR的熱不穩(wěn)定性有關(guān)，導(dǎo)致酶活性60-70％的降低以及輕微的至中等的高半胱氨酸血癥(Franco和Reitsma，Hum.Genet.109369-84，2001；Frosst等.，Nat.Genet.10111-3，1995)。人MTHFR中C677T多態(tài)性在全世界具有較高的頻率，TT基因型以總?cè)丝诘募s5％至17％存在，不同的種族人群中具有很不均勻的分布，歐洲發(fā)病率最高而非洲發(fā)病率最低(Frosst等.，Nat.Genet.10111-3，1995；Schneider等.，Am.J.Hum.Genet.621258-60，1998；De Franchis等.，Am.J.Hum.Genet.59262-4，1996；Ma等.，Circulation 942410-6，1996；Deloughery等.，Circulation943074-8，1996；Arruda V等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997)。純合的MTHRF C677T多態(tài)性為白種人靜脈血栓形成患者中11％-27％發(fā)病率的獨(dú)立的靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)因素，而不與亞洲人和非洲人中的VT有關(guān)(Arruda等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997；Margaglione等.，Thromb.Haemost.79907-11，1998；Salomon等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19511-8，1999)。
另一種MTHFR多態(tài)性，1298A→C在人外顯子7的推定調(diào)控結(jié)構(gòu)域中，并且谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼帷为?dú)地，該多態(tài)性似乎不和高半胱氨酸血癥有關(guān)，但與MTHFR 677C→T組合的雜合性導(dǎo)致降低的酶活性以及提高的高半胱氨酸水平(Weisberg等.，Mol.Genet.Metab.68511-2，1999)。
確定靜脈血栓形成的遺傳傾向性此處提供的為確定受試者，如另外的健康受試者或疑似或處于發(fā)展血栓的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者是否對(duì)發(fā)展靜脈血栓形成(VT)易感的方法。該方法包括檢測(cè)受試者至少一種VT-相關(guān)分子的異常(如突變或多態(tài)性)，如編碼凝血-相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸分子。具體包含的實(shí)施方案包括診斷或預(yù)后方法，其中檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞中VT-相關(guān)核酸分子的一或多處突變或多態(tài)性。在具體的實(shí)施方案中，VT-相關(guān)分子(如核酸序列)的亞型，或所有已知的VT-相關(guān)分子中檢測(cè)到異常，其選擇性地檢測(cè)受試者對(duì)發(fā)展VT的遺傳傾向性。
在具體的實(shí)例中，分子亞型包含與靜脈血栓形成事件有關(guān)的一組10種VT-相關(guān)易感性等位基因，其中該10種VT-相關(guān)易感性等位基因在至少95％的白種人受試者中存在，其處于靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)之中(或其已經(jīng)歷過(guò)靜脈血栓形成)。在具體的實(shí)例中，10種VT-相關(guān)易感性等位基因在至少98％的白種人中存在，如至少99％，并且在至少82％的亞洲人和非洲人人群中存在，如在至少85％的非洲人中，其已經(jīng)發(fā)展或處于發(fā)展VT的風(fēng)險(xiǎn)中。
仍在其他的實(shí)例中，所篩選的VT-相關(guān)易感性等位基因數(shù)目為至少10種，例如至少15種、至少20種、至少50種、至少100種、至少143種、至少200種、至少287種或甚至至少500種等位基因。在其他的實(shí)例中，該方法用于篩選不超過(guò)600種、不超過(guò)500種、不超過(guò)400、不超過(guò)287種、不超過(guò)200種、不超過(guò)143種、不超過(guò)100種、不超過(guò)50種或不超過(guò)10種VT-相關(guān)易感性等位基因。具體的VT-相關(guān)易感性等位基因的實(shí)例在表1中顯示。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“VT-相關(guān)分子”包含VT-相關(guān)核酸分子(如DNA、RNA或cDNA)和VT-相關(guān)蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)不限于列于表1中的那些分子(以及相當(dāng)于所列那些的分子)，而且包括受靜脈血栓形成影響或在靜脈血栓形成期間受影響的其他核酸分子和蛋白質(zhì)(如對(duì)水平、活性、定位的影響)，其包括此處所列的所有這樣的分子。
VT-相關(guān)基因的實(shí)例包括抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和血管緊張素-I轉(zhuǎn)化酶(ACE)。在某些實(shí)例中，異常在至少一種VT-相關(guān)核酸中檢測(cè)到，例如在至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少10種、至少15種或更多種的VT-相關(guān)核酸分子中。在具體的實(shí)例中，某些所述的方法采用篩選不超過(guò)100種、不超過(guò)50種、不超過(guò)40種、不超過(guò)30種、不超過(guò)20種或不超過(guò)15種的VT-相關(guān)基因。
所公開(kāi)的方法(MERT)提供了用于在一種測(cè)定法中篩選總的遺傳靜脈血栓形成易感性的快速、直接、準(zhǔn)確和可負(fù)擔(dān)的多重遺傳篩選方法，其對(duì)鑒定無(wú)癥狀攜帶者具有高的預(yù)測(cè)能力。其允許在高風(fēng)險(xiǎn)處境期間可能需要預(yù)防性抗凝血療法的受試者的早期識(shí)別，所述處境如妊娠、產(chǎn)后期、口服避孕藥或激素替代治療的使用、創(chuàng)傷、外科手術(shù)、骨折、長(zhǎng)時(shí)間的固定術(shù)、長(zhǎng)的空中旅程(如4小時(shí)以上的)、老年、抗磷脂類抗體、以前的血栓形成病史、脊髓增生病、惡性腫瘤或其組合。所公開(kāi)的測(cè)定法可通過(guò)處于遺傳風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的早期鑒定而用于降低靜脈血栓形成的每年發(fā)生率。通過(guò)在發(fā)展病征之前檢測(cè)個(gè)體，可制定有效的預(yù)防措施，如早期的凝血預(yù)防或甚至如避免口服避孕藥或激素替代治療使用的決定。
如上所述，不同的種族人群中遺傳靜脈血栓形成的原因不同。盡管FV Leiden和凝血酶原G0210A多態(tài)性為白種人中靜脈血栓形成最普遍的風(fēng)險(xiǎn)因素，亞洲人和非洲人患者呈現(xiàn)無(wú)或很罕見(jiàn)FV Leiden或凝血酶原G20210A多態(tài)性。所公開(kāi)的方法和陣列設(shè)計(jì)成不僅能在白種人中而且能在各種種族人群中確定遺傳的靜脈血栓形成傾向風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)例中，該方法在不同的種族人群中具有高的預(yù)測(cè)能力(如對(duì)白種人的至少98％、對(duì)亞洲人的至少84％和對(duì)非洲人的至少87％)。在其他的實(shí)例中，該方法檢測(cè)VT-相關(guān)分子(如核酸序列)中的異常，其中該異常在已患有VT的至少99％的白種人中，至少85％的亞洲人中和至少88％的非洲人中發(fā)現(xiàn)。因此，所公開(kāi)方法和陣列在各種種族人群中的適用性使其成為強(qiáng)有力的手段。
在具體的實(shí)例中，所公開(kāi)的方法和陣列相比現(xiàn)用的基于血漿的血栓形成傾向篩選平板低成本，其包括基于抗原性和活性的蛋白質(zhì)C和S、AT III抗原和活性，血纖維蛋白原異常的凝血酶時(shí)間和蛇毒凝血酶時(shí)間的測(cè)定，纖維蛋白原水平的定量測(cè)定和基于PCR的FV Leiden、凝血酶原20210A和MTHFR多態(tài)性的直接的突變分析。
例如，因?yàn)樗_(kāi)的方法在一種測(cè)定法而不是在兩種依次的檢驗(yàn)中檢測(cè)I和II型缺陷，并且檢測(cè)不同的AT III II型缺陷，其由于許多用于臨床實(shí)踐的自動(dòng)的功能性肝素輔因子測(cè)定分析器的長(zhǎng)孵育時(shí)間而可能不幸遺漏，以及通過(guò)避免高比率的假陽(yáng)性，所公開(kāi)方法提供了相比AT III缺陷測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)。
在其他的實(shí)例中，因?yàn)樵谝粋€(gè)實(shí)施方案中所公開(kāi)的方法可在一種測(cè)定法而不是三種依次的檢驗(yàn)中檢測(cè)I和II型缺陷，并且克服了由于低的正常水平和輕微的PC缺陷之間顯著重疊的存在而從無(wú)癥狀的PC缺陷個(gè)體區(qū)分健康受試者的困難，通過(guò)避免由于作為年齡函數(shù)的PC濃度的提高為大約每十年4％而造成的PC缺陷個(gè)體的低估，以及通過(guò)避免高比率的假陽(yáng)性，所公開(kāi)的方法提供了相比PC缺陷測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)，包括功能性PC水平的凝固測(cè)定法，免疫PC測(cè)定法和PC活性的顯色測(cè)定法。
在其他的實(shí)例中，因?yàn)樵谝粋€(gè)實(shí)施方案中所公開(kāi)的方法可在一種測(cè)定法而不是四種依次的表型測(cè)定法中檢測(cè)定量的和功能性的缺陷，并且克服了由血漿中存在兩種PS的分子形式(游離的PS和C4b-BP/PS復(fù)合物)而變復(fù)雜的用免疫學(xué)測(cè)定法診斷PS缺陷的困難，克服了由于對(duì)照和PS缺陷個(gè)體，特別是患有III型PS缺陷的個(gè)體之間重疊值的存在而從無(wú)癥狀的PS缺陷個(gè)體區(qū)分健康受試者的困難，以及通過(guò)避免高比率的假陽(yáng)性，所公開(kāi)的方法提供了相比PS缺陷測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)，包括功能性PS水平的凝固測(cè)定法，PS免疫測(cè)定法和用于總的和游離的PS測(cè)量的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。
在其他的實(shí)例中，所公開(kāi)的方法提供了相比用于血纖維蛋白原異常的測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)，其包括最重要的凝血酶時(shí)間和蛇毒凝血酶時(shí)間的檢驗(yàn)，因?yàn)樗_(kāi)的方法避免了高比率的假陽(yáng)性。
臨床樣本用于和所公開(kāi)的方法一起使用以確定受試者VT遺傳傾向性的合適的樣本包括任何常規(guī)的臨床樣品，例如血液或血液-組分(如血清)。用于所述樣品采集的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知(例如參見(jiàn)Schluger等.，J.Exp.Med.1761327-33，1992，用于血清樣品的收集)。血清或其他血液組分可以常規(guī)方式制備。例如，約200μl血清可用于在擴(kuò)增反應(yīng)中使用的DNA的提取。
一旦獲得樣品，樣品可直接使用、濃縮(例如通過(guò)離心或過(guò)濾)、純化或其組合，并且進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。例如，快速的DNA制備可利用市場(chǎng)上可買到的試劑盒進(jìn)行(如InstaGene Matrix，BioRad，Hercules，CA；NucliSens分離試劑盒，Organon Teknika，Netherlands)。在一個(gè)實(shí)例中，該DNA制備方法產(chǎn)生接近并且可經(jīng)核酸擴(kuò)增的核苷酸制備物。
核酸分子的擴(kuò)增從受試者獲得核酸樣品以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，包括來(lái)自AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR的序列，并且可從檢測(cè)前的臨床樣品擴(kuò)增ACE。在一個(gè)實(shí)例中，擴(kuò)增DNA序列。在另一個(gè)實(shí)例中，擴(kuò)增RNA序列。
可利用任何核酸擴(kuò)增方法。在一個(gè)具體的、非-限制性的實(shí)例中，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增與靜脈血栓形成有關(guān)的核酸序列。其他典型的方法包括，但不限于，RT-PCR和轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)。
來(lái)自受試者的所要擴(kuò)增的靶序列包括AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、ACE和MTHFR。在具體的實(shí)例中，所要擴(kuò)增的VT-有關(guān)靶序列基本上由，或僅由AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE組成。
擴(kuò)增反應(yīng)中可使用一對(duì)引物?？衫缬每蓹z測(cè)的放射性標(biāo)記、熒光基團(tuán)或生物素分子標(biāo)記一個(gè)或兩個(gè)引物。引物對(duì)包括上游引物(其結(jié)合對(duì)于下游引物的5′)和下游引物(其結(jié)合對(duì)于上游引物的3′)。用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物對(duì)為允許參與靜脈血栓形成的核酸擴(kuò)增的選擇性引物?？蛇x擇引物以擴(kuò)增列于表1中，或由列于表1中的那些代表的核酸分子。
另外的引物對(duì)可包含在擴(kuò)增反應(yīng)中作為內(nèi)部對(duì)照。例如，這些引物可用于擴(kuò)增″管家″核酸分子，并且用于提供合適擴(kuò)增的確認(rèn)。在另一個(gè)實(shí)例中，可構(gòu)建包含引物雜交位置的靶核酸分子并且包括在擴(kuò)增反應(yīng)器中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能很容易地鑒定用作內(nèi)部對(duì)照引物的引物對(duì)。
用于檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)序列的陣列在具體的實(shí)例中，用于檢測(cè)至少一種VT-相關(guān)基因異常的方法利用此處公開(kāi)的陣列。所述陣列可包括核酸分子。在一個(gè)實(shí)例中，該陣列包括可雜交至野生型、突變體或多態(tài)VT基因序列，如AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE的核酸寡核苷酸探針。在具體的實(shí)例中，陣列包括可識(shí)別列于表1中的143VT-有關(guān)回復(fù)突變和多態(tài)性的寡核苷酸，如以偶數(shù)編號(hào)SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287顯示的寡核苷酸探針。在其他的實(shí)例中，陣列包括可識(shí)別突變體和野生型凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、AT III、PC、PS、纖維蛋白原、MTHFR和ACE序列，如SEQ ID NO1-287的寡核苷酸探針。某些所述陣列(以及此處所述的方法)可包括未列于表1中的VT-相關(guān)分子，以及其他的序列，如識(shí)別一或多個(gè)管家基因的一或多種探針。
利用特異的寡核苷酸探針，陣列可用于檢測(cè)參與靜脈血栓形成的所擴(kuò)增序列的存在，如抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE序列。此處稱為“VT檢測(cè)陣列”的陣列用于確定受試者發(fā)展靜脈血栓形成的遺傳易感性。在一個(gè)實(shí)例中，一組寡核苷酸探針附著于固相支持物表面用于VT-有關(guān)序列的檢測(cè)，如獲自受試者的那些擴(kuò)增的核酸序列。另外，如果內(nèi)部對(duì)照核酸序列在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增(參見(jiàn)上面)，寡核苷酸探針可包括檢測(cè)這種擴(kuò)增的核酸分子的存在。
結(jié)合至陣列的寡核苷酸探針可特異性地結(jié)合擴(kuò)增反應(yīng)中所擴(kuò)增的序列(如在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下)。因此，該方法使用的序列為識(shí)別VT-相關(guān)序列，如抗凝血酶III、PC、PS、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE基因序列的寡核苷酸探針。所述序列可通過(guò)檢查不同物種的序列，以及選擇特異性退火至特定的野生型或突變體序列(如列于表1中的那些或由列于表1中的那些代表的)而不是其它序列的引物而確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定其他的VT-有關(guān)寡核苷酸分子，其可附著于固相支持物表面而用于其他所擴(kuò)增的VT-有關(guān)核酸序列的檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置利用這樣的事實(shí)，即在合適的條件下寡核苷酸與具有互補(bǔ)堿基序列的核酸分子形成堿基配對(duì)的雙鏈體。雙鏈體的穩(wěn)定性取決于許多因素，包括寡核苷酸的長(zhǎng)度、堿基組成和在其中完成雜交的溶液的組成。堿基組成對(duì)雙鏈體穩(wěn)定性的影響可通過(guò)在特定的溶液中，例如在高濃度的叔或季銨類存在時(shí)進(jìn)行雜交而降低。
雙鏈體的熱穩(wěn)定性還取決于序列之間的序列相似性程度。通過(guò)在接近期望在靶序列和結(jié)合至陣列的寡核苷酸之間形成的雙鏈體類型的預(yù)期Tm的溫度進(jìn)行雜交，可顯著降低錯(cuò)配雙鏈體形成的比率。
可選擇用于陣列的每種寡核苷酸序列的長(zhǎng)度以優(yōu)化靶VT-有關(guān)核酸序列的結(jié)合。特定篩選條件下用于特定VT-有關(guān)核酸序列的最佳長(zhǎng)度可憑經(jīng)驗(yàn)確定。因此，可優(yōu)化陣列包含的寡核苷酸序列組的每一單獨(dú)元素的長(zhǎng)度而用于篩選。在一個(gè)實(shí)例中，寡核苷酸探針從約20個(gè)至約35個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度或約25個(gè)至約40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
形成陣列的寡核苷酸探針序列可直接連接至支持物，例如通過(guò)探針的5′-或3′-端。在一個(gè)實(shí)例中，寡核苷酸通過(guò)5′端結(jié)合至固相支持物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定是否寡核苷酸的3′端或5′端的使用適合于鍵合至固相支持物。通常，3′端和5′端區(qū)域中寡核苷酸探針的內(nèi)部互補(bǔ)性決定結(jié)合至支持物?；蛘撸押塑账崽结樋赏ㄟ^(guò)非-VT-有關(guān)序列，如用作固相支持物間隔物或接頭的寡核苷酸或其他分子而附著于支持物。
在另一個(gè)實(shí)例中，陣列包括蛋白質(zhì)序列，其包括至少一種VT-相關(guān)蛋白質(zhì)如一種由列于表1的核酸分子(或包括一種所列序列或其片段的基因、cDNA或其他多核苷酸分子)編碼的，或所述蛋白質(zhì)的片段，或所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的特異性抗體。所述陣列還可以包含列于表1中的核酸(或相應(yīng)分子)的任何特定亞型。形成陣列的蛋白質(zhì)或抗體可直接連接至支持物?；蛘?，蛋白質(zhì)或抗體可通過(guò)固相支持物的間隔物或接頭附著于支持物。
可利用例如VT蛋白質(zhì)-特異結(jié)合試劑檢測(cè)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的異常，其在有些情況下經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記。因此某些實(shí)例中，檢測(cè)異常包括將來(lái)自受試者的樣品與VT蛋白質(zhì)-特異結(jié)合試劑接觸；以及檢測(cè)結(jié)合試劑是否由樣品結(jié)合并且由此測(cè)定樣品中存在的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的水平，其中相對(duì)來(lái)自不傾向于發(fā)展VT的受試者的類似樣品中測(cè)定的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)水平，或來(lái)自不具有發(fā)展VT的傾向的受試者的類似樣品中標(biāo)準(zhǔn)的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)水平，樣品中VT-相關(guān)蛋白質(zhì)水平的差異為該VT-相關(guān)分子的異常。
在具體的實(shí)例中，微陣列材料由玻璃(二氧化硅)形成。用于固相支持物的合適的二氧化硅類型包括，但不限于鋁硅酸鹽、硼硅酸鹽、二氧化硅、堿石灰、鋅二氧化鈦和熔凝硅石(例如參見(jiàn)Schena，Micraoarray Analysis.John Wiley & Sons，Inc，Hoboken，New Jersey，2003)。核酸附著至玻璃表面可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)形成自有機(jī)聚合物的表面處理。具體的實(shí)例包括，但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚異戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯乙烯醇、聚甲基戊烯、聚氯三氟乙烯、聚砜、羥基化雙軸向聚丙烯、活潑的雙軸向聚丙烯、硫醇化雙軸向聚丙烯、乙烯丙烯酸、乙烯甲基丙烯酸和其共聚物的混合物(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)No.5,985,567，此處通過(guò)引用而引入)、提供化學(xué)活性胺或醛基的有機(jī)硅烷化合物、微陣列的環(huán)氧或聚賴氨酸處理。固相支持物表面的另一個(gè)實(shí)例為聚丙烯。
通常，可用于形成固相支持物表面的材料合適的特征包括經(jīng)受表面活化后，使得在活化時(shí)支持物表面能共價(jià)附著生物分子如寡核苷酸；生物分子“原位”合成的順應(yīng)能力；為化學(xué)惰性的，使得在支持物上未由寡核苷酸占據(jù)的區(qū)域不會(huì)經(jīng)受非特異性的結(jié)合，或當(dāng)非特異性結(jié)合存在時(shí)，所述材料可很容易從該表面除去而不除去寡核苷酸。
在一個(gè)實(shí)例中，表面處理為含有胺的硅烷衍生物。核酸附著至胺表面通過(guò)DNA主鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基和帶正電荷的氨基間的相互作用產(chǎn)生(Schena，Micraoarray Analysis.John Wiley & Sons，Inc，Hoboken，New Jersey，2003，此處通過(guò)引用引入)。在另一個(gè)實(shí)例中，反應(yīng)性的醛基用作表面處理。附著至醛表面通過(guò)5′-胺基或氨基接頭添加至目的DNA而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)胺接頭上的非鍵電子對(duì)用作攻擊醛基陽(yáng)性的碳原子(Id.)的親核試劑時(shí)產(chǎn)生結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明可采用多種陣列形式。一個(gè)實(shí)例包括寡核苷酸帶的線性陣列，本領(lǐng)域中泛指量尺(dipstick)。另一種合適的形式包括獨(dú)立單元的平面模式(如64乘64陣列的4096正方形)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，包括但不限于槽(矩形的)和環(huán)狀陣列的其他陣列形式同樣適用(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)No.5,981,185，此處通過(guò)引用引入)。在一個(gè)實(shí)例中，陣列在聚合物介質(zhì)上形成，其為纖維、薄膜或膠片。有機(jī)聚合物介質(zhì)的實(shí)例為具有相當(dāng)于約1mil.(0.001英寸)至約20mil.厚度的聚丙烯片層，雖然薄膜的該厚度不是臨界的并且可在相當(dāng)寬的范圍內(nèi)變化。此時(shí)特別公開(kāi)用于陣列制備的為雙軸向聚丙烯(BOPP)薄膜；除了其耐用性外，BOPP薄膜呈現(xiàn)低本底的熒光。在具體的實(shí)例中，陣列為固相的、基于等位基因特異的寡核苷酸(ASO)的核酸陣列。
本發(fā)明的陣列形式可包括于各種不同類型的形式中?！靶问健卑ü滔嘀С治锟筛街娜魏涡问?，如微量滴定板、試管、無(wú)機(jī)片層、量尺等等。例如，當(dāng)固相支持物為聚丙烯纖維時(shí)，一或多種聚丙烯纖維可附著至塑料量尺類型的裝置；聚丙烯薄膜可附著至載玻片。具體的形式本身是不重要的。所必需的為固相支持物可附著至此而不影響固相支持物或其上吸收的任何生物聚合物的功能性能，以及形式(如量尺或載玻片)對(duì)裝置導(dǎo)入其中的任何材料(如臨床樣品和雜交溶液)是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的陣列可通過(guò)各種方法制備。在一個(gè)實(shí)例中，寡核苷酸或蛋白質(zhì)序列分別合成并且隨后附著于固相支持物(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)No.6,013,789，此處通過(guò)引用引入)。在另一個(gè)實(shí)例中，序列直接合成在支持物上以提供所想要的陣列(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)No.5,554,501，此處通過(guò)引用引入)。用于將寡核苷酸和蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)至固相支持物以及用于將寡核苷酸或蛋白質(zhì)直接合成在支持物上的合適的方法為本領(lǐng)域的工作人員所知；合適方法的概要可在Matson等.，Anal.Biochem.217306-10，1994中找到。在一個(gè)實(shí)例中，寡核苷酸利用常規(guī)的用于將寡核苷酸制備于固相支持物上的化學(xué)技術(shù)合成在支持物上(如參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO85/01051和WO89/10977，或美國(guó)專利5,554,501，此處通過(guò)引用引入)。
合適的陣列可利用自動(dòng)化方法通過(guò)以預(yù)定模式設(shè)定四種堿基的前體而在陣列的單元中合成寡核苷酸而產(chǎn)生。簡(jiǎn)要地，采用多-通道自動(dòng)的化學(xué)輸送系統(tǒng)在穿過(guò)基底的平行排(以編號(hào)對(duì)應(yīng)輸送系統(tǒng)中的通道編號(hào))產(chǎn)生寡核苷酸探針群。隨著在第一個(gè)方向寡核苷酸合成的完成，基底可隨后旋轉(zhuǎn)90°以允許在第二(2°)組的排內(nèi)進(jìn)行合成，其現(xiàn)在垂直于第一組。該方法產(chǎn)生多通道的陣列，其交叉產(chǎn)生多個(gè)獨(dú)立單元。
在具體的實(shí)例中，陣列上的寡核苷酸探針包括一或多種標(biāo)記物，其允許寡核苷酸探針靶序列雜交復(fù)合物的檢測(cè)。
核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)獲自受試者的核酸和蛋白質(zhì)可包含與靜脈血栓形成有關(guān)的一或多個(gè)基因中(如列于表1中的那些)一或多處插入、缺失、取代或其組合?？蓹z測(cè)所述突變或多態(tài)性(或兩者)以確定受試者是否具有發(fā)展靜脈血栓形成的遺傳素因?？衫脵z測(cè)核酸分子或蛋白質(zhì)的任何方法，如物理的或功能性的測(cè)定法。
用于標(biāo)記核酸分子和蛋白質(zhì)，而使得其可檢測(cè)的方法是眾所周知的。所述標(biāo)記物的實(shí)例包括非-放射性標(biāo)記和放射性標(biāo)記。非-放射性標(biāo)記包括，但不限于酶、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物(如FITC、Cy3和Cy5)、金屬絡(luò)合物、半抗原、酶、比色試劑、染料或其組合。放射性標(biāo)記包括，但不限于125I和35S。例如，本領(lǐng)域已知的放射性和熒光標(biāo)記方法，以及其他的方法適合與本發(fā)明一起使用。在一個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記用于擴(kuò)增受試者核酸的引物(如用生物素、放射性標(biāo)記或熒光基團(tuán))。在另一個(gè)實(shí)例中，擴(kuò)增的核酸樣品為末端-標(biāo)記的來(lái)形成經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增材料。例如，擴(kuò)增的核酸分子可通過(guò)將標(biāo)記的核苷酸包含入擴(kuò)增反應(yīng)中而標(biāo)記。在具體的實(shí)例中，標(biāo)記獲自受試者的蛋白質(zhì)并且隨后例如通過(guò)將其施加到陣列而進(jìn)行分析。
與靜脈血栓形成有關(guān)的擴(kuò)增的核酸分子在合適的雜交條件下施加至VT檢測(cè)陣列以形成雜交復(fù)合物。在具體的實(shí)例中，擴(kuò)增的核酸分子含有標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)例中，預(yù)處理的有機(jī)化合物溶液，即包含有機(jī)化合物或熱水的溶液可在雜交之前施加(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,985,567，此處通過(guò)引用引入)。
用于給定的陣列和靶材料組合的雜交條件可以接近所期望雙鏈體Tm的經(jīng)驗(yàn)方式常規(guī)優(yōu)化，由此最大化該方法的區(qū)別能力。結(jié)合存在于其中的陣列，如單元中位置的識(shí)別允許存在于所擴(kuò)增材料中的與靜脈血栓形成有關(guān)序列的快速和準(zhǔn)確的鑒定(見(jiàn)下文)。
選擇雜交條件以允許匹配和錯(cuò)配寡核苷酸間的區(qū)別。可選擇雜交條件對(duì)應(yīng)于已知適合用于雜交篩選的標(biāo)準(zhǔn)方法中的條件并且隨后優(yōu)化而與本發(fā)明的陣列一起使用。例如，將對(duì)該陣列用于其他靶標(biāo)的用途而調(diào)整適于一種類型靶標(biāo)雜交的條件。尤其，控制溫度以基本上消除除了完全互補(bǔ)的VT-有關(guān)突變體序列的野生型外序列間雙鏈體的形成。可采用各種已知的雜交溶劑，該選擇取決于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的考慮(參見(jiàn)美國(guó)專利5,981,185，此處通過(guò)引用引入)。
一旦所擴(kuò)增的與靜脈血栓形成有關(guān)的核酸分子與VT檢測(cè)陣列中存在的寡核苷酸雜交，可例如通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物而分析雜交復(fù)合物的存在。
之前已描述了在寡核苷酸探針陣列中檢測(cè)雜交復(fù)合物(參見(jiàn)美國(guó)專利5,985,567，此處通過(guò)引用引入)。在一個(gè)實(shí)例中，檢測(cè)包括檢測(cè)寡核苷酸、所擴(kuò)增的序列或兩者上存在的一或多種標(biāo)記物。在具體的實(shí)例中，顯影包括應(yīng)用緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液為檸檬酸鈉鹽、磷酸鈉鹽、氯化四甲銨、乙二胺四乙酸中的檸檬酸鈉鹽、十二烷基磺酸鈉中的檸檬酸鈉鹽、乙二胺四乙酸中的磷酸鈉鹽、十二烷基磺酸鈉中的磷酸鈉鹽、乙二胺四乙酸中的氯化四甲銨、十二烷基磺酸鈉中的氯化四甲銨或其組合。然而，也可利用其他合適的緩沖溶液。
檢測(cè)可進(jìn)一步包括用偶聯(lián)溶液處理雜交的復(fù)合物以影響雜交的復(fù)合物與檢測(cè)標(biāo)記物的結(jié)合或偶聯(lián)，以及用檢測(cè)試劑處理該偶聯(lián)的、雜交的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)例中，偶聯(lián)溶液包括鏈親和素堿性磷酸酶、親和素堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化酶。偶聯(lián)溶液特定的、非-限制性的實(shí)例包括鏈親和素堿性磷酸酶、親和素堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化酶。偶聯(lián)的、雜交的復(fù)合物可用檢測(cè)試劑處理。在一個(gè)實(shí)例中，檢測(cè)試劑包括酶標(biāo)記的熒光試劑或測(cè)熱試劑。在一個(gè)特定的非-限制性的實(shí)例中，檢測(cè)試劑為來(lái)自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)的酶-標(biāo)記的熒光試劑(ELF)。雜交的復(fù)合物可隨后置于檢測(cè)裝置，如紫外線(UV)透照器(由UVP，Inc.of Upland，CA制造)上。顯示信號(hào)并且可用記錄裝置記錄提高的信號(hào)強(qiáng)度，如電荷耦合裝置(CCD)照相機(jī)(由Photometrics，Inc.of Tucson，AZ制造)。在具體的實(shí)例中，當(dāng)利用放射性標(biāo)記時(shí)不進(jìn)行這些步驟。
在具體的實(shí)例中，該方法進(jìn)一步包括定量，例如通過(guò)確定雜交的量。
試劑盒本發(fā)明提供可用于確定受試者，如另外健康的人受試者是否具有靜脈血栓形成遺傳傾向性。所述試劑盒允許確定受試者是否在與靜脈血栓形成有關(guān)的序列中(包括列于表1的那些)具有一或多處遺傳突變或多態(tài)性。
所公開(kāi)的試劑盒包括結(jié)合分子，如選擇性雜交至VT-相關(guān)分子(如突變體或野生型核酸分子)的寡核苷酸探針，其為試劑盒的靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)例中，試劑盒包括以SEQ NO1-287或其亞組，如偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287或奇數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO1-285和SEQ ID NO286所示的寡核苷酸探針。在另一個(gè)實(shí)例中，試劑盒包括以SEQ ID NO1287所示的至少20種探針，如SEQ ID NO1-287中所示的至少50種、至少75種、至少100種、至少125種、至少150種、至少175種、至少200種、至少225種或至少250種探針。當(dāng)然也可利用以SEQ ID NO1-287所示的全長(zhǎng)探針的片段，如包括任何SEQ ID NO1-287的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，如任何SEQ ID NO1-287的至少16個(gè)連續(xù)核苷酸、至少17個(gè)連續(xù)核苷酸、至少18個(gè)連續(xù)核苷酸、至少19個(gè)連續(xù)核苷酸、如至少20個(gè)連續(xù)核苷酸、如至少21個(gè)連續(xù)核苷酸、如至少22個(gè)連續(xù)核苷酸、如至少23個(gè)連續(xù)核苷酸或如至少24個(gè)連續(xù)核苷酸。
在具體的實(shí)例中，試劑盒包括能結(jié)合野生型VT-相關(guān)蛋白質(zhì)或突變的或多態(tài)的蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體具有區(qū)分野生型和突變體或多態(tài)的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的能力。
試劑盒可進(jìn)一步包括一或多種緩沖溶液、用于顯影目的信號(hào)的偶聯(lián)溶液或用于檢測(cè)目的信號(hào)的檢測(cè)試劑，每種在分開(kāi)的包裝，如容器中。在另一個(gè)實(shí)例中，試劑盒包括用作陽(yáng)性對(duì)照的和VT檢測(cè)陣列雜交的多個(gè)VT-相關(guān)靶核酸序列。靶核酸序列可包括寡核苷酸如DNA、RNA和肽-核酸，或可包括PCR片段。
靜脈血栓形成的預(yù)防治療本發(fā)明還提供了避免或降低確定為遺傳傾向于發(fā)展靜脈血栓形成的受試者中靜脈血栓形成發(fā)病率的方法。例如，如果利用上述的篩選方法檢測(cè)到受試者中至少一種VT-相關(guān)分子的突變或多態(tài)性，則選擇治療以避免或降低靜脈血栓形成的發(fā)病率或延緩靜脈血栓形成的發(fā)病。受試者隨后可根據(jù)該選擇而治療，例如通過(guò)一或多種抗凝血試劑的給藥。在一些實(shí)例中，根據(jù)一或多種VT-相關(guān)分子受試者的分布分析，所選擇的治療對(duì)于該受試者是特異性的或經(jīng)調(diào)整的。
本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下列非-限制性的實(shí)施例舉例說(shuō)明。
實(shí)施例1
與靜脈血栓形成有關(guān)的突變和多態(tài)性表1描述了用于設(shè)計(jì)陣列的VT-相關(guān)核酸和蛋白質(zhì)序列，該陣列允許篩選八個(gè)不同基因中目前所有已知的143種靜脈血栓形成相關(guān)的回復(fù)突變和多態(tài)性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解還可利用目前未鑒定的另外的回復(fù)VT-相關(guān)突變和多態(tài)性。針對(duì)突變/多態(tài)性的每個(gè)潛在位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩種寡核苷酸探針(參見(jiàn)實(shí)施例3)。
表1與靜脈血栓形成有關(guān)的突變和多態(tài)性。


*雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定其他生物體對(duì)應(yīng)的核苷酸或氨基酸，核苷酸或氨基酸編號(hào)指人序列。
實(shí)施例2靜脈血栓形成預(yù)測(cè)的統(tǒng)計(jì)分析該實(shí)施例表明通過(guò)在鑒定處于發(fā)展VT很高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中同時(shí)評(píng)估143種等位基因，MERT提供了高數(shù)值的臨床有效性，即使每種等位基因?qū)︼L(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)較小并且不足以引起VT。
為了在統(tǒng)計(jì)學(xué)上證明該公開(kāi)的方法可預(yù)測(cè)健康受試者發(fā)展靜脈血栓形成的概率，利用下列方法。如下所述的結(jié)果表明靜脈血栓形成的疾病預(yù)測(cè)通過(guò)同時(shí)考慮多個(gè)素因性的遺傳因素而得到很大提高。為了證明多發(fā)性靜脈血栓形成(VT)相關(guān)易感性基因缺陷的并行篩選如何提高發(fā)展靜脈血栓形成的預(yù)測(cè)，通過(guò)邏輯回歸計(jì)算每種VT相關(guān)易感性基因檢驗(yàn)的概率比并且隨后VT相關(guān)易感性基因檢驗(yàn)組的組合概率比(LR)僅作為假定每個(gè)檢驗(yàn)獨(dú)立的個(gè)體檢驗(yàn)的概率比(LR)乘積而計(jì)算。
為了計(jì)算，選擇在對(duì)照受試者和未經(jīng)過(guò)選擇的VT患者中均具有確定的發(fā)病率的八個(gè)VT相關(guān)基因中的10個(gè)VT相關(guān)易感性等位基因。
利用在之前報(bào)道的與VT相關(guān)遺傳易感性有關(guān)的不同種族人群中進(jìn)行的病例-對(duì)照研究的數(shù)據(jù)，相關(guān)等位基因頻率源自AT III、蛋白質(zhì)C和蛋白質(zhì)S缺陷、纖維蛋白原Thr312Ala、FV Leiden(G1691A)、FV G1628A、FV A4070G(R2等位基因)、凝血酶原G20210A、MTHFRC677G和ACE DD變體(Seligsohn and Lubetsky，N.Engl.J.Med.3441222-31，2001；Heijboer等.N.Engl.J.Med.3231512-6，1990；Pabinger等.，Blood.Coagul.Fibrinolysis 3547-53，1992；Melissari等.，Blood.Coagul.Fibrinolysis 3749-58，1992；Bombeli等.Am.J.Hematol.70126-32，2002；Salomon等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19511-8，1999；Harper等.，Br.J.Haemotol.77360-364，1991；Tait等.Br.J.Haematol.87106-12，1994；Arruda等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997；Junker等.，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.192568-72，1999；Heller等.，Circulation.1081362-7，2003；Jerrard-Dunne等.Stroke.341821-7，2003；Patel等.Thromb.Haemost.90835-8，2003；Shen等.Thromb.Res.99447-52，2000；Sakata等.J.Tlaromb.Hemost.2528-30，2004；Lee等.Ann.Aead.Med.Singapore.31761-4，2002；Liu等.Thromb.Haemost.71416-9，1994；Suehisa等.Blood.Coagul.Fibrinolysis.1295-9，2001；Chen等.Ann.Hematol.82114-7，2003；Ho等.Am.J.Hematol.6374-8，2000；Miletich等.，N.Engl.J.Med.317991-6，1987；Horellou等.，BMJ 289；1285-1287，1984；Gladson等.，Thromb.Haemost.5918-22，1988；Tait等.，Thromb.Haemost.7387-93，1995；Dykes等.，Br.J.Haematol.113636-41；2001；Carter等.，Blood.961177-9，2000；Liu Y等.，J.Med.Genet.3831.5，2001；De Stefano等.Semin.Thromb.Hemost.24367-79，1998；Benson等.Thromb.Haemost.861188-92，2001；Ehrenforth等.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19276-80，1999；Leroyer等.Thromb.Haemost.8049-51，1998；Brown等.Br.J.Haematol.98907-9，1997；Arruda等.Thromb.Haemost.781430-3，1997；de Moerloose等.，Thromb.Haemost.80239-41，1998；Dowling等.J.Thromb.Hemost.180-7，2003；Rees等.Br.J.Haematol.105564-6，1999；Helley等.Hum.Genet.100245-8，1997；Le等.Clin.Genet.57296-303，2000；Lu等.，Thromb.Res 1077-12，2002；Dilley等.，Am.J.Epidemiol.14730-5，1998；Faisel等.，Eur.J.Hum.Genet.12187-91，2004；Dogulu等.，Thromb.Res.111389-95，2003；Hiyoshi等.Thromb.Haemost.80705-6，1998；Watanabe等.Thromb.Haemost.861594-5，2001；Alhenc-Gelas等.Thromb.Haemost.81193-97，1999；Poort等.Blood 883698-703，1996；Hillarp等.Thromb.Haemost.78990-2，1997；Ferraresi等.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172418-22，1997；Corral等.Br.J.Haematol.99304-307，1997；Hainaut等.Acta Clin Belg 53344-348，1998；Cumming等.Br.J.Haematol.98353-355，1997；Souto等.Thromb.Haemost.80366-9，1998；Eichinger等.Thromb.Haemost.8114-7，1999；Tosetto等.Thromb.Haemost.821395-98，1999；Ridker等.Circulation.99999-1004，1999；Margaglione等.，Thromb.Haemost.79907-11，1998；Dilley等.，J.Lab.Clin.Med 132452-5，1998；Howard等.Blood 911092，1998；Zheng等.，Br.J.Haematol.109870-4，2000；Lin等.，Thromb.Res.9789-94，2000；Fatini等.，Eur.J.Clin.Invest.33642-7，2003；and Hooper等.，Am.J.Hemato.701-8，2002)(表2)。
表2對(duì)照受試者和未經(jīng)過(guò)選擇的VT患者中遺傳血栓形成傾向的頻率

I白種人受試者II亞洲人受試者III來(lái)自非洲、北美洲、亞洲、澳大拉西亞、拉丁美洲和中東以及因紐特人受試者的非-歐洲受試者。
IV非洲受試者V來(lái)自北美洲、拉丁美洲、亞洲和太平洋島嶼的非-歐洲受試者。
VI美裔非洲人受試者通過(guò)邏輯回歸進(jìn)行LR的計(jì)算。通過(guò)將從之前報(bào)道的不同種族人群中有關(guān)VT遺傳易感性病例對(duì)照研究取回的數(shù)據(jù)處理為風(fēng)險(xiǎn)機(jī)會(huì)比率的有效評(píng)估，每一等位基因的LR的陽(yáng)性檢驗(yàn)通過(guò)如之前所述獲得的結(jié)果取冪而計(jì)算(Albert，Clin.Chem..281113-9，1982；McCullagh和Nelder，Chapman and Hall，London，1989；Yang等.，Am.J.Hum.Genet.，72636-49，2003)。
測(cè)定具有每一遺傳檢驗(yàn)(亦稱每一遺傳檢驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)等位基因-陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體的靜脈血栓形成的后驗(yàn)概率(發(fā)展靜脈血栓形成的概率)。
每一靜脈血栓形成相關(guān)易感性基因檢驗(yàn)的所計(jì)算的概率比和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值在表3中表示。
表3.對(duì)于健康受試者中發(fā)展VT的用MERT的單個(gè)易感性基因和多個(gè)遺傳篩選的概率比和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

自種人群；亞洲人群；*非洲人群隨后，假定八個(gè)不同基因中每一種遺傳缺陷的作用是獨(dú)立的并且所有的相互作用是單純相乘的，則十個(gè)VT相關(guān)遺傳易感性檢驗(yàn)組的LR作為個(gè)體檢驗(yàn)結(jié)果概率比的乘積而計(jì)算。
如表3中所示，盡管每種遺傳檢驗(yàn)提供了關(guān)于發(fā)展靜脈血栓形成概率的有限的預(yù)測(cè)信息(每一單獨(dú)檢驗(yàn)的疾病的后驗(yàn)概率范圍為從0.12％至2.5％)，當(dāng)利用本發(fā)明公開(kāi)的方法對(duì)白種人群體未經(jīng)過(guò)選擇的患者評(píng)估時(shí)，存在的靜脈血栓形成后驗(yàn)概率提高至99.7％，亞洲人提高至85.1％，以及非洲人提高至88.7％，提高了＞30倍。
實(shí)施例3用于檢測(cè)靜脈血栓形成易感性的陣列對(duì)突變/多態(tài)性的每個(gè)潛在位點(diǎn)(表1)，設(shè)計(jì)兩種寡核苷酸探針(SEQ ID NO1-287)。第一種與野生型序列互補(bǔ)(SEQ ID NO1-285的奇數(shù)編號(hào)和SEQ ID NO286)并且第二種與突變序列互補(bǔ)(SEQ IDNO2-284的偶數(shù)編號(hào)和SEQ ID NO287)。例如，SEQ ID NO1與野生型AT III序列互補(bǔ)，并且SEQ ID NO2與突變體AT III序列互補(bǔ)，其可用于檢測(cè)核苷酸2770位“T”插入的存在。所公開(kāi)的寡核苷酸探針可進(jìn)一步包括一或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物，以允許探針和靶序列間雜交信號(hào)的檢測(cè)。
雜交信號(hào)“損失”和“獲得”的編譯將揭示個(gè)體關(guān)于143種已知的VT-相關(guān)回復(fù)缺陷的遺傳狀態(tài)。
實(shí)施例4基于核酸的分析此處提供的VT-相關(guān)核酸分子可用于由于VT-相關(guān)核酸分子相比野生型核酸分子的多態(tài)性/突變而造成的靜脈血栓形成傾向的遺傳檢驗(yàn)方法中。對(duì)于所述方法，分析受試者生物樣品在VT-相關(guān)核酸分子(如列于表1中的那些)中的多態(tài)性或突變(或兩者)。合適的生物樣品包括含有獲自受試者細(xì)胞的基因組DNA或RNA(包括mRNA)的樣品，如存在于外周血、尿、唾液、活檢組織、外科樣本、羊膜穿刺樣品和尸檢材料中的那些。
一或多種VT-相關(guān)核酸分子(如列于表1中的那些)中具有多態(tài)性/突變的生物樣品的檢測(cè)可通過(guò)下列方法完成，如利用等位基因特異的寡核苷酸的雜交(ASO)(Wallace等.，CSHL Syrup.Quant.Biol.51257-61，1986)、直接的DNA測(cè)序(Church和Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811991-1995，1988)、限制性內(nèi)切酶的利用(Flavell等.，Cell 1525，1978；Geever等.，1981)、在含有變性試劑的凝膠中電泳遷移率基礎(chǔ)上的差別(Myers和Maniatis，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51275-84，1986)、RNase保護(hù)(Myers等.，Science 2301242，1985)、化學(xué)裂解(Cotton等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397-401，1985)和連接酶-介導(dǎo)的檢測(cè)方法(Landegren等.，Science 2411077，1988)。
野生型或突變VT-相關(guān)序列的特異性寡核苷酸可利用市售獲得的的機(jī)器化學(xué)合成?？呻S后標(biāo)記這些寡核苷酸，例如用放射性同位素(如32p)或用非放射性的標(biāo)記物如生物素(Ward和Langer等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786633-6657，1981)或熒光基團(tuán)，并且雜交至通過(guò)點(diǎn)-印跡或電泳后從凝膠轉(zhuǎn)移而固定在薄膜或其他固相支持物上的個(gè)體DNA樣品。這些特異的序列例如通過(guò)放射自顯影法或熒光(Landegren等.，Science 242229-237，1989)或比色反應(yīng)(Gebeyehu等.，NucleicAcids Res.154513-4534，1987)顯影。利用野生型等位基因特異的ASO，無(wú)雜交將表明基因特定區(qū)域中的突變或多態(tài)性。相比之下，如果突變體等位基因特異的ASO雜交至臨床樣品則將表明由ASO限定的區(qū)域中突變或多態(tài)性的存在。
實(shí)施例5基于蛋白質(zhì)的分析該實(shí)施例描述了可用于檢測(cè)VT-相關(guān)蛋白量的缺陷，或檢測(cè)氨基酸序列本身的改變的方法。VT相關(guān)蛋白質(zhì)的序列可用于靜脈血栓形成傾向遺傳檢驗(yàn)的方法中，由于VT-相關(guān)蛋白質(zhì)相比野生型蛋白質(zhì)的多態(tài)性或突變(或兩者)造成。對(duì)于所述方法，測(cè)定受試者生物樣品在VT-相關(guān)蛋白質(zhì)中的多態(tài)性或突變(如列于表1中的那些)。合適的生物樣品包括含有獲自受試者細(xì)胞的蛋白質(zhì)的樣品，如存在于外周血、尿、唾液、活檢組織、外科樣本、羊膜穿刺樣品和尸檢材料中的那些。
受試者中一或多種VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的量的降低表明受試者具有提高的發(fā)展VT的易感性。同樣，相比野生型蛋白質(zhì)，VT-相關(guān)蛋白質(zhì)中一或多處突變或多態(tài)性的存在表明受試者具有提高的發(fā)展VT的易感性。
相比正常受試者中(如不傾向于發(fā)展VT的受試者)所表示的，降低的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)水平的測(cè)定為VT-相關(guān)核酸突變或多態(tài)性的存在通過(guò)以上所列方法直接測(cè)定的可選擇的或輔助的方法。特定VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的特異性抗體的可獲得性將促進(jìn)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的大量免疫測(cè)定方法中的一種檢測(cè)和細(xì)胞定量，如Harlow和Lane(Antibodies，A Laboratory Manual，CSHL，New York，1988)中介紹的。構(gòu)建所述抗體的方法為本領(lǐng)域已知的。
相比野生型VT-相關(guān)蛋白質(zhì)，VT-相關(guān)蛋白質(zhì)中一或多處突變或多態(tài)性存在的測(cè)定為VT-相關(guān)核酸突變或多態(tài)性的存在通過(guò)以上所列方法直接測(cè)定的另一種可選擇的或輔助的方法?？衫帽绢I(lǐng)域已知的方法制備能區(qū)分突變體或多態(tài)的蛋白質(zhì)和野生型蛋白質(zhì)的抗體。
任何標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定法形式(如ELISA、蛋白質(zhì)印跡或RIA測(cè)定法)可用于測(cè)定VT-相關(guān)多肽或蛋白質(zhì)的水平，以及檢測(cè)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)中的突變或多態(tài)性。相比野生型(正常的)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的水平，VT-相關(guān)多肽水平的降低為發(fā)展VT傾向的指示。同樣，一或多處突變體或多態(tài)的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的存在為發(fā)展VT傾向的指示。免疫組織化學(xué)技術(shù)也可用于VT-相關(guān)多肽或蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定量。例如，可從受試者獲得組織樣品，并且利用合適的VT-相關(guān)蛋白質(zhì)特異結(jié)合試劑以及任何標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)系統(tǒng)(如包括偶聯(lián)至辣根過(guò)氧化酶的二抗的那些)對(duì)野生型或多態(tài)的或突變體VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的存在而染色切片。關(guān)于所述技術(shù)的常規(guī)指導(dǎo)可參見(jiàn)Bancroft和Stevens(Theory and Practice ofHistological Techniques，Churchill Livingstone，1982)以及Ausubel等.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，1998)。
為了定量VT-相關(guān)蛋白質(zhì)，可利用包括細(xì)胞蛋白質(zhì)的受試者的生物樣品。VT相關(guān)蛋白質(zhì)的定量可通過(guò)免疫測(cè)定法以及將所述量與來(lái)自不具有發(fā)展VT的遺傳傾向的受試者細(xì)胞中測(cè)定的蛋白質(zhì)水平作比較而實(shí)現(xiàn)。相比正常人細(xì)胞中測(cè)定的相同VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的量，受試者細(xì)胞中一或多種VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的量的顯著降低通常為約30％或更大的差異。一或多種VT-相關(guān)蛋白質(zhì)的顯著低表達(dá)可以為發(fā)展VT的遺傳傾向性的指示。
實(shí)施例6試劑盒提供試劑盒以確定受試者是否具有VT-相關(guān)核酸序列的一或多種多態(tài)性或突變(如含有VT檢測(cè)陣列的試劑盒)。還提供包含檢測(cè)陣列上的寡核苷酸和來(lái)自受試者的所擴(kuò)增的VT相關(guān)核酸間形成的雜交復(fù)合物所需試劑的試劑盒。這些試劑盒每種可含有說(shuō)明書(shū)，例如提供相比已確定值(如實(shí)驗(yàn)測(cè)定的)的標(biāo)定曲線或圖表的說(shuō)明書(shū)。
在一個(gè)實(shí)例中，試劑盒包含能擴(kuò)增VT-相關(guān)核酸分子，如列于表1中的那些分子的引物。在具體的實(shí)例中，引物懸浮在水溶液中或作為冷凍干燥的或凍干的粉劑而提供。其中提供引物的容器可以是任何常規(guī)容器，其能保持所提供的形式，例如，微量管、安瓿瓶或瓶子。在一些應(yīng)用中，在獨(dú)立的、通常一次性的管或?qū)Φ鹊娜萜髦幸灶A(yù)定的單次用量提供引物對(duì)。
試劑盒中提供的每種引物的量可以是任何量，例如取決于產(chǎn)品針對(duì)的市場(chǎng)。例如，如果試劑盒適于研究或臨床使用，所提供的每種寡核苷酸引物的量可能為足以啟動(dòng)幾個(gè)體外擴(kuò)增反應(yīng)的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知適于在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物量。常規(guī)指導(dǎo)可例如在Innis等.(PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990)，Sambrook等.(In Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Ausubel等.(In Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，1998)中找到。
在具體的實(shí)例中，試劑盒包含具有識(shí)別野生型、突變體或多態(tài)的VT-相關(guān)序列(如列于表1中的那些)的寡核苷酸的陣列。該陣列可包含例如用作陰性或陽(yáng)性對(duì)照的其他寡核苷酸。識(shí)別野生型和突變體序列的寡核苷酸可在相同的陣列上或不同的陣列上。特定的陣列在實(shí)施例3中公開(kāi)。例如，試劑盒可包含SEQ ID NO1-287中所示的寡核苷酸，或其亞型，如SEQ ID NO1-287中所示寡核苷酸的至少10種，例如SEQ ID NO 1-287中所示寡核苷酸的至少20種、至少50種、至少100種、至少143種或甚至至少250種。在特定的實(shí)例中，陣列包含奇數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO1-285(即SEQ ID NO1、3、5、7等等)以及在一些實(shí)例中還包含SEQ ID NO286，或偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO2-284(即SEQ ID NO2、4、6、8等等)以及在一些實(shí)例中還包含SEQ ID NO287。然而，兩種所述陣列可包含在單個(gè)試劑盒中。
在一些實(shí)例中，試劑盒進(jìn)一步包含進(jìn)行雜交和檢測(cè)反應(yīng)所需的試劑，例如包括合適的緩沖液。還可包含書(shū)面說(shuō)明書(shū)。
還提供用于檢測(cè)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的試劑盒，例如由列于表1中的核酸分子所編碼蛋白質(zhì)的低表達(dá)。所述試劑盒包含一或多種野生型或突變體AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE蛋白(全長(zhǎng)的、片段或融合蛋白)或特異結(jié)合試劑(如多克隆或單克隆抗體或抗體片段)，并且可包含至少一種對(duì)照。VT-相關(guān)蛋白質(zhì)特異結(jié)合試劑和對(duì)照可包含在單獨(dú)的容器中。該試劑盒還可包含用于檢測(cè)VT-相關(guān)蛋白質(zhì)試劑復(fù)合物的工具，例如該試劑經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記。如果可檢測(cè)的試劑未標(biāo)記，其可由二抗或蛋白A檢測(cè)，例如其中的任何一個(gè)還可在一或多種分開(kāi)的容器中在一些試劑盒中提供。所述技術(shù)是眾所周知的。
一些試劑盒中的另外組分包括進(jìn)行測(cè)定法的說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)允許檢驗(yàn)者確定VT-相關(guān)的表達(dá)水平相比對(duì)照樣品是否降低了。反應(yīng)容器和輔助試劑如生色團(tuán)、緩沖液、酶等等也可包含在試劑盒中。
鑒于本發(fā)明的原理可應(yīng)用許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到舉例說(shuō)明的實(shí)施方案僅是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例而不應(yīng)該視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。相反，本發(fā)明范圍應(yīng)由下列權(quán)利要求限定。我們因此要求本發(fā)明所有落入這些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)的權(quán)利。
序列表<110>美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部(The Government of the United States of Americaas Represent by the Secretary of the Department of Health and Human Services)<120>發(fā)展用于血栓形成傾向識(shí)別的方法(MERT)(Method evolved for recognition of thrombophilia(MERT))<130>SCT063374-66<150>60/537,463<151>2004-01-15<160>287<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>oligonucleotide probe<400>287gcctatacag tcacttttat gtggt2權(quán)利要求
1.檢測(cè)受試者靜脈血栓形成(VT)遺傳傾向性的方法，包括確定受試者在至少八個(gè)VT-相關(guān)分子中是否具有一或多處突變或多態(tài)性，其中該至少八個(gè)靜脈血栓形成分子包括抗凝血酶III(AT III)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和血管緊張素1-轉(zhuǎn)化酶(ACE)，并且其中一或多處突變或多態(tài)性的存在表明受試者具有靜脈血栓形成的遺傳傾向性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中一或多處突變或多態(tài)性包括列于表1中的一或多處突變或多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括確定受試者在列于表1中的突變或多態(tài)性的至少10種中是否具有一或多處突變或多態(tài)性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括確定受試者在列于表1中的突變或多態(tài)性的至少50種中是否具有一或多處突變或多態(tài)性。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括確定受試者在列于表1中的突變或多態(tài)性的至少143種中是否具有一或多處突變或多態(tài)性。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括確定受試者在列于表1中的突變或多態(tài)性的不超過(guò)10種中是否具有一或多處突變或多態(tài)性。
7.權(quán)利要求2的方法，其中一或多處突變或多態(tài)性包括AT III缺陷、PC缺陷、PS缺陷、纖維蛋白原Thr312Ala多態(tài)性、FV Leiden(G1691A)多態(tài)性、FV G1628多態(tài)性、FV A4070G多態(tài)性、凝血酶原G20210A多態(tài)性、MTHFR C677T和ACE內(nèi)含子16，288bp插入/缺失多態(tài)性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該方法提供了白種人中至少98％、亞洲人中至少85％以及非洲人中至少87％發(fā)展VT的可能性。
9.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括確定受試者是否在至少八種VT-相關(guān)分子中具有一或多處突變或多態(tài)性。
10.權(quán)利要求1的方法，其中該至少八種VT-相關(guān)分子包括核酸分子。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該核酸分子擴(kuò)增自受試者，由此產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，并且其中該擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)一或多處突變或多態(tài)性的寡核苷酸探針雜交。
12.權(quán)利要求11的方法，其中雜交寡核苷酸包括將擴(kuò)增產(chǎn)物與寡核苷酸探針溫育足以允許擴(kuò)增產(chǎn)物和寡核苷酸探針之間雜交的時(shí)間，由此形成擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物；以及分析擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否在VT-相關(guān)核酸中包括一或多處突變或多態(tài)性，其中一或多處突變或多態(tài)性的存在表明受試者具有VT遺傳傾向性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中分析擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物包括確定核酸雜交物的量，以及其中相比雜交至相應(yīng)的野生型序列的量，雜交至一或多處突變序列的量更大表明受試者具有VT遺傳傾向性。
14.權(quán)利要求12的方法，其中分析擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物包括檢測(cè)復(fù)合物以及對(duì)其進(jìn)行定量。
15.權(quán)利要求11的方法，其中寡核苷酸探針存在于陣列基底上。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述陣列進(jìn)一步包括與野生型VT-相關(guān)核酸分子互補(bǔ)的寡核苷酸探針。
17.權(quán)利要求16的方法，其中野生型VT-相關(guān)核酸分子包括與野生型AT III、野生型蛋白質(zhì)C、野生型蛋白質(zhì)S、野生型纖維蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE核酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少八種VT-相關(guān)分子由來(lái)自AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的序列組成。
19.權(quán)利要求1的方法，其中該受試者在可能處于發(fā)展靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的組中。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該受試者已懷孕、在產(chǎn)后期、正使用口服避孕藥或激素替代治療、已有先前的血栓形成病史、已有或?qū)⒔?jīng)受長(zhǎng)時(shí)間的固定術(shù)、患有骨髓增生性疾病、患有惡性腫瘤、已有或?qū)⑦M(jìn)行手術(shù)、具有骨折、在老年期、具有抗磷脂類抗體或其組合。
21.權(quán)利要求11的方法，其中獲自受試者的核酸分子獲自血清。
22.檢測(cè)受試者VT遺傳傾向性的方法，包括將擴(kuò)增產(chǎn)物施加至陣列，其中陣列包括與突變的AT III、突變的蛋白質(zhì)C、突變的蛋白質(zhì)S、突變的纖維蛋白原、突變的凝血因子V、突變的凝血因子II、突變的MTHFR和突變的ACE序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括獲自受試者的AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的核酸序列；將擴(kuò)增產(chǎn)物與陣列溫育足以允許擴(kuò)增產(chǎn)物和寡核苷酸探針之間雜交的時(shí)間，由此形成擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物；以及分析該擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物以確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否在ATIII、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE序列中包括一或多處突變或多態(tài)性，其中一或多處突變或多態(tài)性的存在表明受試者具有VT遺傳傾向性。
23.選擇靜脈血栓形成(VT)治療的方法，包括利用權(quán)利要求1的方法檢測(cè)受試者的至少一種VT-相關(guān)分子中的突變或多態(tài)性；以及如果鑒定到所述突變或多態(tài)性，則選擇治療以避免或緩解VT，或延緩VT的發(fā)病。
24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括給受試者施用所選擇的治療。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所選擇的治療包括用抗凝血?jiǎng)┲委熓茉囌摺?br> 26.陣列，包括與野生型基因序列、突變基因序列或兩者互補(bǔ)的寡核苷酸探針，其中基因序列包括來(lái)自AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因的編碼或非編碼序列。
27.權(quán)利要求26的陣列，其中突變基因序列包括列于表1中的十或更多處突變或多態(tài)性。
28.權(quán)利要求27的陣列，其中突變基因序列基本上由列于表1中的突變或多態(tài)性組成。
29.檢測(cè)受試者靜脈血栓形成(VT)遺傳傾向性的方法，包括將擴(kuò)增產(chǎn)物施加至權(quán)利要求13的陣列，其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括獲自受試者的擴(kuò)增的核酸，其中核酸包括來(lái)自AT III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的編碼或非編碼序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物與陣列溫育足以允許擴(kuò)增產(chǎn)物和寡核苷酸探針之間雜交的時(shí)間，由此形成擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物；以及分析該擴(kuò)增產(chǎn)物寡核苷酸探針復(fù)合物以確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否在ATIII、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE基因中包括一或多處突變或多態(tài)性，其中一或多處突變或多態(tài)性的存在表明受試者具有VT遺傳傾向性。
30.用于檢測(cè)受試者靜脈血栓形成(VT)遺傳傾向性的試劑盒，包括固相核酸陣列，包括以預(yù)定的模式化學(xué)連接至固體聚合支持物表面的多個(gè)寡核苷酸探針，其中該寡核苷酸探針能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與在ATIII、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因中具有VT-相關(guān)突變或多態(tài)性的一或多種核酸分子雜交。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中該寡核苷酸包括SEQ ID NO1-287。
32.權(quán)利要求30的試劑盒，進(jìn)一步包括分開(kāi)包裝、用于擴(kuò)增獲自受試者的核酸分子以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括來(lái)自ATIII、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因的序列。
33.權(quán)利要求30的試劑盒，進(jìn)一步包括分開(kāi)包裝的擴(kuò)增酶。
34.權(quán)利要求30的試劑盒，進(jìn)一步包括分開(kāi)包裝的緩沖溶液。
35.權(quán)利要求30的試劑盒，其中陣列進(jìn)一步包括能在嚴(yán)謹(jǐn)條件與野生型AT III、野生型蛋白質(zhì)C、野生型蛋白質(zhì)S、野生型纖維蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE雜交的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于在各種種族人群中預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)展靜脈血栓形成的遺傳風(fēng)險(xiǎn)的方法，以及可用于實(shí)施該方法的陣列和試劑盒。該方法包括在至少八種靜脈血栓形成－相關(guān)分子中篩選突變、多態(tài)性或兩者，所述分子如與靜脈血栓形成有關(guān)的抗凝血酶III、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、纖維蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和血管緊張素I－轉(zhuǎn)化酶(ACE)分子。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1930306SQ200580008290
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者希格迪姆·F·多烏盧, 歐文·M·倫納特, 陳偉儀 申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部