專利名稱：酶的除去方法和使用該方法的磷脂的堿交換方法或水解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將磷脂的改性或合成磷脂的制造中使用的酶從反應(yīng)液中分離·除去的方法、以及使用該方法的磷脂的堿交換方法(即堿交換方法)和磷脂的水解方法。
背景技術(shù)：
磷脂的水解或堿交換反應(yīng)，通常在酶的存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行。在這些反應(yīng)中，通常，通過加熱等使酶失活，從而使反應(yīng)停止。例如，在特開平2-273536號公報(bào)中，公開了利用脂肪酶或磷脂酶A2(以下稱為PLA2)對磷脂酸衍生物進(jìn)行處理，通過部分水解來制造溶血磷脂的方法。在該方法中，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間對反應(yīng)混合物進(jìn)行加熱，使酶失活，將反應(yīng)中止。在特開2001-186898號公報(bào)中，公開了使用磷脂酶D(以下稱為PLD)在?；视土字徒z氨酸之間進(jìn)行磷脂?；粨Q反應(yīng)，制造磷脂酰絲氨酸的方法。在該方法中，在反應(yīng)后，例如通過加熱或醇變性(alcohol denaturation)等處理，使酶失活。在特開2003-319793號公報(bào)中，公開了使用PLD的?；视土字牧字；粨Q反應(yīng)。在該反應(yīng)中，在上述交換反應(yīng)后，通過加熱等處理，使PLD失活。
但是，根據(jù)特開昭63-233750號公報(bào)，由于磷脂酶耐熱性強(qiáng)，所以，例如，即使在95℃下進(jìn)行30分鐘左右加熱處理也不會充分失活。由于磷脂酶沒有充分失活，所以，例如，有可能產(chǎn)生與磷脂共存的油脂等被水解而產(chǎn)生異臭等品質(zhì)上的問題。該文獻(xiàn)進(jìn)一步記載有在使加熱溫度為100℃以上、例如約120℃下使其失活時(shí)，存在容易引起磷脂或由磷脂酶的處理而產(chǎn)生的游離脂肪酸的劣化的問題。為了解決這樣的問題，在特開昭63-233750號公報(bào)中公開了在用磷脂酶對含有磷脂的原料進(jìn)行處理之后，用蛋白酶對該磷脂酶進(jìn)行處理，接著加熱該蛋白酶以使其失活的方法。
此外，在特開2003-93086號公報(bào)中，暗示了蛋白質(zhì)、肽、酶等能夠成為變態(tài)反應(yīng)(allergy)的原因。在該公報(bào)中進(jìn)一步記載有在特開昭63-233750號公報(bào)中記載的方法中，作為分解生成物的肽和蛋白酶以原樣殘留，會引起變態(tài)反應(yīng)等，很明顯會在安全上存在問題。為了解決這樣的問題，在特開2003-93086號公報(bào)中，公開了用磷脂酶對含有磷脂的原料進(jìn)行處理，接著用蛋白酶進(jìn)行處理，接著除去蛋白質(zhì)、肽和酶的方法。作為除去蛋白質(zhì)等的方法，例示有使用助濾劑的過濾、使用吸附劑的處理等。據(jù)記載，使用完的吸附劑，可以通過使用助濾劑的過濾而除去。該方法能夠除去蛋白質(zhì)等，但是，需要反應(yīng)后的過濾、吸附等處理，所以存在工序復(fù)雜化的問題。
此外，在特開2002-193982號公報(bào)中，公開了在酶反應(yīng)液中添加極性有機(jī)溶劑，利用水提取從有機(jī)溶劑中的磷脂酰絲氨酸溶液中除去親水性雜質(zhì)、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽的方法。據(jù)記載，利用該方法，磷脂酰絲氨酸溶液中的PLD的活性可達(dá)到檢出極限(0.1IU/g)以下，但對于該溶液中的蛋白含量，完全沒有記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在使用酶的磷脂的水解反應(yīng)或堿交換反應(yīng)中，使用上述的各種方法實(shí)際地對酶失活進(jìn)行研究。但是，在任一種方法中，雖然酶活性下降，但是均無法得到滿意的結(jié)果(參照以下的比較例1～7)。
因此，本發(fā)明人對從酶反應(yīng)液中進(jìn)一步有效地除去殘留酶活性的方法反復(fù)進(jìn)行潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對利用酶反應(yīng)后的液體(以下稱為“酶反應(yīng)液”)進(jìn)行清洗，能夠有效地除去酶反應(yīng)液中殘留的酶活性，并且能夠減少蛋白含量，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種從磷脂的水解反應(yīng)或堿交換反應(yīng)中使用的酶反應(yīng)液中除去酶的方法，該方法包括利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
此外，本發(fā)明還提供一種磷脂的堿交換方法，該方法包括使磷脂與選自醇類、糖類和含有羥基的環(huán)狀化合物中的具有醇式羥基的化合物，在能夠?qū)⒘字械膲A轉(zhuǎn)移到該化合物中的酶的存在下發(fā)生反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
此外，本發(fā)明還提供一種磷脂的水解方法，該方法包括在水的存在下，使磷脂與能夠?qū)⒘字獾拿高M(jìn)行反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
在一個(gè)實(shí)施方式中，上述無機(jī)金屬鹽是選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、和硫酸鎂中的至少一種金屬鹽。
在另一實(shí)施方式中，上述有機(jī)溶劑是極性溶劑。
此外，在另一實(shí)施方式中，上述極性有機(jī)溶劑是選自丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇、和甘油中的至少一種溶劑。
此外，在一個(gè)不同的實(shí)施方式中，上述混合溶劑含有30～70容量％的水和70～30容量％的有機(jī)溶劑，該混合溶劑中含有5～25質(zhì)量/容量％的上述無機(jī)金屬鹽。
具體實(shí)施例方式
以下，首先，說明利用酶進(jìn)行的磷脂的堿交換方法和水解方法，接著，說明從它們的酶反應(yīng)液中除去酶的方法。
A.利用酶的磷脂的堿交換方法本發(fā)明的磷脂的堿交換方法，包括使磷脂與選自醇類、糖類、和具有羥基的環(huán)狀化合物中的受體醇，在能夠?qū)⒘字膲A轉(zhuǎn)移到該醇化合物中的酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。在此，首先說明通過堿交換反應(yīng)得到酶反應(yīng)液的工序。
A-1原料磷脂作為本發(fā)明中使用的磷脂(原料磷脂)，沒有特別的限制，可舉出磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、和磷脂酰甘油(PG)等。
作為原料磷脂，除了這樣精制的化合物以外，還可使用含有它們的化合物的蛋黃磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、魚貝類磷脂等。例如，在蛋黃磷脂中，含有73.0％的PC、15.0％的PE、和0.6％的PI。此外，大豆磷脂中含有38.2％的PC、17.3％的PE、和16.0％的PI(均參照“新食品功能材料的開發(fā)”，太田明主編，CMC出版社，1996年)。因此，含有這些化合物的來自天然物質(zhì)的磷脂，作為起始材料是有用的。
上述的蛋黃磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、魚貝類磷脂等，也可以不進(jìn)行高度精制。例如，即使在將除了磷脂以外還含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、鹽等成分的粗提取物或粗精制物作為起始原料的情況下，只要以不阻礙酶反應(yīng)的量含有這些成分，就可以作為原料磷脂使用。此外，通過化學(xué)作用或者酶作用合成的PC或PE等，也可以作為原料磷脂使用。
A-2具有醇式羥基的化合物本發(fā)明中使用的具有醇式羥基的化合物，在磷脂的堿交換中，被用作?；视土字牧字；葔A部位的受體。作為具有醇式羥基的化合物，可舉出醇類、糖類、和具有羥基的環(huán)狀化合物等。
作為醇類，包括一元醇、多元醇(包括二元醇和三元醇，也指多元醇類)、含氮醇等。作為一元醇，可舉出甲醇、乙醇、丙醇等；作為多元醇，可舉出甘油、乙二醇、丙二醇等?？箟难嵋脖话诖碱愔小Ｗ鳛楹?，例如可舉出絲氨酸等氨基酸、1-氨基-2丙醇等。
作為糖類，包括葡萄糖等單糖、以蔗糖等二糖為首的低聚糖、N-乙?；?D-氨基葡萄糖等。此外，還可舉出具有核糖或脫氧核糖等糖的腺苷、鳥苷、肌苷、黃苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷等核苷酸等。
作為具有羥基的環(huán)狀化合物，例如可舉出曲酸、熊果苷等。
A-3酶作為本發(fā)明的磷脂的堿交換方法中使用的酶，可舉出PLD等。
作為PLD，可舉出來自植物的PLD，例如來自甘藍(lán)或花生的PLD。此外，可舉出來自屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬的微生物的PLD。其中，優(yōu)選使用Streptomyces cinnamoneum生產(chǎn)的PLD。該微生物生產(chǎn)的PLD，分子量約54,000，最適pH約5～6，最適溫度約40～60℃(Chiaki Ogmo等，J.Biol.Chem.，125卷，263-269頁(1999))。
此外，使PLD的生產(chǎn)株的生產(chǎn)率提高后的變異株本身，和將從上述微生物分離出的PLD基因?qū)胪N或不同種宿主中從而使PLD的生產(chǎn)率提高的重組微生物本身，以及來自它們的PLD，也可用于本發(fā)明。
A-4堿交換反應(yīng)堿交換反應(yīng)，通過使原料磷脂與具有醇式羥基的化合物(以下有時(shí)也稱為受體醇)在具有堿交換活性的酶(PLD)的存在下發(fā)生反應(yīng)而進(jìn)行。
原料磷脂與受體醇的摩爾比，沒有特別的限制，可以根據(jù)原料磷脂和受體醇的種類適當(dāng)決定。通常，受體醇/原料磷脂(摩爾比)優(yōu)選為0.001～200左右。例如，在PE的情況下，受體醇/PE(摩爾比)通常優(yōu)選為0.01～100。
在堿交換反應(yīng)中，酶的使用量沒有特別的限制，可以根據(jù)原料磷脂、受體、和酶的種類來決定。例如，在PLD的情況下，對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。其中，該酶活性的1單位，是以95％來自大豆的PC(磷脂提取物Phosphatide Extract，Soybean(Granules)Avanti Polar Lipid Inc.公司生產(chǎn))作為基質(zhì)，在基質(zhì)濃度0.16％的40mM乙酸緩沖溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，1分鐘釋放1μmol膽堿的酶的量。
在堿交換反應(yīng)中，可以使用水類溶劑、有機(jī)溶劑、和水類溶劑與有機(jī)溶劑的混合溶劑作為反應(yīng)用溶劑。所謂反應(yīng)用水類溶劑，是指水和/或水性的緩沖溶液。作為水，優(yōu)選使用離子交換水、精制水、或蒸餾水，但也可以使用自來水。作為水性的緩沖溶液，例如，優(yōu)選使用pH4～6的乙酸緩沖溶液、pH7～8的磷酸緩沖溶液等。作為反應(yīng)用有機(jī)溶劑，可舉出正庚烷、正己烷、石油醚等脂肪族烴；環(huán)戊烷、環(huán)己烷等環(huán)狀脂肪族烴；二乙醚、四氫呋喃等醚類；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯類；四氯化碳、氯仿等鹵化烴類。反應(yīng)用有機(jī)溶劑，可以單獨(dú)使用，或者可以將2種以上混合使用?？梢栽谶@些反應(yīng)用水類溶劑或反應(yīng)用有機(jī)溶劑中，進(jìn)一步并用促進(jìn)堿交換反應(yīng)的溶劑、例如丙酮等。
在反應(yīng)中使用水類溶劑和有機(jī)溶劑的混合溶劑的情況下，混合比可以根據(jù)使用的有機(jī)溶劑的種類適當(dāng)選擇?；旌媳嚷蕸]有特別的限制，通常，為了抑制作為副反應(yīng)的磷脂的堿(磷脂酰基)的水解反應(yīng)并有效地進(jìn)行目標(biāo)的堿(磷脂酰基)的交換反應(yīng)，優(yōu)選在反應(yīng)體系內(nèi)的水類溶劑的含量為10容量％以下進(jìn)行。
上述酶反應(yīng)中使用的磷脂的量，根據(jù)反應(yīng)溶劑的容量，優(yōu)選為1～50％(w/v)，更優(yōu)選為5～30％(w/v)。磷脂的量超過50％(w/v)時(shí)，會有溶解有原料磷脂的溶液的粘度變高，導(dǎo)致反應(yīng)效率降低的情況，相反，小于1％(w/v)時(shí)，一次處理能夠得到的磷脂的量非常少，處理效率變差。
堿交換反應(yīng)的溫度，優(yōu)選為10～70℃，更優(yōu)選為25～50℃。反應(yīng)所需時(shí)間，隨著酶的量和反應(yīng)溫度而改變，大致為0.5～48小時(shí)。在本發(fā)明的方法中，考慮到磷脂的分散性，而且，考慮到反應(yīng)用混合溶劑為水層和有機(jī)溶劑層的兩相系統(tǒng)的情況下的混合性，優(yōu)選適當(dāng)進(jìn)行攪拌、振動等分散方法。
通過上述反應(yīng)，進(jìn)行磷脂的堿交換，生產(chǎn)出與受體醇的種類對應(yīng)的磷脂。例如，在使用甘油作為醇的情況下，生產(chǎn)出磷脂酰甘油(PG)，在使用絲氨酸作為醇的情況下，生產(chǎn)出磷脂酰絲氨酸(PS)。
接著，從該酶反應(yīng)液中除去酶、精制反應(yīng)生成物，對于除去酶的工序，將在“D.從酶反應(yīng)液中除去酶的方法”中說明。
B.利用酶的磷脂的水解反應(yīng)本發(fā)明的磷脂的水解方法，包括在水的存在下，使磷脂與能夠?qū)⒘字獾拿高M(jìn)行反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，除去該酶的工序。在此，首先說明通過水解得到酶反應(yīng)液的工序。
B-1原料磷脂水解中使用的原料磷脂可使用上述A-1中記載的磷脂。
B-2酶磷脂的水解中使用的酶，只要是能夠?qū)⒘字闹舅岵课缓?或堿部位水解的酶即可，沒有特別的限制。作為這樣的酶，可舉出脂肪酶、磷脂酶A1(以下稱為PLA1)、PLA2、磷脂酶B(以下稱為PLB)、磷脂酶C(以下稱為PLC)、PLD、鞘磷脂酶等。
作為PLD，可使用上述A-3中記載的PLD。
作為PLA2，可舉出來自動物的PLA2(例如，來自豬胰臟的PLA2)。此外，可舉出來自微生物的PLA2(例如，來自屬于鏈霉菌屬的微生物的PLA2)等。
作為PLA1、PLB、PLC、和脂肪酶，可舉出來自微生物的脂肪酶，例如來自屬于曲霉菌屬(Aspergillus)、鏈霉菌(Streptomyces)屬等的微生物的磷脂酶和脂肪酶。
此外，使上述酶的生產(chǎn)株的生產(chǎn)率提高后的變異株本身，和將從上述微生物分離出的酶的基因?qū)胪N或不同種宿主中從而使該種酶的生產(chǎn)率提高的重組微生物本身，以及來自它們的酶，也可用于本發(fā)明。
B-3水解反應(yīng)水解反應(yīng)通過使水解酶與原料磷脂在水的存在下發(fā)生作用而進(jìn)行。對于磷脂的水解反應(yīng)中的磷脂與水的摩爾比，沒有特別的限制。相對于1摩爾的磷脂，適宜使用0.01～100倍摩爾的水。
在水解反應(yīng)中，酶的使用量沒有特別的限制，可以根據(jù)原料磷脂和酶的種類適當(dāng)決定。例如，在PLD的情況下，與上述的A-4同樣，例如，相對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。
在PLA2的情況下，例如，相對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。PLA2的1單位，是以來自大豆的糊狀卵磷脂(P-3644Sigma PC含量40％)作為基質(zhì)，在基質(zhì)濃度1.25％的25mM Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，1分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶的量。
在脂肪酶的情況下，相對于1g的PE，可以使用20～50000單位的范圍。脂肪酶的1單位，是以將橄欖油、2％PVA和MaIlvaive緩沖溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合、乳化后的物質(zhì)作為基質(zhì)，相對于4ml基質(zhì)，混合1ml脂肪酶稀釋液，在37℃下反應(yīng)60分鐘時(shí)，釋放出相當(dāng)于1μmol油酸的酸的酶量。
作為水解反應(yīng)中使用的反應(yīng)溶劑，可以使用與上述A-4的堿交換反應(yīng)中記載的物質(zhì)相同的水類溶劑、或者水類溶劑與有機(jī)溶劑的混合溶劑。若考慮磷脂在水中的溶解性，則優(yōu)選使用水類溶劑與有機(jī)溶劑的混合溶劑。此外，作為水類溶劑，優(yōu)選使用pH7～9的Tris-HCl緩沖溶液等。
在使用水類溶劑與有機(jī)溶劑的混合溶劑的情況下，混合比可以根據(jù)使用的有機(jī)溶劑的種類適當(dāng)選擇。水類溶劑與有機(jī)溶劑的容量比沒有特別的限制，從促進(jìn)水解反應(yīng)的方面考慮，優(yōu)選使反應(yīng)體系內(nèi)的水類溶劑的含量為10容量％以上。
上述酶反應(yīng)中使用的磷脂的量，根據(jù)反應(yīng)溶劑的容量，優(yōu)選為1～50％(w/v)，更優(yōu)選為5～30％(w/v)。磷脂的量超過50％(w/v)時(shí)，會有溶解有原料磷脂的溶液的粘度變高，導(dǎo)致反應(yīng)效率降低的情況，相反，小于1％(w/v)時(shí)，一次處理能夠得到的磷脂的量非常少，處理效率變差。
水解反應(yīng)的溫度因使用的酶的物理化學(xué)性質(zhì)而不同。例如，在使用來自動物的PLA2的情況下，優(yōu)選為10～70℃、更優(yōu)選25～50℃。反應(yīng)所需時(shí)間，隨著目標(biāo)反應(yīng)、酶的量和反應(yīng)溫度而改變，大致為0.5～48小時(shí)。在本發(fā)明的方法中，考慮到磷脂的分散性，而且，考慮到使用水類溶劑和有機(jī)溶劑的混合溶劑的情況下的水類溶劑和有機(jī)溶劑的混合性，優(yōu)選適當(dāng)進(jìn)行攪拌、振動等分散方法。
通過上述反應(yīng)，進(jìn)行磷脂的水解，從磷脂酰膽堿(PC)生產(chǎn)出溶血磷脂酰膽堿(LPC)，從磷脂酰乙醇胺(PE)生產(chǎn)出溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，或者從PC或PE生產(chǎn)出磷脂酸(PA)。
接著，從該酶反應(yīng)液中除去酶、精制反應(yīng)生成物，對于除去該酶的工序，將在以下的“D.從酶反應(yīng)液中除去酶的方法”中說明。
C.酶除去前的酶反應(yīng)液的處理上述A.堿交換方法或B.水解方法中得到的酶反應(yīng)液，是(1)含有有機(jī)溶劑的體系或(2)水體系中的任一個(gè)。分別在各體系中，對酶除去前的酶反應(yīng)液的處理，記載如下。
(1)含有有機(jī)溶劑的體系在酶反應(yīng)液僅為有機(jī)溶劑的體系的情況下，可以直接進(jìn)行酶除去。
在酶反應(yīng)液為有機(jī)溶劑和水類溶劑的混合溶劑體系的情況下，有機(jī)溶劑和水類溶劑可以分離時(shí)，優(yōu)選預(yù)先除去水類溶劑。但是，在機(jī)溶劑和水類溶劑不能較好地分離的情況下，或者有機(jī)溶劑和水類溶劑成為乳化狀態(tài)的情況下，可以不除去水類溶劑而直接進(jìn)行酶除去。
(2)水體系在酶反應(yīng)液是水體系的情況下，優(yōu)選添加提取用有機(jī)溶劑、進(jìn)行溶劑分餾、除去分餾出的水類溶劑。在此，提取用有機(jī)溶劑可以使用作為上述A-4中記載的反應(yīng)用有機(jī)溶劑而列舉的有機(jī)溶劑。但是，在該情況下，在提取用有機(jī)溶劑與水類溶劑的分離較差時(shí)，或提取用有機(jī)溶劑與水類溶劑成為乳化狀態(tài)時(shí)，也可以不除去水類溶劑而直接進(jìn)行酶除去。
D.從酶反應(yīng)液中除去酶的方法從上述C.中得到的酶反應(yīng)液中除去酶的方法，包括用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑(以下，簡稱為清洗用混合溶劑)，對酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將酶除去的工序。
上述C.中得到的酶反應(yīng)液中，含有酶、原料磷脂、反應(yīng)生成物、以及水類溶劑和/或有機(jī)溶劑。本發(fā)明的特征在于，通過使用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對這些酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將酶除去。
D-1.無機(jī)金屬鹽作為本發(fā)明中使用的無機(jī)金屬鹽，可舉出一價(jià)金屬的無機(jī)鹽、二價(jià)金屬的無機(jī)鹽或多價(jià)金屬的無機(jī)鹽。
作為一價(jià)金屬的無機(jī)鹽，優(yōu)選使用堿金屬的無機(jī)鹽、無機(jī)銨鹽等。作為堿金屬，優(yōu)選使用鈉(Na)、鉀(K)、鋰(Li)，最優(yōu)選鈉。作為與堿金屬或氨形成鹽的無機(jī)化合物，優(yōu)選使用鹽酸、硫酸、碳酸等。作為一價(jià)的無機(jī)金屬鹽，例如，優(yōu)選使用氯化鈉(NaCl)、硫酸鈉(Na2SO4)、氯化鉀(KCl)、硫酸鉀(K2SO4)等。
作為二價(jià)或多價(jià)的無機(jī)金屬鹽，可使用堿土類金屬等。優(yōu)選使用鎂(Mg)、鈣(Ca)等，作為它們的無機(jī)金屬鹽，例如，可使用氯化鎂(MgCl2)、硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸鈣(CaSO4)等。
無機(jī)金屬鹽可以單獨(dú)使用，或者可以將2種以上組合使用。
D-2清洗用有機(jī)溶劑在酶的除去中使用的有機(jī)溶劑(清洗用有機(jī)溶劑)，只要具有極性，就沒有特別的限制。優(yōu)選使用醇(尤其是低級醇)、丙酮等。作為低級醇，可使用碳原子數(shù)1～7的醇，尤其優(yōu)選使用甲醇、乙醇、異丙醇和甘油。
有機(jī)溶劑可以單獨(dú)使用，或者可以將2種以上組合使用。
D-3含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑(清洗用混合溶劑)通常，水和有機(jī)溶劑按照容量比1∶9～9∶1的比例、優(yōu)選3∶7～7∶3的比例、更優(yōu)選4∶6～6∶4的比例混合。
無機(jī)金屬鹽在該混合溶劑中含有3～25質(zhì)量/容量％(以下記為w/v％)、優(yōu)選5～20w/v％、更優(yōu)選5～10w/v％此外，該清洗用混合溶劑的制作方法沒有特別的限制。例如，可以預(yù)先調(diào)制適當(dāng)濃度的無機(jī)金屬鹽水溶液、再與適當(dāng)量的有機(jī)溶劑混合進(jìn)行調(diào)制?；蛘?，可以在水和有機(jī)溶劑的混合溶劑中添加適當(dāng)量的無機(jī)金屬鹽。具體地說，例如，可舉出丙酮與含有15w/v％的NaCl的水溶液的1∶1(v/v)混合溶液(含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％丙酮-水混合溶劑)等。同樣，可舉出含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％乙醇-水混合溶劑、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％異丙醇-水混合溶劑、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％甲醇-水混合溶劑等。不言而喻，這些僅是例示。
D-4酶反應(yīng)液的處理所謂酶反應(yīng)液的處理，是指利用清洗用混合溶劑對上述C.中得到的酶反應(yīng)液進(jìn)行清洗。在將該酶反應(yīng)液與清洗用混合溶劑充分混合后，通過靜置或離心分離，將清洗用混合溶劑分離、除去，由此進(jìn)行清洗。
清洗用混合溶劑可以添加上述C.中得到的酶反應(yīng)液的容積的1/10以上的比例。若考慮到處理效率，則使用的清洗用混合溶劑的量，優(yōu)選為酶反應(yīng)液的容積的3/10～3/1(v/v)，更優(yōu)選為5/10～1/1(v/v)。
清洗后，回收含有磷脂的有機(jī)溶劑相。根據(jù)需要，可以利用清洗用混合溶劑反復(fù)進(jìn)行處理。
利用清洗用混合溶劑對酶反應(yīng)液進(jìn)行的處理，除了上述那樣在酶反應(yīng)物中添加預(yù)先調(diào)制的混合溶劑的方法以外，也可以采用將無機(jī)金屬鹽、水、和有機(jī)溶劑按照上述規(guī)定的添加量直接添加到酶反應(yīng)物中的方法。這些成分的添加順序沒有特別的限制?；蛘撸梢栽诿阜磻?yīng)物中加入含有規(guī)定量的無機(jī)金屬鹽的水溶液和有機(jī)溶劑。即，只要最終酶反應(yīng)物中含有上述規(guī)定量的混合溶劑即可。
此外，在酶反應(yīng)液本身含有作為清洗用混合溶劑的組分的上述無機(jī)金屬鹽、水、或極性溶劑時(shí)，可以利用其作為清洗用混合溶劑的組成物。
在由該清洗得到的含有磷脂的有機(jī)溶劑相中含有作為清洗用溶劑組分的無機(jī)金屬鹽的情況下，通過進(jìn)一步用水和極性有機(jī)溶劑的混合液進(jìn)行清洗，能夠容易地除去該無機(jī)金屬鹽。
E.反應(yīng)生成物的回收利用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法，從上述D.中得到的含有磷脂的有機(jī)溶劑相中回收目標(biāo)生成物。例如，可通過利用能夠溶解反應(yīng)生成物的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取、接著在減壓下除去有機(jī)溶劑等方法進(jìn)行回收，根據(jù)需要，可進(jìn)行精制。得到的生成物，完全不含有反應(yīng)中使用的酶，或者酶含量極低，所以可穩(wěn)定地保存。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。
<分析方法>
(反應(yīng)的確認(rèn))在以下的調(diào)制例中，利用以下方法確認(rèn)反應(yīng)的進(jìn)行。取一部分反應(yīng)液，在減壓下蒸餾除去全部溶劑，將干燥物溶解在氯仿∶乙腈＝7∶3的混合物中，利用下述條件的高速液相色譜法(以下稱為HPLC法)檢測生成物的PS和PA、LPA。
使用的柱GL Sciences制Unisil Q NH2(內(nèi)徑4.6mm×25cm)移動相乙腈∶甲醇∶10mM磷酸二氫銨＝619∶291∶90(v/v/v)流速1.3ml/min柱溫度37℃檢測UV205nm(酶活性的定義和測定方法)以下的調(diào)制例和研究例中使用的酶活性，分別如下述進(jìn)行定義。此外，取一部分磷脂，在減壓下蒸餾除去全部溶劑，利用下述方法測定得到的卵磷脂，以每1g卵磷脂的活性來表示殘留酶活性。
磷脂酶D(PLD)以95％來自大豆的磷脂酰膽堿(PC)(磷脂提取物PhosphatideExtract，Soybean(Granules)，Avanti Polor Lipid Inc.生產(chǎn))作為基質(zhì)，在基質(zhì)濃度0.16質(zhì)量％的40mM乙酸緩沖溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下進(jìn)行反應(yīng)，測定酶活性，以1分鐘釋放1μmol膽堿的酶的量作為1U。
磷脂酶A2(PLA2)以來自大豆的糊狀卵磷脂(P-3644 Sigma PC含量40％)作為基質(zhì)，在基質(zhì)濃度1.25wt％的25mM Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下進(jìn)行反應(yīng)。以1分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶的量作為1U。
脂肪酶以將橄欖油、2％PVA和McIlvaine緩沖溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合·乳化后的物質(zhì)作為基質(zhì)，相對于4ml基質(zhì)，混合1ml脂肪酶稀釋液，在37℃下反應(yīng)60分鐘。以釋放出相當(dāng)于1μmol油酸的酸的酶量作為1U。
蛋白酶在5ml的0.6％乳酪蛋白(pH7.5、0.04M磷酸緩沖溶液)中加入1ml的酶溶液，在30℃下反應(yīng)10分鐘。以每分鐘釋放相當(dāng)于1μg酪氨酸的Folin顯色(Folin’s color)作為TCA可溶性成份的活性作為1U。
(殘留蛋白質(zhì)的定量)在減壓下除去溶劑后，使磷脂餾分(fraction)溶解在氯仿中，進(jìn)行離心分離，將蛋白質(zhì)作為氯仿不溶物回收?；厥盏牡鞍踪|(zhì)再用氯仿清洗數(shù)次后，在減壓下除去氯仿，供給蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)的定量使用Protein Quantification Kit-Wide range(Dojindo MolecularTechnologies，Inc.)以牛血清清蛋白作為標(biāo)記物進(jìn)行定量。
<反應(yīng)液的調(diào)制>
(調(diào)制例1堿交換反應(yīng)后的酶反應(yīng)液的調(diào)制)將卵磷脂(SLP-PI粉末，辻制油生產(chǎn))和絲氨酸溶解在己烷/丙酮/0.2M乙酸緩沖溶液(pH4.0)以78/14/8(容量比)的比例混合的兩相系統(tǒng)的混合溶劑中，使得卵磷脂∶絲氨酸＝1∶7～1∶10(重量比)，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生產(chǎn)))，在30℃下一邊攪拌一邊反應(yīng)5小時(shí)，生成磷脂酰絲氨酸(PS)。此外，反應(yīng)的進(jìn)行由上述的HPLC法確認(rèn)。
反應(yīng)結(jié)束后，靜置，分離成有機(jī)溶劑相和水相兩相，回收含有PS的有機(jī)溶劑。以下，將含有該P(yáng)S的有機(jī)溶劑稱為磷脂餾分I。
(調(diào)制例2水解反應(yīng)后的酶反應(yīng)液的調(diào)制-1)將卵磷脂(Ultralec PADM公司生產(chǎn))以5～25％分散在0.2M乙酸緩沖溶液(pH5.5)中，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生產(chǎn)))，在50℃下一邊攪拌一邊反應(yīng)16小時(shí)，生成磷脂酸(PA)。以下，將含有該P(yáng)A的水類溶劑稱為磷脂餾分II。此外，反應(yīng)的進(jìn)行由上述的HPLC法確認(rèn)。
(調(diào)制例3水解反應(yīng)后的酶反應(yīng)液的調(diào)制-2)取上述調(diào)制例2中得到的磷脂餾分II的一部分，添加該磷脂餾分的2倍容量的庚烷/丙酮＝1∶2(v/v)的混合溶劑，攪拌后，除去水類溶劑，回收含有PA的有機(jī)溶劑相。以下，將含有該P(yáng)A的水類溶劑稱為磷脂餾分III。
(調(diào)制例4水解反應(yīng)后的酶反應(yīng)液的調(diào)制-3)在上述調(diào)制例3中得到的磷脂餾分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作為水類溶劑，添加PLA2(PLA2 Nagase(Nagase ChemteX公司生產(chǎn)))，在30℃下一邊攪拌一邊反應(yīng)16小時(shí)，生成溶血磷脂酸(LPA)。此外，反應(yīng)的進(jìn)行由上述的HPLC法確認(rèn)。反應(yīng)結(jié)束后，靜置，分離水類溶劑，回收含有LPA的有機(jī)溶劑相。以下，將含有該LPA的有機(jī)溶劑相稱為磷脂餾分IV。
(調(diào)制例5水解反應(yīng)后的酶反應(yīng)液的調(diào)制-4)在上述調(diào)制例3中得到的磷脂餾分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作為水類溶劑，添加脂肪酶(LilipaseA-10(Nagase ChemteX公司生產(chǎn)))，在30℃下一邊攪拌一邊反應(yīng)16小時(shí)，生成LPA。此外，反應(yīng)的進(jìn)行由上述的HPLC法確認(rèn)。反應(yīng)結(jié)束后，靜置，分離水類溶劑，回收含有LPA的有機(jī)溶劑相。以下，將含有該LPA的有機(jī)溶劑相稱為磷脂餾分V。
(調(diào)制例6蛋白酶處理后的酶反應(yīng)液的調(diào)制)在含有生成物PA和酶PLD的磷脂餾分II中，以每1g卵磷脂20U添加蛋白酶(商品名Bioprase conc.(Nagase ChemteX公司生產(chǎn)))，在60℃下攪拌1小時(shí)后，回收含有PA的水類溶劑。以下，將含有該P(yáng)A的水類溶劑稱為磷脂餾分VI。
各磷脂餾分(I～VI)中的殘留PLD活性和殘留PLA2活性為每1g卵磷脂10～60U。以后，使用上述的磷脂餾分I～VI，實(shí)施以下的比較例和研究例。
<利用現(xiàn)有方法進(jìn)行的酶失活的研究>
(比較例1利用加熱處理進(jìn)行的PLD除去的研究)將上述調(diào)制例1中得到的磷脂餾分I在表1記載的溫度下進(jìn)行15小時(shí)加熱處理，測定PLD的殘留活性。其中，PLD的殘留活性利用上述的方法測定。將結(jié)果示于表1。
表1

從表1的結(jié)果可知，通過15小時(shí)的加熱處理，PLD活性下降，但是，活性殘留一半以上。由此可推測，PLD在卵磷脂存在下對熱非常穩(wěn)定。此外，通過加熱，PS的酸值和過氧化物值上升，生成的PS被熱分解。因此可知，加熱處理不可能是PLD失活的有效手段。
(比較例2利用蛋白酶處理進(jìn)行的PLD除去的研究-1)將表2記載的各種蛋白酶以每1g卵磷脂20U的比例加入磷脂餾分I中，在60℃下一邊攪拌1小時(shí)一邊進(jìn)行反應(yīng)，殘留PLD活性利用上述的方法測定。將結(jié)果示于表2。
表2

從表2的結(jié)果可知，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行蛋白酶處理的情況下，PLD的活性幾乎不降低。
(比較例3利用蛋白酶處理進(jìn)行的PLD除去的研究-2)可以認(rèn)為，由于上述比較例2的蛋白酶處理在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，所以，利用蛋白酶的PLD蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)沒有進(jìn)行。因此，取一部分磷脂餾分I，在減壓下除去有機(jī)溶劑后，使其分散在水中，再次進(jìn)行利用蛋白酶的處理(蛋白酶的添加量每1g卵磷脂5U，60℃，1小時(shí))。將結(jié)果示于表3。使用的蛋白酶的活性，利用上述的方法測定。
表3

在該條件的蛋白酶處理中，PLD失活大約一半左右，可知不能得到充分的PLD失活效果。
(比較例4利用丙酮處理進(jìn)行的PLD除去的研究)在磷脂餾分I中添加丙酮，使PLD變性·凝集，過濾后，測定殘留PLD活性。將結(jié)果示于表4。
表4

從表4的結(jié)果可知，通過丙酮處理，PLD活性稍微降低。增加丙酮的量時(shí)，PLD處于降低的趨勢。但是，添加磷脂餾分I的容量的6/10量以上的丙酮時(shí)，由于原料卵磷脂沉淀，所以不優(yōu)選。此外，通常酶本身對丙酮等有機(jī)溶劑的耐性低，但從該結(jié)果可推測，在卵磷脂的存在下，PLD的溶劑耐性提高。
(比較例5利用NaCl水溶液清洗進(jìn)行的PLD除去的研究)用NaCl水溶液對磷脂餾分I進(jìn)行清洗后，測定殘留PLD活性。將NaCl水溶液的濃度和使用量、以及結(jié)果示于表5。所謂清洗是指在磷脂餾分I中加入NaCl水溶液后，進(jìn)行攪拌使得充分混合后，通過離心分離或靜置將水相分離并除去。在以下的研究例中，清洗也是進(jìn)行同樣的操作。
表5

接著，改變15％(w/v)NaCl水溶液(以下有時(shí)簡稱15％NaCl)的pH進(jìn)行清洗，測定殘留PLD活性。15％NaCl的使用量為磷脂餾分I的1/10(v/v)。將結(jié)果示于表6。
表6

進(jìn)一步，在增加15％NaCl的清洗次數(shù)的情況下，測定殘留PLD活性。使用量為磷脂餾分I的1/10(v/v)。將結(jié)果示于表7。
表7

從表5～7的結(jié)果可知，使用NaCl水溶液進(jìn)行的清洗，能夠使PLD活性降低至大約一半的量。但是，改變pH或增加清洗次數(shù)，未觀察到顯著的PLD除去效果。
(比較例6利用吸附劑進(jìn)行的PLD除去的研究)在磷脂餾分I中加入吸附劑進(jìn)行處理后，測定殘留PLD活性。每1ml磷脂餾分I加入0.1g吸附劑，在室溫下接觸1小時(shí)，通過過濾除去吸附劑。此外，為了比較，也同時(shí)使用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl實(shí)施磷脂餾分I的清洗。將結(jié)果示于表8。此外，表8中的NaCl水溶液清洗+硫酸鎂或NaCl水溶液清洗+活性白土，是指在用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl對磷脂餾分I進(jìn)行清洗后，使用硫酸鎂或活性白土進(jìn)行吸附處理。
表8

從表8的結(jié)果可知，在吸附劑處理中，沒有觀察到PLD的活性顯著降低，與15％NaCl清洗為相同程度。在活性白土處理中，PLD活性降低至大約25％左右，可認(rèn)為比NaCl清洗更有效。但是，即使并用NaCl清洗和活性白土處理，也觀察不到PLD的活性進(jìn)一步降低。
(比較例7利用含水有機(jī)溶劑清洗進(jìn)行的PLD除去的研究)使用表9記載的極性有機(jī)溶劑與水的混合溶劑對磷脂餾分I進(jìn)行清洗后，測定PLD活性。清洗用的混合溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。此外，為了比較，也同時(shí)使用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl實(shí)施磷脂餾分I的清洗。將結(jié)果示于表9。
表9

使用67％丙酮、67％異丙醇、67％乙醇和67％甲醇進(jìn)行的處理，比NaCl處理有效果，但沒有觀察到PLD的活性充分降低。
如以上的比較例1～7的結(jié)果所示，確認(rèn)現(xiàn)有的方法非常難以使PLD充分失活。因此，通過以下的研究例，說明為了解決該問題的新的酶活性除去方法。
<新方法的開發(fā)>
(研究例1清洗處理的組合)利用表10記載的溶劑的組合對磷脂餾分I進(jìn)行清洗后，測定殘留PLD活性。清洗用的溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。將結(jié)果示于表10。
表10

從表10的結(jié)果可知，在使用將15％的NaCl水溶液與極性溶劑等量混合后的溶劑(含有7.5％NaCl的50％丙酮或異丙醇或乙醇或甲醇或甘油)進(jìn)行清洗時(shí)，PLD達(dá)到檢出限度以下。與此相對，在NaCl清洗后使用含水丙酮或含水乙醇進(jìn)行清洗時(shí)，PLD活性只不過降低至33％～40％。從該結(jié)果可知，使用含有無機(jī)金屬鹽的、水與有機(jī)溶劑的混合溶劑進(jìn)行的清洗，對PLD的除去有效。此外，PLD的檢出限度為每1g卵磷脂0.01U。
(研究例2利用NaCl以外的金屬鹽進(jìn)行的PLD的除去的研究)使用含有NaCl以外的金屬鹽的50％丙酮對磷脂餾分I進(jìn)行清洗后，測定殘留PLD活性。清洗用的溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。將結(jié)果示于表11。
表11

表11的結(jié)果顯示，使用Na2SO4、KCl、CaCl2和MgSO4代替NaCl作為無機(jī)金屬鹽，與NaCl同樣，也能夠除去PLD。
(研究例3；利用含有無機(jī)金屬鹽的含水極性溶劑進(jìn)行的清洗的最優(yōu)化)根據(jù)上述研究例的結(jié)果，對于極性溶劑濃度、無機(jī)金屬鹽濃度、和相對于磷脂餾分I的使用量，研究最佳的處理?xiàng)l件。在本研究中，使用丙酮作為極性溶劑，使用NaCl作為無機(jī)金屬鹽。將結(jié)果示于表12。
表12

※1清洗溶劑/磷脂餾分I的量(v/v)
在表12的結(jié)果中，隨著清洗使用的混合溶劑的量增加，殘留PLD活性降低。此外，在使用磷脂餾分I的容量的6/10(v/v)量的混合溶劑進(jìn)行清洗時(shí)，NaCl濃度越高，殘留酶的除去效率越好，在鹽濃度相同的情況下，丙酮濃度高的，殘留酶的除去效率好。
(研究例4殘留蛋白質(zhì)的確認(rèn))利用其容量的6/10(v/v)量的混合溶劑、即含有7.5％NaCl的50％丙酮對磷脂餾分I進(jìn)行1～3次反復(fù)清洗后，測定磷脂餾分I中的殘留蛋白質(zhì)量。其中，蛋白質(zhì)的定量使用上述記載的方法進(jìn)行。將結(jié)果示于表13。
表13

如表13所示，可以確認(rèn)，通過反復(fù)實(shí)施1～3次的利用含有無機(jī)金屬鹽的含水有機(jī)溶劑進(jìn)行的清洗，蛋白質(zhì)達(dá)到檢出限度以下。這意味著，不僅防止由殘留酶引起的磷脂變性，而且對減少變態(tài)反應(yīng)性也是有用的。
如以上的研究例1～4的結(jié)果，新開發(fā)的利用含有無機(jī)金屬鹽的含水極性溶劑進(jìn)行的清洗方法，能夠有效地除去殘留PLD活性，能夠使蛋白質(zhì)降低至檢出限度以下，所以，確認(rèn)對殘留PLD活性的除去和精制是有效的方法。
<對水解反應(yīng)和其它酶的應(yīng)用>
(研究例5來自水解反應(yīng)酶液的殘留酶活性除去的研究)磷脂餾分II和III中含有生成物PA和酶PLD。磷脂餾分IV中含有生成物L(fēng)PA與酶PLD和PLA2。磷脂餾分V中含有生成物PA與酶PLD和脂肪酶。磷脂餾分VI中含有生成物PA與PLD和蛋白酶。因此，對從這些磷脂的水解物精制生成物的方法、即除去生成物中殘留的酶的方法進(jìn)行研究。為了參考，也使用由堿交換反應(yīng)得到的磷脂餾分I。
添加磷脂餾分I和III～V的6/10(V/V)量的含有15w/v％NaCl的50％丙酮，與上述研究例3同樣地進(jìn)行清洗處理。此外，磷脂餾分II和VI，由于是含有PA的水類溶劑，所以，分別添加磷脂餾分的容量的7.5％(w/v)NaCl與2倍量(v/v)的丙酮和等量(v/v)的庚烷并攪拌，進(jìn)行與研究例3同樣的處理，同時(shí)進(jìn)行PA的提取和清洗。此外，PLD、PLA2、脂肪酶、和蛋白酶的各殘留活性，利用上述的方法測定。將結(jié)果示于表14。
表14

表14的結(jié)果顯示，所有的酶在所有反應(yīng)形式(堿交換反應(yīng)或水解反應(yīng))和所有的反應(yīng)體系(使用有機(jī)溶劑的反應(yīng)或水類反應(yīng))中，通過含有NaCl的含水丙酮的清洗處理，達(dá)到檢出限度以下。此外，使用的酶的檢出限度，每1g卵磷脂，PLD為0.01U、PLA2為20.1U、脂肪酶為1U、蛋白酶為1U。由此可知，來自由磷脂的水解反應(yīng)得到的酶反應(yīng)液的殘留酶活性的除去或?yàn)榱耸惯@些酶失活而添加有蛋白酶的酶反應(yīng)液，與堿交換酶反應(yīng)液同樣能夠使用本發(fā)明的方法。特別地，對于磷脂餾分II和IV，PLD為檢出限度以下，所以，表示能夠同時(shí)進(jìn)行從水溶液的提取和清洗，此外顯示，分別添加構(gòu)成清洗用混合溶劑的物質(zhì)后進(jìn)行混合也是有效的。這表明，在酶反應(yīng)液中含有構(gòu)成清晰用混合溶劑的有機(jī)溶劑、水或無機(jī)金屬鹽時(shí)，將它們作為清洗溶劑組分，添加需要量的有機(jī)溶劑、水和無機(jī)金屬鹽的不足部分并攪拌，進(jìn)行與研究例3同樣的處理，由此能夠除去以PLD為首的磷脂的堿交換反應(yīng)或水解反應(yīng)中使用的酶或者除去用于使這些酶失活的酶的活性。
根據(jù)以上的研究結(jié)果，本發(fā)明的方法，與酶的種類無關(guān)，都可以利用。此外，本發(fā)明的方法能夠應(yīng)用于堿交換反應(yīng)和水解反應(yīng)，反應(yīng)體系不論是含有有機(jī)溶劑的體系還是不含有機(jī)溶劑的體系(水類)，都能夠應(yīng)用。本發(fā)明的方法，由于能夠從上述各種反應(yīng)體系中除去含有酶的蛋白質(zhì)等的雜質(zhì)，所以，作為酶的除去方法和磷脂的精制方法，可認(rèn)為是通用性高的方法。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，在使用酶的磷脂的堿交換反應(yīng)或水解反應(yīng)中，可以不使用加熱等方法而簡單地除去酶反應(yīng)液和反應(yīng)生成物中含有的酶和蛋白質(zhì)。因此，可容易地制造引起變態(tài)反應(yīng)的可能性降低、維持為高品質(zhì)、并且保存穩(wěn)定性優(yōu)異的各種磷脂。這樣的高品質(zhì)的磷脂可以用于以食品用途為首的各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種從磷脂的水解反應(yīng)或堿交換反應(yīng)中使用的酶反應(yīng)液中除去酶的方法，其特征在于，包括利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
2.一種磷脂的堿交換方法，其特征在于，包括使磷脂與選自醇類、糖類和含有羥基的環(huán)狀化合物中的具有醇式羥基的化合物，在能夠?qū)⒘字械膲A轉(zhuǎn)移到該化合物中的酶的存在下發(fā)生反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
3.一種磷脂的水解方法，其特征在于，包括在水的存在下，使磷脂與能夠?qū)⒘字獾拿高M(jìn)行反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液的工序；和利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述無機(jī)金屬鹽是選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、和硫酸鎂中的至少一種金屬鹽。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑是極性溶劑。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述極性有機(jī)溶劑是選自丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇、和甘油中的至少一種溶劑。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述混合溶劑含有30～70容量％的水和70～30容量％的有機(jī)溶劑，該混合溶劑中含有5～25質(zhì)量/容量％的無機(jī)金屬鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從磷脂的水解反應(yīng)或堿交換反應(yīng)中使用的酶反應(yīng)液中除去酶的方法。本發(fā)明的方法包括利用含有無機(jī)金屬鹽的、水和有機(jī)溶劑的混合溶劑對該酶反應(yīng)液進(jìn)行處理，將該酶除去的工序。根據(jù)本發(fā)明，可以不使用加熱等方法而簡單地除去反應(yīng)生成物中含有的酶，所以，可容易地制造引起變態(tài)反應(yīng)的可能性降低、維持為高品質(zhì)、并且保存穩(wěn)定性優(yōu)異的各種磷脂。
文檔編號C12N9/16GK1934263SQ20058000853
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者劉曉麗, 谷脅成幸 申請人:長瀨化成株式會社