專利名稱：合成膜錨著點的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂質(zhì)雙層(包括細胞膜)的合成分子。本發(fā)明特別而言，并非僅僅，涉及這些分子用作合成膜錨著點或者合成分子構造，從而在細胞表面抗原表達中實現(xiàn)定性和定量變化的用途。
背景技術：
細胞表面抗原介導大量細胞和它們環(huán)境之間的相互作用。這些相互作用包括細胞-細胞相互作用、細胞-表面相互作用和細胞-溶質(zhì)相互作用。細胞表面抗原還介導著細胞內(nèi)信號傳輸。
細胞通過表達的細胞表面抗原中的定性和定量差異進行特征化。在表達的細胞表面抗原中的定性和定量變化改變了細胞功能(作用方式)和細胞功能(提供的作用)。
能夠在通過細胞表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化具有診斷學和治療學價值。在通過細胞表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化的轉基因和非轉基因方法是已知的。
蛋白質(zhì)著色是一種在通過細胞表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化的非轉基因方法。這種方法利用了GPI連接蛋白質(zhì)經(jīng)它們的脂質(zhì)末端自發(fā)固著到細胞膜上的能力。描述于國際申請?zhí)朠CT/US98/15124(WO99/05255)附屬說明書中的方法包括將從生物源分離的GPI連接蛋白質(zhì)插入到膜內(nèi)的步驟。據(jù)稱這些分離的GPI-固著蛋白質(zhì)具有不尋常的與細胞表膜重新結合的能力。
細胞存在于含水的環(huán)境中。細胞膜為在細胞的細胞質(zhì)和此含水環(huán)境之間充當半滲透屏障的脂雙層。將抗原定位在細胞表面上還可以通過使用糖脂作為膜錨著點而得到實現(xiàn)。
描述于國際申請?zhí)朠CT/NZ02/00214(WO03/034074)附屬說明書中的方法包括將可控量的糖脂插入到膜內(nèi)的步驟。對插入的糖脂量進行控制，從而提供具有期望抗原表達水平的細胞。
描述于國際申請?zhí)朠CT/NZ03/00059(WO03/087346)附屬說明書中的方法包括將修飾的糖脂插入到作為“膜錨著點”的膜內(nèi)的步驟。修飾的糖脂供抗原在細胞或者多細胞結構表面定位之用。從而，新的特征可以給予到細胞或者多細胞結構。
這些方法一般都包括從生物源分離糖脂或者連接糖脂的抗原。從生物源分離糖脂或者連接糖脂的抗原是非常昂貴和易變的，并且可分離量通常會受到限制。從動物源獲得試劑用于治療學應用是尤其存在問題的，特別是意欲將該試劑或者其衍生物產(chǎn)品給藥至人類主體時。
優(yōu)選使用合成分子，因為由此受動物病原體污染的危險可以得到排除。已經(jīng)了報道天然存在糖脂的合成相應物和合成新糖脂。然而，對于欲用作膜錨著點的合成糖脂而言，它必須能夠自發(fā)和穩(wěn)定地摻入含水環(huán)境中的脂雙層中。合成糖脂在診斷學和治療學應用中的使用進一步受限于那些合成糖脂需要在鹽水中形成溶液。
用于促進糖脂在鹽水中溶解的有機溶劑和/或去垢劑必須是生物相容的。由于它們會對一些細胞膜造成損傷，因此通常必須將溶劑和去垢劑除去或者快速消除。溶劑或者去垢劑從所述制劑中的除去會成為一個難題。
對細胞膜的損傷可以得到防止，特別是其中細胞或者多細胞結構的供給源(例如胚胎)得到限制或者細胞為對攝動特別敏感的細胞(例如肝細胞)時。
就它們自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層(包括細胞膜)的能力而言，需要與天然存在的糖脂和連接糖脂的抗原功能等效的水溶性合成分子。
提供這種合成分子可以避免從生物源分離的糖脂和連接糖脂的抗原的局限性，并且可以促進在通過細胞表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化。
本發(fā)明的目的是提供這種合成分子和它們的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供用于診斷學和治療學應用中的合成分子。上述目的將分別進行闡述，同時目的是至少為公眾提供一種可用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面在于用作合成膜錨著點或者用于制備合成分子構造的結構為R-S2-L的分子，其中R為化學活性官能團；S2是將R連接至L的間隔基團；和L是選自以下的類脂二酰基-和二烷基-甘油脂，包括甘油基磷酸脂；和衍生于二?；?和二烷基-脂肪的鞘氨醇，包括N-脂?；拾贝肌?br> 優(yōu)選R選自，包括二(N-羥基琥珀酰亞胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)。
優(yōu)選S2選自以下，包括-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯(Ad))和-CO(CH2)5CO-。
優(yōu)選R和S2是酯連接的。
優(yōu)選L是選自二?；?和二烷基-甘油脂(包括甘油基磷酸脂)的脂質(zhì)。更優(yōu)選L選自衍生于一種或多種反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六碳烯酸、順式-6-十八碳烯酸、順式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、順式-11-十八碳烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸的二?；视椭?、磷脂酸酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油。更優(yōu)選衍生于一種或者多種順式-不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。最優(yōu)選L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；视?DOG)。
優(yōu)選L為甘油基磷酸脂和所述分子包括以下亞結構 其中n＝3～5，和*不是H。優(yōu)選n為3。
在具體實施方案中，所述分子具有以下結構 表示為Ad-DOPE；結構 表示為sp1-Ad-DOPE；或者結構 M一般為H，但是可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
本發(fā)明的第二方面在于結構為F-S1-S2-L的合成分子構造，其中F選自碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素；S1-S2是將F連接至L的間隔基團；和L為選自二?；?和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)和衍生于二酰基-和二烷基-脂的鞘氨醇(包括N-脂酰鞘氨醇)的脂。
優(yōu)選該分子為水溶性分子。
優(yōu)選當分子溶液與脂雙層接觸時，該分子自發(fā)摻入脂雙層中。更優(yōu)選該分子穩(wěn)定地摻入脂雙層中。
優(yōu)選F、S1、S2和L共價連接。
優(yōu)選F選自天然存在或者合成的glycotopes、抗體(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。最優(yōu)選F選自天然存在或者合成glycotopes或者抗體(免疫球蛋白)。
優(yōu)選L為選自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)的脂。更優(yōu)選L選自衍生于一種或多種反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六烯酸、順式-6-十八烯酸、順式-9-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、反式-11-十八烯酸、順式-11-十八烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸的二?；视椭?、磷脂酸酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油。更優(yōu)選所述脂衍生于一種或多種順式-不飽和脂肪酸。最優(yōu)選L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；?DOG)。
優(yōu)選L為甘油基磷酸脂，并且所述分子包括以下亞結構 其中n＝3～5，X為H或者C，并且*不為H。優(yōu)選n為3。
對S1-S2進行選擇，從而提供水溶性的合成分子構造。
在第一實施方案中，F(xiàn)為天然存在或者合成的glycotope。優(yōu)選F為三個(三糖)或者更多個糖單元組成的天然存在或者合成glycotope。更優(yōu)選F為選自以下的glycotopelacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列低聚糖。最優(yōu)選F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3Galβ；NeuAcα2-6Galβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
當F為glycotope時，L為甘油基磷酸脂和S2選自包括以下的基團-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-，優(yōu)選S1為選自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。更優(yōu)選S1為3-氨基丙基。
在第二實施方案中，F(xiàn)為介導細胞-細胞相互作用或者細胞-表面相互作用的分子。優(yōu)選F為對表達在靶細胞或者表面上的組分具有親合力的碳水化合物、蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)。更優(yōu)選F對表達在上皮細胞或者細胞外間質(zhì)的組分具有親和力。更優(yōu)選F對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)的組分具有親和力。最優(yōu)選表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者為外源性摻入組分。
在第三實施方案中，F(xiàn)為介導細胞溶質(zhì)間相互作用的分子。優(yōu)選F為結合分子的配體，其中結合分子的存在用于診斷病理癥狀。更優(yōu)選F為抗體(免疫球蛋白)配體。
在具體的實施方案中，所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DOPE(I)；結構
表示為Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；結構 表示為Atri-sp-Ad-DSPE(III)；結構 表示為Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；結構
表示為Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；結構 表示為Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；結構 表示為Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；或者結構
表示為Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
M一般為H，但是可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
本發(fā)明的第三方面在于制備結構為F-S1-S2-L的合成分子構造的方法，包括以下步驟1.使活化劑(A)與脂(L)反應，從而提供活化脂(A-L)；2.對抗原(F)進行衍生，從而提供衍生化的抗原(F-S1)；和3.使A-L與F-S1縮合，從而提供分子；其中A為選自以下的活性劑，包括(C3～C7)含碳二酸(carbodioicacids)的二(N-羥基琥珀酰亞胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)酯。
L為選自二?；?和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)和衍生于二酰基-和二烷基-脂的鞘氨醇(包括N-脂酰鞘氨醇)的脂。
F為選自碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素的抗原；和S1-S2為將F連接至L的間隔基團，其中S1選自以下，包括伯氨基烷基、仲脂肪族烷基烷基或者伯芳香胺；和S2不存在或者選自以下，包括-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)和-CO(CH2)5CO-。
優(yōu)選該分子為水溶性分子。
當分子溶液與脂雙層接觸時，優(yōu)選該分子自發(fā)摻入脂雙層中。更優(yōu)選該分子穩(wěn)定地摻入脂雙層中。
優(yōu)選F、S1、S2和L共價連接。
優(yōu)選F選自天然存在或者合成的glycotopes、抗體(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。最優(yōu)選F選自天然存在或者合成的glycotopes或者抗體(免疫球蛋白)。
優(yōu)選L為選自二?；?和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)的脂。更優(yōu)選L選自二?；视椭⒘字狨?phosphatidate)、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和由以下一種或多種物質(zhì)衍生得到的雙磷脂酰甘油反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六烯酸、順式-6-十八烯酸、順式-9-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、反式-11-十八烯酸、順式-11-十八烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸。更優(yōu)選所述脂衍生于一種或多種順式-不飽和脂肪酸。最優(yōu)選L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；?DOG)。
優(yōu)選L為甘油基磷酸脂，并且所述分子包括以下亞結構 其中n＝3～5，X為H或者C，并且*不為H。優(yōu)選n為3。
優(yōu)選對A(R-S2)和S1進行選擇，從而提供水溶性的合成分子構造。
在第一實施方案中，F(xiàn)為天然存在或者合成的glycotope。優(yōu)選F為三個(三糖)或者更多糖單元組成的天然存在或者合成glycotope。更優(yōu)選F為選自以下的glycotopelacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列低聚糖。最優(yōu)選F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3Galβ；NeuAcα2-6Galβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
當F為glycotope時，L為甘油基磷酸脂和S2選自包括以下的基團-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-(例如，A是雙(N-羥基琥珀酰亞胺)(己二酸酯))和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-，優(yōu)選S1為選自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。更優(yōu)選S1為3-氨基丙基。
在第二實施方案中，F(xiàn)為介導細胞-細胞相互作用或者細胞-表面相互作用的分子。優(yōu)選F為對表達在靶細胞或者表面上的組分具有親合力的碳水化合物、蛋白質(zhì)或行脂質(zhì)。更優(yōu)選F對表達在上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。更優(yōu)選F對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。最優(yōu)選表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者為外源性摻入組分。
在第三實施方案中，F(xiàn)為介導細胞溶質(zhì)間相互作用的分子。優(yōu)選F為結合分子的配體，其中結合分子的存在用于診斷病理癥狀。更優(yōu)選F為抗體(免疫球蛋白)配體。
在具體的實施方案中，所述水溶性的合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DOPE(I)；結構
表示為Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；結構 表示為Atri-sp-Ad-DSPE(III)；結構 表示為Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；結構
表示為Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；結構 表示為Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；結構 表示為Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；或者結構
表示為Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
本發(fā)明的第四方面在于根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法制備的水溶性合成分子構造。
本發(fā)明的第五方面在于在通過細胞或者多細胞結構表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化的方法，包括以下步驟1.在足以在通過細胞或者多細胞結構表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化的溫度和時間下，使細胞或者多細胞結構的懸浮液與根據(jù)本發(fā)明第二方面或者第四方面的合成分子構造接觸。
優(yōu)選所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
優(yōu)選水溶性合成分于構造在懸浮液中的濃度為0.1～10mg/mL。
優(yōu)選所述溫度為2～37℃。更優(yōu)選所述溫度為2～25℃。最優(yōu)選所述溫度為2～4℃。
在第一實施方案中，所述細胞為紅血球。
在此實施方案中，優(yōu)選F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3 Galβ；NeuAcα2-6Galβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。更優(yōu)選F為選自低聚糖GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ和Galα1-3(Fucα1-2)Galβ的glycotopes。
優(yōu)選所述合成分子構造選自以下，包括Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第二實施方案中，所述多細胞結構為胚胎。
在此實施方案中，優(yōu)選F為連接分子，其中該連接分子對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者為外源性摻入組分。
優(yōu)選所述合成分子構造選自以下，包括Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第三實施方案中，所述細胞為紅血球。
在此實施方案中，優(yōu)選F為結合分子的配體，其中結合分子的存在用于診斷病理癥狀。更優(yōu)選F為抗體(免疫球蛋白)配體。
本發(fā)明的第六方面在于含有根據(jù)本發(fā)明第二或者第四方面的水溶性合成分子構造的細胞或者多細胞結構。
優(yōu)選所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
在第一實施方案中，所述細胞為含有選自以下水溶性合成分子構造的紅血球，包括Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第一實施方案中，所述多細胞結構為摻入選自以下水溶性合成分子構造的胚胎Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
本發(fā)明的第七方面在于包括根據(jù)本發(fā)明第一方面的分子的干燥制劑或者溶液的試劑盒，或者根據(jù)本發(fā)明第二或者第四方面的水溶性合成分子構造的干燥制品或者溶液的試劑盒。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明第一方面的分子選自Ad-DOPE；sp1-Ad-DOPE；和Ad-DSPE。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明第二或者第四方面的水溶性合成分子構造選自Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
本發(fā)明的第八方面在于，包括根據(jù)本發(fā)明第六方面的細胞或者多細胞結構的懸浮溶液形式的混懸物的試劑盒。
優(yōu)選所述懸浮溶液基本不含脂。
優(yōu)選所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
優(yōu)選所述細胞為不天然表達A-或者B-抗原并且摻入選自以下的水溶性合成分子構造的紅血球Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。更優(yōu)選所述細胞為靈敏度對照。
本發(fā)明的第九方面在于包括根據(jù)本發(fā)明第二或者第五方面的水溶性合成分子構造的干燥制品或者溶液的藥物制劑。
優(yōu)選所述藥物制劑為吸入給藥的制劑形式。
優(yōu)選所述藥物制劑為注射給藥的制劑形式。
本發(fā)明的第十方面在于包括根據(jù)本發(fā)明第六方面的細胞或者多細胞結構的藥物制劑。
優(yōu)選所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
優(yōu)選所述藥物制劑為吸入給藥的制劑形式。
優(yōu)選所述藥物制劑為注射給藥的制劑形式。
發(fā)明詳述當分子溶液與脂雙層接觸時，本發(fā)明的合成分子構造自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層(比如膜)中。雖然并不希望由理論對其進行限定，但是可以相信，脂(L)的脂末端插入膜內(nèi)是熱力學有利地。隨后合成分子構造從脂質(zhì)膜的解離被認為是熱力學不利地。驚人地，還發(fā)現(xiàn)在此確定的合成分子構造具有水溶性。
本發(fā)明的合成分子構造用于轉化導致表達的表面抗原中產(chǎn)生定性和/或定量變化的細胞。應當承認，根據(jù)本發(fā)明的細胞轉化作用不同于通過基因工程進行的細胞轉化作用。本發(fā)明提供細胞的表型轉化作用，不提供遺傳轉化作用。
在本說明書上下文中，關于細胞而使用的術語“轉化作用”是指將外源性制備的合成分子構造插入或者摻入細胞膜中，從而在通過細胞表達的細胞表面抗原中實現(xiàn)定性和定量變化。
本發(fā)明的合成分子構造包括經(jīng)間隔基團(S1-S2)與脂質(zhì)部分連接的抗原(F)。所述合成分子構造可以通過縮合抗原的伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺衍生物與活化脂質(zhì)而進行制備。制備擬糖復合物方法已經(jīng)得到了綜述(Bovin，N.Biochem.Soc.Symp.，69，143-160)。
使用本發(fā)明的合成分子構造，期望的表型轉化作用可以通過一步法或者二步法實現(xiàn)。在一步法中，水溶性合成分子構造(F-S1-S2-L)包括表面抗原作為F。
在二步法中，合成分子構造(F-S1-S2-L)包括作為官能團的抗原(F)，合成分子構造插入到膜中后，表面抗原可以連接到該官能團上。所述官能團可以為比如外源凝集素、抗生物素蛋白或者生物素的基團。當用于兩步法時，所述合成分子構造充當合成膜錨著點的作用。
根據(jù)本發(fā)明對伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及脂質(zhì)活化劑進行選擇，從而提供具有水溶性的合成分子構造，并且當該合成分子構造溶液與脂雙層接觸時它將自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層。
在此說明書上下文中，措詞“水溶性”是指在不存在有機溶劑或者去垢劑下，當合成分子構造與水或者鹽水接觸時穩(wěn)定的單相系統(tǒng)得到形成，并且術語“溶液”具有相應的含義。
在本說明書上下文中，措詞“穩(wěn)定地摻入”是指合成分子構造摻入脂雙層或者膜內(nèi)，同時在脂雙層或者膜與脂雙層或者膜的外部含水環(huán)境之間具有最小繼發(fā)交換。
伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及活化劑的選擇取決于要連接到脂質(zhì)(L)的抗原(F)的理化性質(zhì)。
本領域熟練的技術人員應當理解，對于非特異性相互作用，比如二?；?或者二烷基-甘油酯和膜之間的相互作用，天然存在脂質(zhì)的結構異構體和立體異構體也是功能等效的。例如，發(fā)明人可以預期二酰甘油2-磷酸酯可以被磷脂酸酯(二酰甘油3-磷酸酯)代替。此外，本發(fā)明發(fā)明若可以預期磷脂酸酯的絕對構型可以為或者R或者S。
本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)確定，為了制備其中抗原(F)是選自ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotopes的寡糖的本發(fā)明合成分子構造，應當對伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及活性劑進行選擇，從而提供具有一種根據(jù)下表中結構的間隔基團(S1-S2)


本領域熟練的技術人員應當理解，一旦用于給定類型抗原的間隔基團(S1-S2)的結構得到確定，可以采用相同結構的間隔基團制備具有類似理化性質(zhì)的其它類型抗原的合成分子構造。
例如，對于其中F是ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotope的合成分子構造(F-S1-S2-L)的間隔基團結構，也可以對該間隔基團結構進行選擇，以制備理化性質(zhì)與ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotopes相似的其它抗原的合成分子構造。
原則上，糖脂或者糖蛋白相關的大量血型的glycotope都可以是合成分子構造F-S1-S2-L的抗原(F)，其中S1-S2-L與表示為以下的合成分子構造的相應部分相同或者等效Atri-sp-Ad-DOPE(I)，Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)，Atri-sp-Ad-DSPE(III)，Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，Htri-sp-Ad-DOPE(VII)，Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)，Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)，F(xiàn)ucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
已知的相關血型糖脂和糖蛋白(參見參考文獻)的結構提供于以下糖脂*(*通常，對于幾乎所有的A-抗原實施例，末端A糖基GalNAc都可以替換為B糖基Gal。另外，缺乏A或者B抗原決定簇就形成等量的H抗原決定簇。)A-6-1 A-6-2 A-7-2(ALey) A-7-1(ALeb) A-7-4 A-8-2 A-9-3
A-12-2 A-14-2 A-16-2 乳糖基?；拾贝?Lactosylceramide)Galβ1→4Glcβ1→1Cer血糖苷脂/GM3NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1CerLactotriaosylceramideGlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerGlobotriaosylceramide/PkGalα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer紅細胞糖苷脂/PGalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Paragloboside/neolactotetraosylceramideGalβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerLec-4/LactotetraosylceramideGalβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerSialoyl paragloboside/sialoyl neolactotetraosylceramideNeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerH-5-1 Lex-5 H-5-2 Lea-5 SialylLex Sialyl Lea-6/胃腸癌癥抗原(GlCA或者Ca 19-9)
Disialoyl Lea-7 Leb-6 Ley-6 P-likeGalNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer福斯曼抗原GalNAcα1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1CerCad紅血球 Cad肝癌抗原 P1Galα1→4Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerLKE/’GL 7/SSEA-4
NeuAcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1CerB-6-1 H-6-4 B-6-2 BLeb-7 BLey-7 i抗原/乳糖基-N-nor-hexaosylceramideGalβ1→4GlcNAclβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerSialyl-nor-hexaosylceramide/sialoyl-lacto-N-nor-hexaosylceramideNeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAclβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1CerLex-7 H-8-3
Lex-8 Leb-8 Lea-11 B-8-2 I抗原 Lec-9(fucosylated backbone) Lec-9(fucosylated branch)
VIM-2 紅血球Fl抗原 Lex-11 B-12-2 B-14-2
B-16-2 I-active polyglycosylceramide O-連接糖蛋白Monosialotrisaccharide Disialotetrasaccharide Disialoyl group oligosaccharide H-活化三糖
Sialylated H-活性四糖 Cad寡糖 GlcNAc寡糖 粘蛋白寡糖/A-活性糖蛋白 卵巢囊腫A-活性糖蛋白-6a 卵巢囊腫A-活性糖蛋白-6b 卵巢囊腫Lea-活性糖蛋白-7
卵巢囊腫Lea-活性糖蛋白-10 卵巢囊腫A-活性糖蛋白-18 N-連接糖蛋白復型/堿金屬-穩(wěn)定鏈 混合型

Tamm-Horsfall糖蛋白 高-甘露糖型 二烷基胎兒紅血球抗原
Trisialoyl胎兒紅血球抗原(disialoyl group on branch) Monofucosyl-monosialyl foetal erythrocyte antigen(fucosylated backbone) Monofucosyl-monosialyl foetal erythrocyte antigen(fucosylated branch) Monofucosyl-disialyl foetal erythrocyte antigen(disialyl group on branch)
Difucosyl foetal erythrocyte antigen Foetal lactosaminoglycan Adult lactosaminoglycan Monofucosyl-monosialoyl adult erythrocyte antigen Monofucosyl-monosialoyl adult erythrocyte antigen Difucosyl adult erythrocyte antigen
關鍵Gl＝D-Gal，Gc＝D-Glc，GcN＝D-GlcNAc，M＝D-Man，F(xiàn)＝L-Fuc，NA＝NeuAc.
本領域熟練技術人員應當理解，其中F是寡糖的本發(fā)明合成分子構造(F-S1-S2-L)可以用作“合成糖脂”并且可以代替從生物(植物或者動物)源獲得的糖脂。
在本發(fā)明說明書上下文中，術語“糖脂”是指兩親性質(zhì)碳水化合物的脂質(zhì)，包括糖基化甘油脂，比如糖基化磷酸甘油脂和糖基甘油脂；糖基化鞘脂(中性糖脂)，比如糖基神經(jīng)酰胺或者腦苷脂；和神經(jīng)節(jié)苷脂(酸性糖脂)。
在本發(fā)明說明書上下文中，措詞“連接糖脂的抗原”是指含有碳水化合物的脂質(zhì)，其中抗原(例如蛋白質(zhì))經(jīng)分子的碳水化合物部分連接到糖脂上。連接糖脂的抗原的實例包括GPI-連接蛋白質(zhì)。
本領域熟練技術人員可以理解，糖脂本身為一種抗原。術語和措詞“糖脂”和“連接糖脂的抗原”用來區(qū)分其中抗原是糖脂的天然存在分子和其中抗原(例如蛋白質(zhì))經(jīng)糖脂的碳水化合物部分連接到糖脂上的天然存在分子。照此類推，根據(jù)抗原可以是合成糖脂自身或者可以連接到合成糖脂上，本發(fā)明的合成分子構造既可以稱為“合成糖脂”也可以稱為“合成膜錨著點”。
本領域熟練的技術人員應當理解，通過描述于國際申請?zhí)朠CT/NZ2003/00059(公開為WO03087346)附屬說明書的方法，糖脂的碳水化合物部分還可以進行修飾或者連接其它抗原。
在本發(fā)明說明書上下文中，術語“glycotope”是指位于糖脂的碳水化合物部分的抗原決定簇。在血型血清學中，糖脂質(zhì)抗原的分類基于糖脂的碳水化合物部分的結構進行。
在血型血清學中，熟知A-抗原的glycotopes的末端糖基為GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ，和B-抗原的glycotopes的末端糖基為Galα1-3(Fucα1-2)Galβ。摻入膜內(nèi)的本發(fā)明其中F為GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ或者Galα1-3(Fucα1-2)Galβ的水溶性合成分子構造分別提供了與A-抗原或者B-抗原表達RBCs血清學相當?shù)腞BCs。
天然存在的A-或者B-抗原碳水化合物部分的末端三個糖基是A和B血型鑒定的抗原決定簇。天然存在A-抗原碳水化合物部分的末端四或者五個糖基是血液亞型A型1、A型2等等的抗原決定簇。據(jù)此，結合有本發(fā)明合成分子構造的RBCs可以用于對不同特異性的血型測定試劑(抗體)進行特征化和區(qū)分。
本發(fā)明發(fā)明人對排除了碳水化合物部分的本發(fā)明水溶性合成分子構造進行了預期。在所述“合成糖脂”中，不是碳水化合物或者寡糖但是具有類似理化性質(zhì)的抗原可以代替F。
本發(fā)明發(fā)明人還對包括與碳水化合物或者寡糖理化性質(zhì)不同的抗原(F)的本發(fā)明合成分子構造進行了預期。含有這些抗原的水溶性合成分子構造可以通過選擇不同的間隔基團而得到制備。
當用于國際申請?zhí)朠CT/N02/00212(公開為WO03/034074)和PCT/NZ03/00059(公開為WO03087346)說明書所述的發(fā)明實踐中時，將會產(chǎn)生由本發(fā)明合成分子構造提供的優(yōu)點。這些申請的附屬說明書在此引入作為參考。
在本發(fā)明實踐中，所述合成分子構造克服了許多使用天然糖脂的局限性。所述合成分子構造的具體優(yōu)點是它們的性能優(yōu)越并且它們具有在低溫(例如4℃)下轉化細胞的能力。
如本文中所述，并非所有的間隔基團(S1-S2)結構都能提供具有水溶性并且自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層(比如細胞膜)中的合成分子構造(F-S1-S2-L)。表示為Atri-sp-lipid(IV)和Atri-PAA-DOPE(V)的合成分子構造確定不具有水溶性和/或不能自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層(比如細胞膜)中。
表示為Atri-sp-lipid (IV) 表示為Atri-PAA-DOPE(V)其中x，y＝0.05～0.2本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下非限制性實施例和附圖進行說明，其中

圖1顯示了在(從左到右)為10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、2mg/mL*和1mg/mL下，通過天然A糖脂轉化溶液轉化的CellstabTM貯存的細胞的Diamed結果。使用的抗血清為Albaclone(頂部)和Bioclone(底部)。(*——在培養(yǎng)之后未對轉化溶液(含有糖脂)進行沖洗，將其放置過夜和第二天對其進行沖洗。)圖2顯示了在(從左到右)為10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、2mg/mL*和1mg/mL下，通過天然B糖脂轉化溶液轉化的CellstBbTM貯存的細胞的Diamed結果。使用的抗血清為Albaclone(頂部)和Bioclone(底部)。(*——在培養(yǎng)之后未對轉化溶液(含有糖脂)進行沖洗，將其放置過夜和第二天對其進行沖洗。)。
圖3表示在三種轉化溫度下，37℃(頂部)、22℃(中間)和4℃(底部)，使用天然Leb-6糖脂進行的人類Le(a-b-)紅血球體外轉化作用的FACS分析隨時間的變化。
圖4表示在4℃下通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化溶液進行的細胞轉化的Diamed結果，所述轉化溶液(從左到右)洗滌的0.08mg/mL；未洗滌的0.08mg/mL；洗滌的0.05mg/mL；未洗滌的0.05mg/mL；洗滌的0.03mg/mL；和未洗滌的0.03mg/mL。使用的抗血清為Bioclone anti-A。
圖5顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞，在4℃下通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化溶液進行轉化的細胞的Diamed結果，所述轉化溶液(從左到右)0.08mg/mL、0.05mg/mL和0.03mg/mL。使用的抗血清為Bioclone anti-A。
圖6在左側欄顯示了在4℃下，通過Btri-sp-Ad-DOPE(VI)轉化溶液進行的細胞轉化Diamed結果，所述轉化溶液(從左到右)洗滌的0.6mg/mL；未洗滌的0.6mg/mL；洗滌的0.3mg/mL；未洗滌的0.3mg/mL；洗滌的0.15mg/mL；和未洗滌的0.15mg/mL；和在右側欄中顯示了在4℃下，通過Btri-sp-Ad-DOPE(VI)轉化溶液進行的細胞轉化Diamed結果，轉化溶液(從左到右)洗滌的0.08mg/mL；未洗滌的0.08mg/mL；洗滌的0.05mg/mL；未洗滌的0.05mg/mL；洗滌的0.03mg/mL；和未洗滌的0.03mg/mL。使用的抗血清為Bioclone Bnti-B。
圖7顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞，在4℃下通過Btri-sp-Ad-DOPE(VI)轉化溶液進行轉化的細胞的Diamed結果，轉化溶液(從左到右)0.6mg/mL、0.3mg/mL和0.15mg/mL。
圖8顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.07+B0.3mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含未洗滌的A0.07+B0.3mg/mL。
圖9顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.07+B0.3mg/mL。
圖10顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.07+B0.2mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含未洗滌的A0.07+B0.2mg/mL。
圖11顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.07+B0.2mg/mL。
圖12顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.06+B0.3mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含未洗滌的A0.06+B0.3mg/mL。
圖13顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.06+B0.3mg/mL。
圖14顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.06+B0.2mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含未洗滌的A0.06+B0.2mg/mL。
圖15顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞，在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.06+B0.2mg/mL。
圖16顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.05+B0.3mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含末洗滌的A0.05+B0.3mg/mL。
圖17顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞，在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.05+B0.3mg/mL。
圖18顯示了在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含經(jīng)洗滌的A0.05+B0.2mg/mL。針對抗A和抗B，管3和4包含未洗滌的A0.05+B0.2mg/mL。
圖19顯示了在試驗之前不進行洗滌的細胞，在4℃下，通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行轉化作用轉化的細胞的Diamed結果。針對抗A和抗B，管1和2(從左到右)包含未洗滌的A0.05+B0.2mg/mL。
對比實施例這些對比實施例并不構成本發(fā)明權利要求部分。這些對比實施例描述了使用天然糖脂進行的紅血球轉化。
對比實施例1-天然糖脂的制備通過HPLC純化在第一階段，在每次運行之前都用干燥二氧化硅(15～25μm)對柱進行填充。因為二氧化硅可以進行排除以及理論上其可以高水平不可逆地粘結雜質(zhì)，因此可以對相對臟的樣品使用HPLC。
在硅膠上對糖脂進行分離，使用極性升高的流動相。洗脫程序為線性梯度，開始為100％的氯仿-甲醇-水80∶20∶1(v/v)，最終為100％的氯仿-甲醇-水40∶40∶12(v/v)。
使用的HPLC設備是能夠以程序比例泵入和混合四種分離溶劑的Shimadzu系統(tǒng)。由于氯仿、甲醇和水以不同的速率蒸發(fā)，因此對程序進行開發(fā)，使得所述溶劑組分在未進入HPLC不進行混合。
所述Shimadzu HPLC通過依次從四個燒瓶之一中提取“彈藥”混合四種不同的液體。在管道中氯仿和水“彈藥”彼此直接相接會引起混溶性問題。甲醇需要夾在這兩個不互溶的組分之間。另外，將水與甲醇按1∶1的比例進行預混合，以進一步避免混溶性問題。
對比實施例2-使用天然糖脂進行的紅血球轉化的轉化作用凝集除了使用常規(guī)的試管血清學之外，使用Diamed-ID Micro Typing System通過凝集作用對紅血球的轉化作用進行評價。不使用Diamed ABO分型卡。使用的卡為NaCl、酶試驗和冷凝集素卡，它們不預裝載任何抗血清或者其它試劑。這允許以兩種方法應用特異抗血清。
表1凝膠-卡片

在試管血清學和Diamed系統(tǒng)之間進行對比試驗，以確定兩個系統(tǒng)的性能。細胞在25℃下轉化4小時。使用計量相等的Seraclone和Alba-clone抗A血清。所得結果示于下表3中。
表2.在試管血清學與Diamed系統(tǒng)對比中使用的抗血清。

表3.試管血清學與Diamed系統(tǒng)比較的凝集結果

在此試驗中，經(jīng)證實，使用Seraclone抗A而非Albaclone時Diamed系統(tǒng)比試管血清學對弱反應更為敏感。這些試劑進行了不同配制，由此不能期望它們等同進行。然而，，Seraclone抗A試管血清學組合可能因為操作者的介入因素確實不能檢測確定性(positivity)。由此，弱反應就非常難以得到精確評分，在試管血清學中，1+和0之間的差異可能難以辨別。
最優(yōu)化對變量糖脂濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)持續(xù)時間、稀釋劑和貯存溶液進行了測定，以測定它們對細胞健康的影響。通過與相關抗體的凝集作用對轉化作用的效率和穩(wěn)定性進行了評價。
表4.天然糖脂A轉化細胞在不同時間和溫度下的試管血清學凝集作用。

糖脂濃度使用高度純化(HPLC)的Leb糖脂樣品和純度較差的血型A糖脂樣品進行初始轉化試驗。轉化作用在37℃下進行1.5小時。
A糖脂樣品含有其它脂質(zhì)雜質(zhì)，并且由此與相同濃度(w/v)的Leb糖脂樣品相比，它含有按重量計相對較少的血型A分子。這由與Leb糖脂相比，產(chǎn)生同等的凝集評價(參見表6)需要更高濃度的A糖脂而得到證實。
A糖脂樣品中雜質(zhì)的濃度還可能有助于降低其在62天周期內(nèi)的穩(wěn)定性——A-轉化細胞在最高濃度時“死亡”(接收了最高劑量的雜質(zhì))。
表5.用于天然糖脂轉化作用初始試驗的抗-A和抗-Leb。

表6.在62天周期內(nèi)，通過試管血清學凝集作用評價的使用天然A和Leb糖脂轉化的RBCs的穩(wěn)定性。


還對上述細胞的溶血強度速率進行了測定并且這些結果示于下表7中。
表7.直觀評價的溶血作用。第1天——轉化之后第一次洗滌的上清液；第25和62天——在貯存后細胞再懸浮之前的細胞防腐液中。評價尺度類似于從4+～0的凝集作用評價尺度hhhh-劇烈溶血，hhh—非常溶血，hh-中等溶血，h-適度溶血，w-微弱溶血和0-未觀察到溶血。

這些結果表明，細胞溶血作用可以被證明與高濃度糖脂的轉化作用相關。現(xiàn)在還不清楚進行上述作用的機制是否是通過大量插入的糖脂分裂胞質(zhì)膜、上述插入速率或者可能是由于相關雜質(zhì)的數(shù)量導致。然而，Leb在第62天時的結果看來支持第一種解釋。
在進行溶解之前，Leb樣品是高度純化的，它是一種純白顏色的粉末，并且因此所述溶血作用不可能是由于雜質(zhì)的有害作用。參照第62天時很顯然，溶血作用的量隨著糖脂濃度的降低產(chǎn)生了減少。
培養(yǎng)溫度進行此試驗以研究在插入步驟期間降低RBCs溶血作用的其它可能機制。先前試驗已經(jīng)表明，同低濃度時相比，較高糖脂濃度的溶血作用較差，由此可以認為溶血作用還可能與糖脂插入的速率相關。因為人們認為溫度會影響插入的速率，因此進行試驗，比較37℃時的轉化作用和室溫下(RT；25℃)的轉化作用。
因為預計速率會由于溫度降低而下降，因此室溫試驗的培養(yǎng)期為4小時。在插入后，對溶血作用進行直觀估定和評價。還在細胞上進行血清學試驗。結果示于表8中。
表8.在將糖脂插入RBC膜期間，培養(yǎng)溫度對溶血作用和凝集作用的影響。在三次洗滌的每次洗滌之時對溶血作用進行直觀評價。

培養(yǎng)持續(xù)時間在37℃下培養(yǎng)進行1和2小時，以及它對細胞健康和通過與相關抗體的凝集作用進行評價的轉化作用的影響。
表9.在培養(yǎng)試驗持續(xù)期間使用的抗血清。

表10.培養(yǎng)時間對用天然糖脂轉化的細胞凝集作用的影響

這些結果表明，在天然糖脂插入期間增加培養(yǎng)持續(xù)時間不會增強凝集作用。事實上，在兩小時培養(yǎng)之后凝集作用評價還會降低。這可能是由于膜的去穩(wěn)定性或者糖脂重新返回溶液所致。
稀釋還進行了下述試驗以確定改變糖脂稀釋溶液是否會降低溶血作用。將PBS工作強度與2×PBS以及有2％牛血清蛋白(BSA)的PBS工作強度進行比較。細胞在37℃下培養(yǎng)1.5小時。結果示于表11中。
表11.在將糖脂插入RBC膜期間，改變糖脂稀釋溶液對溶血作用影響的研究。

穩(wěn)定性在將A和B血型糖脂HPLC純化至可接受的程度后，進行試驗以尋找用于穩(wěn)定性試驗的適當濃度。
表12.用天然A糖脂轉化的細胞的早期穩(wěn)定性試驗。

表13.用于穩(wěn)定性試驗(表14和表15)的抗血清。

表14.為了確定用于穩(wěn)定性試驗的適當濃度，用A糖脂轉化的O RBCs試管血清學。

1&2 在25℃下轉化4小時表15.為了確定用于穩(wěn)定性試驗的適當濃度，用B糖脂轉化的O RBCs試管血清學。

1&2 在25℃下轉化4小時兩組細胞使用不同濃度的天然A糖脂進行轉化。轉化作用在25℃下進行。對一組細胞進行長期試驗，而另一組細胞每周進行凝集作用試驗。由試管血清學和Diamed得到的凝集作用結果示于下表16中。所有細胞都貯存在CellstabTM中，放在平底燒瓶中。在任何時候，這些細胞都表現(xiàn)最低程度的溶血作用，甚至沒有溶血作用。
表16.使用不同濃度天然A糖脂進行轉化的細胞的凝集結果。結果使用Albaclone抗-A獲得。

*-Albaclone，同時其它都使用Seraclone抗-A.
貯存溶液對兩種細胞貯存溶液(CelpresolTM(CSL)和CellstabTM(Diamed))進行比較，以試驗它們保持修飾的RBCs的相抵能力。
當貯存入兩種不同的防腐液-CellstabTM和AlseversTM中時，對使用不同濃度血型A和B抗原溶液轉化的RBCs的穩(wěn)定性進行了試驗。
將來自兩種不同來源的A和B抗血清用于血清學試驗中。
全部細胞都使用標準試管血清學平臺試驗高達42天，此時細胞凝集反應已經(jīng)達到了難以人工評價的程度(A結果參見表17，和R結果參見表18)。
對Alsevers貯存細胞進行Diamed凝膠-卡片試驗至56天，該試驗在第63天時由于真菌污染而停止(雖然仍然返回陽性評價)。對CellstabTM貯存細胞持續(xù)試驗至高達70天，并且此時仍然可行(A結果參見圖1，和B結果參見圖2)。
用于穩(wěn)定性試驗的試劑示于表13中。
表17.使用不同濃度的A糖脂轉化和貯存在或者CellstabTM或者AlseversTM中的細胞穩(wěn)定性試驗的試管血清學結果

*-在培養(yǎng)之后未對轉化溶液(含有糖脂)進行洗滌，將其放置過夜和第二天對其進行洗滌。
≠-陽性細胞標志(Button)，但是細胞負性減少(不可能評價)
表18.使用不同濃度的B糖脂轉化和貯存在或者CellstBbTM或者AlseversTM中的細胞穩(wěn)定性試驗的試管血清學結果

*-在培養(yǎng)之后未對轉化溶液(含有糖脂)進行洗滌，將具放置過夜和第二天對其進行洗滌。
≠-陽性細胞標志，但是細胞負性減少(不可能評價)。
糖脂插入的FACS分析使用天然Leb-6糖脂進行的人類Le(a-b-)紅血球體外轉化作用的FACS分析隨時間的變化在三種轉化溫度下(37℃、22℃和4℃)下進行(圖3)。將天然Leb-6糖脂溶于血漿中并且其用于轉化RBCs，最終濃度為2mg/mL和最終懸浮為10％。
通過FACS分析，使用γ抗-Leb對反應性進行確定。(血清學檢測級別為102個分子。天然糖脂在4℃下進行的8小時插入通過與抗體的凝集作用是不可檢測的。)由FACS分析得到插入曲線的速率射影并沒有表明在4℃下，插入速率在24小時內(nèi)將會達到凝集作用檢測水平。
低培養(yǎng)溫度使用天然A或B糖脂的RBCs轉化作用在37℃下進行1小時和在2℃下進行不同的時間。細胞與Bioclone抗-A或者Bioclone抗-B凝集在一起。所得結果提供于表19和20中。
表19.天然A糖脂轉化作用在37℃下進行1小時和在2℃下進行不同時間的對比Diamed結果。

表20.天然B糖脂轉化作用在37℃下進行1小時和在2℃下進行不同時間的對比DiBmed結果。

對于天然A糖脂和天然B糖脂而言，在2℃下，它們的轉化速率都緩慢，如1小時之后的負凝集作用評價所表明。在37℃，在此時間間隔下表現(xiàn)了顯著的插入作用。
在2℃下，天然A糖脂需要插入48小時才能達到通過在37℃下轉化作用可獲得的相同插入水平。在此時間之后，沒有觀察到進一步的插入作用。同樣地，天然B糖脂在2℃下的插入作用也沒有37℃下的轉化作用迅速。通過繼續(xù)培養(yǎng)并不能促進凝集作用評價，由此看來，對于這些濃度此時已經(jīng)達到了最大插入。
實施例以下實施例描述了使用本發(fā)明合成分子構造的紅血球轉化作用。在這些實施例范圍內(nèi)，術語“合成糖脂”用來指代上述這些構造。
實施例1-合成糖脂的制備物質(zhì)和方法TLC分析在硅膠60 F254板(Merck)上進行，化合物通過用8％磷酸水溶液點板，隨后在超過200℃的溫度下加熱進行檢測。柱色譜在硅膠60(0.2～0.063mm，Merck)或者葡聚糖凝膠LH-20(Amersham)上進行。1H NMR光譜在Bruker DRX-500波譜儀上獲得。化學位移以ppm(δ)相對于CD3OD給出。
活化1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)(甘油基磷酸脂)的合成向二(N-羥基琥珀酰亞胺基)己二酸酯(A)(70mg，205μmol)的無水N，N-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中加入DOPE或者DSPE(L)(40μmol)的氯仿(1.5ml)溶液，隨后向其中加入三乙胺(7μl)。將上述混合物在室溫下保持2小時，然后用乙酸對其進行中和并且在真空中進行部分濃縮。
對所得殘余物進行柱色譜(葡聚糖凝膠LH-20，1∶1氯仿-甲醇，0.2％乙酸)分離，得到為無色漿狀的活化脂質(zhì)(A-L)(37mg，95％)；TLC(氯仿-甲醇-水，6∶3∶0.5)Rf＝0.5(DOPE-A)，Rf＝0.55(DSPE-A).
1H NMR(CDCl3/CD3OD，2∶1)，δDOPE-A-5.5(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.58(dd，1H，J＝3.67，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.34(dd，1H，J＝6.61，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.26(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.18(m，2H，-CH2-OP)，3，62(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.8(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.50(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.17(m，8H，2×(-CH2-CH-CH2-)，1.93(m，4H， COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2×(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2bs，40H，20CH2)，1.04(m，6H，2CH3).
DSPE-A-5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.53(dd，1H，J＝3.42，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.33(dd，1H，J＝6.87，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.23(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.15(m，2H，-CH2-OP)，3，61(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.81(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.48(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，1.93(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2×(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2 bs，40H，20 CH2)，1.04(m，6H，2 CH3).
活化DOPE(或者DSPE)與氨基丙基糖苷的縮合。
向活化DOPE(或者DSPE)(A-L)(33μmol)的N，N-二甲基甲酰胺(1ml)溶液中加入30μmol Sug-S1-NH2(F-S1-NH2)和5μl三乙胺。例如，所述Sug可以為或者為GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ三糖(A-glycotope)(F)或者為Galα1-3(Fucα1-2)Galβ三糖(B-glycotope)(F)的氨基丙基糖苷(F-S1-NH2)。
將上述混合物在室溫下攪拌2h。對上述混合物進行柱色譜(在1∶1氯仿-甲醇下用葡聚糖凝膠LH-20，隨后在乙酸乙酯-異丙醇-水(4∶3∶1(v/v/v))下用硅膠)分離，一般得到85～90％的合成分子構造，例如Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
1H NMR(CDCl3/CD3OD，1∶1)，δAtri-sp-Ad-DOPE(I)-5.5(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.43-5，37(m，2H，H-1(GalNHAc)and-OCH2-CHO-CH2O-)，5.32(d，1H，H-1，J＝3.5 H-1 Fuc)，2.50(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.40(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.20(m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)，2.1(s，3H，NHAc)，1.92(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.8(m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2bs，40H，20 CH2)，1.40(d，3H，J＝6.6，CH3Fuc)，1.05(m，6H，2 CH3).
Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)-5.5(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.43-5，37[m，2H，H-1(GalNHAc)and-OCH2-CHO-CH2O-]，5.32(d，1H，H-1，J＝3.6 H-1 Fuc)，2.50(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.40-2.32(m，6H，COCH2CH2CH2CH2CO andCOCH2-(sp1)，2.18[m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)]，2.1(s，3H，NHAc)，1.95(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.8[m，10H，COCH2CH2CH2CH2CO，2×(COCH2CH2-…)，-COCH2CH2(CH2)3NH-]，1.68(m，2H，CO(CH2)3CH2CH2NH-)，1，43，1.47(2 bs，42H，22 CH2)，1.37(d，3H，J＝5.6，CH3Fuc)，1.05(m，6H，2 CH3).
Atri-sp-Ad-DSPE(III)-5.42-5.38(m，2H，H-1(GalNHAc)and-OCH2-CHO-CH2O-)，5.31(d，1H，H-1，J＝3.5 H-1 Fuc)，2.48[m，4H，2×(-CH2-CO)]，2.42(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.18(s，3H，NHAc)，1.95(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.8[m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)]，1，43，1.47(2 bs，56H，28 CH2)，1.38(d，3H，J＝6.6，CH3Fuc)，1.05(m，6H，2 CH3).
Btri-sp-Ad-DOPE(VI)-5.5(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.42-5，38[m，2H，H-1(Gal)and-OCH2-CHO-CH2O-]，5.31(d，1H，H-1，J＝3.7，H-1 Fuc)，2.48[m，4H，2×(-CH2-CO)]，2.39(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.18[m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)]，1.93(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.8[m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-)]，1，43，1.47(2 bs，40H，20 CH2)，1.36(d，3H，J＝6.6，CH3Fuc)，1.05(m，6H，2 CH3).
Htri-sp-Ad-DOPE(VII)-5.5[m，4H，2×(-CH＝CH-)]，5.4(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，5.35(d，1H，H-1，J＝3.2，H-1 Fuc)，4.65，4.54(2d，J＝7.4，J＝8.6，H-1 Gal，H-1 GlcNHAc)，4.46(dd，1H J＝3.18，J＝12，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.38-4.28(m，2H，H-5 Fuc，CCOOHCH-CHO-CH2O-)，2.48[m，4H，2×(-CH2-CO)]，2.40(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.18[m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)]，2.08(s，3H，NHAc)，1.92(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.82-1.72[m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-)]，1，48，1.45(2 bs，40H，20 CH2)，1.39(d，3H，J＝6.5，CH3Fuc)，1.05(m，6H，2 CH3).
Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)-5.49(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.37(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，5.24(d，1H，H-1，J＝2.95，H-1 Fuc)，4.46(d，J＝7.34，H-1 Gal)，2.48[m，4H，2×(-CH2-CO)]，2.42-2.35(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.17[m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)]，1.95(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.81-1.74[m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)]，1，45，1.41(2 bs，40H，20 CH2)，1.39(d，3H，J＝6.5，CH3Fuc)，1.03(m，6H，2 CH3).
Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)-5.51[m，4H，2×(-CH＝CH-)]，5.4(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.61(dd，1H J＝3.18，J＝12，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.41(d，J＝7.8，H-1 Gal)，4.37(dd，1H，J＝6.6，J＝12，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，2.50[m，4H，2×(-CH2-CO)]，2.40(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，2.20[m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)]，1.97(m，2H，O-CH2CH2CH2-NH)，1.82-1.72[m，8H，COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)]，1，48，1.45(2 bs，40H，20 CH2)，1.05(m，6H，2CH3).
實施例2-合成糖脂的溶解性為了用于細胞轉化中，第一個條件就是合成糖脂必須滿足它們可以溶于含水溶劑中，例如磷酸鹽緩沖鹽水中。為了使測試的合成糖脂(表21)的溶解度最大化，最初使用了許多技術，包括熱處理和/或超聲處理。
所述合成糖脂還必須能夠插入膜中和能夠被用于轉化的適當抗體識別以通過凝集作用進行檢測。對分子的初期試驗將確定溶解性，并且由此除去那些不適于用于細胞轉化中的分子。
這些初期試驗的結果提供于表22中。
表21.試驗的合成糖脂分子的范圍。

表22.在熱PBS中合成糖脂的溶解性和轉化能力。

認為Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)和Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)不具有可檢測的轉化作用是由于抗體不具有識別這些合成分子glycotope的能力。
Atri-sp-lipid(IV)具有單?；嵌；玻纱苏J為這種合成分子并沒有插入到膜雙層中去。
實施例3-通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂進行的RBCs低溫轉化作用RBCs在4℃貯存時較為健康，由此認為在4℃轉化時同樣較為健康。根據(jù)先前所述研究(參見對比實施例)和他人研究(Schwarzmann，2000)，并不認為合成糖脂在4℃下會產(chǎn)生顯著的插入速率。這些研究使用天然糖脂進行。驚人地發(fā)現(xiàn)，這些研究并不能預測本發(fā)明合成糖脂的行為。
雖然并不希望與理論結合，但是在Schwarzmann的研究中，天然糖脂插入的低速率可能是由于天然糖脂末端(鞘脂和脂肪酸)的物理化學性能而導致。
糖脂的二?；苍诖_定插入速率中可能是重要的。某些二?；苍诘蜏叵驴梢员３州^大的流動性。另外，這些糖脂二?；膊迦氲陌|(zhì)膜區(qū)域可以保持此較大流動性。
眾所周知，天然糖脂的鞘脂尾在剛性區(qū)域內(nèi)聚集，這些區(qū)域在低溫下可能不允許糖脂的進一步結合。具有順式不飽和二酰基尾的合成糖脂可以有利于應用。
首先對RBCs與具有不同脂質(zhì)末端的合成糖脂的轉化進行了評價(表22和24)。
表23.用于獲得列于表24～27中的結果的抗血清。
抗-A制造商 相關類目批號有效期限Albaclone，SNBTSZ001077012.12.04BioClone，OCD 試驗試劑01102 -抗-B制造商 相關類目批號有效期限Albaclone，SNBTSZ011060027.04.03BioClone，OCD 試驗試劑01103 -
表24.對不同脂質(zhì)末端通過與相關抗血清凝集而插入的評價

在4℃時，使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂進行的RBCs轉化作用，然后對其進行評價(表25～28)。這些轉化作用直接指向A、B或者A和B glycotopes的低水平表達的細胞(“弱A、B和AB細胞”)的制備。
為了制備弱A和B細胞，將在1×PBS中的轉化溶液(20μL，Atri-sp-Ad-DOPE(I)為0.08、0.05和0.03mg/mL，和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)為0.6、0.3、0.15、0.08、0.05和0.03mg/mL)與經(jīng)洗滌、封裝的O型RBCs(60μL)混合。
為了制備弱AB細胞，將在1×PBS中的轉化溶液(20μL，Atri-sp-Ad-DOPE(I)為0.07、0.06和0.05mg/mL，和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)為0.3和0.2mg/mL)與洗滌、包裝的O型RBCs(60μL)合并在封閉滴定管中。所述組合為0.07mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；0.07mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；0.06mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；0.06mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；0.05mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；和0.05mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
將細胞和轉化溶液置于4℃的冷凍機中。每隔一段時間進行一次移液混合。細胞由于每隔一段時間與相關抗血清進行一次試驗而得到了消除，并且細胞以洗滌態(tài)和未洗滌態(tài)(即，洗滌樣品除去了轉化溶液)均進行試驗。
48小時之后，將CelpresolTM加入到細胞中，使得最終細胞∶非細胞的比例為3∶5(v/v)。繼續(xù)每隔一段時間對細胞進行一次試驗。10之后將試驗終止，因為此時細胞變成了褐色。
這種變色可以歸結為多種因素，包括當進行轉化時，細胞已經(jīng)生存了21天；48小時轉化作用在PBS而非CelpresolTM中進行，因此此時細胞受到了壓迫；和在轉化室和測試實驗室之間運送中，細胞可能處理不當。上述變色可以通過在CelpresolTM而非PBS中轉化細胞而得到緩解。
表25.在4℃下通過抗-A轉化的弱A RBCs的Diamed結果。

表26.在4℃下通過抗-B轉化的弱B RBCs的Diamed結果。

表27.在4℃下在封閉滴定管中通過抗-A轉化的弱AB RBCs的Diamed結果。

表28.在4℃下在封閉滴定管中通過抗-B轉化的弱AB RBCs的Diamed結果。

實施例4—通過Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂進行的RBCs轉化作用的插入效率將轉化后上清液溶液(得自于濃度為0.08mg/mL、0.05mg/mL和0.03mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，20μL)以1∶2稀釋溶液加入到干凈和經(jīng)洗滌、封裝的基團ORBCs(60μL)中。將該試管在37℃水浴中培養(yǎng)一小時，每15分鐘進行一次混合。
轉化的RBCs用PBS洗滌3×，然后將其懸浮在適當濃度的CellstabTM中以進行血清學測試。
表29.試管血清學

由轉化后上清液溶液(得自于0.08mg/mL的預轉化溶液)給出的評價甚至不及第一通道(first pass)中0.03mg/mL轉化溶液的評價。這些結果表明，在第一通道中＞75％的分子插入到了RBC膜中。
此外，將轉化后溶液濃縮20×并且將其與已知濃度的轉化溶液進行平行比較。僅僅對來源于0.08mg/mL Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mLBtri-sp-Ad-DOPE(VI)溶液的轉化后溶液進行試驗。
將轉化后溶液(20μL)滲析(孔徑500Da)通過去離子水2天。然后將該樣品放置在通分櫥(fumehood)中10天以進行干燥。在此時間結束后，將它們轉移入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，和啟動旋轉蒸發(fā)在真空和無加熱下旋轉過夜。
在40℃的水浴中對樣品進行干燥并且用氯仿-甲醇2∶1將其沖入較小的容器內(nèi)，剩余了大量的無水多細胞物質(zhì)。將2∶1氯仿-甲醇洗液全部除去，然后再次用2∶1氯仿-甲醇沖洗入試管中和將洗液全部除去。將這些樣品再溶于1mL1×PBS中并且將其用于轉化試驗中。燒瓶底部的多細胞材料用水沖洗入另一套試管中。
將轉化后溶液(得自于0.08mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，20μL)加入到經(jīng)洗滌、封裝的RBCs(60μL)中。平行地，將轉化溶液(0.08mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，20μL)加入到經(jīng)洗滌、封裝的RBCs(60μL)中。
將該試管在37℃水浴中培養(yǎng)一小時，每15分鐘進行一次混合。轉化的RBCs用PBS洗滌3×，然后將其懸浮在適當濃度的CellstabTM中以進行血清學測試。
表30.Diamed血清學

這些結果表明，在轉化后溶液中，即使?jié)饪s20×時都沒有通過血清學檢測的充分分子。
實施例5—通過Htri-sp-Ad-DOPE(VII)合成糖脂進行的鼠RBCs的轉化作用小鼠細胞在37℃下轉化1小時。
表31.用于表32和33結果中的抗-H試劑。

表32.試管血清學

表33.Diamed

實施例6—通過過濾的Atri-sp-Ad-DOPE(I)合成糖脂進行的RBCs轉化將一些Atri-sp-Ad-DOPE(I)無菌濾過0.2μm的過濾器。為了研究是否轉化作用與該產(chǎn)品一樣，進行對比試驗。
表34.用于產(chǎn)生列于表35中結果的抗-A。

表35.使用不同濃度無菌過濾對比未過濾的Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化的RBCs凝集欄

這些結果表明在Atri-sp-Ad-DOPE(I)的兩種制劑之間不存在顯著差異，并且表明濾過0.2μM過濾器不會除去分子或者改變組合物或者使流體性能改變到轉化作用受影響的程度。
實施例7-轉化細胞的貯存為了研究在4℃或者37℃下貯存是否會改變Atri-sp-Ad-DOPE(I)和轉化O RBCs的天然的A糖脂的凝集結果，分別將其確定為“Syn-A”和“Nat-A”細胞，并且將其分為兩份和以5％的濃度懸浮在CellstabTM中。
將一組細胞貯存在4℃水浴中和將另一組細胞貯存在37℃水浴中。對貯存的轉化細胞的凝集作用進行評價(表36)。
表36.


實施例8-使用帶有不同的非碳水化合物結構的A-和B-抗原合成糖脂進行的RBC轉化表示為Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Atri-sp1sp2-Ad-DOPE(II)、Atri-sp-Ad-DSPE(III)和Btri-sp-Ad-DOPE(vI)的水溶性合成糖脂根據(jù)實施例1中所述方法與必要變形進行制備。
將經(jīng)洗滌的封裝O型紅血球(RBCs)(3體積份)和合成糖脂溶液(1體積份，不同濃度)加入到微量離心管中。將該試管在37℃水浴中培養(yǎng)一小時，每15分鐘進行一次混合。轉化的RBCs用PBS洗滌3×，然后將其懸浮在適當濃度的CellstabTM中以進行血清學測試。
使用不同合成分子構造轉化的RBCs的試管血清學和Diamed凝膠-卡片結果提供于表38中。使用不同濃度的不同合成糖脂轉化的RBCs的穩(wěn)定性結果提供于表39～44中。
表37.用于產(chǎn)生列于表38～44中的結果的抗血清。

表38.使用不同濃度A-抗原合成糖脂的RBCs轉化作用的對比


縮略語n.未測定出d.
表39.使用高濃度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。通過人工試管血清學進行凝集。

縮略語°干擾表40.使用低濃度(0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。通過人工試管血清學進行凝集。


縮略語n.d未測定出°干擾表41.使用高濃度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。在Diamed凝膠-卡片上進行凝集。


其中存在不足以進行測試的細胞，對此表示為空白。
表42.使用低濃度(0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。在Diamed凝膠-卡片上進行凝集。


其中存在不足以進行測試的細胞，對此表示為空白。
表43.使用高濃度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Btri-sp-Ad-DOPE(VI)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。通過人工試管血清學進行凝集。


縮略語°干擾表44.使用高濃度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Btri-p-Ad-DOPE(VI)轉化的RBCs的穩(wěn)定性試驗。在Diamed凝膠-卡片上進行凝集。


其中存在不足以進行測試的細胞，對此表示為空白。
實施例9—與H-抗原合成糖脂進行的紅血球轉化作用表示為Htri-sp-Ad-DOPE(VII)、Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)的水溶性合成糖脂根據(jù)實施例1中所述方法與必要修正進行制備。
將經(jīng)洗滌的封裝鼠RBCs(3體積份)和合成糖脂溶液(1體積份，不同濃度)加入到微量離心管中。將該試管在37℃水浴中培養(yǎng)一小時，每15分鐘進行一次混合。轉化的RBCs用PBS洗滌3×，然后將其懸浮在適當濃度的CellstabTM中以進行血清學測試。
使用不同合成糖脂轉化的RBCs的試管血清學和Diamed凝膠-卡片結果存在于表46中。結果表明，三糖(Htri)需要通過抗-HIgM，至少需要通過所用試劑進行檢測。
表45.用于產(chǎn)生存在于表46中的結果的抗血清。

表46.使用制成不同濃度的帶有不同glycotopes的H-抗原合成糖脂的RBCs轉化作用的對比


縮略語n.d未測定出實施例10-Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)合成糖脂向鼠紅血球的插入表示為Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)的水溶性合成糖脂根據(jù)實施例1中所述方法與必要變形進行制備。
鼠RBCs在1×PBS中洗滌3×。將30μl封裝的RBCs與30μlHdi-sp-Ad-DOPE(VIII)合并，并且將30μl封裝的RBCs與30μlGalB-sp-Ad-DOPE(IX)合并。兩種合成分子構造的濃度都為1.0mg/ml。將30μl1×PB S加入到30μl封裝的RBCs，作為對照組。將細胞在37℃的振蕩水浴中培養(yǎng)90分鐘。RBCs在1×PBS中洗滌3×。
在室溫下，將三組封裝的RBCs與等體積量的選擇素UEA-1一起培養(yǎng)30分鐘。選擇素在1×PBS中進行制備，濃度為0.1mg/ml。在Immunofuge中，將50μl3％的細胞懸浮液以低速旋轉15秒鐘。所得結果通過試管血清學進行讀取。所得結果存在于表48中。結果表明，抗-H IgM和UEA-1都沒有檢測到二糖(Hdi)。
表47.用于產(chǎn)生列于表48中的結果的抗血清。

表48.使用Galβ-sp-Ad-DOPE或者Hdi-sp-Ad-DOPE轉化的鼠RBCs，通過凝集作用進行評價。

縮略語n.d未測定出實施例11-敏感性對照的制備本發(fā)明的合成糖脂可以用于制備如國際申請?zhí)朠CT/NZ02/00214(WO03/034074)附屬說明書中所述的“敏感性對照”(還稱為“質(zhì)量對照細胞”、“血清學對照”或者“工藝對照”)。本發(fā)明合成糖脂提供了RBCs的轉化作用可以在低溫下實現(xiàn)的優(yōu)點。
RBC轉化溶液使用了兩種母液溶液1懸浮在CelpresolTM溶液中的1mg/mL Atri-sp-Ad-DOPE(I)。
溶液2懸浮在CelpresolTM溶液中的5mg/mL Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
糖脂被制備成白色干燥粉末。如此形式的糖脂(將其裝入控制溫度下的密封容器中)可以無限期的穩(wěn)定。為了配制轉化溶液，將上述糖脂按重量計懸浮在溶液(例如CelpresolTM)中。
一旦轉化溶液在CSL處得到接收，在無菌條件下對它們進行過濾(濾過MILLEX_-GV 0.22μ過濾裝置)。
RBCs的處理使用連續(xù)流動離心洗滌器在無菌條件下對RBC給體進行處理。在緩沖鹽水中對RBC給體進行洗滌，隨后在CelpresolTM溶液中對其進行洗滌。在Beckman Coulter AcT Diff分析器上對RBC給體的PCV進行測定。然后，在加入CelpresolTM的同時，將給體調(diào)節(jié)至50％的紅細胞壓積(PCV)。
轉化RBCs從而提供“弱AB細胞”在緩沖鹽水和CelpresolTM中對RBCs進行洗滌。將細胞懸浮在CelpresolTM溶液中，以使PCV＞50％。使用Beckman Coulter AcT Diff對紅血球的PCV進行測定。對紅血球溶液的質(zhì)量進行稱重。
The amount of用于轉化的Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Btri-sp-Ad-DOPE(VI)和CelpresolTM的量通過使用以下方程進行計算a=P×FSb=P×FS]]>c＝P-(1-P)-a-b其中a＝要加入到每1mL紅細胞中的Atri-sp-Ad-DOPE(I)的量(mL)b＝要加入到每1mL紅血球中的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)的量(mL)c＝要加入到每1mL紅血球中的CelpresolTM的量(mL)，從而將細胞稀釋至50％PCVP＝紅細胞溶液的PCVF＝糖脂的最終期望濃度S＝糖脂儲液的濃度為了確定加入到紅血球總試樣中的糖脂和CelpresolTM的量，使紅血球體積分別乘以a、b和c。將Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Btri-sp-Ad-DOPE(VI)和CelpresolTM無菌加入到紅血球總試樣中。
在20℃下，在控溫和恒定溫和攪拌下，將樣品培養(yǎng)3小時。在3小時時間結束時，將紅血球無菌除去，并且對樣品進行測試以確定RBCs的轉化作用。使用試管、平鋪和柱凝集技術(CAT)工藝對血型進行鑒定。
在2～8℃下，在控溫下將紅血球樣品培養(yǎng)3小時，并進行恒定溫和攪拌18小時。在3小時時間結束時，將紅血球無菌除去，并且對樣品進行測試以確定紅血球的轉化作用。使用試管、平鋪和CAT方法對血型進行鑒定。
在使用CelpresolTM溶液的無菌條件下，使用連續(xù)流動離心法洗滌轉化的紅血球。測量經(jīng)洗滌的紅細胞的PCV，并且通過加入CelpresolTM溶液調(diào)節(jié)至50％PCV。
制劑和分配將一定量的轉化RBCs與一定量的模擬血漿稀釋劑(SPD)無菌組合。所述血漿可以含有單克隆和多克隆抗體。根據(jù)期望的敏感性對照特性對抗體進行選擇。所述血漿可以另外含有酒石黃和牛血清蛋白。
使用試管、平鋪和CAT方法對全樣進行血型鑒定和抗體屏蔽。然后，將轉化的RBC-SPD混合物無菌地分配入BD Vacutainer試管中并且相應地對試管進行標記。
證實性測試通過利用合成糖脂(在表51～53中表示為AwBw)形成的弱AB細胞用于與天然存在的弱A、弱B和弱AB細胞平行地證實大量試驗平臺。
表49.用于證實測試中的試劑和卡片

表50.證實測試的試驗平臺方法

表51.所有方法對抗-A的證實結果


表52.所有方法對抗-B的證實結果

表53.所有方法對抗-AB的證實結果

實施例12-修飾胚胎與轉化子宮內(nèi)膜細胞的連接對在通過細胞類型而非RBCs表達的細胞表面抗原內(nèi)實現(xiàn)定性和定量差異的能力進行研究。將能夠增強胚胎與子宮內(nèi)膜細胞粘結的選定為模型系統(tǒng)。
合成分子可以用作合成膜錨著點和/或合成分子構造。因此，它們還可以用于入國際專利申請?zhí)朠CT/NZ2003/000059(公開為WO03/087346)中所述的增強胚胎植入的方法中，此申請在此引入作為參考。
·子宮內(nèi)膜細胞轉化作用水溶性合成分子構造的插入對子宮內(nèi)膜上皮細胞的單細胞懸浮液進行制備。通過再懸浮在CMFHBSS中和在2000rpm下離心3分鐘，將子宮內(nèi)膜細胞洗滌3×。將經(jīng)洗滌的細胞制劑再懸浮在50μlM2中。
準備各自含有50μl5M/ml子宮內(nèi)膜細胞的溶液的微離心管。向分離的子宮內(nèi)膜細胞試管中加入50μl合成糖脂Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE A(VI)，或者將50合成μlM2加入到對照細胞中。在37℃下，在混合器上將細胞培養(yǎng)90分鐘。通過再懸浮在CMF HBSS介質(zhì)中和在2000rpm下離心3分鐘，將子宮內(nèi)膜細胞洗滌3×。將經(jīng)洗滌的細胞制劑再懸浮在50μlM2中。
使用熒光探針進行的插入測試將50μl相應的原生鼠單克隆抗體加入到各個試管中。在室溫下將各個試管培養(yǎng)10分鐘。在M2介質(zhì)將細胞洗滌3×。將10μl鼠抗-IgG FITC加入到各個試管中。在黑暗環(huán)境中，將試管在室溫下培養(yǎng)10分鐘。將子宮內(nèi)膜細胞載片到載玻片并且在熒光顯微鏡下對其進行觀察。
直接凝集測試將5μl各血型細胞放置在分離的顯微鏡載片上。向5μl各血型細胞中加入5μl相應的抗體。在載片上將各細胞溫和地混合2分鐘。在顯微鏡下對凝集作用進行觀察。所得結果存在于表55中。
表54.用于產(chǎn)生列于表55中的結果的抗血清。

55.使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE A(VI)轉化的子宮內(nèi)膜細胞，通過熒光進行觀察。


·胚胎修飾水溶性合成分子構造的插入通過在37℃烘箱中，用0.5％鏈霉蛋白酶處理胚胎6分鐘將胚胎透明帶除去，或者直至所有的透明帶都得到消除。Atri-sp-Ad-DOPE(I)orBtri-sp-Ad-DOPE(VI)通過將5μl濃度為1mg/mL的合成糖脂加入到45μl覆蓋有礦物油的M2介質(zhì)滴中，微滴得到制備。在37℃下，將所有的胚胎組在50μl上述微滴中培養(yǎng)1小時。試驗和對照組的胚胎都用M2介質(zhì)洗滌3×。
插入試驗將試驗和對照組胚胎都放入相應抗體微滴中，并且將其在37℃下培養(yǎng)30分鐘。試驗和對照組的胚胎都用M2介質(zhì)洗滌3×。
將所有的試驗和對照組胚胎都放入抗-鼠Ig FITC(抗-鼠Ig FITC在M2中1∶50的稀釋液)微滴中并且將其在37℃下培養(yǎng)30分鐘。試驗和對照組的胚胎都用M2介質(zhì)洗滌3×。將胚胎載片在顯微鏡載片的5μl M2滴中，所述M2滴用油覆蓋。
在熒光顯微鏡下對載片進行觀察。結果列于表56和57中。
Btri-sp-Ad-DOPE使用(VI)轉化的否定結果是由于缺少11°抗體敏感性。



縮略語n.d未測定出轉化子宮內(nèi)膜細胞與修飾胚胎的增強連接修飾的(BioG-Avidin-BioIgGB和BioG-Avidin-BioIgMA)胚胎根據(jù)國際申請?zhí)朠CT/NZ03/00059(公開為WO03/087346)附屬說明書所述的方法進行制備。
準備兩個凹面載玻片，其中一個具有兩個合成糖脂Atri-sp-Ad-DOPE(I)插入子宮內(nèi)膜細胞，另一個具有兩個合成糖脂Btri-sp-Ad-DOPE(VI)插入子宮內(nèi)膜細胞。
將兩組胚各自胎轉移到一個凹面載玻片上載玻片1Atri/IgGB胚胎Atri/IgMA胚胎載玻片2Btri/IgGB胚胎Btri/IgMA胚胎所述胚胎周圍環(huán)繞有子宮內(nèi)膜細胞。用礦物油對所述細胞進行覆蓋并且在37℃下將其培養(yǎng)15分鐘。用大開口把手移液管將各組胚胎小心地轉移到新鮮的M2介質(zhì)滴中。對所述胚胎進行溫和洗滌。將所述胚胎溫和地轉移入標記的顯微鏡載片上的M2介質(zhì)中。每滴都用礦物油進行覆蓋。
在Olympus顯微鏡的焦點中心面下，對各組中粘附到胚胎上的子宮內(nèi)膜細胞數(shù)目進行估定。對粘附到各個胚胎上的細胞數(shù)目進行記錄。所得結果列于表58中。

在上述說明書中，已經(jīng)對已知等價物進行了整體或者部分參考，上述等價物在此作為單獨闡述引入。
雖然本發(fā)明已經(jīng)通過實施例和參考其可能的實施方案進行了描述，但是應當理解，可以對本發(fā)明進行改進和/或變形，這并不背離本發(fā)明的精神和范圍。
參考文獻Abe K，McKibbin JM & Hakomori SI.(1983)The monoclonalantibody directed to difucosylated type 2 chain(Fuucα1→2Galβ1→4[Fucα1→3]GlcNAc；Y determinant).J.Biol.Chem.25811793-11797.
Adamany AM，Blumenfeld OO，Sabo B & McCreary J.(1983)Acarbohydrate structural variant of MM glycoprotein(glycophorin A).J.Biol.Chem.25811537-11545.
Blanchard D，Cartron JP，F(xiàn)ournet B，Mountreuil J，van Halbeek H &Vliegenthart JFG.(1983)Primary structure of the oligosaccharidedeterminant of blood group Cad specificity.J.Biol.Chem.2587691-7695.
Fukuda M，Dell A & Fukuda M.(1984a)Structure of fetallactosaminoglycan.The carbohydrate moiety of band 3 isolated from humanumbilical cord erythrocytes.J.Biol.Chem.2594782-4791.
Fukuda M，Dell A，Oates JE & Fukuda M.(1984b)Structure ofbranched lactosaminoglycan，the carbohydrate moiety of band 3 isolated fromadult human erythrocytes.J.Biol.Chem.2598260-8273.
Fukuda M，Lauffenberger M，Sasaki H，Rogers ME & Dell A.(1987)Structures of novel sialylated O-linked oligosaccharides isolated from humanerythrocyte glycophorins.J.Biol.Chem.26211952-11957.
Fukuda MN，Dell A，Oates JE，Wu P，Klock JC & Fukuda M.(1985)Structures of glycosphingolipids isolated from human granulocytes.Thepresence of a series of linear poly-N-acetyllactosaminylceramide and itssignificance in glycolipids of whole blood cells.J.Biol.Chem.2601067-1082.
Gillard BK，Blanchard D，Bouhours JF，Cartron JP，van Kuik JA，Kamerling JP，Vliegenthart JFG & Marcus DM.(1988)Structure of aganglioside with Cad blood group antigen activity.Biochemistry.274601-4604.
Hakomori SI，Nudelman E，Levery SB & Kannagi R.(1984)Novelfucolipids accumulating in human adenocarcinoma.I.Glycilipids with di-ortrifucosylated type 2 chain.J.Biol.Chem.2594672-4680Hanfland P.(1975)Characterisation of B and H blood group activeglycosphingolipids from human B erythrocyte membranes.Chem.Phys.Lipids.15105-124.
Hanfland P，Kordowicz M，Niermann H，Egge H，Dabrowski U，Peter-Katalinic J & Dabrowski J.(1984)Purification and structures ofbranched blood-group-B-active glycosphingolipids from human erythrocytemembranes.Eur.J.Biochem.145531-542.
Hanfland P，Kordowicz M，Peter-Katalinic J，Pfannschmidt G，CrawfordRJ，Graham HA & Egge H.(1986)Immunochemistry of the Lewisblood-group systemisolation and structures of Lewis-c active and relatedglycosphingolipids from the plasma of blood-group O Le(a-b-)nonsecretors.Arch.Biochem.Biophys.246655-672.
Hiraiwa N，Tsuyuoka K，Li YT，Tanaka M，Seno T，Okubo Y，F(xiàn)ukuda Y，Imura H & Kannagi R.(1990)Gangliosides and sialoglycoproteinscarrying a rare blood group antigen determinant，Cad，associated with humancancers as detected by specific monoclonal antibodies.Cancer Res.505497-5503.
Kannagi R，Nudelman E，Levery SB，& Hakomori SI.(1982)A seriesof human erythrocytes glycosphingolipids reacting to the monoclonalantibody directed to a developmentally regulated antigen，SSEA-1.J.Biol.Chem.25714865-14874.
Kewitz S，GroβHJ，Kosa R & Roelcke D.(1995)Anti＝Pr coldagglutinins recognise immunodominantα2，3-orα2，6-sialyl groups onglycophorins.Glycocon.J.12714-720.
Koscielak J，Miller-Podraza H，Krauze R & Piasek A.(1976)Isolationand characterisation of poly(glycosyl)ceramides(megaloglycolipids)with A，H，and I blood group activities.Eur.J.Biochem.719-18.
Laine RA.(1994)Invited commentary.Glycobiol 4759-767
Lidowska E，Duk M & Dahr W.(1980)Comparison of alkali-labileoligosaccharide chains of M and N blood-group glycopeptides from humanerythrocyte membrane.Carbohydr.Res.79103-113.
Lloyd KO & Kabat EA.(1968)Immunochemical studies on bloodgroups.XLI.Proposed structures for the carbohydrate portiotns of blood groupA，B，H，Lewisa，and Lewisbsubstances.Proc.Natl.Acad.Sci USA.611470-1477.
Lundblad A.(1977)Urinary glycoproteins，glycopeptides，andoligosaccharides.InThe Glycoconjugates Eds Horowitz MI & PigmanW.Vol1441-458.
Magnani JL，Nilsson B，Brockhaus M，Zopf D，Steplewski Z，Koprowski H& Ginsburg V.(1986)A monoclonal antibody-defined antigen associatedwith gastrointestinal cancer is a ganglioside containing sialylatedlacto-N-fucopentaose II.J.Biol.Chem.25714365-14369.
Nudelman E，F(xiàn)ukushi Y，Levery SB，Higuchi T & Hakomori SI.(1986)Novel fucolipids of human adenocarcinomadisialoyl Leaantigen(III4FucIII6NeuAcIV3NeuAcLc4)of human colonic adenocarcinoma and themonoclonal antibody(FH7)defining this structure.J.Biol.Chem.2615487-5495.
Slomiany A，Zdebska E & Slomiany BL.(1984)Structures of theneutral oligosaccharides isolated from A-active human gastric mucin.J.Biol.Chem.25914743-14749.
Takasaki S，Yamashita K & Kobata A.(1978)The sugar chainstructures of ABO blood group active glycoproteins obtained from humanerythrocyte membrane.J.Biol.Chem.2536086-6091.
Tanaka M，Dube VE & Anderson B.(1984)Structures ofoligosaccharides cleaved by base-borohydride from an I，H，and Leaactiveovarian cyst glycoprotein.Biochim.Biophys.Acta.798283-290.
Thomas DB & Winzler RJ.(1969)Structural studies on humanerythrocytes glycoprotein.Alkali-labile oligosaccharides.J.Biol.Chem.2445943-5946.
Watkins WM.(1966)Blood group substances.Science.152172-181.
Yoshima H，F(xiàn)urthmayr H & Kobata A.(1980)Structures of theasparagine-linked sugar chains of glycophorin A.J.Biol.Chem.2559713-9718.
權利要求
1.用作合成膜錨著點或者用于制備合成分子構造的結構為R-S2-L的分子，其中R為化學活性官能團；S2是將R連接至L的間隔基團；和L是選自以下的脂質(zhì)二?；?和二烷基-甘油脂，包括甘油基磷酸脂；和衍生于二?；?和二烷基-脂肪的鞘氨醇，包括N-脂?；拾贝肌?br> 2.權利要求1的分子，其中R選自以下基團，包括二(N-羥基琥珀酰亞胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基))))、二(五氯苯基)。
3.權利要求1或者2的分子，其中S2選自以下基團，包括-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯(Ad))和-CO(CH2)5CO-。
4.權利要求1～3任一項的分子，其中R和S2為酯連接。
5.權利要求1～4任一項的分子，其中L為選自二?；?和二烷基-甘油脂的脂質(zhì)，其中二?；?和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
6.根據(jù)權利要求5的分子，其中L選自衍生于一種或多種反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六碳烯酸、順式-6-十八碳烯酸、順式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、順式-11-十八碳烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸的二?；视椭?、磷脂酸酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油。
7.根據(jù)權利要求6的分子，其中所述脂質(zhì)衍生于一種或多種順式-不飽和脂肪酸。
8.根據(jù)權利要求7的分子，其中L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；视?DOG)。
9.根據(jù)權利要求1～8任一項的分子，其中L為甘油基磷酸脂和所述合成分子構造包括以下亞結構 其中n＝3～5，和*不為H。
10.根據(jù)權利要求9的分子，其中n為3。
11.根據(jù)權利要求1的分子，其中所述分子具有以下結構 其表示為Ad-DOPE，并且其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
12.根據(jù)權利要求1的分子，其中所述分子具有以下結構 其表示SP1-Ad-DOPE，并且其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
13.根據(jù)權利要求1的分子，其中所述分子具有以下結構 其表示為Ad-DSPE，并且其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
14.一種結構為F-S1-S2-L的合成分子構造，其中F是選自碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素所構成組群的抗原；S1-S2是將F連接至L的間隔基團；和L是選自以下的脂質(zhì)二?；?和二烷基-甘油脂，包括甘油基磷酸脂；和衍生于二?；?和二烷基-脂肪的鞘氨醇，包括N-脂酰基鞘氨醇。
15.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述合成分子構造具有水溶性。
16.根據(jù)權利要求14或者15的合成分子構造，其中當所述合成分子構造溶液與脂雙層接觸時，所述合成分子構造自發(fā)地摻入脂雙層中。
17.根據(jù)權利要求16的合成分子構造，其中所述合成分子構造穩(wěn)定地摻入脂雙層中。
18.根據(jù)權利要求14～17任一項的合成分子構造，其中F、S1、S2和L共價連接。
19.根據(jù)權利要求14～18任一項的合成分子構造，其中F選自天然存在或者合成glycotopes、抗體(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。
20.根據(jù)權利要求19的合成分子構造，其中F選自天然存在或者合成glycotopes或者抗體(免疫球蛋白)。
21.根據(jù)權利要求14～20任一項的合成分子構造，其中L為選自二?；?和二烷基-甘油脂的脂質(zhì)，其中二?；?和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
22.根據(jù)權利要求21的合成分子構造，其中L選自衍生于一種或多種反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六碳烯酸、順式-6-十八碳烯酸、順式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、順式-11-十八碳烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸的二?；视椭?、磷脂酸酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油。
23.根據(jù)權利要求22的合成分子構造，其中所述脂質(zhì)衍生于一種或多種順式-不飽和脂肪酸。
24.根據(jù)權利要求23的合成分子構造，其中L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；视?DOG)。
25.根據(jù)權利要求14～24任一項的合成分子構造，其中L為甘油基磷酸脂和所述合成分子構造包括以下亞結構 其中n＝3～5，X為H或者C，和*不是H。
26.根據(jù)權利要求25的合成分子構造，其中n為3。
27.根據(jù)權利要求14～24任一項的合成分子構造，其中對S1-S2進行選擇，從而提供水溶性合成分子構造。
28.根據(jù)權利要求14～27任一項的合成分子構造，其中F選自天然存在的或者合成的glycotope。
29.根據(jù)權利要求28的合成分子構造，其中F為由三個(三糖)或者更多個糖元組成的天然存在或者合成的glycotope。
30.根據(jù)權利要求28的合成分子構造，其中F為選自以下的glycotopelacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列寡糖。
31.根據(jù)權利要求28的合成分子構造，其中F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Ga1β；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3Galβ；NeuAcα2-6Galβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
32.根據(jù)權利要求14～31任一項的合成分子構造，其中當F為glycotope時，L為甘油基磷酸脂，和S2選自以下基團，包括-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-。
33.根據(jù)權利要求14～32任一項的合成分子構造，其中S1為選自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。
34.根據(jù)權利要求33的合成分子構造，其中S1為3-氨基丙基。
35.根據(jù)權利要求14～27任一項的合成分子構造，其中F介導細胞-細胞相互作用或者細胞-表面相互作用。
36.根據(jù)權利要求35的合成分子構造，其中F為對表達在靶細胞或者表面上的組分具有親和力的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白或者生物素。
37.根據(jù)權利要求36的合成分子構造，其中F對表達在上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
38.根據(jù)權利要求37的合成分子構造，其中F對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
39.根據(jù)權利要求38的合成分子構造，其中表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者外源性摻入的組分。
40.根據(jù)權利要求14～27任一項的合成分子構造，其中F介導細胞-溶質(zhì)相互作用。
41.根據(jù)權利要求40的合成分子構造，其中F為結合分子的配體，其中所述結合分子的存在用于診斷病理癥狀。
42.根據(jù)權利要求41的合成分子構造，其中F為抗體(免疫球蛋白)的配體。
43.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DOPE(I)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
44.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
45.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DSPE(III)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
46.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
47.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Htri-sp-Ad-DOPE(VII)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
48.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
49.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
50.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
51.根據(jù)權利要求14的合成分子構造，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)，和M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
52.一種制備結構為F-S1-S2-L的合成分子構造的方法，包括以下步驟-使活化劑(A)與脂質(zhì)(L)反應，從而提供活化脂質(zhì)(A-L)；-對抗原(F)進行衍生化，從而提供衍生化的抗原(F-S1)；和-使A-L與F-S1進行縮合，從而提供所述構造；其中A為選自以下的活化劑，包括(C3～C7)碳二酸的二(N-羥基琥珀酰亞胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)酯；L是選自以下的脂質(zhì)二?；?和二烷基-甘油脂，包括甘油基磷酸脂；和衍生于二?；?和二烷基-脂肪的鞘氨醇，包括N-脂?；拾贝?；F是選自碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白所構成組群的抗原；和S1-S2為將F連接至L的間隔基團，其中S1選自以下基團，包括伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺；和S2不存在或者選自以下基團，包括CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)和-CO(CH2)5CO-。
53.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述合成分子構造具有水溶性。
54.根據(jù)權利要求51或者52的方法，其中當所述合成分子構造的溶液與脂雙層接觸時，所述合成分子構造自發(fā)地摻入脂雙層中。
55.根據(jù)權利要求54的方法，其中所述合成分子構造穩(wěn)定地摻入脂雙層中。
56.根據(jù)權利要求52～55任一項的方法，其中F、S1、S2和L共價連接。
57.根據(jù)權利要求52～56任一項的方法，其中F選自天然存在或者合成的glycotopes、抗體(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白、和生物素。
58.根據(jù)權利要求57的方法，其中F選自天然存在或者合成的glycotopes或者抗體(免疫球蛋白)。
59.根據(jù)權利要求52～58任一項的方法，其中L為選自二?；?和二烷基-甘油脂的脂質(zhì)，其中二?；?和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
60.根據(jù)權利要求59的方法，其中L選自衍生于一種或多種反式-3-十六烯酸、順式-5-十六烯酸、順式-7-十六烯酸、順式-9-十六碳烯酸、順式-6-十八碳烯酸、順式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、順式-11-十八碳烯酸、順式-11-二十烯酸或者順式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油。
61.根據(jù)權利要求60的方法，其中所述脂質(zhì)衍生于一種或多種順式-不飽和脂肪酸。
62.根據(jù)權利要求61的方法，其中L選自1，2-O-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1，2-二油?；视?DOG)。
63.根據(jù)權利要求52～62任一項的方法，其中L為甘油基磷酸脂和所述合成分子構造包括以下亞結構 其中n＝3～5，X為H或者C，和*不是H。
64.根據(jù)權利要求63的方法，其中所述n為3。
65.根據(jù)權利要求52～62任一項的方法，其中對A和S1進行選擇，從而提供水溶性的合成分子構造。
66.根據(jù)權利要求52～65任一項的方法，其中F為天然存在或者合成的glycotope。
67.根據(jù)權利要求66的方法，其中F為由三個(三糖)或者更多個糖元組成的天然存在或者合成的glycotope。
68.根據(jù)權利要求66的方法，其中F為選自以下的glycotopelacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列寡糖。
69.根據(jù)權利要求66的方法，其中F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3Gaβ；NeuAcα2-6Gaβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
70.根據(jù)權利要求52～69任一項的方法，其中當F為glycotope時，L為甘油基磷酸脂，和S2選自以下基團，包括-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-。
71.根據(jù)權利要求52～70任一項的方法，其中S1為選自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。
72.根據(jù)權利要求71的方法，其中S1為3-氨基丙基。
73.根據(jù)權利要求52～65任一項的方法，其中F介導細胞-細胞相互作用或者細胞-表面相互作用。
74.根據(jù)權利要求73的方法，其中F為對表達在靶細胞或者表面上的組分具有親和力的碳水化合物、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。
75.根據(jù)權利要求74的方法，其中F對表達在上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
76.根據(jù)權利要求75的方法，其中F對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
77.根據(jù)權利要求76的方法，其中表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者外源性摻入的組分。
78.根據(jù)權利要求52～65任一項的方法，其中F是介導細胞-溶質(zhì)的合成分子構造。
79.根據(jù)權利要求78的方法，其中F為結合分子的配體，其中所述結合分子的存在用于診斷病理癥狀。
80.根據(jù)權利要求79的方法，其中F為抗體(免疫球蛋白)的配體。
81.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DOPE(I)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
82.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
83.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Atri-sp-Ad-DSPE(III)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
84.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Btri-sp-Ad-DOPE(VI)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
85.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Htri-sp-Ad-DOPE(VII)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
86.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
87.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；
88.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
89.根據(jù)權利要求52的方法，其中所述水溶性合成分子構造具有以下結構 表示為Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)，和其中M一般為H，但是它可以被其它一價陽離子替換，比如Na+、K+或者NH4+。
90.根據(jù)權利要求52～89任一項的方法制備的水溶性合成分子構造。
91.一種在細胞或者多細胞結構表達的表面抗原中實現(xiàn)定性和/或定量變化的方法，包括以下步驟-使細胞或者多細胞結構的懸浮液與根據(jù)權利要求14～51或者90任一項的水溶性合成分子構造在足以使細胞或者多細胞結構表達的表面抗原實現(xiàn)定性和/或定量變化的時間和溫度下接觸。
92.根據(jù)權利要求91的方法，其中所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
93.根據(jù)權利要求91或者92的方法，其中所述水溶性合成分子構造在懸浮液中的濃度為0.1～10mg/mL。
94.根據(jù)權利要求91～93任一項的方法，其中所述細胞或者多細胞結構懸浮液在2～37℃的溫度下與水溶性合成分子構造接觸。
95.根據(jù)權利要求94的方法，其中所述細胞或者多細胞結構的懸浮液在2～25℃的溫度下與所述水溶性合成分子構造溶液接觸。
96.根據(jù)權利要求95的方法，其中所述細胞或者多細胞結構的懸浮液在2～4℃的溫度下與所述水溶性合成分子構造溶液接觸。
97.根據(jù)權利要求91～96任一項的方法，其中F選自包括以下末端糖基的glycotopesGalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ；Galα1-3Galβ；Galβ；Galα1-3(Fucα1-2)Galβ；NeuAcα2-3Galβ；NeuAcα2-6Galβ；Fucα1-2Galβ；Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Gaβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；NeuAcα2-3 Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ；Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc；或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
98.根據(jù)權利要求97的方法，其中F選自由寡糖GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ和Galα1-3(Fucα1-2)Galβ組成的glycotopes。
99.根據(jù)權利要求91或者96任一項的方法，其中所述合成分子構造選自以下，包括Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE (IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
100.根據(jù)權利要求91～99任一項的方法，其中所述細胞或者多細胞結構為胚胎。
101.根據(jù)權利要求100的方法，其中F為連接分子，其中該連接分子對表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分具有親和力。
102.根據(jù)權利要求101的方法，其中表達在子宮內(nèi)膜上皮細胞或者細胞外間質(zhì)上的組分可以為天然表達的組分或者外源性摻入的組分。
103.根據(jù)權利要求91～99任一項的方法，其中所述細胞或者多細胞結構為紅血球。
104.根據(jù)權利要求103的方法，其中F為結合分子的配體，其中所述結合分子的存在用于診斷病理癥狀。
105.根據(jù)權利要求104的方法，其中F為抗體(免疫球蛋白)的配體。
106.結合有根據(jù)權利要求14～51或者90任一項的水溶性合成分子構造的細胞或者多細胞結構。
107.根據(jù)權利要求106的細胞或者多細胞結構，其中所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
108.根據(jù)權利要求106或者107的細胞或者多細胞結構，其中所述細胞或者多細胞結構為摻入水溶性合成分子構造的紅血球，所述水溶性合成分子構造選自以下，包括Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
109.根據(jù)權利要求106或者107的細胞或者多細胞結構，其中所述細胞或者多細胞結構為摻入選自以下的水溶性合成分子構造的胚胎Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE (IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
110.一種試劑盒，包括根據(jù)權利要求1～13任一項的分子制劑，或者包括根據(jù)權利要求14～51或者90任一項的水溶性合成分子構造的干燥制品或者溶液。
111.根據(jù)權利要求110的試劑盒，其中根據(jù)權利要求1～13任一項的分子選自Ad-DOPE；sp1-Ad-DOPE；和Ad-DSPE。
112.根據(jù)權利要求110的試劑盒，其中根據(jù)權利要求14～51或者90任一項的水溶性合成分子構造選自Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβi-sp-Ad-DOPE(IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
113.一種包括根據(jù)權利要求106～109任一項的細胞或者多細胞結構的懸浮溶液形式的混懸物的試劑盒。
114.根據(jù)權利要求113的試劑盒，其中所述懸浮溶液基本上不含脂質(zhì)。
115.根據(jù)權利要求113或者114的試劑盒，其中所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
116.根據(jù)權利要求113～115任一項的試劑盒，其中所述細胞為不天然表達A-或者B-抗原的紅血球，并且所述細胞包含選自以下的水溶性合成分子構造Atri-sp-Ad-DOPE(I)；Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)；Atri-sp-Ad-DSPE(III)；Btri-sp-Ad-DOPE(VI)；Htri-sp-Ad-DOPE(VII)；Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)；Galβ1-sp-Ad-DOPE (IX)；Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)；和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
117.根據(jù)權利要求116的試劑盒，其中所述懸浮溶液另外包含一種或多種抗體。
118.根據(jù)權利要求117的試劑盒，其中所述細胞為敏感性對照細胞。
119.一種藥物制劑，包括根據(jù)權利要求14～51或者90任一項的水溶性合成分子構造的干燥制品或者溶液。
120.根據(jù)權利要求119的藥物制劑，其中所述藥物制劑為吸入給藥的形式。
121.根據(jù)權利要求120的藥物制劑，其中所述藥物制劑為注射給藥的形式。
122.一種藥物制劑，其包括根據(jù)權利要求106～109任一項的細胞或者多細胞結構。
123.根據(jù)權利要求122的藥物制劑，其中所述細胞或者多細胞結構源于人類或者鼠。
124.根據(jù)權利要求122或者123的藥物制劑，其中所述藥物制劑為吸入給藥的形式。
125.根據(jù)權利要求122或者123的藥物制劑，其中所述藥物制劑為注射給藥的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及自發(fā)和穩(wěn)定地摻入脂雙層(包括細胞膜)的合成分子。本發(fā)明特別是，但并非僅僅，涉及這些分子用作合成膜錨著點或者合成分子構造，從而在細胞表面抗原表達中實現(xiàn)定性和定量變化的用途。
文檔編號C12N5/08GK1938325SQ200580009170
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月22日 優(yōu)先權日2004年3月22日
發(fā)明者尼喬萊·博溫, 麗莎·吉利佛, 斯蒂芬·亨利, 葉連娜·科爾恰金娜 申請人:科德生物工程有限公司