專利名稱：新的木聚糖酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有木聚糖分解活性的新酶及其相應(yīng)的基因。特別地，本發(fā)明涉及從嗜冷微生物分離的和/或?qū)儆谔擒账饷讣易?的木聚糖酶。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酶具有許多應(yīng)用且高度適用于面包改良組合物中。
背景技術(shù)：
木聚糖是形成植物生物量中半纖維素主要成分的雜多糖。這些多糖的主鏈由β-1，4-連接的吡喃木糖苷殘基鏈構(gòu)成?？梢杂酶鞣N側(cè)鏈基團(tuán)，包括乙酰基，阿拉伯糖基和/或葡糖醛酸基取代基將該主鏈取代至不同程度。此外，木聚糖鏈的交聯(lián)中或/和木聚糖和木質(zhì)素鏈的交聯(lián)中也可能涉及酚化合物如阿魏酸或羥基肉桂酸，通過酯結(jié)合。
木聚糖內(nèi)切酶(也稱為內(nèi)-β-1，4-木聚糖酶，戊聚糖酶或半纖維素酶)特異性地水解木聚糖的主鏈。然而，一些情況中，可以通過側(cè)基在空間上來阻礙它們的活性。已經(jīng)描述了不同類型的木聚糖酶及其對(duì)底物的特異性相互之間是不同的，例如一些對(duì)不溶的阿拉伯糖基木聚糖更有活性。此外，所產(chǎn)生的寡聚物長(zhǎng)度還取決于所考慮的木聚糖酶類型。
基于序列同源性已經(jīng)將糖苷水解酶歸類為93個(gè)家族(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)，并因此反映出結(jié)構(gòu)和機(jī)械特征。因?yàn)榈鞍椎恼郫B比序列更保守，可將一些家族分組為“異種集團(tuán)(clan)”(Henrissat B.1991，Biochem.J.Vol.280，p.309)。
通常將內(nèi)-β-1，4-木聚糖酶歸為家族10(之前為家族F)和家族11(之前為家族G)，并發(fā)現(xiàn)在其pI和分子量之間通常具有反比關(guān)系。家族10木聚糖酶(EXs10)通常比家族11木聚糖酶(EXs11)更大和更復(fù)雜。此外，這些家族在它們的結(jié)構(gòu)和催化特征中呈現(xiàn)了顯著差異。EXs10呈現(xiàn)(α/β)8桶狀折疊，具有約40％的α-螺旋結(jié)構(gòu)并屬于異種集團(tuán)GH-A(Dominguez等，1995，Nat.Struct.Biol.Vol.2，p.569)，而Exs11呈現(xiàn)了β-膠狀卷形折疊，具有約3-5％的α-螺旋結(jié)構(gòu)并屬于異種集團(tuán)GH-C(T_rr_nen等，1994，EMBO J.Vol.13，p.2493)。EXs10具有較小的底物結(jié)合部位和較低的底物特異性。此外，與EXs11相比較，它們通常具有葡聚糖內(nèi)切酶活性并產(chǎn)生較小的寡糖(Biely等，1997，J.Biotechnol.Vol.57，p.151)。迄今為止所表征的這兩個(gè)家族的木聚糖酶水解后保持著糖苷氧的異頭構(gòu)型，其中兩個(gè)谷氨酸通常起催化殘基作用(Jeffries，1997，Curr.Opin.Biotechnol.Vol.7，p.337)。
木聚糖酶用于各種工業(yè)部門中，包括用于食品，飼料和一些技術(shù)工業(yè)中。
食品工業(yè)中，木聚糖酶用于水果，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造和釀造，焙烤，磨粉，糕點(diǎn)和糖果以及咖啡加工中。它們?cè)谶@些工業(yè)中的作用是完全不同的。例如，在水果和植物加工中，它們促進(jìn)了浸漬過程，汁液澄清，提取產(chǎn)量和過濾效率，因此提高了加工性能和產(chǎn)品質(zhì)量。木聚糖酶還在啤酒制造中降低了麥芽汁的粘度，在葡萄酒制造中促進(jìn)了葡萄皮浸漬和降低了成品的混濁度。在焙烤中，木聚糖酶提高了面團(tuán)的彈性和強(qiáng)度，因此使得更容易操作，獲得更大的面包體積和改善的面包質(zhì)地。在咖啡加工中，木聚糖酶降低了咖啡提取物的粘度并改善了干燥/凍干過程。
木聚糖酶進(jìn)一步用于單胃動(dòng)物(豬和家禽)和反芻動(dòng)物的飼料中。其中，它們降低了非淀粉多糖的含量，因此降低了腸粘度并提高了飼料中存在的蛋白質(zhì)和淀粉的利用。木聚糖酶改善了動(dòng)物的行為表現(xiàn)并提高了降解差的飼料如大麥和小麥的可消化性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
在淀粉工業(yè)中，使用木聚糖酶改善了谷蛋白-淀粉分離過程。
在紙漿和紙張工業(yè)中，將木聚糖用于促進(jìn)制漿處理和減少機(jī)械制漿方法的使用，因此降低了能量消耗。木聚糖酶還提高了紙漿的原纖維形成和透水性，因此提高了加工效率和紙張強(qiáng)度。它們還有助于脫墨處理和減少了這些過程中堿的使用。
木聚糖酶進(jìn)一步用于紡織品(亞麻，黃麻，苧麻，大麻，...)的酶解漚麻中，并因此減少或替代化學(xué)漚麻方法。它們還用于生物整治中，用于處理農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)廢物。例如一些生物轉(zhuǎn)化過程如可發(fā)酵產(chǎn)物，可再生燃料(生物乙醇)或精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)也可以借助于木聚糖酶來進(jìn)行。
將來還可以獲得木聚糖酶的更多應(yīng)用。
在焙烤中使用木聚糖酶(也稱為木聚糖內(nèi)切酶，內(nèi)-β-1，4-木聚糖酶，戊聚糖酶或半纖維素酶)已經(jīng)公知很多年了。這些面團(tuán)調(diào)節(jié)酶可以提高面團(tuán)的可加工性和穩(wěn)定性以及烘烤膨脹和面包瓤結(jié)構(gòu)。酶的其他效果是較大的面包體積和較軟的面包瓤。
木聚糖酶在面包制作中的作用機(jī)理仍然沒有得到清楚地闡明。小麥粉含有約3至4％戊聚糖。這些戊聚糖可以吸收大量的水(高達(dá)30％)且這種水吸收有助于面團(tuán)的特性以及成品的質(zhì)量。通過戊聚糖酶將戊聚糖部分水解成水溶性的短鏈寡糖提高了水結(jié)合量。此外，戊聚糖與面粉的谷蛋白部分強(qiáng)烈地相互作用形成網(wǎng)絡(luò)。戊聚糖酶可以幫助松弛這種強(qiáng)而堅(jiān)硬的網(wǎng)絡(luò)，因此使得通過由酵母形成的二氧化碳使面團(tuán)更好的膨脹。
已經(jīng)有多種半纖維素酶制劑用于上述的應(yīng)用中，這些制劑是可購(gòu)得的。使用各種微生物作為酶源通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)這些制劑。這些酶中的一些還可以通過遺傳改變的微生物來產(chǎn)生。所有用文件證明的商業(yè)用途的木聚糖酶涉及屬于糖苷水解酶家族10或家族11的木聚糖酶，如之前所定義的。
商業(yè)木聚糖酶的實(shí)例是來自芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種，木霉屬(Trichoderma)菌種，腐殖菌屬(Humicola)菌種和曲霉屬(Aspergillus)菌種的木聚糖酶。
最近已經(jīng)公開了描述木聚糖酶領(lǐng)域中技術(shù)現(xiàn)狀的很多綜述(參見，例如Shallom D & Shoham Y.2003，Curr.Opin.Microbiol.Vol.6，p.219-Subramaniyan S & Prema P.2002，Crit Rev Biotechnol.Vol22，p.33-Beg QK，Kapoor M，Mahajan L & Hoondal GS.2001，ApplMicrobil Biotechnol.Vol.56，p.326)。
最近已經(jīng)描述了屬于糖苷水解酶家族10和11以外家族的木聚糖酶(參見，例如 http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/，EC代碼為木聚糖酶3.1.2.8.，綜述)。其中，一個(gè)實(shí)例是來自Pseudoalteromonashaloplanktis TAH3a的屬于已經(jīng)表征的糖苷水解酶家族8的木聚糖酶，且為此已經(jīng)克隆了相應(yīng)的基因(Collins T.等，2002，J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133；Collins T.等，2003，J.Mol.Biol.Vol 328，P.419；Van Petegem F.等，2003，J.Biol.Chem.Vol 278，p.7531)。這種酶是典型的嗜冷酶并在低溫呈現(xiàn)高度催化活性。它與家族10或11木聚糖酶不同源，但是與糖苷水解酶家族8成員(之前稱為家族D)具有20至30％的同一性，家族8是主要包括葡聚糖內(nèi)切酶，以及地衣多糖酶和殼聚糖酶的家族。此外，使用InterPro掃描檢索程序(Zdobnov和Apweiler，2001，Bioinformatics Vol.17，p.847)的針對(duì)PRINTS的指紋掃描(FingerPRINTScan)表明所分離的序列包含糖基水解酶家族8的指紋。此外，所分離的序列含有迄今所分析的53個(gè)家族8酶中嚴(yán)格保守的家族8殘基。
與大多數(shù)EXs10和EXs11相反，這種家族8木聚糖酶(EXs8)具有高pI和高分子量。結(jié)構(gòu)和催化特性不同于EXs10和EXs11的那些。EXs8木聚糖酶呈現(xiàn)變形的(α/α)6桶狀折疊，帶有13個(gè)α-螺旋和13個(gè)β-鏈并屬于異種集團(tuán)GH-M(Van Petegem等2003，J.Biol.Chem.Vol.278(9)，p7531-9)。這種酶不具有葡聚糖內(nèi)切酶，殼聚糖酶或地衣多糖酶活性且似乎功能上與EXs11相似，對(duì)長(zhǎng)鏈木聚糖-寡糖更有活性。
與其他表征的保留異頭構(gòu)型的EXs10和EXs11相反，家族8糖苷水解酶(Fierobe等，1993.，Eur.J.Biochem.Vol.217p557；http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)易于水解糖苷氧異頭構(gòu)型倒位的底物。來自Pseudoalteromonas haloplanktis的嗜冷木聚糖酶已經(jīng)表明了這一點(diǎn)(Collins，T.等，2002.J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133)。此外，認(rèn)為水解中所涉及的催化殘基是谷氨酸和天冬氨酸。
存在評(píng)價(jià)酶制劑中木聚糖酶活性的多種方法。這類用于木聚糖酶活性測(cè)定的方法實(shí)例包括測(cè)量還原糖從木聚糖的釋放(Miller G.L.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)，或測(cè)量有色化合物從改性底物的釋放(例如，來自Megazyme的AzoWAX或Xylazyme AX)。然而，已經(jīng)表明在各種酶制劑中發(fā)現(xiàn)的木聚糖分解活性和在特定應(yīng)用中的效果之間沒有直接相關(guān)性。例如在焙烤中，對(duì)于單個(gè)酶可以在某種程度上觀察到劑量相關(guān)結(jié)果，但相同劑量的不同來源的兩種木聚糖酶在面團(tuán)或面包中沒有產(chǎn)生相同的結(jié)果。有幾個(gè)原因可以解釋這一點(diǎn)底物特異性的不同，最佳溫度和pH的不同，催化效率的不同，...
有極大的興趣來開發(fā)新的酶制劑，如，但不限于，用于具有新的或改進(jìn)特性的面包改良組合物或改良劑的成分。這些特性之一是木聚糖酶含量盡可能地低(以獲得特定結(jié)果所需要的酶重量計(jì))。
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的在于提供具有木聚糖分解活性的新酶和酶制劑。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供編碼這些酶的氨基酸和核苷酸序列及其變體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于農(nóng)業(yè)食品，飼料和許多其它技術(shù)方法中的酶和酶制劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供具有木聚糖分解活性的酶和酶制劑，其中在特定應(yīng)用中觀察到特定效果所需要的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于任何常規(guī)的商業(yè)酶。
仍然本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有木聚糖分解活性的酶和酶制劑，其比本領(lǐng)域已知的酶明顯更穩(wěn)定，且優(yōu)選同時(shí)更有效(通過獲得給定效果所需要的量顯著更低來反映)。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及新的木聚糖分解酶，優(yōu)選屬于糖苷水解酶家族8且優(yōu)選是嗜冷酶，最優(yōu)選是水解異頭構(gòu)型倒位的嗜冷酶，附帶條件是所述的木聚糖分解酶不是由SEQ ID NO1編碼的。
有利地，本發(fā)明的酶當(dāng)以1500至6000木聚糖酶單位/100kg面粉的濃度應(yīng)用時(shí)，增加了焙烤產(chǎn)品的面包體積至少10％，和/或當(dāng)以1500至6000木聚糖酶單位/100kg面粉的濃度應(yīng)用時(shí)，增加了焙烤產(chǎn)品表面的切割寬度。本發(fā)明的酶可以有利地用于冷凍面團(tuán)中和/或涉及低溫醒發(fā)成形的應(yīng)用中。
優(yōu)選，酶包括對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16或35中任一的氨基酸序列，或由該氨基酸序列構(gòu)成。這些序列含有426個(gè)氨基酸(aa)，其中頭21個(gè)構(gòu)成信號(hào)肽。優(yōu)選的序列是SEQ ID NO4，表示從TAH 2a分離的木聚糖酶。
優(yōu)選，所述的酶-由以上SEQ ID NO之一標(biāo)識(shí)的-屬于糖苷水解酶家族8并優(yōu)選是嗜冷酶。
本發(fā)明的另一方面涉及以上任一種的成熟多肽，對(duì)應(yīng)于以上任一序列的aa 22-426。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸序列是SEQ ID NO21，23，25，27，29，31，33和37和SEQ ID NO20，22，24，26，28，30，32和36，編碼這些成熟多肽的相應(yīng)核苷酸序列。
本發(fā)明的酶還可以具有少于10，9，8，7，6，5，4，3，2或1個(gè)aa不同于以上任一氨基酸序列(成熟蛋白或多肽)的氨基酸序列，或具有與SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一高于50％，70％，更優(yōu)選高于80％，85％，90％，最優(yōu)選高于95％，97％，98％或甚至更優(yōu)選99％序列同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的酶優(yōu)選從以下任一細(xì)菌菌株中分離TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2或SP.23.2bis。這些菌株涉及本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼以上任一種木聚糖分解酶的核苷酸序列。
優(yōu)選的這樣的核苷酸序列是包括SEQ ID NO19并編碼由SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，21，23，25，27，29或31所標(biāo)識(shí)的TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2或Sp.11.2木聚糖酶的序列。
其他優(yōu)選的核苷酸序列是編碼以上標(biāo)識(shí)的前蛋白或成熟多肽之一的那些。這樣的核苷酸序列實(shí)例包括SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32和36。
本發(fā)明的再一方面涉及重組核苷酸序列，包括一個(gè)或多個(gè)以上核苷酸序列，可操作地連接一個(gè)或多個(gè)相鄰的調(diào)控序列。本發(fā)明的另一方面涉及含有所述核苷酸序列的載體和用其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及摻入大腸桿菌(Escherichia coli)中的質(zhì)粒，大腸桿菌具有選自LMBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866的保藏號(hào)。優(yōu)選LMBP4862。
本發(fā)明的酶可以是胞外表達(dá)的或胞內(nèi)表達(dá)的。可以直接使用表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的酶的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物和/或只使用其中分泌了酶的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液?；蛘?，可以將細(xì)胞提取物和/或無細(xì)胞提取物用作本發(fā)明的酶源。最后，可以在純化或部分純化后(至少一個(gè)純化步驟后)使用酶，也就是或多或少純的形式。
本發(fā)明的木聚糖酶高度適用于涉及植物細(xì)胞壁成分降解的應(yīng)用中。例如，它們有利地用于分解植物和水果，優(yōu)選水果的方法中，豆汁，啤酒，紙張，淀粉，谷蛋白或植物油的制備過程中。其他應(yīng)用包括它們?cè)谒?，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造或釀造，咖啡加工，紙張或紡織品加工，生物轉(zhuǎn)化過程，分解廢物過程，優(yōu)選用于分解農(nóng)業(yè)廢物或造紙廠廢物，淀粉-谷蛋白分離過程，飼料制備，焙烤，磨粉，糕點(diǎn)和糖果加工中的用途。
本發(fā)明的酶特別適用于食品應(yīng)用中。
對(duì)于一些應(yīng)用，有利的是將上述細(xì)胞，上述細(xì)胞提取物的成分和/或根據(jù)本發(fā)明的具有木聚糖分解活性的一種或多種純化酶固定于固體支持物上。
本發(fā)明的酶可以用于面包改良劑或面包改良組合物中。除了根據(jù)本發(fā)明的一種或多種木聚糖分解酶，所述的改良劑或改良組合物可以進(jìn)一步含有至少一種其他的面包改良劑，這些其他的面包改良劑選自其他酶，乳化劑，氧化劑，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，鹽和蛋白質(zhì)(谷蛋白，纖維素結(jié)合部位)或其混合物。所述的其他酶優(yōu)選選自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麥芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-還原酶，葡聚糖酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，異構(gòu)酶，脂酶，磷脂酶，果膠酶或其混合物。所述的α-淀粉酶優(yōu)選是從米曲霉(Aspergillus oryzae)獲得的α-淀粉酶。
優(yōu)選在面團(tuán)混合過程中加入上述的面包改良組合物。
本發(fā)明的酶可以結(jié)合任何其他酶或配料并可以以例如干粉或顆粒尤其是無粉塵顆粒的形式來使用?；蛘?，可以以液體形式來使用，優(yōu)選和一種或多種穩(wěn)定劑如多元醇，糖，有機(jī)酸或糖醇一起使用。
本發(fā)明的最后一方面涉及包括至少一種，優(yōu)選至少兩種或三種本發(fā)明的酶的組合物，可能結(jié)合Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a木聚糖酶，例如由SEQ ID NO1編碼的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1a和b各自表示了Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖2表示了TAH 2a(圓形，實(shí)線)，TAH 4a(方塊，虛線)和TAH7a(三角形，短虛線)的木聚糖分解活性的溫度相關(guān)性。
圖3a和b各自表示了菌株TAH 2a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖4a和b各自表示了菌株TAH 4a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖5a和b各自表示了菌株TAH 7a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖6a和b各自表示了菌株Sp.10.1木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖7a和b各自表示了菌株Sp.10.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖8a和b各自表示了菌株Sp.11.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖9a和b各自表示了菌株Sp.23.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
圖10顯示了菌株TAH 3a，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1.，Sp.10.2.，Sp.11.2.，Sp.23.2 & Sp.23.2bis的木聚糖酶的核苷酸序列比對(duì)。在比對(duì)之下的符號(hào)*表示所列的所有序列中相同的核苷酸。
圖11顯示了菌株TAH 3a(xy13)，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1.，Sp.10.2.，Sp.11.2.，Sp.23.2 & Sp.23.2bis的木聚糖酶的氨基酸序列比對(duì)。在比對(duì)之下的符號(hào)*表示所列的所有序列中相同的氨基酸。
圖12顯示了Sp.11.2，Sp.23.2bis，TAH 2a和TAH 7a純化木聚糖酶的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。
圖13顯示了蛋白質(zhì)(木聚糖酶)的相對(duì)含量和根據(jù)本發(fā)明的不同木聚糖酶在焙烤中性能之間的關(guān)系。
圖14顯示了優(yōu)選的核苷酸序列SEQ ID NO19。
圖15顯示了本發(fā)明的木聚糖酶在焙烤測(cè)試中的體積-響應(yīng)曲線。
圖16a和b各自顯示了菌株Sp.23.2bis木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
通過參考附圖將在以下的實(shí)施例和實(shí)施方案中進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明。特定的實(shí)施方案和實(shí)施例不以任何方式來限制所要求的本發(fā)明的范圍。
發(fā)明詳述
A.根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)酶微生物的分離
本發(fā)明的第一方面涉及能夠產(chǎn)生具有新特性的木聚糖酶的未鑒定的微生物的分離。
有利地，這些微生物是從南極和北極環(huán)境中采集的環(huán)境樣品中分離的嗜冷微生物。文獻(xiàn)中描述了關(guān)于從這樣的樣品中分離嗜冷微生物的方法(Collins T.等，2002，J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133)。
通常這些方法包括將合適稀釋度的樣品涂布于各種組成的固體培養(yǎng)基上。通常在低溫(約4至約20℃)下進(jìn)行培養(yǎng)，使得嗜冷微生物生長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，固體培養(yǎng)基含有木聚糖酶的底物如含有半纖維素的材料或木聚糖。
根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案，固體培養(yǎng)基含有木聚糖酶的衍生化底物，如例如，RBB-木聚糖(Remazol Brilliant Blue木聚糖，Sigma)。這種底物可以更好地、通常更靈敏地篩選陽(yáng)性木聚糖酶產(chǎn)生微生物。
顯而易見的是除了在此所述的那些，存在篩選木聚糖酶陽(yáng)性微生物的其他技術(shù)。一種這樣的技術(shù)涉及微生物的系統(tǒng)液體培養(yǎng)，例如使用含有木聚糖酶誘導(dǎo)劑如但不限于木聚糖，麥麩等的培養(yǎng)基，接著進(jìn)行培養(yǎng)物上清液和/或細(xì)胞提取物的酶法分析。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，分離的木聚糖酶陽(yáng)性微生物可以在或不在屬或種的水平上得到鑒定。技術(shù)如脂肪酸分析或16S rDNA序列分析是公知鑒定技術(shù)的實(shí)例。
本發(fā)明更特別地涉及分離的菌株TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp10.1，Sp10.2，Sp11.2，Sp23.2和Sp23.2bis。
TAH2a，TAH4a和TAH7a是細(xì)菌菌株，更具體地是Pseudoalteromonas屬的細(xì)菌菌株。
B.木聚糖酶編碼基因的分離
本發(fā)明涉及從上述菌株分離木聚糖酶編碼基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知幾種技術(shù)可用于從微生物分離特定的基因。這樣技術(shù)的實(shí)例包括從合適載體中的菌株的基因組DNA構(gòu)建基因文庫(kù)，接著通過目標(biāo)基因的直接表達(dá)，或通過與推測(cè)的密切相關(guān)基因或與從所述酶的部分或完整氨基酸序列的逆轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)的寡核苷酸雜交來篩選該文庫(kù)。
其他技術(shù)包括通過分子技術(shù)例如PCR技術(shù)來擴(kuò)增基因，使用從推測(cè)的密切相關(guān)基因設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并或非簡(jiǎn)并寡核苷酸引物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，用于設(shè)計(jì)這樣的寡核苷酸引物的起始序列是從Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a分離的木聚糖酶基因序列(EMBL登錄號(hào)AJ427921，所包括的序列引入作為參考，還參見圖1a或SEQ ID NO 1)。
本發(fā)明的一方面涉及分離的(和純化的)編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32，36或其變體。
在本情況下，“變體”定義為其中一個(gè)或幾個(gè)核苷酸已經(jīng)被其他核苷酸替代或其中一個(gè)或幾個(gè)核苷酸已經(jīng)被添加和/或缺失而編碼的酶仍然呈現(xiàn)木聚糖分解活性的分離的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，變體的核苷酸序列呈現(xiàn)與分離的序列高于50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，優(yōu)選高于97％，98％或甚至高于99％序列同一性。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，變體的核苷酸序列與SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32或36相比較，呈現(xiàn)少于20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1個(gè)修飾的核苷酸。
C.本發(fā)明的木聚糖酶的表征
本發(fā)明的另一方面涉及由上述任一核苷酸序列編碼的具有木聚糖分解活性的酶。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，該酶的氨基酸序列選自SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33，37或其變體。
在本情況下，“變體”定義為其中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸已經(jīng)被一個(gè)或幾個(gè)其他氨基酸替代的分離的氨基酸序列，或其中已經(jīng)添加和/或缺失了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而保留全部或大部分的木聚糖酶活性的分離的氨基酸序列。變體酶優(yōu)選保留至少80％，更優(yōu)選至少90％和最優(yōu)選至少95％或甚至99％的由SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37表征的任一種酶的木聚糖分解活性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，變體的氨基酸序列呈現(xiàn)與SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一序列高于50％，70％，更優(yōu)選高于80％，85％，90％，最優(yōu)選高于95％，97％，98％或甚至高于99％序列同一性。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，變體的氨基酸序列與SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一相比較，呈現(xiàn)少于4，3，2或1個(gè)修飾的氨基酸。
公知大多數(shù)分泌的酶，如本發(fā)明的酶，在其N末端具有驅(qū)動(dòng)酶從細(xì)胞中分泌出來的小氨基酸序列。因此本發(fā)明的目的還將酶的成熟部分視為本發(fā)明的組成部分(參見，例如，SEQ ID NO21，23，25，27，29，31，33或37)。然而，可以有利地使用含有信號(hào)序列修飾的變體，因?yàn)檫@些變體最終在重組宿主中能夠得到更好的表達(dá)和/或更好的分泌。
對(duì)于由SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16或35任一所標(biāo)識(shí)的酶，成熟蛋白起始于第22位氨基酸。
表征蛋白和/或酶的另一種方法是研究它們與已知蛋白的同一性或相似性。第一步可以使用Blast程序，將所限定的序列與所有可獲得的公開序列進(jìn)行比較。該程序可以在以下URL(http://www.nebi.nlm.nih.gov/blast/)在線使用。為了確定和明確兩個(gè)或多個(gè)蛋白之間的同一性/相似性的百分比，可以有利地使用程序Clustal(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或Align(http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)
表征新蛋白和/或酶的另外的方法是分析它們的三維結(jié)構(gòu)。一些情況中，這種三維結(jié)構(gòu)是未知的。然而，通過與相關(guān)蛋白的其他可獲得的結(jié)構(gòu)相比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如專門的軟件可以推演該三維結(jié)構(gòu)。此外，對(duì)于非常密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如具有高于90％同一性/相似性的蛋白質(zhì)，可以預(yù)測(cè)由氨基酸序列中的特定修飾(例如，氨基酸替代)引起的特性改變。這樣的改變可以是例如底物結(jié)合，蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，...
本發(fā)明的另一方面涉及通過它們的生化特性如分子量，最佳溫度或最佳pH來表征本發(fā)明的木聚糖酶。實(shí)際上，通過以下實(shí)施例，本發(fā)明所述的酶具有相對(duì)低溫的最佳活性。此外，它們?cè)诘蜏乇３至烁叩拇呋什⒁虼吮徽J(rèn)為是嗜冷木聚糖酶。限定嗜冷酶的一種方法是考慮酶在5℃保持至少40％的其最大活性。其他特性也可以用來限定嗜冷酶(參見例如，Georlette D.等，2004，F(xiàn)ERM Microbiol.Rev.Vol.28，p.25；D’Amico S.2002，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.Vol.357，p.917)。
然而，不排除存在具有上述序列特征但具有不同生化特性的酶。
D.酶的表達(dá)和/或純化
本發(fā)明的另一方面涉及重組核苷酸序列，由可操作地連接一個(gè)或多個(gè)上述本發(fā)明的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)相鄰調(diào)控序列組成。
所述的相鄰調(diào)控序列可以源自同源和/或異源微生物。
這些相鄰調(diào)控序列是特定的序列，如但不限于啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)基因，分泌信號(hào)和/或終止子。
本發(fā)明的另一方面涉及含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列的載體，可能可操作地連接一個(gè)或多個(gè)源自同源或/和異源微生物的相鄰調(diào)控序列。
本發(fā)明內(nèi)容中，將“載體”定義為可以用于(通過轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，感染，接合等)將核苷酸序列引入細(xì)胞中的任何生化構(gòu)建體。有利地，本發(fā)明所述的載體選自質(zhì)粒，病毒，噬菌粒，染色體，轉(zhuǎn)座子，脂質(zhì)體，陽(yáng)離子泡囊和/或其混合物。所述載體可以已經(jīng)含有一個(gè)或多個(gè)上述的相鄰調(diào)控序列(使其通過所述的微生物表達(dá)并翻譯成相應(yīng)的肽)。優(yōu)選，所述載體是摻入大腸桿菌中的質(zhì)粒并具有選自LMBP4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866的保藏號(hào)。
本發(fā)明還涉及用一個(gè)或多個(gè)上述的根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體“轉(zhuǎn)化的”宿主細(xì)胞，優(yōu)選重組宿主細(xì)胞。
本發(fā)明內(nèi)容中，將“由一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體轉(zhuǎn)化的”“宿主細(xì)胞”定義為具有摻入的所述核苷酸序列和/或所述載體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以是其中通過遺傳轉(zhuǎn)化，優(yōu)選通過同源重組，或通過另一種公知的產(chǎn)生/形成重組生物體的方法引入所述載體和/或所述核苷酸序列的細(xì)胞。
“宿主細(xì)胞”可以是轉(zhuǎn)化之前沒有天然(原始)含有所述核苷酸序列和/或所述載體的細(xì)胞?；蛘?，“宿主細(xì)胞”還可以是已經(jīng)含有本發(fā)明的核苷酸序列之一的原始細(xì)胞，且遺傳上改變的(重組宿主細(xì)胞)超表達(dá)或更有效地表達(dá)所述酶(更好的pH或溫度特征，更高的細(xì)胞外表達(dá)，...)。
優(yōu)選，所述的宿主細(xì)胞能夠超表達(dá)(比在原始或野生型微生物中觀察到的表達(dá)更高的表達(dá))所述核苷酸序列和/或所述載體，有利地使得由所述核苷酸序列和/或所述載體編碼的氨基酸序列的高產(chǎn)量?？梢詫⒈景l(fā)明所述的分離和純化的核苷酸序列整合至選定宿主細(xì)胞的基因組中和/或可以存在于所述宿主細(xì)胞中的游離基因載體上。
有利地，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞選自微生物界，優(yōu)選選自細(xì)菌或真菌，包括酵母。
更優(yōu)選重組宿主細(xì)胞屬于芽胞桿菌屬。
優(yōu)選，改變所述的重組宿主細(xì)胞來獲得木聚糖酶的高水平表達(dá)。這可以通過使用能夠指導(dǎo)重組宿主細(xì)胞內(nèi)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列超表達(dá)的相鄰調(diào)控序列或通過增加根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的拷貝數(shù)目來獲得。
以上已經(jīng)描述了一些優(yōu)選用于培養(yǎng)選定來表達(dá)本發(fā)明的木聚糖酶的宿主細(xì)胞的條件(培養(yǎng)基，溫度和pH條件等)。為此，用設(shè)計(jì)來表達(dá)所述酶的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的原始生產(chǎn)種和/或合適的宿主細(xì)胞存在于合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和/或表達(dá)培養(yǎng)基之內(nèi)或之上。
根據(jù)本發(fā)明，所述具有木聚糖分解活性的蛋白可以通過以下方法獲得首先將菌株在適于表達(dá)木聚糖的培養(yǎng)基之中/之上培養(yǎng)菌株，接著進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)純化步驟，如但不限于，離心，細(xì)胞破碎，微濾，超濾，沉淀，液相色譜，凍干等。所有這些技術(shù)描述于科學(xué)文獻(xiàn)且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
因此，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的具有木聚糖分解活性的酶可以直接用于本發(fā)明的目的之一和/或，另外，可以經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)如上所述的純化和/或(進(jìn)一步的)培養(yǎng)步驟。本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，可以以純的形式來使用本發(fā)明的酶。
本發(fā)明的酶的制備方法其中包括從搖瓶或發(fā)酵器中的重組或未重組微生物的培養(yǎng)物的制備和/或純化，和從固定化培養(yǎng)物的制備或純化，以及從活細(xì)胞(植物，...)的提取和/或純化。
E.酶的應(yīng)用
本發(fā)明的木聚糖酶可以用于不同類型的應(yīng)用中。
本發(fā)明中所述的具有木聚糖分解活性的酶，純化的或未純化的，特別適宜用作面包改良劑或配方。面包改良劑或組合物是能夠改善和/或提高質(zhì)地，風(fēng)味，保鮮效果，柔軟度，存儲(chǔ)時(shí)的面包瓤柔軟度，新鮮度，面團(tuán)可加工性和/或面團(tuán)和/或最終焙烤產(chǎn)品體積的產(chǎn)品。優(yōu)選，所述的具有木聚糖分解活性的酶改善了面團(tuán)加工和/或增加了最終焙烤產(chǎn)品的比體積。
術(shù)語(yǔ)“焙烤產(chǎn)品”包括從面團(tuán)制得的和焙烤面團(tuán)后獲得的任何產(chǎn)品，并特別包括酵母發(fā)酵的焙烤產(chǎn)品。從任何類型的面粉或粗粉(例如，基于小麥，黑麥，大麥，燕麥或玉米)獲得面團(tuán)。優(yōu)選，用小麥和/或包括小麥的混合物制得面團(tuán)。
本發(fā)明的一方面顯示了本發(fā)明所述的具有木聚糖分解活性的酶可以有利地用于面包改良劑配方或面包改良組合物中。
這些具有木聚糖分解活性的酶有利地選自糖苷水解酶家族8的酶。
這些具有木聚糖分解活性的酶有利地是嗜冷酶。
結(jié)果顯示了所述的酶增加了焙烤產(chǎn)品的面包體積。
進(jìn)一步顯示了在焙烤中獲得特定結(jié)果需要的所述酶的量比用商業(yè)獲得的酶操作時(shí)通常所用的/所需的量低得多。將這樣的量另外稱為足以獲得所需結(jié)果的量和/或有效量。
另外的方面中，本發(fā)明涉及所述具有木聚糖分解活性的酶和其他酶，尤其是和α-淀粉酶，優(yōu)選來自米曲霉的α-淀粉酶的相加效應(yīng)。所述具有木聚糖分解活性的酶可以結(jié)合其他面包改良劑一起使用，這些改良劑如但不限于酶，乳化劑，氧化劑，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，鹽，蛋白質(zhì)(谷蛋白，纖維素結(jié)合部位)，這樣的改良劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些酶的實(shí)例包括，但不限于，α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麥芽糖的淀粉酶，木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-還原酶，葡聚糖酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，異構(gòu)酶，脂酶，磷脂酶，果膠酶等。
根據(jù)本發(fā)明，具有木聚糖分解活性的酶，純化的或未純化的，在細(xì)胞壁成分存在下顯示出水解活性。特別地，所述酶降解小麥細(xì)胞壁成分。因此所述酶可以有利地用于分離植物細(xì)胞材料的成分，如谷類成分。特別地，所述酶可以用于提高通過所謂的洗面筋法將小麥分離成谷蛋白和淀粉。
根據(jù)本發(fā)明，具有木聚糖分解活性的酶，純化的或未純化的，可以用于食品加工中。它們可以用于水果，蔬菜和植物加工中。它們可以用于葡萄酒制造和釀造中以及用于咖啡加工中。
所述酶的另一種應(yīng)用在于飼料，其中它們可以用于提高動(dòng)物如家禽，豬或反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)速率或飼料轉(zhuǎn)化率。
另外其他的應(yīng)用是本發(fā)明的木聚糖酶在制紙漿和造紙工業(yè)中(生物機(jī)械制紙漿，纖維的生物改性，生物脫墨，...)，紡織品加工中，生物整治中，生物轉(zhuǎn)化過程中，...的用途。
根據(jù)本發(fā)明的具有木聚糖分解活性的酶可以在幾種形式下使用。表達(dá)該酶的細(xì)胞，如酵母，真菌，古細(xì)菌或細(xì)菌，可以直接用于操作過程中。還可以以細(xì)胞提取物，無細(xì)胞提取物(即，已經(jīng)經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)破碎，離心，提取和/或其他純化步驟的宿主細(xì)胞的部分)或以純化的蛋白來使用所述酶。上述任一種形式可以結(jié)合上述任一種形式的一種或多種酶來使用。這些完整的細(xì)胞，細(xì)胞提取物，無細(xì)胞提取物和/或純化的酶可以通過任何常規(guī)方法固定于固體支持物上來保護(hù)酶，使底物連續(xù)水解和/或使酶制劑重復(fù)利用。所述的細(xì)胞，細(xì)胞提取物(包括粗的和部分純化的提取物)，無細(xì)胞提取物和/或酶可以與不同的成分混合，并可以例如以干粉或顆粒，尤其是無粉塵顆粒的形式，以液體的形式來使用，例如根據(jù)公知的方法和如多元醇，糖，有機(jī)酸或糖醇的穩(wěn)定劑一起使用。
實(shí)施例
實(shí)施例1木聚糖酶產(chǎn)生微生物的分離和表征
從在南極洲Terre Adelie，Port Martin廢棄的法國(guó)南極站(66°40’S；140°01’E)附近采集的木材樣品或從在挪威斯瓦爾巴特群島Spitzberg，Ny-Alesund附近采集的海水樣品中分離木聚糖酶產(chǎn)生微生物。在補(bǔ)充了0.15％Remazol Brilliant Blue-木糖的marine瓊脂(5g/l胰蛋白胨(Difco)，1g/l酵母提取物(Difco)，33g/l海鹽(Wiegandt)，18g/l瓊脂(Difco))上在4℃進(jìn)行木聚糖酶活性的篩選。木聚糖酶產(chǎn)生微生物周圍出現(xiàn)明顯的暈圈，分離得到7個(gè)菌株。將從南極洲分離的微生物命名為TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，并將從Spitzberg分離的微生物命名為Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis。
已經(jīng)測(cè)定了TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a菌株的細(xì)胞脂肪酸組成。這三個(gè)菌株最可能屬于Pseudoalteromonas菌種。
實(shí)施例2野生型木聚糖酶的產(chǎn)生
培養(yǎng)條件
將分離的木聚糖酶產(chǎn)生細(xì)菌菌株TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis在改良marine培養(yǎng)液(5g/升胰蛋白胨(Difco)，1g/升酵母提取物(Difco)，20g/升海鹽(Wiegandt))中4℃培養(yǎng)72小時(shí)，所述的改良marine培養(yǎng)液(在TAH 2a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis的情況中)補(bǔ)充了15g/升樺木木聚糖(Sigma)或(在TAH 4a的情況中)補(bǔ)充了15g/升小麥半纖維素(Beldem)。
酶的制備
將上述培養(yǎng)物(參見以上的培養(yǎng)條件)在18,000×g和4℃離心1小時(shí)后，用80％硫酸銨沉淀來濃縮上清液，并重懸浮于pH8.0的20mMMOPS(3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸)中。將該懸浮液與TAH 4a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis木聚糖酶一起用于焙烤試驗(yàn)中。然而，在TAH 2a和TAH 7a的情況中，首先將重懸浮樣品對(duì)含有300mM NaCl的20mM MOPS透析過夜并在18,000×g離心1小時(shí)。對(duì)于這些樣品，將由此獲得的可溶部分(上清液)和不溶部分用于焙烤試驗(yàn)中(參見實(shí)施例3)。
酶的表征
在各種溫度下測(cè)定從菌株TAH 2a，TAH 7a(如上所述的可溶和不溶部分)獲得的和從菌株TAH 4a獲得的木聚糖酶的活性。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖2中。木聚糖酶在20℃至40℃之間呈現(xiàn)了最大活性并在5℃保持高于40％的活性。
實(shí)施例3焙烤試驗(yàn)
進(jìn)行焙烤試驗(yàn)來證明實(shí)施例2中所獲得的木聚糖酶在焙烤中的正面效果。通過與可購(gòu)得的木聚糖酶相比較和與不含有任何這些酶的參照相比較的面包體積的增加來評(píng)價(jià)正面效果。
在比利時(shí)每天大量生產(chǎn)的比利時(shí)硬面包卷中來測(cè)試本發(fā)明的木聚糖酶。所述的程序是專業(yè)面包師公知的且使用其他方案或來自其他供應(yīng)商的設(shè)備可以獲得相同結(jié)果是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
所用的配料列于以下的表1中
表1
將配料在Diosna SP24混合機(jī)中低速混合2分鐘，高速混合8分鐘。成品面團(tuán)溫度以及靜置和醒發(fā)溫度為25℃。在25℃靜置15分鐘后，將面團(tuán)重新用手揉捏并再靜置10分鐘。此后，加工成2kg的面團(tuán)塊并醒發(fā)10分鐘。使用Eberhardt Optimat來分割2kg的面團(tuán)塊并成型。獲得66g的圓形面團(tuán)塊。再靜置5分鐘后，通過壓制來切割面團(tuán)塊并經(jīng)過70分鐘的最后醒發(fā)階段。將面團(tuán)塊在使用蒸汽的MIWECondoTM烤爐(Michael Wenz-Arnstein-德國(guó))中230℃焙烤。使用常用的油菜籽頂替方法來測(cè)量6個(gè)面包卷的體積。
焙烤試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于以下的表2中
表2
(*)將一單位的Belase B210木聚糖酶定義為在30℃和pH4.5從樺木木聚糖釋放1μmol還原糖(以木糖來表示)所需要的酶用量(Nelson-Somogyi方法)。將一單位的其他木聚糖酶定義為在25℃和pH6.5從樺木木聚糖釋放1μmol還原糖(以木糖來表示)所需要的酶用量(二硝基水楊酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
(**)可溶的意思是上清液中存在的(可溶)酶部分(參見上文)。
上述結(jié)果表明所測(cè)試的所有木聚糖酶對(duì)面包體積都具有正面效果。
實(shí)施例4木聚糖酶基因的克隆
細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件
將實(shí)施例1中所述的TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis菌株在上述的改良Marine培養(yǎng)液中培養(yǎng)16小時(shí)(參見實(shí)施例2)。
基因組DNA的制備
用Wizard_基因組DNA純化試劑盒(Promega)從在上述培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時(shí)的培養(yǎng)物中提取和純化基因組DNA。
木聚糖酶基因的克隆
使用VENT聚合酶(Biolabs)來PCR-擴(kuò)增木聚糖酶基因，使用有義引物5’-GGGCATATGAAAGTATTTTTTAAAATAACAACTT-3’SEQ ID NO17，含有NdeI位點(diǎn)(帶下劃線的)和反義引物5’-GGGCTCGAGTTAATTAAACGTGTTGTTATAAAA-3’SEQ ID NO18，含有XhoI位點(diǎn)(帶下劃線的)和終止密碼子(斜體)。所用的基因組DNA模板濃度對(duì)于每種來源的分離物是最佳化的。95℃初始變性3分鐘后，使用Progene裝置(Techne Cambrige，UK)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。每個(gè)循環(huán)包括95℃變性1分鐘，54℃雜交30秒，和72℃延伸1.5分鐘。
使用由供應(yīng)商推薦的程序?qū)拿總€(gè)分離物獲得的片段克隆至PCRScript Amp SK(+)載體(Stratagene)中，并用于轉(zhuǎn)化XL10-Gold_Kan超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。藍(lán)-白選擇使得可以選擇帶有PCR片段的白色集落。使用ALF DNA測(cè)序儀(Pharmacia Biotech)來測(cè)定插入片段的序列，使用純化的質(zhì)粒制劑(Nucleospin質(zhì)粒，Macherey-Nagel)。
木聚糖酶基因的序列
TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis木聚糖酶基因的序列顯示于圖3-10a和16a中(SEQ IDNO3，5，7，9，11，13，15，34)及其相應(yīng)的氨基酸序列顯示于圖3-10b和16b中(SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，35)。SEQ IDNO20，22，24，26，28，30，32和36給出了編碼成熟蛋白部分的序列。
這些序列相互之間高度相似且還與Pseudoalteromonashaloplanktis TAH 3a木聚糖酶基因的公開序列(EBML登錄號(hào)AJ427921)同源。本發(fā)明中描述的所有酶都屬于糖苷水解酶家族8。
使用缺省參數(shù)的Clustalw多序列比對(duì)(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖10(核苷酸序列)和圖11(氨基酸序列)中。
所有新的序列與已知的公開序列相差至少20個(gè)核苷酸或至少4個(gè)氨基酸(參見以下)。
所有上述標(biāo)識(shí)的氨基酸序列中，成熟蛋白(酶)起始于第22位氨基酸。
通過使用缺省參數(shù)的Blast檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)鑒定的最密切相關(guān)的氨基酸序列是
1/已經(jīng)表征的來自Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a的家族8木聚糖酶(92至98％序列同一性)。
2/來自哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)的具有C-末端OMP(外膜蛋白)結(jié)構(gòu)域的未表征的1748個(gè)氨基酸長(zhǎng)的蛋白質(zhì)(在412個(gè)氨基酸跨度上33至34％的同一性)。
3/來自Bacillus halodurans的木聚糖酶Y(31至32％的同一性)
4/來自芽胞桿菌屬菌種KKI的木聚糖酶Y(28至30％的同一性)。
已經(jīng)鑒定了公開的Pseudoalteromonas haloplanktisTAH 3a木聚糖酶序列和本發(fā)明的木聚糖酶序列之間的氨基酸差異并列于以下的表3中。還顯示了它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)中的各自位置，基于公開的結(jié)構(gòu)(VanPetegem F.等，2003，J.Biol.Chem.Vol.278，p.7531)。
表3
實(shí)施例5木聚糖酶的純化
分離的木聚糖酶的超表達(dá)
用NdeI和XhoI從PCRScript Amp SK(+)(參見以上的實(shí)施例4)切除木聚糖酶基因片段并連接至pET 22b(+)表達(dá)載體(Novagen)。將所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Stratagene)中。
將質(zhì)粒pXYP4至pXYP10轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109(LMBP 4860至LMBP4866)中。
將含有菌株TAH 4a木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP4(參見LMBP4860)。
將含有菌株TAH 7a木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP5(參見LMBP4861)。
將含有菌株TAH 2a木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP6(參見LMBP4862)。
將含有菌株Sp.10.1木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP7(參見LMBP4863)。
將含有菌株Sp.10.2木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP8(參見LMBP4864)。
將含有菌株Sp.11.2木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP9(參見LMBP4865)。
將含有菌株Sp.23.2bis木聚糖酶基因的質(zhì)粒標(biāo)記為pXYP10(參見LMBP 4866)。
木聚糖酶的純化
如所述的(Collins等，2002，參見上文)從重組大腸桿菌BL21(DE3)菌株的液體培養(yǎng)物純化TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp10.1，Sp10.2，Sp11.2，Sp23.2和Sp.23.2bis菌株的木聚糖酶。將表達(dá)實(shí)施例2的克隆基因之一的5ml大腸桿菌重組菌株的過夜預(yù)培養(yǎng)物(18℃)在10,000×g離心1分鐘并將沉淀重懸浮于3升搖瓶的300ml含有200μg/ml氨芐青霉素的Terrific培養(yǎng)液(12g/l Bacto胰蛋白胨(Difco)，24g/l酵母提取物(Difco)，4ml/l甘油，12.54g/lK2HPO4，2.31g/lKH2PO4)中。將培養(yǎng)物在18℃和250rpm培養(yǎng)直至550nm處的吸光度達(dá)到3至4，隨之用1mM異丙基-1-硫代-β-吡喃半乳糖苷來誘導(dǎo)酶的表達(dá)。
在18℃進(jìn)一步培養(yǎng)20小時(shí)后，通過在4℃18,000×g離心30分鐘來收集細(xì)胞，重懸浮于緩沖液A(50mM BICINE，pH8.5)中，在預(yù)冷的細(xì)胞破碎器(Constant Systems Ltd.)中在28K磅/平方英寸破碎，在40.000×g離心，并對(duì)緩沖液A進(jìn)行透析。將透析液裝載于在相同緩沖液中平衡的Q-Sepharose快速流動(dòng)(Amersham Biosciences)柱(50×2.5cm)上，收集流出物。在TAH 2a(SEQ ID NO4)，TAH 4a(SEQ ID NO6)，TAH 7a(SEQ ID NO8)，Sp.11.2(SEQ ID NO14)，Sp.23.2(SEQ ID NO16)和Sp.23.2bis(SEQ ID NO35)木聚糖酶的情況中，將該溶液立即裝載于S-Sepharose快速流動(dòng)(AmershamBiosciences)柱(50×2.5cm)上，也在上述緩沖液中平衡，而在Sp10.1(SEQ ID NO10)和Sp10.2(SEQ ID NO12)木聚糖酶的情況中，在裝載于在pH7.6的50mM BICINE中平衡的S-Sepharose快速流動(dòng)(Amersham Biosciences)柱(50×2.5cm)上之前，首先將該溶液的pH調(diào)節(jié)至pH7.6。用線性NaCl梯度(350ml中0-100mM)來洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，并合并活性級(jí)分，通過超濾(Millipore PBGC 10,000NMWL)來濃縮。將該溶液與菌株Sp.10.1和Sp.10.2木聚糖酶一起用于焙烤試驗(yàn)中，而將TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis菌株的木聚糖酶首先在20mM MOPS，100mM NaCl，pH7.5中平衡的Sephacryl S-100(Amersham Biosciences)柱(90×2.5cm)上進(jìn)一步純化，1ml/分鐘。
通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了酶的純度。其結(jié)果呈現(xiàn)于圖12中。
實(shí)施例6重組木聚糖酶在小型焙烤測(cè)試中的效果
進(jìn)行焙烤試驗(yàn)來證明本發(fā)明的重組木聚糖酶在焙烤中的相似正面效果。通過與可購(gòu)得的木聚糖酶相比較和與不含有這些酶中任何一種的參照相比較的面包體積的增加來評(píng)價(jià)正面效果。
在包括用100g面粉制備面團(tuán)的小型焙烤測(cè)試中來評(píng)價(jià)實(shí)施例5的純化的或部分純化的木聚糖酶。
所述的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且使用其他方案或來自其他供應(yīng)商的設(shè)備可以獲得相同結(jié)果是顯而易見的。
所用的配料列于以下的表4中
表4
將配料在National混合機(jī)中混合4.5分鐘。稱取150g的面團(tuán)塊，并在塑料盒中25℃靜置20分鐘。將面團(tuán)再次揉捏并再靜置20分鐘。最后的醒發(fā)時(shí)間為36℃50分鐘。然后將面團(tuán)塊在225℃焙烤20分鐘。使用常用的油菜籽頂替方法來測(cè)量面包的體積。
使用重組酶的焙烤試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于以下的表5中
表5
(*)將一單位的Belase B210木聚糖酶定義為在30℃和pH4.5從樺木木聚糖釋放1μmol還原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(Nelson-Somogyi方法)。將一單位的其他木聚糖酶定義為在25℃和pH6.5從樺木木聚糖釋放1μmol還原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(二硝基水楊酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
(1)三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值
(2)兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值
上述結(jié)果表明通過重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的木聚糖酶與野生型酶相比較對(duì)面包體積具有相似的正面效果。
實(shí)施例7焙烤中所用家族8木聚糖酶的體積響應(yīng)測(cè)試
進(jìn)行焙烤試驗(yàn)來證明本發(fā)明的重組木聚糖酶在焙烤中的相似正面效果并測(cè)定加入的木聚糖酶的量的效果。通過面包體積的增加來評(píng)價(jià)正面效果。
以下的表6中呈現(xiàn)了使用重組酶的焙烤試驗(yàn)的結(jié)果。按照實(shí)施例3中所述的方案
表6
隨加入的木聚糖酶單位而變化的面包體積
(*)將一單位的其他木聚糖酶定義為在25℃和pH6.5從樺木木聚糖釋放1μmol還原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(二硝基水楊酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
圖15中以圖解表示了結(jié)果。
實(shí)施例8焙烤中所用木聚糖酶的絕對(duì)用量
上述實(shí)施例中所述的在比利時(shí)硬面包卷試驗(yàn)中獲得限定的體積效果所需的木聚糖酶的相對(duì)用量，已經(jīng)與常用的商業(yè)細(xì)菌木聚糖酶(Bel’ase B210-Beldem-比利時(shí))進(jìn)行了比較。
通過在280nm處的吸光度測(cè)量來測(cè)定純化木聚糖酶的蛋白質(zhì)濃度，使用以下的消光系數(shù)92，860(在TAH 2a的情況中)，94，140(在TAH 4a和Sp.11.2的情況中)，89，730(在TAH 4a和Sp.23.2的情況中)，95，420(在Sp.10.1的情況中)和94，140(在Sp.10.2的情況中)M-1cm-1和/或按照制造商所述的來使用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce)。
根據(jù)實(shí)施例6中所述的方法進(jìn)行了幾個(gè)焙烤試驗(yàn)，使用不同量的實(shí)施例5中所述的純化酶。
圖13顯示了作為不同酶的相對(duì)用量函數(shù)的面包體積的增加。對(duì)于Bel’ase B210木聚糖酶(約本發(fā)明酶的一半大小)，結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。對(duì)于TAH 2a木聚糖酶，結(jié)果是兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。
圖13清楚地顯示了與商業(yè)酶相比較，本發(fā)明的木聚糖酶的“inpano”比活性(即，以 ml表示的面包體積/以mg表示的蛋白質(zhì)用量)明顯更高。
申請(qǐng)人已經(jīng)在2004年3月4日將根據(jù)本發(fā)明的微生物大腸桿菌JM109(pXYP4)，大腸桿菌JM109(pXYP5)，大腸桿菌JM109(pXYP6)，大腸桿菌JM109(pXYP7)，大腸桿菌JM109(pXYP8)，大腸桿菌JM109(pXYP9)，大腸桿菌JM109(pXYP10)培養(yǎng)物保藏于BCCM/LMBP培養(yǎng)物保藏中心(Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Ghent(根特大學(xué))，‘Fiers-Schell-Van Montagu’building Technologiepark 927 B-9052 Gent-Zwijnaarde Belgium(根特，比利時(shí)))。這些保藏物接到的保藏號(hào)各自為L(zhǎng)MBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP4866。
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-01表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-01
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-01表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述 是
否
-建議的分類學(xué)命名
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-01表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-01
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-01表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-02表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-02
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-02表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
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BCCMTM/LMBP/BP/9/04-02表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-02
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
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IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
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Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
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比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
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國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-03
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I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
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II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述 是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
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IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
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Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-03表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-03
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-03表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-04表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-04
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-04表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-04表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-04
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-04表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述 是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述 是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07表格的第1頁(yè)。原始保藏證明
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則7.1
出具的原始保藏證明
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07
至保藏人的名字 PURATOS NV
地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
I.微生物的標(biāo)識(shí)
I.1.保藏人給予的標(biāo)識(shí)參考號(hào)
I.2.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07表格的第2頁(yè)。原始保藏證明
II.科學(xué)描述和/或建議的分類學(xué)命名
以上I中標(biāo)識(shí)的微生物伴有
(用叉標(biāo)記適用的格子)
-科學(xué)描述是
否
-建議的分類學(xué)命名 是
否
III.收到和受理
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以上I中標(biāo)識(shí)的微生物，其接收于(原始保藏日期)2004年3月4日
IV.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07表格的第1頁(yè)。存活報(bào)告
用于專利程序目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約在下一頁(yè)的底部標(biāo)示的由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)BCCMTM/LMBP根據(jù)細(xì)則
10.2出具的存活報(bào)告
國(guó)際表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07
至出具存活報(bào)告的當(dāng)事人
姓名Dr Thierry DAUVRIN
地址Rue Bourrie，12
B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字PURATOS NV
I.2.地址Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利時(shí))
II.微生物的標(biāo)識(shí)
II.1.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)
II.2.原始保藏日期(或已進(jìn)行了新的保藏或轉(zhuǎn)移時(shí)，最近的相關(guān)日期)2004年3月4日
III.存活報(bào)告
以上II標(biāo)識(shí)的微生物的存活測(cè)試于2004年3月10日
(給予的日期。在細(xì)則10.2(a)和(iii)中所提及的情況下，指的是最近的存活測(cè)試)。
在當(dāng)日，所述的微生物是(用叉標(biāo)記適用的格子)
存活
不再存活
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07表格的第2頁(yè)。存活報(bào)告
IV.已經(jīng)進(jìn)行的存活測(cè)試的條件
(如果有需要的信息和如果測(cè)試結(jié)果是陰性的請(qǐng)?zhí)顚?
V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大學(xué))
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利時(shí))
具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人員或授權(quán)官員的簽名
Martine Vanhoucke
BEEM/LMBP管理人
日期2004年3月10日
權(quán)利要求
1.屬于糖苷水解酶家族8的具有木聚糖分解活性的分離并純化的酶，其特征在于所述酶是嗜冷酶，附帶條件是所述的木聚糖分解酶不是由SEQ ID NO1編碼的，并包括對(duì)應(yīng)于以下的氨基酸序列
-SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa1至aa 426；
-SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa 22至aa 426；
或其變體
-包括少于4個(gè)氨基酸不同于以上任一序列的氨基酸序列，或
-包括具有與上述任一序列高于50％，70％，更優(yōu)選高于80％，85％，90％，最優(yōu)選高于95％，97％，98％或再更優(yōu)選高于99％序列同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，其特征在于當(dāng)以1500至6000木聚糖酶單位/100kg面粉的濃度加入面團(tuán)時(shí)，它使焙烤產(chǎn)品的體積增加至少10％和/或使所述焙烤產(chǎn)品的切割寬度增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的具有木聚糖分解活性的分離并純化的酶，由對(duì)應(yīng)于以下的氨基酸序列組成
-SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa 1至aa 426；
-SEQ ID NO4，6，8，10，，12，14，16或35任一的aa 22至aa 426；
或其變體
-由少于4個(gè)氨基酸不同于以上任一序列的氨基酸序列組成，或
-由具有與上述任一序列高于50％，70％，更優(yōu)選高于80％，85％，90％，最優(yōu)選高于95％，97％，98％或再更優(yōu)選高于99％序列同一性的氨基酸序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，其從保藏號(hào)為L(zhǎng)MBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865或LMBP 4866的細(xì)菌菌株可獲得。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)酶的分離并純化的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的核苷酸序列，包括SEQ ID NO19。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的核苷酸序列，包括對(duì)應(yīng)于以下的核苷酸序列
-SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 1至nt 1281；
-SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 64至nt 1281；
-或以上的任一變體，具有少于20個(gè)核苷酸不同于以上任一序列的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的核苷酸序列，由對(duì)應(yīng)于以下的核苷酸序列組成
-SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 1至nt 1281；
-SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 64至nt 1281；或
或以上的任一變體，具有少于20個(gè)核苷酸不同于以上任一序列的核苷酸序列。
9.重組核苷酸序列，包括可操作地連接一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)相鄰調(diào)控序列。
10.包括權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)的核苷酸序列的載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的載體，是摻入具有選自LMBP 4860，LMBP4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866保藏號(hào)的大腸桿菌中的質(zhì)粒。
12.用根據(jù)權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)的核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求11或12的載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的重組宿主細(xì)胞，其特征在于它選自細(xì)菌或真菌，包括酵母。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的酶，其特征在于它是由權(quán)利要求12或13的重組宿主細(xì)胞胞外表達(dá)的。
15.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的酶，其特征在于它是由根據(jù)權(quán)利要求12或13的重組宿主細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)的。
16.固定要素的固體支持物，該要素選自根據(jù)權(quán)利要求12或13的細(xì)胞，根據(jù)權(quán)利要求12或13的細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的具有木聚糖分解活性酶的細(xì)胞提取物，和/或至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的具有木聚糖分解活性的分離并純化的酶。
17.面包改良組合物，包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的面包改良組合物，進(jìn)一步包括另一種面包改良劑，該改良劑選自其它酶，乳化劑，氧化劑，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，鹽和蛋白質(zhì)(谷蛋白，纖維素結(jié)合部位)或其混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的面包改良組合物，其中所述其它酶選自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麥芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化還原酶，葡聚糖酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，異構(gòu)酶，脂酶，磷脂酶，果膠酶或其混合物。
20.權(quán)利要求19的面包改良組合物，其中所述α-淀粉酶是從米曲霉獲得的α-淀粉酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求12或13的重組宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的具有木聚糖分解活性的酶用于降解植物細(xì)胞壁成分的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，用于分解植物和水果，優(yōu)選水果的方法中，豆汁，啤酒，紙張，淀粉，谷蛋白或植物油的制備過程中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，用于水果，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造或釀造，咖啡加工，紙張或紡織品加工，生物轉(zhuǎn)化過程，分解廢物方法，優(yōu)選用于分解農(nóng)業(yè)廢物或造紙廠的廢物，淀粉-谷蛋白分離方法，飼料制備。
24.根據(jù)權(quán)利要求12或13的重組宿主細(xì)胞，根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的具有木聚糖分解活性的酶或根據(jù)權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)的面包改良組合物在焙烤，磨粉，糕點(diǎn)和糖果加工中的用途，尤其是用于增加焙烤產(chǎn)品的體積和/或用于增加所述焙烤產(chǎn)品表面的切割寬度。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24任一項(xiàng)的用途，其中所述的根據(jù)權(quán)利要求12或13的宿主細(xì)胞，或所述的根據(jù)權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)的酶可以結(jié)合另一種酶來使用。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述的其它酶選自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麥芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-還原酶，葡聚糖酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，異構(gòu)酶，脂酶，磷脂酶，果膠酶或其混合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的用途，其中將所述的宿主細(xì)胞或酶摻入根據(jù)權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)的面包改良組合物中。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中在面團(tuán)混合過程中加入面包改良組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求21至28任一項(xiàng)的用途，其中如權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)所限定的所述具有木聚糖分解活性的酶以細(xì)胞提取物，無細(xì)胞提取物存在或以純化的蛋白質(zhì)來使用。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至30任一項(xiàng)的用途，其中如權(quán)利要求1至4，14或15任一項(xiàng)所限定的所述具有木聚糖分解活性的酶以干粉或顆粒形式，尤其是無粉塵顆粒，或以液體形式和其他配料混合，尤其是和一種或多種穩(wěn)定劑混合，如多元醇，糖，有機(jī)酸或糖醇。
31.一種組合物，包括至少一種由SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一所標(biāo)識(shí)的酶，可能結(jié)合由SEQ ID NO2所標(biāo)識(shí)的酶或其成熟部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于糖苷水解酶家族8的具有木聚糖分解活性的新酶。本發(fā)明特別涉及從產(chǎn)生木聚糖酶的細(xì)菌嗜冷菌株分離的具有由SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33，37任一所標(biāo)識(shí)的氨基酸序列或其變體的酶。本發(fā)明的另一方面涉及相應(yīng)的基因。發(fā)現(xiàn)這些酶的許多應(yīng)用并有利地用于例如飼料和食品應(yīng)用中如焙烤。與常規(guī)木聚糖酶相比較，只需要少量的酶就能獲得所需的效果，如增加面包體積和/或增加焙烤產(chǎn)品的表面切割寬度。
文檔編號(hào)A21D2/26GK1938421SQ20058001015
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者J·若里, T·多夫林, A·霍伊奧克斯, T·科林斯, G·費(fèi)勒 申請(qǐng)人:普瑞圖斯股份有限公司