專利名稱：含他汀的食用油的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含他汀的食用油，其含有至少90％甘油二酯和/或甘油三酯，具有小于25wt％的飽和脂肪酸(SAFA)含量。本發(fā)明還涉及一種制備所述油的方法。此外，本發(fā)明涉及這種油的用途。
背景技術(shù)：
心血管疾病是發(fā)病和死亡的首要原因，特別是在美國和西歐國家，并在發(fā)展中國家開始出現(xiàn)。涉及心血管疾病發(fā)展的幾個(gè)因素包括易生病的遺傳體質(zhì)、性別、諸如吸煙和飲食等生活方式因素、年齡、高血壓、以及高血脂，包括高膽固醇血癥。這些因素中的幾個(gè)，特別是高血脂和高膽固醇血癥促進(jìn)了動(dòng)脈硬化癥的形成，并且是血管和心臟疾病的首要起因。
低密度脂蛋白膽固醇(下文稱為“LDL膽固醇”)的升高與冠心病風(fēng)險(xiǎn)的增大直接相關(guān)。
他汀是已知能降低人血液中LDL膽固醇水平的化合物。他汀抑制了羥甲基戊二酰基輔酶A(HMG-CoA)還原酶，這是膽固醇生物合成的決定速率步驟。
科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了他汀的有益功能，尤其是降低動(dòng)物和人體中的LDL血膽固醇以及甘油三酯水平的活性(Li等，Nutrition Research18，71-81(1998)；Heber等，Am.J.Clin.Nutr.69，231-236(1999))。
人所吃食物中他汀的存在關(guān)系到降低LDL膽固醇水平和降低冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。
對(duì)含他汀食物的制備而言，有利的是具有高他汀含量、并能廣泛應(yīng)用于食品中的他汀源。
WO02/64809公開了一種通過發(fā)酵制備他汀以及制備含有一種或多種他汀的食品的方法。其公開了用有機(jī)溶劑(乙醇或乙腈)來從發(fā)酵大豆中提取他汀，以及所述提取物在制備人造乳瑪琳和涂抹物中的用途。該方法的缺陷在于他汀的產(chǎn)率極其低下(0.0545g他汀/kg(乙醇提取物)以及0.0978g他汀/kg(乙腈提取物))。此外，當(dāng)這些提取物被用于制備食品時(shí)，提取流體必須被除去，因而其包括一個(gè)額外的加工步驟。另外，即使在強(qiáng)烈蒸發(fā)以及干燥后，依然可能有一些有機(jī)提取流體殘留在提取物中，這在所述提取物用于食品的情況下是不合適的。而且，如果考慮環(huán)境問題，則有機(jī)溶劑的使用應(yīng)保持最低。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種含有他汀的食用油。此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有高不飽和脂肪酸含量以及低飽和脂肪酸含量的油。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將該含有他汀的食用油用于制備食品。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包括用盡可能少步驟來制備含他汀的食用油的簡(jiǎn)單方法。
我們現(xiàn)在驚喜地發(fā)現(xiàn)，用生產(chǎn)他汀的微生物對(duì)含油底物進(jìn)行發(fā)酵，再對(duì)底物進(jìn)行提取，這能產(chǎn)生含他汀的食用油。
發(fā)明詳述純化他汀的制備是醫(yī)藥工業(yè)中所知曉的。用于藥品制備中的他汀的制備和純化包括許多加工步驟，其中使用了并非食品工業(yè)中所普遍應(yīng)用的成分。相對(duì)于更少加工步驟的方法來說，這些許多加工步驟是耗費(fèi)巨大的。出于這些原因，用于藥物用途的他汀并不應(yīng)用于食品工業(yè)。例如應(yīng)用于藥物工業(yè)的合成或半合成他汀，在食品領(lǐng)域中也不是合乎需要。
在WO02/063976中公開了一種含有大豆蛋白和他汀功能性食品，其可降低人的低密度脂蛋白膽固醇水平。該食品可通過用一種或多種絲狀真菌對(duì)大豆進(jìn)行發(fā)酵而制得。這些食品含有大豆蛋白和他汀，因而將含他汀的食品限制于同時(shí)含有大豆蛋白的食品。另外，產(chǎn)品中他汀的量使得必須使用大量的這些產(chǎn)品才能獲得低密度脂蛋白膽固醇降低作用。對(duì)于食品工業(yè)中更普遍的應(yīng)用而言，含有高濃度他汀和盡可能少其他物質(zhì)的產(chǎn)品是具有優(yōu)勢(shì)的。
下面的解釋將被使用他汀被界定為具有圖1中所述結(jié)構(gòu)式的物質(zhì)。在該結(jié)構(gòu)式中，R1和R2可以是任何基團(tuán)。優(yōu)選的他汀在圖1中給出。
除另有說明外，所述的量以相對(duì)于食品總重量的wt.％、每百萬分之重量份(ppm)、mg/kg或mg/g表示。
除另有說明外。本文中給出的他汀的量是各種他汀的量的總和，比如通過色譜法測(cè)定。
本發(fā)明的一個(gè)目的涉及一種含他汀的食用油的制備方法。含他汀的油可通過用超臨界流體對(duì)已經(jīng)用產(chǎn)他汀真菌進(jìn)行發(fā)酵后的底物進(jìn)行提取而獲得。
超臨界流體通過將氣體在過高溫度下進(jìn)行壓縮形成液體而形成。在一定溫度之上，所謂的臨界溫度，氣體分子的熱動(dòng)能總是高于分子間的吸引能。在這個(gè)溫度之上，沒有壓力能夠高到能將氣體壓縮成液體。一定的最小壓力，所謂的臨界壓力，是形成超臨界流體所必需的。在這個(gè)臨界壓力之下，該成分表現(xiàn)如氣體。對(duì)于純的成分而言，在高于其臨界溫度和壓力的條件下氣體和液體之間不再有區(qū)別。這反映在兼具低的氣體狀的粘度和高的液體狀的密度。
許多氣體可以用于超臨界流體提取中，例如惰性氣體，其它氣體如氮?dú)狻錃夂脱鯕?，烯烴如乙烯和丙烯，烷烴如甲烷、乙烷、丙烷和丁烷，炔烴和鹵代烷如四氟甲烷。非常適用的氣體是被FDA認(rèn)可為安全的人類食品成分，如二氧化碳、氮?dú)?、氦氣、丙烷、正丁烷、異丁烷和氧化?N2O)。對(duì)于食品加工應(yīng)用，二氧化碳特別適用于超臨界提取。二氧化碳具有相對(duì)低的超臨界溫度和壓力，并且其便宜、無毒而易于除去。
任選將無機(jī)和/或有機(jī)化合物加入到超臨界流體中。在該方法中采用的這些改性劑或共溶劑應(yīng)與所選擇的超臨界流體相容，并且能至少部分溶解所提取的化合物。乙醇、丙酮、水、稀酸或堿以及乙醇/水(50/50v/v)混合物都是合適的共溶劑。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在提取過程中并不使用共溶劑。優(yōu)選的，超臨界流體不含共溶劑。該超臨界流體是食品級(jí)的，其純度優(yōu)選為99％以上。
用超臨界流體對(duì)底物進(jìn)行的提取在溫度20-95℃、優(yōu)選在30-60℃下進(jìn)行。壓力應(yīng)足以保持超臨界流體，并可從75巴(bar)上升到約550巴，優(yōu)選在150-400巴之間。
反應(yīng)參數(shù)的選擇取決于所用的超臨界流體和改性劑。技術(shù)人員能夠基于底物的已知屬性、待提取的化合物以及氣體的具體情況，包括超臨界溫度和壓力，來確定使用何種條件。
底物可根據(jù)是否用產(chǎn)他汀菌進(jìn)行發(fā)酵而改變。
現(xiàn)已知曉多種絲狀真菌可產(chǎn)生他汀，包括紅霉菌、曲霉菌、青霉菌、側(cè)茸菌(Pleurotus)、腐霉菌、菌寄生菌(Hypomyces)、Paelicilomyces、正青霉(Eupenicillium)和矛束孢菌(Doratomyces)。
作為食品，用紅曲霉菌發(fā)酵的米(紅曲)是已知的，并在中國應(yīng)用了幾百年。紅曲在制酒中曾被并且現(xiàn)在依然被用作食品著色劑，并在中藥中用作藥物。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)市售紅曲大多數(shù)不含他汀或僅含有極其少量的他汀。食品藥品管理局已經(jīng)得出結(jié)論，市場(chǎng)上的紅酵母米不含有顯著量的洛伐他汀(lovastatin)(FDA，No.97-0441備案摘要，最終決定)。
WO99/23996描述了一種用于治療高血清膽固醇和/或甘油三酯的組合物，其含有紅曲產(chǎn)品，該紅曲產(chǎn)品包含至少0.05重量％的洛伐他汀。
Pharmanex公司以Cholestin的名稱來銷售作為飲食增補(bǔ)劑的紅曲粉膠囊，還出售含有紅曲酵母的Cholestin條(Monascuspurperuswent)紅曲具有強(qiáng)烈的紅色。當(dāng)紅曲被用作著色劑時(shí)，其強(qiáng)烈的紅色是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，但當(dāng)被用于食品中時(shí)又有劣勢(shì)。由于紅曲產(chǎn)品的強(qiáng)烈紅色，由紅曲制備的食品被染成黃色、橙色或紅色，而這取決于添加到食品中的紅曲產(chǎn)品量。加入食品中的紅曲量越高，這食品紅色越強(qiáng)烈。在已知的食品中，為保持足夠的他汀必須加入相對(duì)大量的紅曲。這導(dǎo)致了無法避免的紅色食品。
在一些食品中，紅曲著色是不合適的。尤其在西方世界中，顧客不愿使用顏色與其通常的顏色不同的產(chǎn)品。舉例而言，涂抹物(spread)，包括人造黃油、黃油、低脂涂抹物或色拉油，當(dāng)這類產(chǎn)品的顏色是橙色或紅色時(shí)，都被認(rèn)為是難以接受的。然而同時(shí)，這類產(chǎn)品已被我們發(fā)現(xiàn)是能獲得降低血液LDL膽固醇作用的足量他汀的極佳載體。優(yōu)選地，真菌選擇紅曲霉，更優(yōu)選來自紅色紅曲霉。該真菌最優(yōu)選是Monascus ruber F125Ml-4，其在大豆材料上生長(zhǎng)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生紅色著色。
發(fā)酵可以由技術(shù)人員在WO02/064809和WO02/063976中描述方法的基礎(chǔ)上決定的方式來實(shí)施。
發(fā)酵溫度也許是重要的。該溫度優(yōu)選為10-37℃，更優(yōu)選為20-30℃。
在發(fā)酵期間優(yōu)選對(duì)介質(zhì)進(jìn)行充氣，比如通過攪拌、搖晃等方式。充氣可以通過將空氣吹入發(fā)酵介質(zhì)來實(shí)施。在使用固態(tài)發(fā)酵的情況下空氣優(yōu)選是全部或部分用水蒸氣進(jìn)行飽和的。這避免了發(fā)酵介質(zhì)的干燥。
他汀的水平取決于發(fā)酵時(shí)間。因而發(fā)酵時(shí)間也取決于所需他汀的量。優(yōu)選的發(fā)酵時(shí)間是1-50天，更優(yōu)選是15-40天，最優(yōu)選是20-30天(參見WO02/064809和WO02/063976)此外，底物優(yōu)選含有與由真菌產(chǎn)生的他汀一起提取出的油。可使用的合適底物包括大豆、諸如榛子、核桃等堅(jiān)果，以及花生、橄欖、葵花籽、油菜籽、大米、腰果、綠豆、羽扇豆籽、玉米或燕麥。
底物優(yōu)選包含具有高多不飽和脂肪酸(PUFA)含量以及低飽和脂肪酸(SAFA)含量的油。
尤其合適的底物是大豆。大豆油幾乎無味，由于其不會(huì)干擾食品的口味因而這是個(gè)優(yōu)勢(shì)。大豆油是食品生產(chǎn)中所普遍使用的。在食品工業(yè)中大豆油幾乎適合每一種脂肪或油的應(yīng)用。與其他成分，包括其他脂肪或油也能共用，這使得其非常適合用于基于脂肪的食品，比如涂抹物、色拉調(diào)味料、沙司和焙烤產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法提供了一種含有他汀的食用油。食用油被定義為一種適合人食用的油或脂肪。本申請(qǐng)中的術(shù)語油既包括固體脂肪也包括液體油。該食用油含有大于90wt％的甘油二酯和/甘油三酯。這種油準(zhǔn)備用于食品的制備，在液體油的情況中，也可用作餐用油。根據(jù)本發(fā)明的油可以是任何食用油，這取決于所使用的底物，例如大豆油、橄欖油、葵花油或菜籽油。
該食用油優(yōu)選含有至少1mg/g他汀，更優(yōu)選至少4mg/g他汀。
除油和他汀之外，其他有益于健康的化合物，比如多酚、多不飽和脂肪酸、植物甾醇、肽、生育酚、皂角苷、膳食纖維和維生素可以與油和他汀一起從發(fā)酵底物中提取出。
此處的多酚指植物來源的多酚。這些包括類黃酮，其包括異黃酮。這些多酚包括異黃酮、茋、木酚素、配糖(coumestans)、二羥基苯甲酸內(nèi)酯。異黃酮的例子是染料木黃酮、大豆黃酮、牛尿酚、黃豆黃素、鷹嘴豆芽素A、香豆雌酚、maitaresinol、芒柄花黃素、O-desmethylengolesin、腸內(nèi)酯(enterolactone)、腸二醇(enterodiol)。本發(fā)明優(yōu)選的異黃酮是存在于大豆中的染料木黃酮、大豆黃酮和黃豆黃素。
此處的皂角苷衍生為β-D-吡喃葡糖苷酸(β-D-glucopyranosiduronic acid)衍生物。皂角苷的例子是大豆皂甾醇A、B、C、D和E以及大豆皂角苷I、II和III，這在Lebensmittel Lexikon，B.Behr′s Verlag GmbH&Co.Hamburg，Bd.2，L-Z-3，1993，第550-552頁有所描述。
多不飽和脂肪酸酯被定義為在脂肪鏈中具有多于1個(gè)不飽和基團(tuán)的脂肪酸酯。多不飽和脂肪酸酯的例子是亞油酸酯、亞麻酸酯、花生四烯酸酯。
此處的膳食纖維是多種植物物質(zhì)的集合術(shù)語，其能抵抗人胃腸酶的消化。根據(jù)它們的溶解度，膳食纖維可被分類成不溶性的(纖維素、一些半纖維素、木質(zhì)素)和可溶性的(其他半纖維素、樹膠、粘質(zhì))。大豆colyledon纖維包括可溶性和不溶性的膳食纖維。
此處的植物甾醇被定義為由植物產(chǎn)生的甾醇化合物，其在結(jié)構(gòu)上非常類似于膽固醇，除了它們?cè)阽薮紓?cè)鏈上的C24位上具有一些取代基。植物甾醇包括4-去甲基甾醇、4-單甲基甾醇、4，4’-二甲基甾醇及其混合物。這種植物甾醇的例子是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇。此處的術(shù)語植物甾醇也包括植物甾醇的飽和等價(jià)物phytostanol。
生育酚是維生素E家族的成員。術(shù)語維生素E包括8種自然產(chǎn)生的、生物活性迥然不同的異構(gòu)體。4種是生育酚形式(a、b、g、d)，剩下4種是生育三烯酚形式(a、b、g、d)。
維生素E的作用是獨(dú)特的和不可缺少的。它的結(jié)構(gòu)決定了在戰(zhàn)略上的地位，并保護(hù)細(xì)胞和其他膜。它也保護(hù)了LDL和其他脂質(zhì)免于氧化。
γ-生育酚是抵抗氮自由基的有效形式。這些自由基是關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化(MS)和大腦疾病(比如(早老性癡呆)的主要原因。γ-生育酚的代謝產(chǎn)物有助于調(diào)節(jié)流過腎并最終進(jìn)入尿的流體和電解質(zhì)的量。因此，它在血壓控制、充血性心力衰竭和肝硬化中能起到主要作用。
國家科學(xué)院對(duì)維生素E的科學(xué)推薦日常攝入量(RDI)是15毫克。國際單位被用來衡量α-生育酚。該國際單位基于α-生育酚醋酸酯。1mg的α-生育酚醋酸酯等價(jià)于1.0IU的α-生育酚醋酸酯，1mg的α-生育酚＝1.49IU的α-生育酚此外，α-生育酚當(dāng)量(α-TE)也被用作維生素E的度量。α-生育酚當(dāng)量考慮了食品中所有的8種維生素E族成員。
α-生育酚當(dāng)量＝(mgα)+(0.4mgβ)+(0.01mgγ)+(0.1mgδ)生育酚的推薦日常攝入量(RDI)是10個(gè)α-生育酚當(dāng)量/天。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有他汀的食用油，該食用油含有至少90％的甘油二酯和/或甘油三酯、以及50-1000個(gè)α-生育酚當(dāng)量/千克，優(yōu)選含有100-750個(gè)α-生育酚當(dāng)量，更優(yōu)選為250-750個(gè)α-生育酚當(dāng)量。
合適量的總生育酚是500-10000mg/kg?？偵邮撬写嬖诘纳拥目偤汀?yōu)選的量是750-5000mg/kg，更優(yōu)選是1000-2500mg/kg。
本發(fā)明的食用油合適地具有小于25wt％的飽和脂肪酸(SAFA)含量，優(yōu)選小于20wt％，更優(yōu)選小于15wt％。此外，本發(fā)明的食用油具有至少75wt％的不飽和脂肪酸(UFA)含量，優(yōu)選至少80wt％，更優(yōu)選至少85wt％。對(duì)于本發(fā)明的食用油而言，具有高于5wt％的多不飽和脂肪酸(PUFA)含量是合乎需要的，優(yōu)選高于15wt％，更優(yōu)選高于30wt％，最優(yōu)選高于50wt％。
優(yōu)選的，本發(fā)明的食用油具有小于10mg/kg的膽固醇。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將該食用油用于制備食品。根據(jù)本發(fā)明可制備若干種食品，例如，涂抹物、人造奶油、湯、意大利面食、面條、冰淇淋、沙司、調(diào)味品、蛋黃醬、小吃、谷類食物、飲料、面包、餅干、其他焙烤產(chǎn)品、糖果、條糕、巧克力、口香糖、乳制品、諸如減肥產(chǎn)品或膳食替代品等營養(yǎng)產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明尤其可制備意大利面食、豆奶或牛奶。
根據(jù)本發(fā)明的食品優(yōu)選含有他汀，所述他汀的量足以在根據(jù)消費(fèi)者的普通需要來食用該食品時(shí)獲得降低血LDL膽固醇的作用。
此處他汀的每天優(yōu)選攝入量是5-40mg/天，更優(yōu)選5-20mg/天，尤其優(yōu)選8-15mg/天。此外，他汀每天的攝入量?jī)?yōu)選為1-5mg/天，更優(yōu)選是1-2.5mg/天。
技術(shù)人員能調(diào)整食品中他汀的百分比以獲得上述作用。由于食品以不同份量被食用，因而該百分比取決于食品的類型。而且，食品的食用方式(每天食用和分幾天食用)取決于該食品。
本發(fā)明的食品優(yōu)選含有他汀和非糖基化的異黃酮。在大豆或源自大豆的大豆材料中，異黃酮基本上以糖基化的形式存在。通常約5wt％的異黃酮以非糖基化的形式存在。最重要的糖基化異黃酮是染料木苷、黃豆苷和黃豆素黃酮(glycetin)。非糖基化的形式分別是染料木黃酮、黃豆黃酮和黃豆黃素。染料木黃酮、黃豆黃酮和黃豆黃素被報(bào)道具有突出的健康作用，包括雌激素和抗氧化功能。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明的發(fā)酵，糖基化的異黃酮轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的非糖基化的異黃酮，后者是更有益的。例如，與未發(fā)酵大豆相比，發(fā)酵大豆中染料木黃酮和黃豆黃酮的量增加了。令人驚奇的是，這種有利的轉(zhuǎn)化與他汀的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生。
如果將顏色分類，它們可被分解成3種主要因素。一種是色調(diào)(色彩)，另一種是色值(亮度)，第三種是色度(如鮮艷明亮色澤或陰暗無光色澤的飽和度)為了使任何人都能準(zhǔn)確地告訴他人他們?cè)谟懻摰念伾?，一和普通的商業(yè)代碼得到了應(yīng)用。這種所使用的商業(yè)代碼是L*a*b*。當(dāng)一種顏色以這種系統(tǒng)進(jìn)行表示時(shí)，色值便是L*，而色調(diào)和色度分別用a*和b*表示。L*a*b*可通過Shimatzu的UV 1601分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。食品優(yōu)選具有小于20的色調(diào)a*值，優(yōu)選小于10，更優(yōu)選小于0。


圖1表示不同他汀的結(jié)構(gòu)圖示。
圖2表示用于超臨界二氧化碳提取的實(shí)驗(yàn)性裝置的圖示。
實(shí)施例總則超臨界提取關(guān)于天然固體底物的超臨界提取，使用了Thar設(shè)計(jì)的設(shè)備。該實(shí)驗(yàn)裝置在圖2中示意性地進(jìn)行了描述。
CO2泵能夠在恒定流速下將液體二氧化碳?jí)嚎s到直至600巴的壓力。在靜止混合器，將極性改性劑與液體二氧化碳混合。在改性劑存在的情況下所能應(yīng)用的最大壓力是約400巴。在預(yù)熱器中(未畫出)，二氧化碳(和改性劑)在進(jìn)入提取容器之前被加熱到超臨界狀態(tài)。
在用雙面加熱套進(jìn)行加熱的提取容器中，超臨界的二氧化碳被通過固體底物來進(jìn)行提取。
在提取容器的下游，超臨界二氧化碳通過自動(dòng)背壓調(diào)節(jié)器膨脹。該背壓調(diào)節(jié)器被連接到一個(gè)反饋控制單元，從而控制該系統(tǒng)中的壓力。在漩渦分離系統(tǒng)中使二氧化碳從所提取材料(液體/固體)中分離出。二氧化碳留在漩渦的頂部，而所提取的材料在留在漩渦中。從固體底物中提取出的液體則在該實(shí)驗(yàn)期間通過將漩渦底部的閥門打開而得以回收。
該二氧化碳在另一個(gè)背壓調(diào)節(jié)器中進(jìn)一步膨脹，該背壓調(diào)節(jié)器手動(dòng)操作。在二氧化碳在環(huán)境壓力下離開系統(tǒng)之前，在背壓調(diào)節(jié)器的氣體時(shí)鐘下游對(duì)已有多少氣體通過該系統(tǒng)進(jìn)行記錄。
該過程設(shè)備被設(shè)計(jì)成在下列條件下操作表1超臨界提取布置的過程操作條件

使用HPLC測(cè)定洛伐他汀通過將25ml的包含乙腈、水和磷酸(1∶1∶0.05，v/v/v)的提取混合物加入約5g的大豆中來制備樣本。在油樣本(40-100％油)和液體樣本(如豆奶)中的他汀通過以1∶1(v/v)的比例加入100％的乙腈來提取。
樣本在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，然后使用Ulta-Turra進(jìn)行均質(zhì)。在均質(zhì)后將樣本在滾瓶機(jī)上室溫培養(yǎng)過夜。在11000rpm下將樣本離心10分鐘，并收集上清液來進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)Morovjan等在J.chromatogr.A 763(1997)165-172頁中的方法，對(duì)樣本中的洛伐他汀量通過HPLC分離來進(jìn)行測(cè)定。
該系統(tǒng)包括Shimadzu SCL-10A系統(tǒng)控制器、CTO-10AS柱式加熱爐、LC-10AT真空泵系統(tǒng)、RID-10A折射率檢測(cè)器、SPD-M10A二極管陣列檢測(cè)器和SIL-10A自動(dòng)注射器。對(duì)于洛伐他汀的色譜分析，使用Waters NovaPak C18(150×3.9mm I.D.，4μm)在25℃下進(jìn)行操作。洗脫液是流速為1.5ml/min的乙腈-0.1％磷酸(50∶50，v/v)溶液。運(yùn)行15分鐘。從190nm-800nm使用二極管陣列檢測(cè)器完成檢測(cè)。測(cè)定屬于洛伐他汀的光譜中所有峰面積總和。與標(biāo)準(zhǔn)樣(Mevinolin，Sigma)進(jìn)行比較，從而完成洛伐他汀含量的計(jì)算(以mg/g所分析的產(chǎn)品來表示)實(shí)施例1-8發(fā)酵底物的制備接種體制備將Monascus rubber F125 M1-4放于VMA瓊脂盤中，并在30℃下培養(yǎng)3天。
用消毒過的解剖刀把VMA瓊脂切成小方塊以制備接種體。用消毒過的抹刀，將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到液體介質(zhì)中。使用麥芽水來進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將300ml介質(zhì)裝入500ml的已消毒燒瓶中。將燒瓶在Innova 400振蕩器中在25℃下培養(yǎng)2天。
菌株F125和F125 M1-4保藏在Centraal Bureau voorSchimmelculturen(CBS)，保藏號(hào)分別為No.CBS 109070-14.11.2000和No.CBS 109269-23.01.2001。
這些保藏物根據(jù)布達(dá)佩斯條約中關(guān)于用于專利程序的微生物保藏的國際認(rèn)可的規(guī)定制備的。
發(fā)酵方法將底物，諸如大豆、蕓豆、綠豆、羽扇豆種子、胡桃、玉米、燕麥和花生，浸泡在自來水(50℃)中達(dá)60分鐘。浸泡后用冷的自來水對(duì)底物進(jìn)行沖洗。之后在環(huán)境溫度下將底物風(fēng)干180分鐘。經(jīng)浸泡和干燥的底物被轉(zhuǎn)移到振蕩瓶中，每瓶約50g。通過高壓滅菌對(duì)振蕩瓶進(jìn)行殺菌(10分鐘、120℃)，接種1ml充分生長(zhǎng)的紅曲霉培養(yǎng)物，并在25℃下培養(yǎng)合適時(shí)間(2-6星期)。對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)生進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)達(dá)到足夠水平時(shí)，通過將燒瓶置于80℃的培養(yǎng)器過夜來對(duì)燒瓶進(jìn)行巴氏殺菌，之后獲得最終產(chǎn)物。表2給出了3個(gè)星期發(fā)酵后最終產(chǎn)物的他汀含量的觀察。
表23個(gè)星期發(fā)酵后最終產(chǎn)物中他汀的量

實(shí)施例9發(fā)酵大豆的超臨界提取在提取前將發(fā)酵大豆在用水冷卻的萬能軋機(jī)(M20型、IKA、德國)進(jìn)行研磨，直到獲得細(xì)粉。
提取所用的樣本量是100克經(jīng)研磨的發(fā)酵大豆。將發(fā)酵和研磨大豆放置于提取容器(500ml)中，用小的玻璃珠(2mm直徑)填滿剩余容積?？偟娜軇┝魉偈?0g·min-1。在加入改性劑的情況中，將18g·min-1的二氧化碳與2g·min-1改性劑(乙醇或者乙醇/水混合物)進(jìn)行混合。用配備給Thar提取設(shè)備的控制軟件來調(diào)節(jié)流速。每隔3分鐘，開啟漩渦分離器，并收集所提取的油。總的提取時(shí)間是2小時(shí)。該方法適合于工業(yè)規(guī)模的提取。
在使用乙醇作為改性劑的情況中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在真空下通過蒸發(fā)來除去乙醇，直到獲得恒重。當(dāng)使用乙醇/水50/50(v/v)混合物作為極性改性劑時(shí)，通過在裝有外開式轉(zhuǎn)子的離心機(jī)中在3200g離心10分鐘，從而將油相與乙醇/水相分離開。對(duì)所收集的油餾分、水相以及提取容器中殘留物的等分試樣進(jìn)行洛伐他汀含量分析，結(jié)果見表3。
表3紅曲霉發(fā)酵大豆的超臨界二氧化碳提取的結(jié)果

對(duì)用二氧化碳提取過的發(fā)酵大豆油進(jìn)行植物甾醇和生育酚含量的分析，結(jié)果見表4。
表4CO2提取過的發(fā)酵大豆油的生育酚和植物甾醇含量

對(duì)比實(shí)施例A、B、C使用不同溶劑的索氏提取對(duì)于在食品應(yīng)用中的使用而言，從發(fā)酵大豆提取他汀可以用一系列有機(jī)溶劑來完成己烷、丙酮、乙酸乙酯、以及乙醇或它們的混合物。
為測(cè)試使用不同有機(jī)溶劑的提取，可實(shí)施索氏提取。將大約135g經(jīng)研磨的發(fā)酵大豆放置于提取套管中。加入約500ml的有機(jī)溶劑，并實(shí)施提取3小時(shí)。提取之后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑直至恒重。使用反相色譜法(HPLC，Shimadzu)對(duì)等分試樣進(jìn)行他汀濃度的測(cè)定。結(jié)果見表5。
表5紅曲霉發(fā)酵大豆的索氏提取結(jié)果

從表3和5可看出、當(dāng)發(fā)酵材料用超臨界二氧化碳提取時(shí)，比起用有機(jī)溶劑提取，其他汀的回收率要高很多。
實(shí)施例10食品的制備含他汀的牛奶通過往1升滅菌脫脂乳中加入2.7g含洛伐他汀(1mg/g)的大豆油以及15.3g的葵花油，來制備含他汀的低脂(1.8％)牛奶。在包裝前將該混合物進(jìn)行均質(zhì)和巴氏殺菌。最終產(chǎn)品中的他汀水平是2.7mg/L。200ml的日常消費(fèi)量可產(chǎn)生預(yù)計(jì)3％的血膽固醇降低(BCL)。
通過往1升滅菌脫脂乳中加入12.5g含洛伐他汀(1mg/g)的大豆油以及5.5g的葵花油，來制備含更高水平他汀的牛奶。最終產(chǎn)品中的他汀水平是12.5mg/L。200ml的日常消費(fèi)量可產(chǎn)生預(yù)計(jì)10-15％的血膽固醇降低(BCL)。
實(shí)施例11食品的制備含他汀的豆奶通過往1升豆奶中加入2.5g含他汀(1mg/g)的大豆油來制備含他汀的豆奶，所述豆奶由市售豆奶基料(AdeS)制備。最終產(chǎn)品中估計(jì)的脂肪百分比是2.4％。該產(chǎn)品中洛伐他汀的量是2.5mg/L。200ml的日常消費(fèi)量可產(chǎn)生預(yù)計(jì)3％的BLC。
實(shí)施例12含他汀的干牛奶和干豆奶往1升含洛伐他汀的牛奶/豆奶中加入225g麥芽糊精(Passelli)，使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的噴霧干燥器將奶噴霧干燥。設(shè)置
-進(jìn)口溫度＝130℃-出口溫度＝90℃-充氣器＝15(75％)-噴嘴壓力＝4巴-流速＝200ml/h奶粉中他汀的估計(jì)量為0.011mg/g。
實(shí)施例13含他汀的意大利面由表6中的成分來制備意大利面。該意大利面中洛伐他汀的估計(jì)量為0.013mg/g。80g的消費(fèi)可導(dǎo)致預(yù)計(jì)5％的BCL。
表6意大利面的成分

權(quán)利要求
1.包含他汀的食用油，其含有至少90％的甘油二酯和/或甘油三酯，其具有小于25wt％的飽和脂肪酸(SAFA)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的食用油，其具有至少75wt％的不飽和脂肪酸(UFA)含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的食用油，其具有高于5wt％的多不飽和脂肪酸(PUFA)含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的食用油，其每千克具有50-500個(gè)α生育酚當(dāng)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的食用油，其含有至少1mg/g的他汀。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的食用油，其含有至少4mg/g的他汀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的食用油，其含有低于10mg/kg的膽固醇。
8.含他汀食用油的制備方法，其特征在于該方法包括用超臨界流體對(duì)底物進(jìn)行提取，所述底物已用產(chǎn)他汀真菌進(jìn)行發(fā)酵。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，該超臨界流體是超臨界二氧化碳。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中，該超臨界流體不含共溶劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的方法，其中，該底物是大豆。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的方法，其中，該產(chǎn)他汀的真菌是紅霉菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12任一項(xiàng)的方法，其中，該方法包括下述步驟用產(chǎn)他汀真菌對(duì)底物進(jìn)行發(fā)酵，將該底物研磨，用超臨界流體對(duì)底物進(jìn)行提取，以及回收油。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述食用油的用途，其用于制備選自意大利面、豆奶、牛奶和干奶粉的食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含他汀的食用油，其含有至少90％的甘油二酯和/或甘油三酯，具有小于25％wt的飽和脂肪酸(SAFA)，并優(yōu)選含有至少4mg/g的他汀。一種含他汀的食用油的制備方法，其包括用超臨界流體對(duì)底物進(jìn)行提取，所述底物已用生產(chǎn)他汀的菌種進(jìn)行發(fā)酵。一種含至少90％甘油二酯和/或甘油三酯的食用油的用途，所述食用油具有小于25wt％的飽和脂肪酸，并優(yōu)選含有至少4mg/g的他汀。
文檔編號(hào)C12P17/06GK1946302SQ200580012636
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者C·M·貝恩多夫, W·M·梅杰, H·O·F·莫爾休詹 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司