專利名稱：多譜系祖細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自于人血的多譜系祖細胞(MLPC)，更具體涉及具有分化成多種組織譜系潛能的MLPC及其在再生治療中的應用。
背景技術：
已在多種來源中鑒定出能在清髓治療后進行造血重建的祖細胞，其中包括骨髓、臍帶血和胎盤血、以及用干細胞動員劑量的粒細胞集落刺激因子處理的受試者的外周血。這些細胞通常被稱為造血干細胞(HSC)，因其表面存在細胞表面糖蛋白如CD34和CD133而被鑒定。HSC作為“骨髓移植”的一部分只占總細胞群的很小比例，被認為是這種治療的救命部分，負責恢復經(jīng)清髓劑量的化療或放療患者的血液形成能力。通過骨髓移植進行干細胞治療已經(jīng)成為許多難治的白血病和遺傳性血液疾病的標準治療方法。
最近的研究表明，在骨髓中存在一個較原始的細胞群，該群細胞能自我更新，并且能夠分化成多種不同類型的組織，而不僅僅是血液細胞。這些多潛能細胞是在成人骨髓的CD34塑料粘附細胞群中作為次要成分而被發(fā)現(xiàn)的，曾被賦予各種名稱，如間充質(zhì)干細胞(MSC)(Pittenger等，Science284143-147(1999))或多潛能成年祖細胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美國專利公開20040107453 A1)。MSC細胞沒有單一的特異性鑒別標記，但是研究發(fā)現(xiàn)有許多標記是陽性的，其中包括CD29、CD90、CD105和CD73，而另外一些標記是陰性的，其中包括CD14、CD3和CD4。不同的研究小組報道，MSC可分化成肌細胞、神經(jīng)元、胰腺β細胞、肝細胞、骨細胞和結(jié)締組織。另外一個研究小組(Wernet等，美國專利公開20020164794 A1)描述了一種具有多潛能的非限定性體細胞干細胞(USSC)，這種細胞來源于臍帶血內(nèi)的CD45-/CD34-細胞群。
發(fā)明概述本發(fā)明的基礎在于從人胎兒血中鑒定稀有的未分化細胞群，該細胞群可自我更新，具有分化成分別代表三個胚層的細胞的潛能。這些胎兒血來源的細胞被稱為多譜系祖細胞(MLPC)。如本文所描述，胎兒血MLPC與骨髓來源的MSC、HSC和USSC不同，其區(qū)別在于免疫表型特征、形態(tài)和不同的生長模式。本發(fā)明提供了從單個細胞培養(yǎng)單型克隆細胞系的方法。本發(fā)明還提供了深低溫保存MLPC的方法(如，為了建立臍帶血庫)以及利用MLPC進行再生治療的方法。
在一個方面，本發(fā)明的特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的純化群，其中的MLPC是CD9和CD45陽性的。MLPC具有白細胞的形態(tài)。MLPC還可以是SSEA-4或CD34陽性的，以及CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細胞因子、SSEA-3和CD13陽性的。MLPC可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。MLPC在培養(yǎng)一段時間后可獲得成纖維細胞樣形態(tài)。MLPC在培養(yǎng)時還可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞，其中包括，例如，具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞以及具有胰腺細胞表型的細胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。
在另一方面，本發(fā)明的特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的純化群，其中的MLPC是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC具有成纖維細胞的形態(tài)。MLPC還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的，還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。MLPC在培養(yǎng)時可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞，其中包括，例如，具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞以及具有胰腺細胞表型的細胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。
本發(fā)明的另一個特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的克隆系，其中的MLPC是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC具有成纖維細胞的形態(tài)。MLPC還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的，還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。MLPC在培養(yǎng)時可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞，其中包括，例如，具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞以及具有胰腺細胞表型的細胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。在某些實施方式中，MLPC在培養(yǎng)時至少可以經(jīng)歷5次倍增(如至少8、10、15或25次倍增)。
在另一方面，本發(fā)明的特征是包含MLPC純化群或MLPC克隆系以及培養(yǎng)基的組合物。該組合物還可以包含冷凍保存液。在一個實施方式中，冷凍保存液是二甲亞砜(DMSO)(如1％到10％的DMSO)。在另一個實施方式中，冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物質(zhì)中的一種或幾種DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷凍保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。
在另一方面，本發(fā)明的特征是制品，其中包含MLPC純化群或MLPC的克隆系。MLPC的純化群或克隆系可儲存在容器內(nèi)(如玻璃瓶或袋子)。容器內(nèi)還可以包含冷凍保存液。
本發(fā)明的另一個特征是從人胎兒血內(nèi)純化MLPC細胞群的方法。該方法包括使人胎兒血樣品(如臍帶血)與含葡聚糖、抗血型糖蛋白-A抗體、抗CD15抗體和抗CD9抗體的組合物接觸；使樣品分成凝集物相和上清相；從上清相中收取細胞；以及通過粘附到固體基質(zhì)(如塑料基質(zhì))上從收獲的細胞中純化MPLC，其中的MPLC是CD9和CD45陽性的。MLPC還可以是CD34、CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細胞因子、SSEA-3、SSEA-4和CD13陽性的。MLPC還可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。該方法還包括檢測MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。
該方法還包括培養(yǎng)MLPC使其獲得成纖維細胞形態(tài)，其中的MLPC在獲得成纖維細胞形態(tài)后是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC在獲得成纖維細胞形態(tài)后還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的。MLPC在獲得成纖維細胞形態(tài)后還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。該方法還包括檢測MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。
在另一方面，本發(fā)明的特征是冷凍保存MLPC的方法。該方法包括使MLPC的純化群或克隆系與冷凍保存液接觸；以及冷凍MLPC的純化群或克隆系。在一個實施方式中，冷凍保存液是DMSO(如1％到10％的DMSO)。在另一個實施方式中，冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物質(zhì)中的一種或幾種DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷凍保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。MLPC的純化群或克隆系以1×105和5×107細胞/毫升的濃度懸浮在冷凍保存液中。純化群或克隆系可以可控速度冷凍(如冷凍速度是電控制的)，或者通過將細胞放置在液氮儲存罐的蒸汽層進行乙醇浴來冷凍。
在另一方面，本發(fā)明的特征是制備分化細胞群的方法。該方法包括用能夠有效誘導MLPC分化的試劑培養(yǎng)MLPC的純化群或克隆系。所述試劑包括胰島素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤；地塞米松、谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油；上皮生長因子、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細胞生長因子；堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、NSF-1和視黃酸；肝素、牛腦提取物、上皮生長因子和氫化可的松；或者抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-4和干細胞因子。
除非特別說明，本文所用的所有技術和科學術語都與本發(fā)明所屬領域的技術人員所常理解的意思相同。雖然與本文所描述的那些方法和材料相似或等價的方法和材料也可用于實現(xiàn)本發(fā)明，但是下面所描述的都是合適的方法和材料。本文所提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都已完整納入本文作為參考。在發(fā)生矛盾時以本說明書包括定義為準。另外，材料、方法和實施例只是為了說明，并不意味著限制。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點通過閱讀下面的詳細描述和權利要求就會清楚。


圖1是從胎兒血中純化MLPC的細胞分離過程示意圖。
圖2A-2D是描述正在發(fā)育的MLPC形態(tài)的顯微照片。圖2A顯示的是從臍帶血分離的MLPC的早期培養(yǎng)情況，說明細胞處于白細胞形態(tài)期。圖2B顯示的是MLPC培養(yǎng)物開始從白細胞形態(tài)向成纖維細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。圖2C顯示的是處于對數(shù)生長期的MLPC晚期培養(yǎng)物。圖2D顯示的是MLPC生長完全匯合的培養(yǎng)物。
詳細描述總的來說，本發(fā)明提供了人胎兒血(如臍帶血(“臍血”)、胎盤血或胎兒血)來源的MLPC純化群以及MLPC來源的MLPC克隆系。胎兒血提供了比成人骨髓更幼稚的細胞來源，所含有的攜帶不成熟細胞表面標記的細胞百分比更高。因此，胎兒血來源的祖細胞可能具有更高的擴增和分化能力。如本文所描述，MLPC具有與骨髓來源的MSC、骨髓來源的HSC以及臍帶血來源的HSC和USSC不同的免疫表型特征。本文所描述的細胞具有自我更新的能力以及分化成不同類型組織的能力，這與骨髓來源的MSC和MAPC細胞相似。MLPC可用于開展細胞治療和建立冷凍細胞庫以便于以后進行再生治療。MLPC還可以被改造使其能表達一種或多種我們感興趣的多肽或其他治療性化合物。
細胞分離組合物MLPC可利用美國專利公開No.2003-0027233-A1所描述的負篩選過程和細胞分離組合物從胎兒血(如臍帶血)中分離。這種組合物包含葡聚糖和一種或多種抗細胞表面抗原的抗體(即與抗原具有結(jié)合親和力的抗體)。
葡聚糖是由葡萄糖單位組成的多糖，各單位之間主要以α(1到6)鍵相連。葡聚糖可導致紅細胞堆積(即形成紅細胞錢串)，因而便于從溶液中去除紅細胞?？辜毎砻婵乖目贵w有利于通過同型凝集(即相同類型的細胞凝集在一起)和/或異型凝集(即不同類型的細胞凝集在一起)從溶液中去除血細胞。
例如，細胞分離組合物可包含葡聚糖和抗血型糖蛋白-A、CD15以及CD9的抗體。細胞分離組合物還可以包含抗其他血細胞表面抗原的抗體，其中包括CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、HLA I類分子、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1、表面Ig及其組合。因此，細胞分離組合物可制備成能選擇性凝集特定類型血細胞的組合物。
一般來說，細胞分離組合物中抗血型糖蛋白-A抗體的濃度為0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)?？寡吞堑鞍?A抗體至少可通過兩種機制來促進從溶液中去除紅細胞。第一，抗血型糖蛋白抗體可引起紅細胞發(fā)生同型凝集，因為血型糖蛋白-A是紅細胞的主要表面糖蛋白。另外，抗血型糖蛋白-A抗體可穩(wěn)定葡聚糖介導形成的紅細胞錢串。典型的抗血型糖蛋白-A單克隆抗體包括而不限于107FMN(鼠IgG1同種型)、YTH89.1(兔IgG2b同種型)、2.2.2.E7(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及E4(鼠IgM同種型)。參見Vanderlaan等，Molecular Immunology201353(1983)；Telen M.J.和Bolk，T.A.，Transfusion27309(1987)；以及Outram S.等，Leukocyte Research.12651(1988)。
細胞分離組合物中抗CD15抗體的濃度為0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)?？笴D15抗體可通過交聯(lián)粒細胞表面存在的CD15分子而導致粒細胞發(fā)生同型凝集。抗CD1抗體還可以導致粒細胞與單核細胞、NK細胞和B細胞發(fā)生同型或異型凝集，其機制為刺激粒細胞表面表達能與單核細胞、NK細胞和B細胞的粘附分子發(fā)生相互作用的粘附分子(如L-選擇素和β-2整合素)。這些細胞發(fā)生的異型凝集可促使這些細胞和紅細胞組分一起從溶液中去除。典型的抗CD1單克隆抗體包括而不限于AHN1.1(鼠IgM同種型)、FMC-10(鼠IgM同種型)、BU-28(鼠IgM同種型)、MEM-157(鼠IgM同種型)、MEM-158(鼠IgM同種型)、324.3.B9(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及MEM-167(鼠IgM同種型)。參見Leukocyte typingIV(1989)；Leukocyte typing II(1984)；Leukocyte typing VI(1995)；Solter D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA755565(1978)；Kannagi R.等，J.Biol.Chem.25714865(1982)；Magnani，J.L.等，Arch.Biochem.Biophys233501(1984)；Eggens I.等，J.Biol.Chem.2649476(1989)。
細胞分離組合物中抗CD9抗體的濃度為0.1到15mg/L、0.1到10mg/L、1到5mg/L或1mg/L。抗CD9抗體可促使血小板發(fā)生同型凝集?？笴D9抗體還可以通過粘附到粒細胞和單核細胞表面的血小板引起粒細胞和單核細胞發(fā)生異型凝集。CD9抗體可加速血小板p-選擇素(CD62P)、CD41/61、CD31和CD36的表達。這些分子可促使血小板結(jié)合到白細胞表面。因此，抗CD9抗體可加速多種細胞-細胞結(jié)合，從而有利于這些細胞的凝集并從溶液中去除。典型的抗CD9單克隆抗體包括而不限于MEM-61(鼠IgG1同種型)、MEM-62(鼠IgG1同種型)、MEM-192(鼠IgM同種型)、FMC-8(鼠IgG2a同種型)、SN4(鼠IgG1同種型)、8.10.E7(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及BU-16(鼠IgG2a同種型)。參見Leukocyte typing VI(1995)；Leukocytetyping II(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr.和Moderman P.N.(1989)，引自Leukocytetyping IV(W.Knapp等編)，pp.989-92，Oxford University Press，Oxford；Jennings，L.K.等，引自Leukocyte typing V，S.F.Schlossmann等編，pp.1249-51，OxfordUniversity Press，Oxford(1995)；Lanza F.等，J.Biol.Chem.26610638(1991)；Wright等，Immunology Today15588(1994)；Rubinstein E.等，Seminars in Thrombosis andHemostasis2110(1995)。
在某些實施方式中，細胞分離組合物含有抗CD41抗體，該抗體可選擇性凝集血小板。在某些實施方式中，細胞分離組合物含有抗CD3抗體，該抗體可選擇性凝集T細胞。在某些實施方式中，細胞分離組合物含有抗CD2抗體，該抗體可選擇性凝集T細胞和NK細胞。在某些實施方式中，細胞分離組合物含有抗CD72抗體，該抗體可選擇性凝集B細胞。在某些實施方式中，細胞分離組合物含有抗CD16抗體，該抗體可選擇性凝集NK細胞和中性粒細胞。其中每種抗體的濃度為0.01到15mg/L。典型的抗CD41抗體包括而不限于PLT-1(鼠IgM同種型)、CN19(鼠IgG1同種型)和8.7.C3(鼠IgG1同種型)?？笴D3抗體的非限定性例子包括OKT3(鼠IgG1)、HIT3a(鼠IgG2a同種型)、SK7(鼠IgG1)和BC3(鼠IgG2a)?？笴D2抗體的非限定性例子包括7A9(鼠IgM同種型)、T11(鼠IgG1同種型)以及Leu5b(鼠IgG2a同種型)?？笴D72抗體的非限定性例子包括BU-40(鼠IgG1同種型)和BU-41(鼠IgG1同種型)?？笴D16抗體的非限定性例子包括3G8(鼠IgG)。
如上所述，細胞分離組合物可被制備成能夠選擇性凝集特定血細胞的制劑。細胞分離組合物的一個例子包含抗血型糖蛋白-A、CD15和CD9抗體，該組合物可加速紅細胞、粒細胞、NK細胞、B細胞和血小板的凝集。然后從溶液中回收T細胞、NK細胞和稀有的前體細胞如MPLC。如果制劑中還包含抗CD3的抗體，那么T細胞也可以被凝集，因而可以從溶液中回收NK細胞和稀有前體細胞如MLPC。
細胞分離組合物可以包含抗其他類型細胞表面抗原的抗體(如腫瘤細胞的細胞表面蛋白)。本領域的技術人員可利用常規(guī)方法制備抗細胞表面抗原的抗體，這些抗原來源于人和其他哺乳動物如非人靈長類動物、嚙齒動物(如小鼠、大鼠、倉鼠、兔和荷蘭豬)、豬、牛和馬的血細胞和其他細胞。
一般來說，組合物中所用的抗體為單克隆抗體，單克隆抗體是針對抗原內(nèi)特定表位的同源抗體群。適宜的單克隆抗體可從公司購買，或者利用標準的雜交瘤技術制備。更具體地說，單克隆抗體可利用通過培養(yǎng)傳代細胞系制備抗體分子的技術制備，其中包括Kohler，G.等，Nature，1975，256495所描述的技術，人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，Immunology Today472(1983)；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802026(1983))，以及EBV雜交瘤技術(Cole等，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy”(單克隆抗體和腫瘤治療)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1983))。
抗體可以是任何類的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亞類。IgG和IgM的同種型抗體在本發(fā)明的細胞分離組合物中是特別有用的。五聚體IgM抗體比IgG抗體含有更多的抗原結(jié)合位點，在某些情況下(如抗血型糖蛋白-A和CD15抗體)特別適于作為細胞分離試劑。在另外一些情況下(如抗CD9抗體)，IgG同種型抗體特別適于刺激同型和/或異型凝集。
抗細胞表面抗原的抗體可以存在于液相中(如可溶性的)。液相抗體在細胞分離組合物中存在的濃度一般在約0.1到約15mg/l之間(如，0.25-10、0.25-1、0.5-2、1-2、4-8、5-10mg/l之間)。
抗細胞表面抗原的抗體還可以連接到固相(即底物結(jié)合)上?？共煌毎砻婵乖目贵w可以共價連接到固相支持物上以促進細胞表面分子的交聯(lián)以及細胞表面粘附分子的活化。使用底物結(jié)合的抗體可加速細胞的分離(如，利用粒子有利于凝集細胞的特性，或者利用有益于純化的特性)。
在某些實施方式中，結(jié)合有底物結(jié)合抗體的固相支持物是粒子。在某些實施方式中，抗體被結(jié)合到乳膠微粒(如，通過生物素-親和素連接子共價連接到聚苯乙烯小珠的COO基團上，或者共價連接到修飾小珠的NH2基團上)。在某些實施方式中，抗體被連接到酸腐蝕的玻璃粒子上(如，通過生物素-親和素連接子)。在某些實施方式中，抗體被連接到凝集多肽如凝集的牛血清白蛋白上(如通過生物素-親和素連接子，或者共價連接到多肽的COO基團或NH2基團上)。在某些實施方式中，抗體被共價連接到多糖如高分子量(如＞1,000,000Mr)的硫酸葡聚糖上。在某些實施方式中，生物素化的抗體被連接親和素粒子上，形成四聚體復合物，每個親和素分子結(jié)合四個抗體分子。在某些實施方式中，抗體通過生物素-親和素-生物素化的抗體連接子被結(jié)合到生物素化的瓊脂糖凝膠顆粒上(One Cell Systems(單細胞系統(tǒng))，Cambridge，MA，U.S.A.)。這種粒子的直徑一般約為300-500微米，可在超聲水浴或快速混合水浴中制備。
細胞-底物粒子(即，包含細胞和底物結(jié)合抗體的粒子)可作為凝集物從溶液中沉淀出來。當粒子是順磁磁珠時，還可以通過應用磁場從溶液中去除細胞-底物粒子。底物結(jié)合抗體在細胞分離組合物中的濃度通常為約0.1到約50.0×109個粒子/升(如，0.25～10.0×109、1～20.0×109、2～10.0×109、0.5～2×109、2～5×109、5～10×109以及10～30×109個粒子/升)，其中的粒子是指結(jié)合有抗體的固相粒子。
細胞分離組合物還可以含有二價陽離子(如Ca+2和Mg+2)。二價陽離子可通過平衡鹽溶液(如Hank’s平衡鹽溶液)的方式提供。據(jù)報道，Ca+2離子對于選擇素介導的和整合素介導的細胞-細胞粘附來說是重要的。
細胞分離組合物還可以包含抗凝血劑如肝素。肝素可防止凝固以及在高鈣環(huán)境下由凝固導致的非特異性細胞丟失。肝素還可以促使血小板凝集。凝集的血小板可粘附到粒細胞和單核細胞上，因而比單個的血小板更容易促使異型凝集。肝素可以肝素鹽(如肝素鈉、肝素鋰或肝素鉀)的形式提供。
MLPC群和克隆系MLPC可用上述細胞分離組合物從人胎兒血中純化。本文所使用的術語“純化的”是指細胞群內(nèi)至少有90％(如91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的細胞是MLPC。本文所用的術語“MLPC”是指CD9陽性的、以及常常顯示其他標記如CD13、CD73和CD105群體(constellation)的胎兒血細胞?！癕LPC群”是指從人胎兒血中獲得的原始培養(yǎng)物及其未克隆的后代。“克隆系”是指單個細胞來源的細胞系。本文所用的術語“細胞系”是指在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下、在適當?shù)囊欢螘r間內(nèi)能自我更新的一群細胞。但是，術語“系”并不代表那些進行不確定繁殖的細胞。本文所描述的克隆系在衰老前一般都能經(jīng)歷75到100次倍增。
一般來說，MLPC群可通過使胎兒血樣本與上述細胞分離組合物接觸并使樣本分成凝集相和上清相來獲得。例如，通過重力作用或通過離心使樣本沉降。優(yōu)選的MLPC純化自小于48小時的臍帶血樣本(如，產(chǎn)后24、12、8或4小時之內(nèi))凝集以后，從上清相中回收未凝集的細胞。例如，通過如下過程回收上清相中的細胞離心，用鹽溶液洗滌并接種到固相底物上(如，塑料培養(yǎng)裝置如帶槽的玻片或培養(yǎng)板)，使用含10％血清的標準培養(yǎng)基(如含10％血清的DMEM；含10％血清的RPMI-1640；或者含10％血清的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號為#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD))培養(yǎng)。MLPC可粘附到固相底物表面，而其他細胞如T細胞、NK細胞和CD34+HSC卻不能粘附，因而通過洗滌可以去除。在開始培養(yǎng)后3天到2周內(nèi)MLPC從白細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞形態(tài)，然后細胞進入對數(shù)生長期，只要培養(yǎng)物內(nèi)的細胞濃度維持在約1.5×105細胞/cm2以下，細胞就可以繼續(xù)維持對數(shù)生長。
克隆系的建立可通過如下過程完成收獲MLPC，然后稀釋并重新接種到多孔培養(yǎng)板上，這樣就可以在孔內(nèi)找到單個細胞。當細胞濃度達到1到5×105細胞/75cm2時將細胞轉(zhuǎn)移到較大的培養(yǎng)瓶內(nèi)。細胞濃度維持在1×105到5×105細胞/75cm2之間以使其維持對數(shù)生長。
可利用本領域熟知的技術來分析MLPC的存活力、增殖能力和壽命。例如，存活力可通過臺盼藍排出試驗、醋酸熒光素攝取試驗或碘化丙啶攝取試驗來測定。增殖能力可通過胸苷攝取試驗或MTT細胞增殖試驗來測定。壽命可通過確定培養(yǎng)物細胞群倍增的最大數(shù)目來分析。
利用已知的技術可確定MLPC的免疫表型。例如，從組織培養(yǎng)裝置中去掉細胞培養(yǎng)基，然后用平衡鹽溶液(如Hank’s平衡鹽溶液)和牛血清白蛋白(如2％ BSA)洗滌粘附的細胞。細胞與抗體共孵育，這些抗體與細胞表面抗原如CD9、CD45、CD13、CD73、CD105或其他任何細胞表面抗原有結(jié)合親和力。抗體可連接上可檢測標記(如熒光標記或酶催化標記)或者利用帶有可檢測標記的二抗來檢測。另外，MLPC上的細胞表面抗原可利用流式細胞儀和熒光標記抗體來檢測。
如本文所描述，MLPC上存在的細胞表面抗原是可以改變的，這些抗原因培養(yǎng)階段的不同而不同。在培養(yǎng)早期MLPC展示白細胞樣形態(tài)時，MLPC是CD9和CD45、SSEA-4(階段特異性胚胎抗原-4)、CD34以及CD13、CD29、CD41、CD44、CD73、CD90、CD105、干細胞因子、STRO-1(骨髓體細胞表達的細胞表面抗原)、SSEA-3(半乳糖苷葡糖)和CD133陽性的，并且是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)和系標記CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR以及CD102陰性的。當轉(zhuǎn)變成成纖維細胞形態(tài)后，MLPC依然是CD9、CD13、CD29、CD73、CD90和CD105陽性的，但是卻變成CD34、CD41、CD45、干細胞因子、STRO-1、SSEA-3、SSEA-4和CD133陰性的。在體外培養(yǎng)的整個過程中，未分化的MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)、系標記CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR和CD102陰性的。
骨髓來源的MSC和MAPC以及臍帶血來源的USSC被認為是來源于CD45-/CD34-細胞群。MLPC與這些類型的細胞的區(qū)別在于MLPC是CD45+/CD34+來源的細胞。另外，在整個成熟過程中胎兒血來源的MLPC是否存在CD9以及存在的持續(xù)時間也可以將MLPC與MSC和MAPC區(qū)分開，后者沒有CD9標記。MLPC在其白細胞形態(tài)相中擁有造血標記CD45、CD133、CD90和CD34，與HSC的區(qū)別在于HSC具有強制性的塑料粘附特性以及存在間充質(zhì)細胞相關的標記CD105、CD29、CD73、CD13和胚胎相關標記SSEA-3和SSEA-4。另外，利用現(xiàn)有的技術無法在體外培養(yǎng)HSC而不使其進一步分化，而MLPC保持不分化狀態(tài)可擴增許多代。MLPC與MSC和USSC的區(qū)別還在于MSC和USSC在體外培養(yǎng)時生長狀態(tài)較差，具有絲狀胞漿突起以及達到最佳生長偏愛低密度培養(yǎng)條件。
可通過將細胞(5×106到2×107細胞/毫升)懸浮于冷凍保存液中冷凍保存MLPC，所述冷凍保存液如二甲亞砜(DMSO，一般為1-10％)，或者胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一種或幾種。例如，(1)含10％ DMSO的胎牛血清；(2)含10％ DMSO和1％葡聚糖的人血清；(3)含1％ DMSO和5％海藻糖的人血清；或者(4)20％人血清白蛋白、1％ DMSO和5％海藻糖，這些都可用于冷凍保存MLPC。加入冷凍保存液后將細胞冷凍起來(如到-90℃)。在某些實施方式中，細胞以可控速度冷凍(如冷凍速度是電控制的)，或者通過將細胞放置在70％乙醇浴和液氮儲存罐的蒸汽層進行冷凍。當細胞冷凍到-90℃時放置到液氮儲存罐的液體相中以便于長期儲存。冷凍保存液可用于長期儲存這些細胞作為治療的應用。
MLPC的分化MLPC能夠分化成各種細胞，包括三個胚層(即內(nèi)胚層、外胚層和中胚層)的細胞。本文所用的術語“能夠分化成”是指一個給定的細胞或其后代能夠在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下呈現(xiàn)分化表型。例如，MLPC可分化成具有骨細胞表型的細胞、脂肪細胞表型的細胞、神經(jīng)細胞表型的細胞、肌細胞表型的細胞、內(nèi)皮細胞表型的細胞、肝細胞/胰腺細胞前體細胞表型的細胞(也被稱為橢圓形細胞)以及其他類型的細胞。利用一種或幾種分化試劑可誘導分化，其中包括而不限于Ca2+、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、角質(zhì)化細胞生長因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、細胞因子如白細胞介素、干擾素或腫瘤壞死因子、視黃酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、激素(如雄激素、雌激素、胰島素、催乳素、三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松或地塞米松)、丁酸鈉、TPA、DMSO、NMF(N-甲基甲酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)或基質(zhì)如膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素。
確定MLPC是否已經(jīng)分化成特定類型的細胞可以利用已知的方法來分析，其中包括檢測形態(tài)學和細胞表面標記的改變(如，通過流式細胞術或免疫組化方法)、通過光學顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、或者利用一些方法如聚合酶鏈式反應(PCR)或基因表達譜分析來檢測基因表達的變化。
例如，利用含地塞米松、L-谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油的誘導培養(yǎng)基(如成骨細胞分化培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號為#PT-3002，Cambrex)誘導MLPC使其分化成具有骨細胞表型的細胞(Jaiswal等，J.Biol.Chem.64(2)295-312(1997))。具有骨細胞表型的細胞含有鈣結(jié)晶沉淀，通過茜素紅染色可以看到。
利用含胰島素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的誘導培養(yǎng)基(如脂肪細胞分化培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號為#PT-3004，Cambrex)誘導MLPC使其分化成具有脂肪細胞表型的細胞。具有脂肪細胞表型的細胞包含充滿脂質(zhì)的脂質(zhì)體，通過油紅染色可以看到。這種細胞還含有甘油三酯(trigyceride)，用尼羅紅染色后可發(fā)綠色熒光(Fowler和Greenspan，Histochem.Cytochem.33833-836(1985))。
利用含EGF、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細胞生長因子的誘導培養(yǎng)基誘導MLPC可使其分化成具有肌細胞表型的細胞(如SkGMTM，產(chǎn)品編號為CC-3160，Cambrex)。具有肌細胞表型的細胞表達快肌肌球蛋白和α肌動蛋白。
利用含人堿性成纖維細胞生長因子、NSF-1和FGF-4的培養(yǎng)基(如，NPMMTM-神經(jīng)祖細胞維持培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號為#CC-3209，Cambrex)在預先涂布多聚D賴氨酸和層粘連蛋白(BD Biosciences Discovery Labware，產(chǎn)品編號為#354688)培養(yǎng)裝置內(nèi)誘導MLPC可使其分化成具有神經(jīng)干細胞表型的細胞(神經(jīng)球)。細胞一旦分化成神經(jīng)球，通過加入腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)它們還可以進一步分化成運動神經(jīng)元，通過加入白血病抑制因子(LIF)、視黃酸和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子可以進一步分化成星形膠質(zhì)細胞，通過加入3，3’，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)可以進一步分化成少突膠質(zhì)細胞。通過檢測是否表達干蛋白、III類β微管蛋白(微管蛋白β-4)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)和半乳糖腦苷脂(GalC)可以確定細胞是否已經(jīng)向神經(jīng)細胞分化。對于神經(jīng)球來說，所有這些標記都是陽性的，而某些類型的分化細胞不表達這些標記。髓磷脂堿蛋白(MBP)染色陽性說明已分化成少突膠質(zhì)細胞。
利用含肝素、牛腦提取物、上皮生長因子(如人重組上皮生長因子)和氫化可的松的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(如EGM3-MV，產(chǎn)品編號為#CC-3125，Cambrex)誘導MLPC可使其分化成具有內(nèi)皮細胞表型的細胞。內(nèi)皮細胞的分化可通過E-選擇素(CD62E)和ICAM-2(CD102)的表達來確定。
利用含抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、EGF、肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、FGF-4和干細胞因子的誘導培養(yǎng)基(如HCMTM-肝細胞培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號為#CC-3198，Cambrex)誘導MLPC可使其分化成具有肝細胞/胰腺細胞前體細胞表型的細胞。肝細胞和胰腺細胞具有共同的祖細胞。肝細胞的分化可通過肝細胞生長因子和人血清白蛋白的表達來確定。胰腺細胞的分化可通過胰島素和胰島素原的表達來確定。
MLPC的修飾群MLPC可以被修飾以使其產(chǎn)生一種或多種目的多肽或其他治療性化合物。為了修飾分離的細胞以使其產(chǎn)生目的多肽或其他治療性化合物，必須向細胞內(nèi)導入合適的外源核酸。在某些實施方式中，細胞被瞬時轉(zhuǎn)染，這說明外源核酸是游離的(即，不整合到染色體DNA上)。在另外一些實施方式中，細胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，即，外源核酸被整合到宿主細胞的染色體DNA上。本文所用的術語“外源的”指核酸和特定細胞時是指非來源于其天然宿主細胞的任何核酸。另外，術語“核酸”也包括天然核酸。例如，編碼分離自人細胞的多肽的核酸一旦被導入到第二種人源細胞中，鈣核酸對于第二種人源細胞來說就是外源的。外源核酸一般作為載體的一部分被轉(zhuǎn)移，載體內(nèi)的調(diào)節(jié)元件如啟動子可操控地連接到目的核酸上。
利用病毒載體如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、皰疹病毒或牛乳頭狀瘤病毒載體可改造細胞。參見Kay等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9412744-12746中有關病毒載體和非病毒載體的綜述。載體可以通過機械方式導入，如脂質(zhì)體或化學介導的DNA攝取。例如，通過本領域熟知的方法將載體導入到MLPC內(nèi)，其中包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE葡聚糖、鈣磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)體、LIPOFECTINTM、溶酶體融合、合成的陽離子脂質(zhì)、利用基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運子。
載體包含編碼篩選標記的核酸。篩選標記的非限定性例子包括嘌羅霉素、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo、G418、APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶(TK)和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)。這些標記可用于篩選培養(yǎng)物中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
MLPC還可以進行靶向基因修飾。導入靶向基因修飾的同源重組方法是本領域熟知的。為了獲得同源重組MLPC，需要構建同源重組載體，其中目的基因的5’和3’端側(cè)翼序列分別為靶向細胞基因組內(nèi)源性的基因序列，這樣載體攜帶的目的基因就可以和靶細胞基因組的內(nèi)源性基因發(fā)生同源重組。兩側(cè)所加的核酸序列要足夠長，以便于目的基因與靶細胞基因組的內(nèi)源性基因發(fā)生同源重組。一般來說，載體內(nèi)所包含的側(cè)翼序列有幾個kb(5’端和3’端)。構建同源重組載體的方法以及制備同源重組動物的方法是本領域熟知的(參見Thomas和Capecchi，1987，Cell51503；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2823-29；以及PCT公開Nos.WO 90/11354、WO91/01140和WO 93/04169)。
使用MLPC的方法MLPC可用于酶替代療法以治療特殊的疾病，其中包括而不限于溶酶體貯積病，如Tay-Sachs綜合征、Niemann-Pick綜合征、Fabry綜合征、Gaucher綜合征、Hunter綜合征和Hurler綜合征，以及其他神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病、粘多糖增多癥和糖原貯積病。
在其他實施方式中，細胞可作為基因治療的載體來矯正遺傳性代謝缺陷、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、囊性纖維化、糖原貯積病、甲狀腺功能低下、鐮狀細胞性貧血、Pearson綜合征、Pompe病、苯酮尿癥(PKIJ)、卟啉病、楓糖尿病、高胱氨酸尿癥、粘多糖貯積癥(mucoplysaccharide nosis)、慢性肉芽腫性疾病和酪氨酸血癥以及Tay-Sachs病，或者治療癌癥、腫瘤或其他病理狀態(tài)。
MLPC可用于修復因疾病而導致的組織和器官損傷。在這種實施方式中，給予患者MLPC群使因疾病受損的組織或器官再生或修復。例如，給予患者MLPC群以增強患者化療或放療后的免疫系統(tǒng)功能，或者修復心肌梗死后的心臟組織。
細胞還可用于組織再生治療或替代治療，其中包括而不限于角膜上皮缺損的治療、軟骨修復、面部斑痕修復、粘膜膜、腸墊片、神經(jīng)結(jié)構(如視網(wǎng)膜、基底膜上的聽覺神經(jīng)元、嗅上皮上的嗅覺神經(jīng)元)、皮膚燒傷創(chuàng)傷修復、或者重建其他損傷或患病的器官或組織。
MLPC還可用于治療性移植手術中以增加或替換肝、胰腺、腎、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、骨、骨髓、胸腺、脾、粘膜組織或頭發(fā)的干細胞或祖細胞。
組合物和制品本發(fā)明的特征還有含MLPC純化群或MLPC克隆系的組合物和制品。在某些實施方式中，MLPC的純化群或克隆系被置于容器內(nèi)(如玻璃瓶或袋子)。在某些實施方式中，克隆系至少在培養(yǎng)物中經(jīng)歷了3次倍增(如，至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次倍增)。在其他實施方式中，組合物或制品中也包含培養(yǎng)基(如，MSCGMTM培養(yǎng)基)。在其他實施方式中，組合物或制品還包含一種或多種冷凍保存液或藥用載體。例如，組合物可包含血清和DMSO，血清、DMSO和海藻糖的混合物，或者人血清、DMSO和海藻糖的混合物。
MLPC的純化群或克隆系可用包裝材料包裝，以試劑盒的形式出售。試劑盒的包裝材料通常包含描述MLPC純化群或克隆系如何培養(yǎng)、分化或使用的說明書或標記。生產(chǎn)這種試劑盒的組分和方法也是大家所熟知的。
本發(fā)明還在下列實施例中做了進一步的描述，這些實施例并不是要限定權利要求所描述的本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1分離血細胞本實施例描述了利用下文所述的細胞分離試劑分離細胞的通用方法。等體積的細胞分離試劑(見表1)和枸櫞酸葡萄糖(ACD)、CPDA(枸櫞酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤)或肝素化的臍帶血樣品在封閉的無菌容器(如，50ml圓錐形試管)內(nèi)混合(每種25ml)。含20×106細胞/毫升以上白細胞的一份血液樣品與兩份細胞分離試劑混合。在室溫下，試管在振蕩平臺上溫和振蕩混合20到45分鐘，然后將試管正放在試管架上靜置30到50分鐘，使凝集細胞與未凝集細胞分開，未凝集細胞依然留在溶液中。用移液管從上清中回收未凝集細胞，不要攪動凝集物?；厥盏募毎?5ml PBS洗滌，500×g離心7分鐘。然后將細胞團重新懸浮于4ml含2％人血清白蛋白的PBS中。
表1細胞分離試劑

還可以利用含EDTA和乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低滲溶解液從凝集物中回收細胞。凝集的細胞用25ml VitaLyse(BioE，St.Paul，MN)處理，并振蕩。10分鐘后細胞在500×g離心7分鐘，去掉上清，然后將細胞重懸于4ml PBS中。
利用標準的流式細胞術和免疫表型分析法鑒定回收的紅細胞、白細胞、淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、造血干細胞和非造血干細胞。在進行流式細胞術前，利用Coulter Onyx Hematology Analyzer鑒定回收的白細胞(即，白細胞計數(shù))。通過血液學分析和流式細胞術分析、根據(jù)光學發(fā)散特性鑒定細胞及標記抗體染色來確定細胞的類型并進行細胞計數(shù)。
如表2所示，99.9％的紅細胞被去除，99.8％的單核細胞和粒細胞、74％的B細胞、64.9％的B細胞和99.4％的血小板被從臍帶血中去除。
表2細胞回收

實施例2MLPC的純化表3所示的細胞分離試劑用于從非凝集的上清相中分離MLPC。參見圖1所示的純化示意圖。
表3細胞分離試劑

簡言之，50-150ml CPDA抗凝的臍帶血(48小時以內(nèi)的臍帶血)與表3所示的等體積細胞分離組合物溫和混合30分鐘?；旌贤暌院?，將盛有血液/細胞分離組合物混合物的容器向上放置，在正常的1×g重力下使內(nèi)容物沉降30分鐘。沉降完成后從上清中收集非凝集的細胞。通過離心然后用PBS洗滌的方法從上清中回收細胞。細胞重懸到完全MSCGMTM(間充質(zhì)干細胞生長培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號為#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD)中，用完全MSCGMTM將細胞濃度調(diào)整到2-9×106/ml。將細胞接種到標準塑料組織培養(yǎng)瓶(如，Corning)、帶槽的玻片或其他培養(yǎng)裝置中，在37℃、含5％ CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)過夜。除非特別說明，以后的孵育都是在37℃、5％ CO2的濕潤環(huán)境中進行。在這個初始孵育過程中，MLPC粘附到塑料上。未粘附的細胞(如T細胞、NK細胞和CD34+造血干細胞)通過用完全MSCGMTM強力洗滌培養(yǎng)瓶或孔而去除。
通過定期去掉完全MSCGMTM并加入新鮮的完全MSCGMTM來飼養(yǎng)MLPC培養(yǎng)物。通過這種方法，細胞濃度可維持在1×105-1×106細胞/75cm2之間。當細胞濃度達到8×105-1×106細胞/75cm2時，用10％ DMSO和90％血清冷凍保存細胞，或者擴增到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。通過去掉完全MSCGMTM并加入PBS+0.1％ EGTA從粘附培養(yǎng)物上回收細胞。細胞在37℃孵育15到60分鐘，然后從培養(yǎng)瓶中收集，并用完全MSCGMTM洗滌。然后以1×105細胞/mL的濃度重新接種細胞。培養(yǎng)物生長到匯合時就會發(fā)現(xiàn)細胞已失去增殖和分化能力。如果出現(xiàn)這種情況，培養(yǎng)物的密度就不要超過1×106細胞/75cm2。
實施例3MLPC的形態(tài)學及向成纖維細胞的發(fā)育按照實施例1和2描述的方法分離和培養(yǎng)的臍帶血來源的MLPC用標準的MSCGMTM培養(yǎng)直到匯合為止。根據(jù)供體的不同，MLPC培養(yǎng)物生長到匯合所需的時間為2到8周不等。這些細胞在生長和培養(yǎng)成熟期間的形態(tài)學見圖2A-2D。
在圖2A所示的早期階段，細胞分裂比較緩慢，與循環(huán)中的白細胞形態(tài)相似，但是有樹突狀的胞漿突起。許多細胞還呈現(xiàn)小的圓形細胞形態(tài)，與這些細胞在循環(huán)中的形態(tài)相似。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，白細胞樣細胞的形態(tài)開始從白細胞樣變成更扁平更暗的成纖維細胞樣(見圖2B)。當細胞分裂時，它們開始聚集、分裂并重新粘附到培養(yǎng)瓶的表面，然后再次擴展開來。這個過程緩慢地持續(xù)進行，直到細胞長滿可用的表面。圖2C顯示了處于對數(shù)生長期的細胞的形態(tài)。圖2D顯示了MLPC完全匯合后的形態(tài)。除了在畫面的左下角發(fā)現(xiàn)有兩個處于活躍分裂期的細胞以外，其他所有細胞都呈成纖維細胞樣形態(tài)。
總之，在培養(yǎng)的早期，細胞小而圓，但是具有胞漿突起，既有手指樣突起又有高度延伸的突起，這是它們與其他血細胞的區(qū)別。開始培養(yǎng)后不久，細胞開始擴展，變得扁平，呈現(xiàn)與成纖維細胞一致的形態(tài)。最后，細胞一旦生長到匯合在一起，細胞開始大量地在平行方向上生長。培養(yǎng)物多次生長到匯合會導致其失去增殖和分化能力。
實施例4利用免疫熒光顯微鏡確定細胞的免疫表型為了確定MLPC的表面標記，將新鮮分離的細胞接種到16孔帶槽玻片上并使其生長到匯合。在培養(yǎng)的不同時間點(從接種后3天到匯合后)收獲細胞并用下列標記染色CD45-FITC(BD/Pharmingen)、CD34-PE(BD/Pharmingen)、CD4-PE(BioE)、CD8-PE(BioE)、抗HLA-DR-PE(BioE)、CD41-PE(BioE)、CD9-PE(Ancell)、CD105-PE(Ancell)、CD29-PE(Coulter)、CD73-PE(BD/Pharmingen)、CD90-PE(BD/Pharmingen)、抗人干細胞因子-FITC(R&D Systems)、CD14-PE(BD/Pharmingen)、CD15-FITC(Ancell)、CD38-PE(BD/Pharmingen)、CD2-PE(BD/Pharmingen)、CD3-FITC(BD/Pharmingen)、CD5-PE(BD/Pharmingen)、CD7-PE(BD/Pharmingen)、CD16-PE(BD/Pharmingen)、CD20-FITC(BD/Pharmingen)、CD22-FITC(BD/Pharmingen)、CD19-PE(BD/Pharmingen)、CD33-PE(BD/Pharmingen)、CD10-FITC(BD/Pharmingen)、CD61-FITC(BD/Pharmingen)、CD133-PE(R&DSystems)、抗STRO-1(R&D Systems)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-3(R&DSystems)和羊抗大鼠IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-4(R&D Systems)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE)。還要分析骨髓MSC(Cambrex，Walkersville，MD)和臍帶血HSC(來自上述非粘附細胞)的細胞表面標記。
簡言之，從玻片的孔中去掉細胞培養(yǎng)基，用Hank’s平衡鹽溶液+2％BSA洗滌細胞3次，然后在暗處室溫下用抗體染色細胞20分鐘。孵育以后用Hank’s平衡鹽溶液+2％BSA洗滌細胞3次，，然后用熒光顯微鏡直接觀察細胞是否有熒光。臍帶血來源的MLPC與骨髓來源的MSC及臍帶血來源的造血干細胞(HSC)進行比較所得到的結(jié)果列于表4中。
表4


實施例5克隆的MLPC細胞系實施例2的MLPC傳2代以后，通過用含0.1％ EGTA(pH 7.3)的PBS替換細胞培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)瓶的塑料表面分離下來。用完全MSCGMTM將細胞稀釋到1.3個細胞/毫升，然后加入到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.2ml，這樣平均3個孔約有一個細胞。在37℃過夜孵育使細胞粘附到培養(yǎng)板上以后，觀察培養(yǎng)板內(nèi)細胞的實際分布情況。只有每孔一個細胞的孔繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞繁殖到濃度為1-5×105細胞/75cm2時將其轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)瓶中以使細胞濃度維持在1×105到5×105細胞/75cm2之間，使其保持對數(shù)生長狀態(tài)。細胞在37℃、5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。
利用這種方法至少建立了52個克隆細胞系，分別命名如下UM081704-1-E2、UM081704-1-B6、UM081704-1-G11、UM081704-1-G9、UM081704-1-E9、UM081704-1-E11、UM081704-1-G8、UM081704-1-H3、UM081704-1-D6、UM081704-1-H11、UM081704-1-B4、UM081704-1-H4、UM081704-1-C2、UM081704-1-G1、UM081704-1-E10、UM081704-1-B7、UM081704-1-G4、UM081704-1-F12、UM081704-1-H1、UM081704-1-D3、UM081704-1-A2、UM081704-1-B11、UM081704-1-D5、UM081704-1-E4、UM081704-1-C10、UM081704-1-A5、UM081704-1-E8、UM081704-1-C12、UM081704-1-E5、UM081704-1-A12、UM081704-1-C5、UM081704-1-A4、UM081704-1-A3、MH091404-2#1-1.G10、UM093004-1-A3、UM093004-1-B7、UM093004-1-F2、UM093004-1-A12、UM093004-1-G11、UM093004-1-G4、UM093004-1-B12、UM093004-2-A6、UM093004-2-A9、UM093004-2-B9、UM093004-2-C5、UM093004-2-D12、UM093004-2-H3、UM093004-2-H11、UM093004-2-H4、UM093004-2-A5、UM093004-2-C3和UM093004-2-C10。按照實施例所述的方法分析克隆細胞系UM081704-1-E8的細胞表面標記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與具有成纖維細胞形態(tài)的“成熟MLPC”一樣，如表4所示。
實施例6MLPC向骨細胞的分化MLPC細胞群和克隆細胞系UM081704-1-E8都用完全MSCGMTM培養(yǎng)，并在上述對數(shù)生長條件下擴增。用PBS+0.1％ EGTA處理后收獲細胞，再以5×103到2×104/ml的濃度接種用完全MSCGMTM。細胞孵育過夜使其粘附，然后培養(yǎng)基替換成成骨細胞分化培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號為#PT-3002，Cambrex)，該培養(yǎng)基由添加地塞米松、L-谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油的完全MSCGMTM組成。細胞在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，每3-4天換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2-3周。利用修改的茜素紅染色方法證明是否存在鈣結(jié)晶，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察鈣礦化的茜素紅染色情況。
實施例7MLPC向脂肪細胞的分化MLPC細胞群和克隆細胞系UM081704-1-E8都接種到完全MSCGMTM，濃度為1×104到2×105細胞/毫升培養(yǎng)基，在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。使細胞重新粘附到培養(yǎng)板上，每3-4天換一次培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)物生長到匯合為止。當細胞100％匯合時，用脂肪細胞形成分化培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號為#PT-3004，Cambrex)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基由添加人胰島素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的完全MSCGMTM組成，至少培養(yǎng)14天。
為了分析分化情況，細胞用可對脂質(zhì)特異性染色的油紅染色。MLPC匯合培養(yǎng)物呈成纖維細胞樣形態(tài)，油紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有任何跡象表明出現(xiàn)了脂質(zhì)體。但是用脂肪細胞形成培養(yǎng)基誘導分化3周后MLPC出現(xiàn)了脂肪細胞特有的脂質(zhì)體(即，胞漿中亮白色的管狀物)，并且油紅染色后產(chǎn)生紅色。用脂肪細胞形成培養(yǎng)基誘導分化的MLPC在用特異于甘油三酯的尼羅紅染色后還呈現(xiàn)綠色熒光。未分化的細胞維持其成纖維細胞樣形態(tài)，不被染色。
實施例8MLPC向肌細胞的分化MLPC(細胞群和克隆細胞系UM081704-1-E8)以1.9×104細胞/孔的濃度接種到帶四個槽的用纖連蛋白預涂布的玻片內(nèi)的完全MSCGMTM中，并在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24-48小時使細胞粘附到板上。去掉培養(yǎng)基，換成10μM的5-氮雜胞苷(產(chǎn)品編號為#A1287，Sigma Chemical Co.)，繼續(xù)孵育24小時。細胞用PBS洗滌2次，然后用含重組人表皮生長因子(huEGF)、人胰島素、胎球蛋白、地塞米松和重組人堿性成纖維細胞生長因子(100ng/mL)(huFGF-basic，產(chǎn)品編號為#F0291，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的SkGMTM骨骼肌細胞培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號為#CC-3160，Cambrex)培養(yǎng)。每2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)約21天。對照孔用MSCGMTM培養(yǎng)，而試驗孔用SkGMTM(如上所述)培養(yǎng)。
在開始肌細胞培養(yǎng)后7天收獲細胞。去掉培養(yǎng)上清，細胞用2％緩沖甲醛溶液固定2小時。細胞用PermaCyteTM(BioE，St.Paul，MN)進行透化處理，然后用人快骨骼肌肌球蛋白特異性的鼠單克隆抗體(MY-32，產(chǎn)品編號為#ab7784，Abcam，Cambridge，MA)或α肌動蛋白特異性的鼠單克隆抗體(BM 75.2，產(chǎn)品編號為#ab11008，Abcam)染色。細胞與一抗孵育20分鐘，用PBS洗滌，再用羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE，St.Paul，MN)復染。肌細胞培養(yǎng)物含有快骨骼肌肌球蛋白和α肌動蛋白，這說明MLPC已轉(zhuǎn)分化成骨骼肌細胞。
實施例9MLPC向神經(jīng)細胞的分化骨髓來源的hMSC(Cambrex)、臍帶血MLPC和MLPC克隆細胞系在上述對數(shù)生長條件下培養(yǎng)。按照上述方法收獲細胞，再以每孔0.8×104個細胞的濃度接種到四槽玻片上，該玻片已預先涂布了多聚D賴氨酸和層粘連蛋白(BD Biosciences DiscoveryLabware，產(chǎn)品編號為#354688)，每孔加入0.5mL含huFGF-basic、huEGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)存活因子-1、成纖維細胞生長因子-4(20ng/mL)和200mM GlutaMaxI Supplement(產(chǎn)品編號為#35050-061，Invitrogen，Carlsbad，CA)的NPMMTM(產(chǎn)品編號為#CC-3209，Cambrex)。每2-3天換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21天。4到20天后出現(xiàn)神經(jīng)球。MLPC轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞系可通過干蛋白(抗人干蛋白單克隆抗體，MAB1259，克隆196908，R&D Systems)、III類β微管蛋白(微管蛋白b-4)(抗神經(jīng)元特異性的III類β微管蛋白單克隆抗體，MAB1195，克隆TuJ-1，R&D Systems)、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)(抗人GFAP單克隆抗體，HG2b-GF5，克隆GF5，AdvancedImmunochemical，Inc.)以及半乳糖腦苷脂(GalC)(鼠抗人GalC單克隆抗體MAB342，mGalC克隆，Chemicon)的陽性染色來確定。
在神經(jīng)祖細胞維持培養(yǎng)基中加入10ng/mL BDNF(產(chǎn)品編號為#B3795，SigmaChemical Co.)和10ng/mL NT3(產(chǎn)品編號為#N1905，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，細胞可進一步分化成神經(jīng)元。在神經(jīng)祖細胞維持培養(yǎng)基中加入10-6M視黃酸(產(chǎn)品編號為#R2625，Sigma Chemical Co.)、10ng/mL LIF(產(chǎn)品編號為#L5158，SigmaChemical Co.)和10ng/mL CNTF(產(chǎn)品編號為#C3710，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，神經(jīng)球可進一步分化成星形膠質(zhì)細胞。在神經(jīng)祖細胞維持培養(yǎng)基中加入10-6M T3(產(chǎn)品編號為#T5516，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，神經(jīng)球可進一步分化成少突膠質(zhì)細胞。分化成少突膠質(zhì)細胞可由髓磷脂堿性蛋白(MBP)(抗MBP單克隆抗體，產(chǎn)品編號為#ab8764，克隆B505，Abcam)的陽性染色來確定。
實施例10MLPC向內(nèi)皮細胞的分化MLPC以每孔1.9×104個細胞的濃度接種到四槽玻片上(2cm2)。細胞用1ml含肝素、牛腦提取物、人重組上皮生長因子和氫化可的松的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基-微脈管系統(tǒng)(EGM3-MV，產(chǎn)品編號為#CC-3125，Cambrex)培養(yǎng)。每2-3更換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)約21天。在7到10天內(nèi)發(fā)生形態(tài)學的改變。MLPC分化成內(nèi)皮細胞系可通過CD62E [E-選擇素，鼠抗人CD62E單克隆抗體，產(chǎn)品編號為#551145，克隆68-5H11，BDPharmingen]和CD102[ICAM-2，抗人ICAM-2單克隆抗體，MAB244，克隆86911，R&D Systems]染色來分析。在MSCGM中生長14天的對照MLPC是CD62E和CD102染色陰性的，而分化的培養(yǎng)物是CD62E和CD102雙陽性的。
實施例11MLPC向肝細胞/胰腺細胞前體細胞的分化MLPC以1×105細胞/cm2的濃度體外接種到HCMTM培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號為#CC-3198，Cambrex)內(nèi)，該培養(yǎng)基含有抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、huEGF、重組人肝細胞生長因子(40ng/mL)、huFGF-basic(20ng/mL)、重組人成纖維細胞生長因子-4(20ng/mL)和干細胞生長因子(40ng/mL)。細胞培養(yǎng)29天或更長時間以使其分化成肝細胞系和胰腺細胞系的前體細胞。MLPC從成纖維細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成肝細胞形態(tài)，表達肝細胞生長因子的細胞表面受體，產(chǎn)生肝細胞的細胞產(chǎn)物人血清白蛋白和胰島細胞的細胞產(chǎn)物胰島素，二者都可以通過在30天時進行細胞內(nèi)抗體染色來確定。
其他實施方式雖然結(jié)合上面的詳細說明和實施例已對本發(fā)明作了描述，但是上述的說明和實施例是為了說明的目的，并不意味著對附屬權利要求所定義的本發(fā)明范圍的限制。其他方面、優(yōu)點及修飾都在權利要求的范圍之內(nèi)。
權利要求
1.人胎兒血多譜系祖細胞(MLPC)的純化群，其特征在于，所述MLPC是CD9和CD45陽性的。
2.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC展示白細胞形態(tài)。
3.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
4.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是SSEA-4陽性的。
5.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD34陽性的。
6.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細胞因子、SSEA-3和CD13陽性的。
7.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。
8.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后獲得成纖維細胞樣形態(tài)。
9.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時粘附到塑料表面。
10.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞。
11.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞和具有胰腺細胞表型的細胞。
12.如權利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
13.如權利要求12所述的MLPC純化群，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
14.人胎兒血MLPC的純化群，其特征在于，所述MLPC是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
15.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC展示成纖維細胞的形態(tài)。
16.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
17.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的。
18.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
19.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時粘附到塑料表面。
20.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞。
21.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞以及具有胰腺細胞表型的細胞。
22.如權利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
23.如權利要求22所述的MLPC純化群，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
24.人胎兒血MLPC的克隆系，其特征在于，所述MLPC是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
25.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC展示成纖維細胞的形態(tài)。
26.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
27.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的。
28.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
29.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時粘附到塑料表面。
30.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個胚層來源的細胞。
31.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細胞表型的細胞、具有脂肪細胞表型的細胞、具有神經(jīng)干細胞表型的細胞、具有肌細胞表型的細胞、具有內(nèi)皮細胞表型的細胞、具有肝細胞表型的細胞以及具有胰腺細胞表型的細胞。
32.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
33.如權利要求32所述的克隆系，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
34.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時至少經(jīng)歷了5次倍增。
35.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時經(jīng)歷了至少8次倍增。
36.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時經(jīng)歷了至少10次倍增。
37.如權利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時經(jīng)歷了至少25次倍增。
38.包含權利要1所述MLPC純化群、權利要求14所述MLPC純化群或權利要求24所述克隆系以及培養(yǎng)基的組合物。
39.如權利要求38所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含冷凍保存液。
40.如權利要求39所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是二甲亞砜(DMSO)。
41.如權利要求40所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是1到10％的DMSO。
42.如權利要求39所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一種或多種物質(zhì)的混合物DMSO、海藻糖和葡聚糖。
43.如權利要求42所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是人血清、DMSO和海藻糖。
44.如權利要求42所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清和DMSO。
45.包含權利要1所述MLPC純化群、權利要求14所述MLPC純化群或權利要求24所述克隆系的制品。
46.如權利要求45所述的制品，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系被盛裝在容器內(nèi)。
47.如權利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器是玻璃瓶。
48.如權利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器是袋子。
49.如權利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器還盛有冷凍保存液。
50.一種從人胎兒血中純化MLPC群的方法，所述方法包括a)使人胎兒血樣本與組合物接觸，所述組合物包含i)葡聚糖；ii)抗血型糖蛋白-A抗體；iii)抗CD15抗體；以及iv)抗CD9抗體；b)使所述樣品分成凝集相和上清相；c)從所述上清相中回收細胞；以及d)通過使MLPC粘附到固體基質(zhì)上從回收的細胞中純化MLPC，其中所述MLPC是CD9和CD45陽性的。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述MLPC還是CD34、CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細胞因子、SSEA-3、SSEA-4和CD13陽性的。
52.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。
53.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述胎兒血樣本是臍帶血。
54.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述固體基質(zhì)是塑料基質(zhì)。
55.如權利要求50所述的方法，所述方法還包括培養(yǎng)所述MLPC使其獲得成纖維細胞表型，其中所述MLPC在獲得所述成纖維細胞表型后是CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
56.如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述MLPC在獲得所述成纖維細胞表型后還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性的。
57.如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述MLPC在獲得所述成纖維細胞表型后還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
58.如權利要求50或55所述的方法，還包括檢測所述MLPC是否表達CD9。
59.如權利要求58所述的方法，還包括檢測所述MLPC是否表達CD29、CD45、CD73和CD90。
60.一種冷凍保存MLPC的方法，所述方法包括a)使權利要求1所述的MLPC純化群、權利要求14所述的MLPC純化群或權利要求24所述的克隆系與冷凍保存液接觸；以及b)冷凍所述MLPC純化群或所述克隆系。
61.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是DMSO。
62.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一種或多種物質(zhì)的混合物DMSO、海藻糖和葡聚糖。
63.如權利要求62所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是人血清、DMSO和海藻糖。
64.如權利要求62所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清和DMSO。
65.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系以1×105到5×107細胞/毫升的濃度懸浮在所述冷凍保存液中。
66.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系以可控速度冷凍。
67.如權利要求66所述的方法，其特征在于，所述冷凍速度是電控制的。
68.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系通過放置在液氮冷凍儲藏罐的蒸汽相中進行乙醇浴而冷凍。
69.一種制備分化細胞群的方法，所述方法包括用有效誘導MLPC分化的試劑培養(yǎng)權利要1所述的MLPC純化群、權利要求14所述的MLPC純化群或權利要求24所述的克隆系。
70.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含胰島素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤。
71.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含地塞米松、谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油。
72.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含上皮生長因子、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細胞生長因子。
73.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、NSF-1和視黃酸。
74.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含肝素、牛腦提取物、上皮生長因子和氫化可的松。
75.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-4和干細胞生長因子。
全文摘要
本發(fā)明描述了能夠廣譜轉(zhuǎn)分化的胎兒血多譜系祖細胞。
文檔編號C12N5/02GK101080486SQ200580012739
公開日2007年11月28日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權日2004年4月23日
發(fā)明者D·P·柯林斯, S·L·斯普拉格, B·M·蒂格斯 申請人:佰歐益股份有限公司