專利名稱：9－脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
背景技術(shù)：
用作食品和食品原料的谷類含有脂質(zhì)和脂肪酸。這些脂質(zhì)和脂肪酸在加工和保存時由于谷類中所含的脂肪加氧酶或空氣中的氧氣引起的自動氧化而被氧化，生成脂質(zhì)氫過氧化物和脂肪酸氫過氧化物。這些氫過氧化物由于熱分解、化學(xué)分解和酶引發(fā)的分解等而生成醛，生成的醛具有木腥氣味和脂肪酸臭味，因此明顯有損谷類的香味(非專利文獻1)。
醛類中，已知反式-2-壬烯醛是感覺到臭味的閾值較低的醛，被認為是長期保存而劣化的啤酒的老化臭味的原因物質(zhì)(非專利文獻2)和因加工或保存而品質(zhì)劣化的米所具有的令人不快的臭味的原因物質(zhì)(非專利文獻3和4)。
例如，啤酒中反式-2-壬烯醛的生成機理如下所示(非專利文獻5)。啤酒釀造中有使麥芽糖化而獲得麥汁的下料工序，該工序中生成作為脂肪酸氫過氧化物之一的9-亞油酸氫過氧化物。接著，生成的9-亞油酸氫過氧化物經(jīng)麥芽等啤酒原料中所含的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶引起的裂解，生成反式-2-壬烯醛。
對植物活體的醛合成中由氧脂素(oxylipin)合成體系承擔(dān)的部分反應(yīng)在雙子葉植物中進行了詳細的研究(非專利文獻6)。醛通過脂肪加氧酶和脂肪酸氫過氧化物裂合酶的級聯(lián)反應(yīng)而生成，但脂肪酸氫過氧化物裂合酶被認為是對該反應(yīng)體系的限速步驟進行催化的酶。醛類中，已知反式-2-壬烯醛是9-亞油酸氫過氧化物通過9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的裂解反應(yīng)催化作用而生成(非專利文獻7)，9-亞油酸氫過氧化物裂合酶基因的結(jié)構(gòu)也已經(jīng)清楚(非專利文獻8)。
另一方面，對水稻、小麥等單子葉植物的研究不充分，僅在大麥中分離出脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。但是，該脂肪酸氫過氧化物裂合酶無法將9-亞油酸氫過氧化物作為底物，因此與反式-2-壬烯醛的生成完全沒有關(guān)系(非專利文獻9)。
非專利文獻1J.Bruce German，食品加工和脂類氧化(Food Processing andLipid Oxidation).加工對食品安全的影響(Impact of Processing on FoodSafety)，Kluwer Academic/Plenum Publishers，紐約，1999非專利文獻2Drost，B.W.等，香味穩(wěn)定性(Flavor stability).J.Am.Soc.Brew.Chem.，48，124-131.1990非專利文獻3Suzuki等，種子中存在或不存在脂肪加氧酶-3時的各種貯藏大米中的揮發(fā)性成分(Volatile components in stored rice(Oryza sativa(L.)of varieties with and without lipoxygenase-3 in seeds))，J.Agric.Food.Chem.，471119，1999非專利文獻4Lam.H.S.和Proctor A.，精米氧化揮發(fā)成分和臭味的形成(Milled Rice Oxidation Volatiles and Odor Development)，Journal of FoodScience，682676-2681，2003非專利文獻5Kuroda等，糖化時2(E)-壬烯醛的生成所涉及的因子的鑒定(Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenalduring mashing)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67691-697，2003非專利文獻6Blee，E.，植物氧脂素和植物防御反應(yīng)(Phytooxylipins andplant defence reactions)，Prog.Lipid Res.，37，33-72，1998非專利文獻7Matsui等，來源于黃瓜的脂肪酸9-和13-氫過氧化物裂合酶(Fatty acid 9-and 13-hydroperoxide lyases from cucumber)，F(xiàn)EBS Lett.481，183-8，2000非專利文獻8Matsui，K.等，甜椒脂肪酸氫過氧化物裂合酶是一種細胞色素P450(CYP74B)(Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is acytochrome P450(CYP74B)).FEBS Lett.，394，21-24，1996非專利文獻9Koeduka等，大麥脂肪酸氫過氧化物裂合酶的動力學(xué)受到鹽和去污劑的調(diào)控(Kinetics of barley FA hydroperoxide lyase are modulatedby salts and detergents)，Lipids，381167-1172，2003發(fā)明的揭示如果清楚了單子葉植物的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，則可發(fā)現(xiàn)限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)，篩選出9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶缺失的品種或9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的穩(wěn)定性和活性低的品種。此外，通過以RNA干擾(RNAi)為代表的基因抑制技術(shù)等，可以培育出9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的活性受到抑制的品種。
因此，本發(fā)明的目的在于弄清單子葉植物的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
隨著近年來基因組技術(shù)的進展，逐步積累了充足的基因信息，可以基于已知的基因信息而抽提出與之類似的基因，但特別指定催化作用、特別是生成物的情況下，就現(xiàn)有的技術(shù)而言，還非常困難。脂肪酸氫過氧化物裂合酶屬于細胞色素P-450家族，但該家族由數(shù)千種相似基因的群構(gòu)成，無法通過基因序列的相似性來推定酶蛋白質(zhì)的功能。
因此，本發(fā)明者以與水稻相關(guān)的基因公開信息為基礎(chǔ)，篩選出多個與脂肪酸氫過氧化物裂合酶具有相似性的基因，使各基因表達，考察其功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因和由序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成的基因?qū)?-亞油酸氫過氧化物轉(zhuǎn)化為反式-2-壬烯醛，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。此外，本發(fā)明提供編碼由序列編號2所示的氨基酸序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
本發(fā)明還提供由序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。此外，本發(fā)明提供編碼由序列編號6所示的氨基酸序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
若以本發(fā)明的基因為指標(biāo)，可以篩選出9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的穩(wěn)定性和活性低的品種。此外，通過控制或改變本發(fā)明基因的表達，可以培育出9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的穩(wěn)定性和活性低的品種。因此，可以提供香味得到保持的食品。
附圖的簡單說明

圖1為與AK105964和AK107161相關(guān)的分子系統(tǒng)樹。
圖2(a)為使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達而得到的蛋白質(zhì)與9-亞油酸氫過氧化物的反應(yīng)生成物的GC-MS的總離子流色譜圖。圖2(b)為陰性對照的總離子流色譜圖(total ion chromatogram)。
圖3為峰1的質(zhì)譜圖。
圖4為表示使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達而得到的蛋白質(zhì)與9-亞油酸氫過氧化物反應(yīng)生成的反式-2-壬烯醛的圖。
圖5(a)、(b)和(c)分別為13-HPOD、9-HPOT和13-HPOT與使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達而得到的蛋白質(zhì)的反應(yīng)生成物的GC-MS的總離子流色譜圖。
符號說明1表示反式-2-壬烯醛，2表示1-壬醇(內(nèi)標(biāo)物)。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因來源于水稻，由序列表的序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成。此外，該基因編碼的多肽、即9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶由序列表的序列編號2所示的氨基酸序列構(gòu)成。另外，本發(fā)明的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因來源于水稻，由序列表的序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成。此外，該基因編碼的多肽、即9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶由序列表的序列編號6所示的氨基酸序列構(gòu)成。9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶能將9-亞油酸氫過氧化物轉(zhuǎn)化為作為老化臭味的原因物質(zhì)的反式-2-壬烯醛。因此，通過抑制本發(fā)明基因的表達或改變本發(fā)明的基因，可以保持谷類的香味，可以將本發(fā)明的基因用于這樣的目的。
例如，有通過利用RNAi或反義RNA控制本發(fā)明基因的表達而保持谷類的香味的方法。此外，也可以利用位點特異性誘變等，制成反式-2-壬烯醛生成活性低下的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，將該基因?qū)牍阮愔?，從而培育出可以保持香味的谷類。作為?dǎo)入方法，可以例舉農(nóng)桿菌法、原生質(zhì)體法、PEG法、電穿孔法、基因槍法、顯微注射法等。
本發(fā)明的基因可以從表達該基因的水稻(例如日本晴(Oryza sativa L.)等品種)的種子等通過RT-PCR法得到。更具體地，通過AGPC法或胍·氯化銫超離心法等從水稻的種子中提取RNA，將得到的RNA作為模板進行PCR，從而可以獲得本發(fā)明的基因。
另外，通過位點特異性誘變法等，也可以合成作為本發(fā)明基因的突變型的編碼9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶的基因。作為在核酸中導(dǎo)入突變的方法，可以例舉Kunkel法、缺口雙鏈體(gapped duplex)法等公知的方法。例如，使用采用位點特異性誘變法的突變導(dǎo)入用試劑盒(Mutan-K和Mutan-G等；TAKARA)等，或者LA PCR體外誘變系列試劑盒(TAKARA)，來進行突變的導(dǎo)入。
實施例
(實施例1)利用基因功能已知的大麥13-脂肪酸氫過氧化物裂合酶(CAC82980)、大麥水稻氧化丙二烯合成酶(CAB86383、CAB86384)和水稻氧化丙二烯合成酶(Q8VZX5、Q940D7)，在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心，National Center forBiotechnology Information)和KOME(水稻分子生物學(xué)百科全書，Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia)的數(shù)據(jù)庫中，使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST程序，將E-value＝e-10設(shè)定為閾值，篩選與上述基因具有同源性的蛋白質(zhì)。
其結(jié)果，新篩選出水稻cDNA，即AK105964和AK107161。用ExPASy分子生物學(xué)服務(wù)器上的ClastaIW制成分子系統(tǒng)樹，得到圖1所示的分子系統(tǒng)樹。如圖1所示，新篩選出的2個基因被分類到與氧化丙二烯合成酶基因(AOS)和13-脂肪酸氫過氧化物裂合酶(13-HPL)這兩個明顯不同的組中，推測其具有與AOS和13-HPL不同的酶功能。AK105964和AK107161具有非常相似的結(jié)構(gòu)，所以對AK105964進行了進一步的功能分析。
(實施例2)從水稻種子(品種日本晴)中用Tripure分離試劑(羅氏)提取總RNA后，使用Oligotex-dT30 mRNA純化試劑盒(TAKARA BIO)生成PolyA+RNA。使用兩個引物(5′-gcggatccatggcgcgccgccgcgagccaa-3′(序列編號3)和5′-gcgaattcccgcaccaacactcgccgctc-3′(序列編號4))進行RT-PCR，亞克隆到pUC118中。進行全長序列的測序，確認序列與AK105964一致。接著，將AK105964的結(jié)構(gòu)基因亞克隆到pRSETA(Invitrogen)的BamH I位點和EcoR I位點之間，導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLys中。
大腸桿菌中的表達和粗提取液的制備使用Kuroda等，麥芽汁中將亞油酸轉(zhuǎn)化為二羥基十八烯酸和三羥基十八烯酸的因子的鑒定(Charaterization offactors that transform linoleic acid into di-and trihydroxyoctadecenoicacids in mash)，J.Biosci.Bioeng.，9373-77，2002中所記載的方法。具體來說，首先于16℃下在50mL預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液(OD600＝0.5)中添加異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷，使最終濃度為1mM。再培養(yǎng)16小時，將大腸桿菌細胞通過離心分離回收后，加入5mL含有0.1％的Tween20的10mM的Tris鹽酸緩沖液(pH7.2)，使其懸浮。將細胞懸浮液通過超聲波破碎使細胞可溶化，離心分離30分鐘后(15000g，4℃)，回收上清，得到粗提取液。作為對照樣品，準(zhǔn)備導(dǎo)入了pRSETA的BL21(DE3)pLys，以與上述同樣的條件制備粗提取液。
脂肪酸氫過氧化物裂合酶的活性測定以Kuroda等，糖化時2(E)-壬烯醛的生成所涉及的因子的鑒定(Characterization of factors involved in theproduction of 2(E)-nonenal during mashing)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67691-697，2003中所記載的方法進行。具體來說，在5μL粗提取液中加入含有0.1％的Tween20的10mM的Tris鹽酸緩沖液(pH7.2)，定容到100μL，添加5μL溶解有9-亞油酸氫過氧化物(2mM)的乙醇，在30℃下保溫5分鐘后，加入900μL乙醇，停止反應(yīng)。將反應(yīng)物移入添加了30g氯化鈉和5mL蒸餾水的管瓶中，作為內(nèi)標(biāo)加入1ppm的1-壬醇(乙醇溶液)后加蓋。
采用氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)的定量和化合物的鑒定如下進行。將聚二甲基硅氧烷SPME纖維(SUPELCO)插入到管瓶中，在40℃下保溫10分鐘后，供于氣相色譜(惠普HP6890/MSD系統(tǒng))的注射孔(260℃)。毛細柱使用DB-1(30m×0.25mm，膜厚1μm，J&W公司)，載氣使用氦氣(1mL/分鐘)。加熱爐條件為120℃下保持1分鐘，以5℃/分鐘升溫至150℃，以40℃/分鐘升溫至300℃，在300℃下保持2分鐘。反式-2-壬烯醛和1-壬醇的定量以選擇離子模式(m/z)的條件進行分析。反式-2-壬烯醛和1-壬醇的保留時間分別為7.6分和7.8分。GC-MS分析中，如上所述進行氣相色譜，使用HP-Chemistation的軟件和化合物數(shù)據(jù)庫進行生成物的MS/MS分析和化合物的鑒定。
圖2(a)為表示使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達而得到的蛋白質(zhì)與9-亞油酸氫過氧化物的反應(yīng)生成物的GC-MS的結(jié)果的圖(總離子流色譜圖)。此外，圖2(b)為陰性對照的總離子流色譜圖。保留時間7.6分的峰1表示反式-2-壬烯醛，保留時間7.8分的峰2表示內(nèi)標(biāo)物1-壬醇。如圖2所示，只有使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達的情況下，發(fā)現(xiàn)反式-2-壬烯醛的峰。圖3為峰1的質(zhì)譜圖，由該質(zhì)譜圖可知，峰1表示反式-2-壬烯醛。
圖4為表示使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達而得到的蛋白質(zhì)與9-亞油酸氫過氧化物反應(yīng)生成的反式-2-壬烯醛的圖?？v軸表示單位大腸桿菌蛋白質(zhì)(mg)的反式-2-壬烯醛的活性。由圖4可知，只有使由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因表達的情況下生成反式-2-壬烯醛。
對于AK107161也進行了與AK105964同樣的分析。引物使用5′-gccggatccatggcgccaccgccagt-3′(序列編號7)和5′-gccgaattccgcaattaaaacatccaccaacct-3′(序列編號8)，亞克隆到pUC118中。進行全長序列的測序，確認序列與AK107161一致。接著，將AK107161的結(jié)構(gòu)基因亞克隆到pRSETA的BamH I位點和EcoRI位點之間，導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLys中。以下，通過與AK105964同樣的方法，在大腸桿菌中進行表達，制備粗提取液，測定其酶活性，確認AK107161具有與AK105964同樣的活性。
由以上的結(jié)果可知，由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的基因和由序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成的基因是將9-亞油酸氫過氧化物轉(zhuǎn)化為反式-2-壬烯醛的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
(實施例3)以下，對于AK105964(和AK107161)對以下的脂肪酸過氧化物(所有脂肪酸過氧化物都含于水稻中)的催化作用進行分析13(S)-氫過氧化-9(Z)，11(E)-十八碳二烯酸(13-HPOD)、9(S)-氫過氧化-10(E)，12(Z)，15(Z)-十八碳三烯酸(9-HPOT)和13(S)-氫過氧化-9(Z)，11(E)，15(Z)-十八碳三烯酸(13-HPOT)。與實施例2同樣地，使酶提取液和脂肪酸過氧化物反應(yīng)，對得到的生成物用GC-MS進行分析。
得到的色譜圖示于圖5。(a)、(b)和(c)分別與13-HPOD、9-HPOT和13-HPOT反應(yīng)而得到的生成物的GC-MS的色譜圖。如圖5(a)～(c)所示，由13-HPOD生成了己醛，由9-HPOT生成了(2，6)-壬二烯醛，由13-HPOT生成了(3Z)-己烯醛和(2E)-己烯醛。生成的這些醛會成為引起食品的老化臭味的物質(zhì)，可以期待通過用基因抑制技術(shù)抑制AK105964(和AK107161)的表達等來提高米的品質(zhì)。
序列表序列表<110>札幌啤酒株式會社(Sapporo Breweries Ltd.)<120>9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因<130>FP05-0209-00<150>JP 2004-162138<151>2004-05-31<150>JP 2004-318233<151>2004-11-01<150>JP 2004-368306<151>2004-12-20<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1533<212>DNA<213>日本晴水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1533)<223>
<400>1atg gcg ccg ccg cga gcc aac tcc ggc gac ggt aac gac ggc gcc gtc 48Met Ala Pro Pro Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gly Asn Asp Gly Ala Val1 5 10 15gga ggg cag agc aag ctc tcg ccg tcg ggc ctg ctg ata cgc gag att 96Gly Gly Gln Ser Lys Leu Ser Pro Ser Gly Leu Leu Ile Arg Glu Ile20 25 30ccg ggc ggc tac ggc gtg ccc ttc ctc tcg ccg ctg cgc gac cgc ctc 144Pro Gly Gly Tyr Gly Val Pro Phe Leu Ser Pro Leu Arg Asp Arg Leu35 40 45gac tac tat tac ttc cag ggc gcc gac gag ttc ttc cgc tca cgc gtc 192Asp Tyr Tyr Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Glu Phe Phe Arg Ser Arg Val50 55 60gcc cgc cac ggc ggc gcc acc gtg ctc cgc gtc aac atg ccg ccc ggc 240
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<223>AK107161的引物<400>8gccgaattcc gcaattaaaa catccaccaa cct 3權(quán)利要求
1. 9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，其特征在于，由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成。
2.脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，其特征在于，編碼由序列編號2所示的氨基酸序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶。
3. 9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，其特征在于，由序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成。
4.脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因，其特征在于，編碼由序列編號6所示的氨基酸序列構(gòu)成的9-脂肪酸氫過氧化物裂合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及由序列編號1所示的堿基序列構(gòu)成的9－脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因和由序列編號5所示的堿基序列構(gòu)成的9－脂肪酸氫過氧化物裂合酶基因。
文檔編號C12N9/88GK1946846SQ20058001285
公開日2007年4月11日 申請日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者黑田久夫, 金田弘舉, 大嶋利幸 申請人:札幌啤酒株式會社