專利名稱：通過利用兩個染色體外元件在原核細(xì)胞中產(chǎn)生重組基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及在原核細(xì)胞具體是細(xì)菌中產(chǎn)生和檢測重組DNA序列的體內(nèi)方法，所述方法通過利用兩個不同的染色體外元件以及用于進行本發(fā)明方法的染色體外元件具體是質(zhì)粒來進行。這些方法涉及的DNA序列包括蛋白質(zhì)編碼型和非編碼型序列。
背景技術(shù)：
進化是遺傳變異以及表型選擇的連續(xù)過程。群體的遺傳多樣性可通過產(chǎn)生新的突變體組合來擴增，以改進群體內(nèi)個體的表現(xiàn)。微生物的定向進化通過連續(xù)隨機誘變和篩選經(jīng)由經(jīng)典菌株改進的過程常規(guī)實現(xiàn)。
定向進化目前幾乎只被用作改造蛋白質(zhì)的工具。通過突變技術(shù)諸如定點誘變，盒式誘變，隨機誘變以及易錯PCR已經(jīng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體，并且已經(jīng)篩選由此產(chǎn)生的文庫中的蛋白質(zhì)執(zhí)行具體功能的能力。該方法的循環(huán)應(yīng)用已經(jīng)成功用于改造酶的物理和催化性質(zhì)，諸如pH最佳值，耐熱性，溶劑穩(wěn)定性，等電點選擇性，催化活性，底物特異性以及細(xì)菌中的毒性抗性機制以及病毒的宿主范圍和穩(wěn)定性。
產(chǎn)生出酶的新性質(zhì)的常規(guī)誘變方法有很多限制。這些方法僅適用于已經(jīng)被克隆并且在功能上定性且具有離散功能的基因或序列。此外，常規(guī)誘變方法僅開發(fā)出數(shù)量非常有限的改變(permutation)總數(shù)，甚至對于單個基因也如此。但是，在特定環(huán)境下可能需要不僅修飾一個基因，還要修飾其它基因，以表達具有新性質(zhì)的蛋白質(zhì)。所述其它基因可為例如協(xié)同賦予單個表型的基因或在一或多種細(xì)胞機制諸如轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、分泌或基因產(chǎn)物的蛋白水解降解中起作用的基因。意圖通過常規(guī)誘變方法分別最優(yōu)化所有具有所述功能的基因?qū)⑹鞘聦嵣喜豢赡艿娜蝿?wù)。
大多數(shù)與常規(guī)誘變方法相關(guān)的問題可通過需要隨機組合不同的功能基因序列的重組方法克服，從而在分子水平混合天然類似的或隨機誘變的基因。與利用重組的常規(guī)誘變相比，獲得具有改進的表型的突變體的可能性明顯更高。重組方法相比于常規(guī)DNA操作技術(shù)的主要優(yōu)勢具體在于試驗的簡單性以及沒有DNA序列導(dǎo)致的限制。
對于重組方法的許多認(rèn)識來自對簡單的單細(xì)胞生物體諸如細(xì)菌的研究。所述生物體中重組的研究的優(yōu)勢在于很容易操作DNA序列以及研究在大部分細(xì)胞中同步誘導(dǎo)的特異性重組事件的可能性。同樣重要的是逐漸確信(growing conviction)在微生物中研究的過程在許多方面與哺乳動物細(xì)胞例如人細(xì)胞產(chǎn)生遺傳多樣性的途徑是相同或相似的。此外，定義這些機制使得在哺乳動物細(xì)胞中開發(fā)更有效的基因靶向和基因置換機制的需要更為重要。
盡管存在在原核細(xì)胞中實施重組的多種不同系統(tǒng)，其中的大多數(shù)不允許方便且可信地檢測新重組的DNA序列。因此，本領(lǐng)域仍然需要有效的原核檢測系統(tǒng)，其具體允許快速并簡便地檢測重組體和/或在選擇壓力下選擇重組體。
因此，本發(fā)明的技術(shù)問題是提供改進的方法和手段以簡單并有效地在原核細(xì)胞中產(chǎn)生重組嵌合基因，具體用于篩選和檢測所述重組序列。
本發(fā)明通過提供用于在原核生物中產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的方法解決該技術(shù)問題，包括以下步驟a)產(chǎn)生含有受體DNA分子以及供體DNA分子的第一原核細(xì)胞，所述受體DNA分子包含待重組的第一DNA序列并可在所述原核細(xì)胞中自主復(fù)制，所述供體DNA分子包含待重組的第二DNA序列以及編碼基因產(chǎn)物的至少第一標(biāo)記序列并不能在原核細(xì)胞中自主復(fù)制，b)如果第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物被表達，在僅允許細(xì)胞的生長和增殖的選擇性條件下培養(yǎng)第一原核細(xì)胞，和c)分離第二原核細(xì)胞，其在選擇性條件下生長和/或增殖，并且由于第一和第二DNA序列之間的重組，含有具有至少第一標(biāo)記序列以及第一和第二重組的DNA序列的雜合DNA分子。
本發(fā)明提供用于在體內(nèi)篩選至少兩種趨異或異源的DNA序列或重組基質(zhì)之間的重組事件的原核系統(tǒng)。通過涉及來自包含待重組的兩個DNA序列的兩個染色體外元件的DNA的體內(nèi)交換的方法，本發(fā)明的系統(tǒng)允許以快速且有效的方式從至少兩個趨異的DNA序列產(chǎn)生具有改進的性質(zhì)的新的優(yōu)勢DNA序列。其核苷酸序列不顯示同源性的兩個染色體外元件以受體DNA分子和供體DNA分子的形式導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞。受體分子可在訴諸中自主復(fù)制，而供體分子沒有復(fù)制能力。但是，供體分子含有至少一種獨特的蛋白編碼型標(biāo)記序列，諸如抗生素抗性標(biāo)記或營養(yǎng)標(biāo)記，其既不存在宿主細(xì)胞的基因組中，也不存在受體分子中。將兩種染色體外元件導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞后，所述細(xì)胞在強制進行兩種異源基因的重組的條件下培養(yǎng)。這些條件可包括例如在存在細(xì)胞通常對其敏感的抗生素的條件下進行培養(yǎng)和在缺乏必要營養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞自身不能合成所述必要營養(yǎng)素并且由此必需從外部添加。在所用的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞僅可生長和繁殖，即分裂，條件是選擇性標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物得以表達。但標(biāo)記序列的表達的前提是非復(fù)制型供體分子和復(fù)制型受體分子形成共整合子，其可從受體分子的起點復(fù)制并由此保證保持標(biāo)記序列。該共整合子的形成是兩種重組基質(zhì)之間的重組的結(jié)果，導(dǎo)致產(chǎn)生新的DNA分子，其序列與親本DNA序列不同。該創(chuàng)造性方法由此提供簡單和快速的選擇系統(tǒng)來鑒定重組DNA序列。利用該創(chuàng)造性方法，重組的突變DNA序列可大文庫可輕易產(chǎn)生，隨后可利用適宜的選擇或篩選系統(tǒng)鑒定具有獲得的所需功能的變體。
在簡單的單細(xì)胞生物體諸如原核生物中對重組過程的研究具有明顯的優(yōu)勢，即DNA序列操作容易以及研究在大部分細(xì)胞中同步誘導(dǎo)的具體重組事件的可能性。此外，最近幾十年來，在發(fā)酵技術(shù)以及原核生物體的基本遺傳學(xué)中積累了大量專業(yè)知識。原核宿主細(xì)胞的另一主要優(yōu)勢涉及其非常短的倍增時間。由此，通過利用原核宿主細(xì)胞，可進行許多輪細(xì)胞分裂由此進行多輪重組并在短時間內(nèi)產(chǎn)生多種新的重組DNA序列。
本發(fā)明的方法可在野生型或錯配修復(fù)缺陷的原核細(xì)胞中進行。使得受損DNA得以修復(fù)的方法與遺傳重組的機制緊密相關(guān)；并且已知錯配修復(fù)機制對于不同序列之間的重組即部分同源重組的頻率有抑制性效應(yīng)。錯配修復(fù)系統(tǒng)的突變由此大大促進原核細(xì)胞中重組事件的總體頻率。另一方面，已知原核野生型細(xì)胞具有錯配修復(fù)依賴性重組機制，其基于兩種重組基質(zhì)中間隔一段距離的錯配。根據(jù)待重組的DNA序列，無論是野生型或錯配修復(fù)缺陷原核細(xì)胞可用于獲得重組的序列。
本發(fā)明用于產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的方法具有這樣的優(yōu)勢，即差異很大的DNA序列可被重組。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)具有高總體差異程度并僅共享非常短的同源或相同片段的序列可被重組。對重組序列的分析揭示了其中出現(xiàn)重組的最長的同一性片段僅包括18-22個核苷酸。大多數(shù)重組事件出現(xiàn)在長度為10-15個核苷酸的同源片段中。一些情況中，重組出現(xiàn)在長度僅為4-5個核苷酸的片段中。
因此，本發(fā)明的方法允許源自不同原核物種或不同原核屬的DNA序列的重組，以產(chǎn)生具有優(yōu)勢性質(zhì)的重組DNA序列。
本發(fā)明產(chǎn)生和檢測重組的DNA序列的方法的優(yōu)勢在于超過兩種不同的序列可被重組，由此所述待重組的兩種不同的序列可為預(yù)選出的或非選出的序列。
例如多種不同DNA序列直到整個基因文庫可被插入受體以及供體DNA分子。隨后，單獨的不同DNA序列可彼此重組。還可能將第一套不同的DNA序列直到整個基因文庫僅僅插入受體DNA分子中，并將第二套不同的DNA序列直到整個基因文庫插入供體DNA分子中或反之，然后將這兩組進行重組。在兩種情況下，對于哪對不同的DNA序列將被重組沒有選擇。
然而，可能將多種，優(yōu)選預(yù)選出的不同序列以逐步的方式進行重組，由此每個步驟中，對哪對應(yīng)當(dāng)重組的不同的DNA序列進行選擇。如果，例如，三種待重組的不同的DNA序列應(yīng)當(dāng)被重組，而不是第一步中第一原核細(xì)胞被產(chǎn)生，由此例如，具有待重組的第一DNA序列的受體DNA分子以及具有待重組的第二DNA序列的供體DNA分子被導(dǎo)入給定物種的細(xì)菌種類。這些原核細(xì)胞在選擇性條件下培養(yǎng)，使得只有這樣的細(xì)胞生長并增殖，其中不同的受體和供體DNA分子形成雜合分子，使得能夠表達供體分子的標(biāo)記序列并且兩種待重組的DNA序列能夠重組。由此，獲得含有由于重組具有第一和第二重組DNA序列的雜合分子的第二原核細(xì)胞。分離第一和第二重組序列并將其中之一插入例如受體分子，而待重組的第三DNA序列被插入供體分子。隨后，在下一步中，包含重組序列之一的受體分子以及包含待重組的第三DNA序列的供體分子再次被導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞并進行另一輪重組。
如果，例如，四種不同的DNA序列將進行重組，則在第一步中產(chǎn)生兩組不同的第一原核細(xì)胞。例如，第一組的第一原核細(xì)胞可通過將具有待重組的第一DNA許蘭列的受體DNA分子和具有待重組的第二DNA序列的供體DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞來產(chǎn)生。同樣，第二組第一原核細(xì)胞可通過將具有待重組的第三DNA序列的受體DNA分子以及具有待重組的第四DNA序列的供體DNA分子導(dǎo)入相同物種的細(xì)胞來產(chǎn)生。每組原核細(xì)胞在可實現(xiàn)重組的選擇性條件下培養(yǎng)。由此，獲得具有由于第一和第二待重組DNA序列之間的重組產(chǎn)生的具有第一和第二重組的DNA序列的雜合分子的第一組原核細(xì)胞。還獲得另一組原核細(xì)胞，其含有由于待重組的第三和第四DNA序列之間的重組產(chǎn)生的具有第三和第四重組DNA序列的雜合分子。然后，由此獲得的所述第一、第二、第三和第四重組DNA序列自其分別的宿主細(xì)胞分離。另一步驟中，所述第一或第二重組序列可被插入供體DNA分子，第三和第四重組序列可被插入受體DNA分子。由此獲得的供體和受體DNA分子隨后被引入原核宿主細(xì)胞，并接受另一輪重組。由此，第五、第六和更多的不同DNA序列也可被重組。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述供體DNA分子和受體DNA分子是不同的線性或環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)。術(shù)語“DNA結(jié)構(gòu)”指DNA分子，例如載體諸如質(zhì)?；蚴删w，其特征在于其在導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞時呈現(xiàn)染色體外元件的形式。本發(fā)明中，“染色體外元件”是不整合入原核宿主細(xì)胞的染色體的DNA分子。
供體DNA分子必須能夠與受體DNA分子雜交，由此可形成雜合分子。優(yōu)選，供體DNA分子和受體DNA分子不共享同源性，除非待重組的DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明，受體DNA分子必須能夠在導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞后在其中自主復(fù)制。由此受體DNA分子必須具有至少一個復(fù)制起點，使得受體DNA分子能夠獨立于宿主遺傳物質(zhì)而進行復(fù)制。本發(fā)明中，“復(fù)制起點”或“ori”是細(xì)胞酶用于啟動DNA分子復(fù)制的DNA分子的區(qū)域。在起點，DNA的兩條鏈被拉開形成復(fù)制泡(bubble)，在泡的每側(cè)產(chǎn)生單鏈DNA區(qū)域。DNA聚合酶裝置可隨后移動進入其中，并開始合成新的DNA鏈，利用舊的鏈作為模板。包括細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w的小的DNA通常具有單個起點。
本發(fā)明的實施方案中，受體DNA分子是質(zhì)粒，具體是雙鏈環(huán)狀DNA分子。“質(zhì)?！笔侨旧w外元件，其可獨立于宿主遺傳物質(zhì)進行復(fù)制。本發(fā)明另一實施方案中，受體DNA分子是噬菌體，具體是以染色體外元件的形式存在原核細(xì)胞中的DNA的噬菌體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，受體DNA分子是質(zhì)粒，其可在大腸桿菌宿主細(xì)胞中復(fù)制。優(yōu)選，受體DNA分子是大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或其衍生物，質(zhì)粒pACYC184是TetR和CamR。
本發(fā)明中，供體DNA分子是不能在原核宿主細(xì)胞中復(fù)制但能夠與受體DNA形成雜合分子的DNA分子。因此，制藥含有至少標(biāo)記序列并且不能在給定的原核宿主細(xì)胞中獨立復(fù)制，任何DNA分子可用作供體分子。適宜供體分子包括，但不限于，線性雙鏈DNA，其可環(huán)化，例如通過PCR產(chǎn)生并含有適宜標(biāo)記序列，質(zhì)粒和噬菌體。如果質(zhì)粒和噬菌體用作供體DNA分子，該分子可根本不具有復(fù)制的功能起點或具有在所用的原核宿主細(xì)胞中沒有功能即無活性的復(fù)制起點。
因此，本發(fā)明的一個實施方案中，供體DNA分子含有復(fù)制起點。這意味著，供體DNA分子不含有任何可在任何原核宿主細(xì)胞中作為復(fù)制起點起作用的序列，即參與復(fù)制起始的蛋白質(zhì)因子可結(jié)合的序列。缺乏復(fù)制起點可由于缺失起起點作用的核酸序列。
本發(fā)明另一實施方案中，供體DNA分子的復(fù)制起點的功能被一或多種消除復(fù)制起點本身的功能或參與復(fù)制的蛋白質(zhì)的功能的突變損害，具體是與起點的核酸序列結(jié)合的那些蛋白質(zhì)，由此啟動復(fù)制。例如已知大腸桿菌中，復(fù)制啟動的關(guān)鍵蛋白DnaA在復(fù)制染色體起點結(jié)合特異性序列即所謂的DnaA-盒子并融化三種富含AT的13mer直接重復(fù)。DnaA蛋白還結(jié)合開放區(qū)中單鏈6mer盒子，這被認(rèn)為可穩(wěn)定所述開放復(fù)合物(參見Jiang etal，PNAS，100(2003)，8692-8697)。DnaA盒子以及富含AT的區(qū)域通常見于多種原核復(fù)制子的起點，DnaA蛋白質(zhì)顯示在這些起點處在復(fù)制啟動中起重要作用。因此，DnaA盒子和/或AT富含區(qū)或復(fù)制起點的序列中的相應(yīng)位點的一些突變諸如適宜堿基取代，缺失等可防止復(fù)制啟動所需蛋白質(zhì)的結(jié)合，由此抑制染色體外元件的功能。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，供體DNA分子的復(fù)制起點的功能可受到供體DNA分子的復(fù)制起點的核酸序列中一或多種突變的損害，具體是DnaA盒子中和/或起點的AT富含區(qū)域中。
此外，已知單獨的DnaA蛋白不足以在質(zhì)粒的起點形成開放復(fù)合體，所述質(zhì)粒諸如RK2，P1，F(xiàn)，pSC101或R6K。在這些情況中，有效形成開發(fā)復(fù)合體需要質(zhì)粒Rep蛋白的結(jié)合，盡管與宿主DnaA蛋白和HU或IHF(整合的宿主因子)蛋白一起。開放復(fù)合體形成的質(zhì)粒特異性啟動蛋白需要是質(zhì)粒對其復(fù)制起點的啟動事件的頻率進行控制的關(guān)鍵(參見Jiang etal.，PNAS，100(2003)，8692-8697)。這意味著，編碼在質(zhì)粒復(fù)制中具有重要功能的蛋白質(zhì)因子的質(zhì)粒核酸序列的突變也可損害染色體外元件的復(fù)制起點的功能。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，供體DNA分子的復(fù)制起點可被編碼在供體DNA分子的復(fù)制中具有重要功能的蛋白質(zhì)因子的核酸序列中的一或多種突變損害。
本發(fā)明另一實施方案中，供體DNA分子含有這樣的復(fù)制起點，其僅在一些原核宿主細(xì)胞中有活性，但在導(dǎo)入了所述供體DNA分子的原核細(xì)胞中無活性，從而實現(xiàn)待重組的兩種DNA序列的重組。有許多報道稱，在具體的細(xì)菌種類中有活性的復(fù)制起點不在另一種細(xì)菌種類中起作用。例如已知肺炎克雷伯氏菌的復(fù)制起點(oriC)在Caulobacter crescent、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)或Rhodobacter sphaeroides(O′Neill和Bender，J.Bacteriol.，170(1988)，3774-3777)中無活性。還已知枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒不能在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制。優(yōu)選實施方案中，供體DNA分子和/或其復(fù)制起點源自除其細(xì)胞中導(dǎo)入了該供體DNA分子的原核物種以外的原核生物。
具體的優(yōu)選實施方案中，所述供體DNA分子是枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91，其為質(zhì)粒plL253的衍生物并可在大腸桿菌中復(fù)制，并包含specR標(biāo)記，phleoR標(biāo)記和限制位點ScaI，PpuMI和EcoO109I，用于插入外來DNA序列。另一具體優(yōu)選實施方案中，供體DNA分子是枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101，其為質(zhì)粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢桿菌中復(fù)制但不能在大腸桿菌中復(fù)制，并且包含specR標(biāo)記，phleoR標(biāo)記以及限制位點XhoI以及PstI用于插入外來DNA序列。
本發(fā)明另一實施方案中，供體DNA分子的復(fù)制起點僅僅在具體的溫度范圍內(nèi)起作用，例如在低于45℃。如果供體DNA分子含有所述溫度敏感起點，其將不能在非容許性條件即高于45℃的溫度下復(fù)制，但允許原核宿主細(xì)胞的生長。
本發(fā)明術(shù)語“標(biāo)記序列”指在給定的原核細(xì)胞中獨一無二避過那且位于供體DNA分子和受體DNA分子上的DNA序列，優(yōu)選位于重組基質(zhì)的上游或下游，或已經(jīng)重組的DNA序列。標(biāo)記序列在相同DNA分子殺過那存在，這是由于重組基質(zhì)或已經(jīng)重組的DNA序列，優(yōu)選與另一標(biāo)記序列組合，其可位于重組基質(zhì)的另一側(cè)，允許重組基質(zhì)或已經(jīng)重組的DNA序列被識別并選擇，所述選擇可通過分子或遺傳學(xué)方法。
本發(fā)明的供體DNA分子包含第一標(biāo)記序列，其允許選擇參與重組基質(zhì)的交叉。所述第一標(biāo)記序列，優(yōu)選與其它存在供體DNA分子或受體DNA分子上的其它標(biāo)記序列組合，也允許其它輪的重組以重復(fù)的方式進行。
本發(fā)明的“第一標(biāo)記序列”是編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，其基因產(chǎn)物對于原核宿主細(xì)胞在所用選擇性條件下的生長和繁殖是必要的。第一標(biāo)記序列選自以下物質(zhì)組成的組營養(yǎng)標(biāo)記，抗生物抗性標(biāo)記，以及編碼僅兩個或多個亞基在相同細(xì)胞中表達的條件下起作用的酶的亞基的序列。
“營養(yǎng)標(biāo)記”是編碼可補償生物體或細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型的基因產(chǎn)物并由此可賦予所述營養(yǎng)缺陷型生物體或細(xì)胞原營養(yǎng)的標(biāo)記序列。本發(fā)明術(shù)語“營養(yǎng)缺陷型”意指有機體或細(xì)胞必須在含有不能由所述營養(yǎng)缺陷型生物體自身合成的必須營養(yǎng)的培養(yǎng)基中生長。營養(yǎng)標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物促進營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞中缺乏的必須營養(yǎng)素的合成。因此，一旦營養(yǎng)標(biāo)記基因得以表達，不需要將該必需營養(yǎng)素添加到所述生物體或細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中，這是由于所述生物體或細(xì)胞已經(jīng)獲得了原營養(yǎng)。
“抗生素抗性標(biāo)記”是標(biāo)記基因，其中基因產(chǎn)物在表達時賦予所述抗生素標(biāo)記基因在其中表達的細(xì)胞在存在給定濃度的給定抗生素的培養(yǎng)基中生長，而不具有所述抗生素抗性標(biāo)記的細(xì)胞則不能。
“編碼酶亞基的序列”可用作標(biāo)記序列，條件是所述細(xì)胞不能合成完整酶結(jié)構(gòu)的組裝由此獲得酶的完整活性所需的酶的所有亞基，并且如果存在或缺失酶活性可通過遺傳和/或分子手段監(jiān)控。如果，例如酶的活性是細(xì)胞的重要生化途徑所需的，其使得細(xì)胞能在具體環(huán)境中生長和/或增殖，則細(xì)胞不能合成完整酶結(jié)構(gòu)的所有組分，則細(xì)胞不能在所述環(huán)境中生存。用作標(biāo)記序列的“編碼酶亞基的序列”在表達時允許完整酶的組裝以及細(xì)胞的存活。
優(yōu)選，第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予抗生素敏感性細(xì)胞以對抗生素的抗性。具體地，所述第一標(biāo)記序列是specR，其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對壯觀霉素的抗性，phleoR，其基因產(chǎn)物賦予對腐草霉素的抗性，或tcR，其基因產(chǎn)物賦予對四環(huán)素的抗性。
本發(fā)明另一實施方案中，所述供體DNA分子含有第二標(biāo)記序列。本發(fā)明另一實施方案中，所述受體DNA分子含有第三標(biāo)記序列以及可選的第四標(biāo)記序列。這意味著，本發(fā)明的實施方案中，供體DNA分子可包含至少第一和第二標(biāo)記序列，可選甚至更多標(biāo)記序列，其可被排列在例如重組基質(zhì)的上游或下游。另一實施方案中，受體DNA序列可包含第三和第四標(biāo)記序列，可選甚至更多標(biāo)記序列，其可排列在例如重組基質(zhì)的上游或下游。這些其它的標(biāo)記允許增加對重組DNA序列進行選擇的嚴(yán)謹(jǐn)度，這是由于在第二原核細(xì)胞中形成并包含兩種不同重組DNA序列的雜合分子可包含總共至少四種不同的標(biāo)記序列。
本發(fā)明“第二、第三和第四標(biāo)記序列”是選自下組的蛋白質(zhì)編碼型或非編碼型序列營養(yǎng)標(biāo)記、色素標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、抗生素敏感標(biāo)記、引物識別位點、內(nèi)含子/外顯子邊界、編碼酶的具體亞基的序列、啟動子序列，下游調(diào)控的基因序列和限制酶位點。
“色素標(biāo)記”是其中基因產(chǎn)物參與色素合成的標(biāo)記基因，所述色素在表達時將使該色素標(biāo)記在其中表達的細(xì)胞被染色。不具有色素標(biāo)記的細(xì)胞不能合成色素并且由此不能被染色。由此該色素標(biāo)記允許快速檢測含有該色素標(biāo)記的細(xì)胞的表型。
“抗生素敏感標(biāo)記”是其基因產(chǎn)物在表達時破壞細(xì)胞在存在給定濃度的給定抗生素下生長的能力的標(biāo)記基因。
“引物識別標(biāo)記”是位點特異性PCR引物的退火位點，其允許通過PCR快速鑒定不同的標(biāo)記序列。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，供體DNA分子的第二標(biāo)記序列以及受體DNA分子的第三和第四標(biāo)記序列是蛋白質(zhì)編碼型序列，其基因產(chǎn)物賦予抗生素敏感型細(xì)胞對抗生素的抗性。優(yōu)選，第三標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對四環(huán)素的抗性，第四標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對氯霉素的抗性。
本發(fā)明術(shù)語“待重組的DNA序列”和“重組基質(zhì)”指任何兩種可作為同源或非同源重組過程的結(jié)果而被重組的DNA序列。
多種類型的同源重組事件的特征在于破壞的DNA鏈與同源配偶體的堿基配對，其中反應(yīng)的程度可涉及成百個幾乎完全配對的堿基對。反之，illegitimate或非同源重組的特征在于不具有互補堿基對或僅具有少量互補堿基對的DNA的末端的連接。在原核細(xì)胞中，非同源修復(fù)和重組事件以比同源重組事件低得多的頻率發(fā)生。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，兩種重組基質(zhì)，即待重組的第一和第二DNA序列是不同的序列，即其不相同但顯示一定程度的同源性。術(shù)語“同源性”是指存在兩種核酸分子序列之間的同一性程度。根據(jù)本發(fā)明，待重組的DNA序列就其整體比對而言在兩個或更多個位置上不同。在本發(fā)明的實施方案中，兩種重組基質(zhì)之間的總體分歧度相對于其總體長度為超過0,1％，具體為超過5％，優(yōu)選超過25％。這意味著，待重組的DNA序列的差異可為超過30％，超過40％或甚至超過50％。本發(fā)明具體優(yōu)選的實施方案中，待重組的兩個DNA序列共享至少一或多個同源或相同區(qū)域，但所述區(qū)域非常短。本發(fā)明的同源或相同區(qū)域可包括少于25個核苷酸，具體少于29個或少于15個核苷酸，甚至少于10個核苷酸，例如4，5，6，7，8或9個核苷酸。
重組基質(zhì)或待重組的DNA序列可具有天然或合成來源。因此，本發(fā)明一個實施方案中，待重組的第一和第二DNA序列是天然存在的序列。天然存在的序列可通過適宜分離方法分離自任何天然來源，包括病毒，存活或死亡的原核生物體諸如細(xì)菌，存活或死亡的真核生物體諸如真菌、動物、植物和人，或其部分，或可通過化學(xué)手段合成。天然存在的序列也可包括在從天然來源分離后進行誘變的序列。本發(fā)明另一實施方案中，待重組的第一和第二DNA序列是不見于天然來源的人工序列。人工序列可通過任何已知化學(xué)方法合成。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，待重組的DNA序列是編碼蛋白質(zhì)的序列，例如編碼可用于工業(yè)制備天然和非天然化合物的酶的序列。用于通過利用酶的輔助制備的化合物的酶可用于制備藥物，化妝品，食品等。編碼蛋白質(zhì)的序列也可為編碼可用于人和動物健康領(lǐng)域的治療應(yīng)用的蛋白質(zhì)的序列。醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)的重要種類包括細(xì)胞因子和生長因子。蛋白質(zhì)編碼序列的重組允許產(chǎn)生編碼具有改變的優(yōu)選改進的功能和/或新獲得的功能的新的突變序列的產(chǎn)生。由此，可能例如實現(xiàn)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的提高，改變蛋白質(zhì)的底物特異性，改善其活性，開發(fā)新的催化性位點和/或融合來自兩種不同的酶的結(jié)構(gòu)域。待重組的編碼蛋白質(zhì)的DNA序列可包括來自不同物種的序列，其編碼在其天然背景中相似或相同的功能的相同或相似的蛋白質(zhì)。待重組的蛋白質(zhì)編碼型DNA序列可包括來自相同蛋白或酶家族的序列。待重組的蛋白質(zhì)編碼序列也可為編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)的序列-例如，編碼催化給定代謝途徑的不同步驟的酶的序列。本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，待重組的第一和第二DNA序列選自Beta-內(nèi)酰胺酶的Oxa超家族的基因序列的組。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，待重組的DNA序列是非編碼型序列，諸如例如參與其天然細(xì)胞背景中參與蛋白質(zhì)編碼型序列的表達的調(diào)節(jié)的序列。非編碼型序列的實例包括，但不限于，啟動子序列，含有核糖體結(jié)合位點的序列，內(nèi)含自序列，多腺苷酸化序列等。通過重組所述非編碼型序列，可能產(chǎn)生突變序列，其在細(xì)胞環(huán)境中在改變的細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)-例如，基因的改變的表達。
本發(fā)明的重組基質(zhì)或待重組的DNA序列可當(dāng)然包括超過一種蛋白質(zhì)編碼序列和/或超過一種非編碼型序列。例如，重組基質(zhì)可包括一種蛋白質(zhì)編碼型序列加上一種非編碼型序列以及不同的非編碼型序列。本發(fā)明的另一實施方案中，待重組的DNA序列可由一或多個具有間插和/或側(cè)接非編碼序列的編碼序列組成。這意味著，待重組的DNA序列可為例如在其5’-末端具有調(diào)節(jié)序列和/或未翻譯的3’-區(qū)域的基因序列或具有外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的哺乳動物基因序列。本發(fā)明另一實施方案中，待重組的DNA序列可由較大的連續(xù)DNA片段組成，所述片段含有超過一個編碼序列，可選具有間插型非編碼序列，諸如操作子。待重組的DNA序列可為已經(jīng)經(jīng)過一次或多次重組事件的序列，例如同源和/或非同源重組事件。
重組基質(zhì)可包含非突變型野生型DNA序列和/或突變型DNA序列。優(yōu)選實施方案中，可能將野生型序列與已經(jīng)存在的突變序列重組以產(chǎn)生新的突變序列。
本發(fā)明中原核細(xì)胞用作宿主細(xì)胞以導(dǎo)入受體和供體DNA分子。術(shù)語“原核細(xì)胞”和“原核宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞，其中的基因組在細(xì)胞漿中作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)游離存在，即細(xì)胞，其中的基因組不被細(xì)胞核膜所圍繞。原核細(xì)胞的特征還在于其不必需依賴于氧并且其核糖體小于真核細(xì)胞的核糖體。原核細(xì)胞包括古細(xì)菌和真細(xì)菌。與細(xì)胞壁組成無關(guān)，真細(xì)菌可分成革蘭氏陽性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌和藍細(xì)菌。
因此，本發(fā)明的原核細(xì)胞是古細(xì)菌或真細(xì)菌的細(xì)胞，由此本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，原核細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌或藍細(xì)菌。優(yōu)選，革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌，例如大腸桿菌AB1157或其MutS-突變體，大腸桿菌MXP1。
本發(fā)明優(yōu)選使用原核宿主細(xì)胞，用于具有功能修復(fù)系統(tǒng)的創(chuàng)造性方法。錯配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)是避免由于復(fù)制過程中DNA聚合酶錯誤造成的突變的最大的貢獻因素之一。但是錯配修復(fù)也通過保證遺傳重組的忠誠度來促進遺傳穩(wěn)定性。雖然在細(xì)菌以及酵母和哺乳動物細(xì)胞中，含有一些錯配(＜1％)的部分同源DNA底物出現(xiàn)的效率淵源低于相同序列的情況，重組的頻率(基因轉(zhuǎn)化和/或交叉)在MMR缺陷系中明顯升高。這意味著，重組的高度忠誠度不僅是由于重組酶的內(nèi)在性質(zhì)造成的，也是由于通過錯配修復(fù)系統(tǒng)對重組進行編輯造成的。因此，錯配修復(fù)機制對于趨異序列之間的重組具有抑制效應(yīng)。在大腸桿菌中，甲基指導(dǎo)的MMR系統(tǒng)的兩種蛋白，即MutS和MutL，是這種強抗重組活性所需的，但是其它MMR系統(tǒng)蛋白MutH和UvrD的影響則低得多。除了它們在MMR和部分同源重組中的作用，MMR蛋白也在基因轉(zhuǎn)化過程中非同源DNA的去除中起重要作用。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，使用錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的原核細(xì)胞。本發(fā)明中，術(shù)語“錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷”意指原核細(xì)胞的MMR系統(tǒng)被暫時或永久性損害。細(xì)胞或生物體的MMR缺陷可通過任何暫時或永久損害MMR系統(tǒng)的策略實現(xiàn)，包括但不限于一或多種參與MMR的基因的突變，利用諸如UV光的因子進行處理，其導(dǎo)致MMR的整體損傷，利用諸如2-氨基嘌呤或含有過量錯配的異源雙鏈體的因子進行處理以部分包含并失活MMR系統(tǒng)，以及參與MMR的一或多種基因的可誘導(dǎo)表達或抑制，例如通過可調(diào)節(jié)的啟動子，其允許瞬時失活。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，原核宿主細(xì)胞的錯配修復(fù)系統(tǒng)是由于至少一種參與MMR的基因的突變造成的。優(yōu)選實施方案中，原核細(xì)胞具有突變的mutS基因，突變的mutL基因，突變的mutH基因和/或突變的UvrD基因。
另一實施方案中，原核宿主細(xì)胞的一或多種主要重組蛋白受損或受阻。已經(jīng)顯示例如AddAB基因受損的細(xì)胞顯示高頻率同源和非同源重組。另一實施方案中，所述原核宿主細(xì)胞過表達主要重組蛋白之一諸如recA。該蛋白通過促進單鏈DNA的復(fù)性以形成重組事件所需的異源雙鏈體分子并啟動DNA鏈的交換而參與同源重組。
本發(fā)明中第一原核細(xì)胞通過將受體DNA分子和供體DNA分子同時或序貫導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。本發(fā)明一個實施方案中，第一原核細(xì)胞可通過在第一步中將受體DNA分子引入具體的原核宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)含有受體分子的原核宿主細(xì)胞之后，在第二步中將供體DNA分子引入含有受體DNA分子的細(xì)胞。本發(fā)明另一實施方案中，受體和供體DNA分子都可被同時引入原核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，將受體和供體DNA分子導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞可通過任何已知適宜方法進行，例如轉(zhuǎn)化，接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)，性導(dǎo)，感染和/或電穿孔。
本發(fā)明術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指通過細(xì)胞例如微生物細(xì)胞對環(huán)境中分離的優(yōu)選純化的核酸分子的攝取。一些原核物種的細(xì)胞諸如芽孢桿菌或雙球菌(Diplococcus)是天然感受態(tài)的，但是其它原核物種諸如大腸桿菌的細(xì)胞必需經(jīng)過特殊處理以使其變?yōu)楦惺軕B(tài)，即誘導(dǎo)核酸分子轉(zhuǎn)移穿過細(xì)胞膜。已知幾種細(xì)菌具有通過轉(zhuǎn)化進行DNA交換的能力。
“接合(conjugation)”指通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸，質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌質(zhì)粒從一種細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入另一種細(xì)菌細(xì)胞。有關(guān)的轉(zhuǎn)移機制通常由質(zhì)?；蚺悸?lián)的轉(zhuǎn)運子編碼。所述質(zhì)粒是結(jié)合質(zhì)?；蜉o助質(zhì)粒。結(jié)合質(zhì)粒是自身可傳遞的質(zhì)粒，其攜帶促進細(xì)胞-細(xì)胞接觸(動員(mobilization)基因)。它們含有產(chǎn)生接合橋的基因。一旦產(chǎn)生所述的橋，其它質(zhì)粒以及甚至染色體DNA(結(jié)合轉(zhuǎn)運子)也可被轉(zhuǎn)移。可移動的質(zhì)粒含有移動化基因，但需要接合質(zhì)粒的“輔助”以在細(xì)胞間移動。接合是原核細(xì)胞的不同種系發(fā)生的組之間以及原核細(xì)胞和真核細(xì)胞之間的遺傳交換的主要途徑之一。
“性導(dǎo)”是這樣的過程，經(jīng)由該過程遺傳物質(zhì)從具有F因子和F質(zhì)粒的原核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含有F因子的細(xì)胞(F-)。F因子通常存在細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但有時可包含在細(xì)菌染色體不同位點，這導(dǎo)致形成Hfr-細(xì)胞。F因子的整合是可逆的，由此一旦所述質(zhì)粒發(fā)生錯誤整合，就產(chǎn)生所謂的取代的F因子(F’)，其含有細(xì)菌染色體中與F因子的原始真核位點側(cè)接的遺傳物質(zhì)。
“轉(zhuǎn)導(dǎo)”意指核酸分子通過噬菌體從一種細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌細(xì)胞中，包括將噬菌體從一種細(xì)胞釋放以及隨后對另一種細(xì)胞的感染。存在兩種形式的轉(zhuǎn)導(dǎo)。專門的(specialized)轉(zhuǎn)導(dǎo)可在溫度細(xì)菌噬菌體的細(xì)胞裂解性細(xì)胞周期的過程中出現(xiàn)，由此細(xì)菌的遺傳物質(zhì)可取代部分細(xì)菌噬菌體基因組。該段細(xì)菌DNA作為噬菌體基因組的一部分復(fù)制并可通過噬菌體被轉(zhuǎn)移入另一受體細(xì)胞。在通常的轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況中，裂解性噬菌體的整個基因組可被細(xì)菌DNA取代。當(dāng)該噬菌體感染另一種細(xì)菌的時候，其將DNA注入受體，在受體中其與受體細(xì)胞的DNA片段進行交換。
“電穿孔”是這樣的過程，其中細(xì)胞與核酸分子混合，并短時間暴露于高電壓。由此使得宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜可通透，允許外來核酸進入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明具體優(yōu)選的實施方案中，供體DNA分子在導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞之前接受UV照射，這是由于已知輻照會導(dǎo)致重組頻率增加。
根據(jù)本發(fā)明，含有受體和供體DNA分子的第一原核細(xì)胞在強迫受體和供體DNA分子的共整合子或雜合分子以及兩種重組基質(zhì)的重組優(yōu)選非同源重組的條件下，即允許選擇重組的DNA序列的條件。
如果供體DNA分子的第一標(biāo)記序列是抗生素抗性標(biāo)記，含有受體和供體DNA分子的第一原核細(xì)胞在存在所述原核宿主細(xì)胞敏感并且第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予對其的抗性的抗生素的條件下培養(yǎng)。具有優(yōu)選的實施方案中，所述第一原核細(xì)胞在存在放線壯觀素的條件下培養(yǎng)，條件是供體DNA上存在的第一標(biāo)記序列是specR，其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對放線壯觀素的抗性。另一具體優(yōu)選的實施方案中，所述第一原核細(xì)胞在腐草霉素存在的條件下進行培養(yǎng)，條件是存在供體DNA分子上的第一標(biāo)記序列是phleoR，其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對腐草霉素的抗性。另一具體優(yōu)選的實施方案中，所述第一原核細(xì)胞在存在四環(huán)素的條件下培養(yǎng)，條件是存在供體DNA分子上的第一標(biāo)記序列是tcR，其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對四環(huán)素的抗性。
如果供體DNA分子的第一標(biāo)記序列是營養(yǎng)標(biāo)記，含有受體和供體DNA分子的第一原核細(xì)胞在缺乏特定的必要營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該營養(yǎng)素不能由宿主細(xì)胞自身合成，并且在導(dǎo)入供體分子并表達包含在供體分子中的第一標(biāo)記基因時供給宿主細(xì)胞。一旦第一營養(yǎng)標(biāo)記基因表達，不必要將該必需營養(yǎng)素添加到原核細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中。
如果第二標(biāo)記序列，第三標(biāo)記序列和/或第四標(biāo)記序列是抗生素標(biāo)記，則在優(yōu)選實施方案中，第一原核細(xì)胞可在另外存在第二、第三和/或第四抗生素的條件下培養(yǎng)，其中所述第二、第三和第四標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物分別賦予對所述抗生素的抗性。優(yōu)選，第一原核細(xì)胞培養(yǎng)在不僅存在腐草霉素或壯觀霉素或四環(huán)素，而且還存在氯霉素的條件下。最優(yōu)選，所述第一原核細(xì)胞在存在腐草霉素，壯觀霉素，氯霉素和四環(huán)素的條件下生長并增殖。
在選擇性條件下培養(yǎng)原核細(xì)胞之后，分離含有受體和供體DNA分子形成的共整合子或雜合分子的第二原核細(xì)胞。該共整合子含有重組DNA序列。共整合子和/或重組DNA序列的存在可通過多種手段諸如限制圖譜分析，PCR擴增和/或測序等得以確認(rèn)和檢測。如果，例如供體分子的第二標(biāo)記許了和受體分子的第三或第四標(biāo)記序列是獨特的引物識別序列，則該共整合子的特異性片段可通過利用識別這些各自的標(biāo)記組合的適當(dāng)引物來進行PCR擴增。為了檢測各種標(biāo)記組合的存在，如果沒有形成共整合子，即沒有出現(xiàn)重組，這些片段則不能被檢出。如果，例如供體分子的第二標(biāo)記序列和受體分子的第三或第四標(biāo)記序列是獨特的限制酶切位點，那么所述共整合子可接受限制酶分子以檢測具體的DNA片段。如果沒有形成共整合子，即沒有出現(xiàn)重組，這些片段則不能被檢出。
根據(jù)本發(fā)明，第二原核細(xì)胞的雜合DNA分子中包含的第一和第二重組DNA序列可被分離和/或分析和/或選擇。獲得的第一和第二重組DNA序列可通過例如PCR擴增或利用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈顏矸蛛x。雜合DNA分子中所含的第一和第二重組DNA序列的分析可例如通過測序方法來進行。
根據(jù)本發(fā)明，分離的第一和第二重組DNA序列可分別再次插入供體DNA分子和受體DNA分子，并通過利用本發(fā)明的方法進行另一輪重組。
本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生具有新的或改進的功能和性質(zhì)的新蛋白、酶和非編碼序列的方法，由此已知的蛋白質(zhì)編碼型序列或已知的非編碼型序列通過利用本發(fā)明的方法進行一或多輪重組，以產(chǎn)生并檢測原核宿主細(xì)胞中的重組DNA序列。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的任何一種方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、酶和非編碼序列。
本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91，其是質(zhì)粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢桿菌中復(fù)制，但不能在大腸桿菌中復(fù)制，并且其包含specR標(biāo)記和phleoR標(biāo)記以及限制位點ScaI，PpuMI和EcoO109I，用于插入外來DNA序列。
本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌質(zhì)粒p-MIX101，其為質(zhì)粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢桿菌中復(fù)制，但不能在大腸桿菌中復(fù)制，并且其包含tcR標(biāo)記序列和限制位點XhoI和PstI，用于插入DNA序列。
本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌菌株DSM4393，其含有枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91(于2005年2月21日保藏在DSMZ，Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany，SB202pMIX91)，并涉及枯草芽孢桿菌菌株1A423，其含有枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101(于2005年2月21日保藏在DSMZ，Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany，1A423pMIX101)。
本發(fā)明另一方面分別涉及枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91和pMIX101作為供體DNA分子在本發(fā)明方法中的用途，即質(zhì)粒pMIX91或pMIX101用于在原核宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生和/或檢測重組DNA序列的用途。
本發(fā)明另一方面涉及大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或pMIX100或其衍生物作為本發(fā)明方法中的受體DNA分子的用途，即質(zhì)粒pACYC184或pMIX100用于在原核宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生和/或檢測重組DNA序列的用途。
本發(fā)明另一方面涉及試劑盒，其可用于進行本發(fā)明的方法以在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生并檢測的重組DNA序列。第一個實施方案中，所述試劑盒至少包含含有大腸桿菌AB1157的細(xì)胞作為原核宿主細(xì)胞的第一容器，含有大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100的大腸桿菌菌株AB1157的細(xì)胞作為受體DNA分子的第二容器，以及含有枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91的枯草芽孢桿菌菌株DSM4393的細(xì)胞或包含枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101的枯草芽孢桿菌菌株1A423的細(xì)胞作為供體DNA分子的第三容器。本發(fā)明的第二個實施方案中，所述試劑盒至少包含含有菌株AB1157的MutS-突變體即大腸桿菌菌株MXP1的細(xì)胞作為原核宿主細(xì)胞的第一試劑盒，含有質(zhì)粒pACYC184或pMIX100的大腸桿菌菌株AB1157的細(xì)胞的第二容器，以及含有質(zhì)粒pMIX91的枯草芽孢桿菌菌株DSM4393的細(xì)胞或含有質(zhì)粒pMIX101的枯草芽孢桿菌菌株1A423的細(xì)胞的第三容器。另一實施方案中，所述試劑盒至少包含含有大腸桿菌菌株AB1157或大腸桿菌菌株MPX1的細(xì)胞的第一容器，含有大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或pMIX100的DNA的第二容器，以及含有枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91或枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101的DNA的第三容器。
本發(fā)明另一方面涉及在原核細(xì)胞中產(chǎn)生雜合基因和/或雜合基因編碼的蛋白質(zhì)的方法。用于產(chǎn)生雜合基因和/或雜合基因編碼的蛋白質(zhì)的方法包括進行本發(fā)明的方法以產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的步驟，由此在原核細(xì)胞中產(chǎn)生雜合基因和/或雜合基因編碼的蛋白質(zhì)。表達后，在原核細(xì)胞中選擇和/或分離雜合基因和/或編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明用于產(chǎn)生雜和基因的方法或本發(fā)明用于產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的方法獲得的雜合基因。
本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)，其由雜合基因編碼，所述雜合基因可通過本發(fā)明用于產(chǎn)生雜合基因的方法或本發(fā)明用于產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的方法獲得，和/或可通過本發(fā)明用于產(chǎn)生雜合基因編碼的蛋白質(zhì)的方法獲得。
本發(fā)明通過以下序列表，附圖，以及實施例舉例說明。


圖1圖示了本發(fā)明產(chǎn)生和/或檢測兩條DNA序列間的重組的方法。第一序列oxa7基因，存在于枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pTG2-phleo上作為供體DNA分子。pTG2-phleo攜帶specR和phleoR標(biāo)記，其賦予對壯觀霉素和腐草霉素的抗性。通過電穿孔將TG2-phleo導(dǎo)入作為受體DNA分子的含有質(zhì)粒pTG3的大腸桿菌宿主細(xì)胞。pTG3包含第二DNA序列，oxa11基因，以及賦予對氯霉素抗性的cmR標(biāo)記。導(dǎo)入TG2-phleo后，細(xì)胞在存在壯觀霉素和腐草霉素的條件下培養(yǎng)，其強制兩種質(zhì)粒間的共整合形成以及兩種基因之間同時進行重組。因此，培養(yǎng)后，獲得含有二聚體質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，所述質(zhì)粒含有新重組的DNA序列R1和R2。重組的DNA序列可通過對限制圖譜分析、R1和R2重組基因的PCR擴增和/或R1和R2的測序來分析。
圖2顯示質(zhì)粒spUC19-phleo，pic156，pACYC184和pIL253的物理圖譜，其用于構(gòu)建適合本發(fā)明所述方法的構(gòu)建體。
圖3顯示被構(gòu)建用于進行本發(fā)明方法的質(zhì)粒的物理圖譜。質(zhì)粒pMIX96和pMIX97沒有顯示，這是由于它們與pMIX95相似，但是分別具有oxa5和oxa1，而不是oxa11。pMIX99與PMIX98相似，但具有oxa1而不是oxa11。
圖4顯示通過本發(fā)明對趨異度22％的oxa基因進行體內(nèi)重組的方法獲得的基因的結(jié)構(gòu)。詳細(xì)描述了其中發(fā)生交換的序列同一性片段。
圖5顯示大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100的結(jié)構(gòu)，其可在大腸桿菌宿主細(xì)胞中用作受體DNA分子。PMIX100攜帶來自質(zhì)粒pACYC184的復(fù)制起點以及氯霉素抗性基因。PMIX100還攜帶來自pBluescript SK+的基因lacZ。
圖6顯示枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101的結(jié)構(gòu)，其為枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pIL253的衍生物并可在大腸桿菌宿主細(xì)胞中用作供體DNA分子。pMIX101攜帶賦予對紅霉素的抗性的標(biāo)記ErmR，以及賦予對四環(huán)素抗性的TcR。四環(huán)素抗性基因擴增自質(zhì)粒pACYC184。
圖7顯示轉(zhuǎn)化效率對照質(zhì)粒pMIX102的結(jié)構(gòu)。pMIX102是pBluescriptSK+的衍生物，含有自質(zhì)粒pACYC184擴增的TcR基因。在pMIX102中，TcR基因由plac啟動子驅(qū)動。
圖8顯示轉(zhuǎn)化效率對照質(zhì)粒pMIX103的結(jié)構(gòu)。pMIX103是pBluescriptSK+的衍生物，含有自質(zhì)粒pACYC184擴增的TcR基因。在pMIX103中，TcR基因以與plac相反的方向克隆。因此，該基因由其自身啟動子驅(qū)動。
圖9圖示將oxa7，oxa11和oxa5基因克隆入大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100以及枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101的策略。為將oxa7，oxa11克隆入pM1X100，所述基因利用5’末端含有PstI或XhoI的引物進行擴增。利用這些酶進行消化之后，擴增的DNA片段與pMIX100獨立連接，所述質(zhì)粒已經(jīng)用Pst1+XhoI切割。大腸桿菌DH810的感受態(tài)細(xì)胞利用連接混合物電穿孔，攜帶陽性克隆的集落利用氯霉素抗性、在含有Cm(30μg/rnl)+X-Gal(80μg/ml)+IPTG(0.5mM)的LB板上呈白色進行表型選擇。質(zhì)粒DNA通過限制作圖獲得并進行分析。結(jié)果證實，pMIX104攜帶oxa7，pMIX106攜帶oxa11，pMIX107攜帶oxa5。為了克隆入枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101，通過利用PstI和XhoI進行限制從pMIX104獲得作為0.9kb片段的oxa7，并與已經(jīng)用相同的酶切割的pMIX101連接。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A423感受態(tài)細(xì)胞后，在含有0.5μg/ml紅霉素(Erm)的LB上選擇細(xì)胞。
SEQ ID No.1和2分別顯示引物OLG1和OLG2的序列，所述引物用于擴增oxa7并分別在5’和3’末端導(dǎo)入ScaI和PpuM1限制位點。
SEQ ID No.3和4分別顯示引物OLG3和OLG4的序列，所述引物用于擴增oxa11并分別在5’和3’末端導(dǎo)入BamHI和EcoO109I限制位點。
SEQ ID No.5和6分別顯示引物OLG5和OLG6的序列，所述引物用于擴增oxa5并分別在5’和3’末端導(dǎo)入BamHI和EcoO109I限制位點。
SEQ ID No.7和8分別顯示引物OLG7和OLG8的序列，所述引物用于擴增oxa1并分別在5’和3’末端導(dǎo)入BamHI和EcoO109I限制位點。
SEQ ID No.9和10分別顯示引物OLG9和OLG10的序列，所述引物用于擴增oxa11并分別在5’和3’末端導(dǎo)入ScaI和EcoO109I限制位點。
SEQ ID No.11顯示引物OLG11的序列，其與引物OLG8(SEQ ID No.8)一起使用，用于擴增oxa1并分別在5’和3’導(dǎo)入ScaI和EcoO109I限制位點。
SEQ ID No.12和13分別顯示引物OLG12和OLG13的序列，所述引物用于擴增包含在雜合質(zhì)粒pMIX93中的重組基因R1。
SEQ ID No.14顯示引物OLG11的序列，其與引物OLG12(SEQ ID No.12)一起使用，用于擴增包含在雜合質(zhì)粒pMIX95，pMIX96和pMIX97之一中的重組基因R1。
SEQ ID No.15顯示引物OLG15的序列，其與引物OLG17(SEQ ID No.17)一起使用，用于擴增包含在雜合質(zhì)粒pMIX93中包含的重組基因R2。
SEQ ID No.16顯示引物OLG16的序列，其與引物OLG17(SEQ ID No.17)一起使用，用于擴增包含在雜合質(zhì)粒pMIX95，pMIX96和pMIX97中的重組基因R2。
SEQ ID No.17顯示引物OLG17的序列。
實施例實施例1利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)(大腸桿菌/枯草芽孢桿菌)的體內(nèi)異源基因重組，由此通過對壯觀霉素和/或腐草霉素的抗性選擇重組DNA序列1.材料和方法1.1細(xì)菌菌株和質(zhì)粒用于本實施例的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒分別顯示于表1和表2。
表1細(xì)菌菌株

表2質(zhì)粒

1.2生長條件和培養(yǎng)基大腸桿菌和枯草芽孢菌株均于37℃培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基(DifcoLaboratories，Detroit，USA)中。當(dāng)在板(LBA)中應(yīng)用培養(yǎng)基時，每升加入15g瓊脂(Difco)。當(dāng)向所需的培養(yǎng)基中補充抗生素時，終濃度如下四環(huán)素(Sigma-Aldrich Chimie，St.QuentinFal-lavier，F(xiàn)rance)，12.5μg/ml；氯霉素(Sigma-Aldrich Chimie)，30μg/ml；氨芐西林(Sigma-Aldrich Chimie)，100μg/ml；紅霉素(Sigma-Aldrich Chimie)，0.5μg/ml；壯觀霉素(Sigma-AldrichChimie)，75μg/ml；腐草霉素(Euromedex，Strasbourg，F(xiàn)rance)，2μg/ml、當(dāng)在LBA中加入壯觀霉素和腐草霉素時，終濃度分別為60和1μg/ml。
1.3DNA操作以及微生物轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌MIXP1菌株利用P1-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建(3)。
轉(zhuǎn)化通過電穿孔轉(zhuǎn)化、利用Eppendorf Electroporator 2510(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌菌株。
制備枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞并如Yasbin et al.(9)所述進行轉(zhuǎn)化。
DNA操作遵循分子生物學(xué)技術(shù)已確立的規(guī)則(4)。DNA操作用酶購自New Eng-land Biolabs(Beverly，MA，USA)，MBI Fermentas(Vilnius，Lithuania)，Promega(Madison，Wis.)或Stratagene(La Jolla，CA，USA)，并如生產(chǎn)商推薦那樣使用。如需要，利用限制內(nèi)切核酸酶消化的DNA用NucefoSpin ExtractKit(Machery-Nagel)自瓊脂糖凝膠純化。
質(zhì)粒DNA利用NucleoSpin試劑盒(Machery-Nagel GmbH & Co.，Dren，Germany)根據(jù)生產(chǎn)商的說明自大腸桿菌分離。為了從枯草芽孢桿菌分離質(zhì)粒DNA，使用相同的試劑盒，但第一個裂解步驟通過將細(xì)與2mg ml-1溶菌酶于37℃保溫30min來進行。
所用引物由Proligo France SAS(Paris，F(xiàn)rance)合成。
核苷酸序列通過Genome Express(Meylan，F(xiàn)rance)在兩個方向確定。利用lnfobiogen package(Genopole d′Evry，Evry，F(xiàn)rance)分析序列。利用ClustalW程序進行序列比較。
PCR擴增PCR反應(yīng)利用Mastercycler Gradient(Ep-pendorf AG，Hamburg，Germany)進行。利用高保真度Herculase Enhanced DNA聚合酶(Strategene)在以下條件下于50μl體積中進行反應(yīng)96℃、3min，96℃、30s循環(huán)35次，退火溫度30s，72℃、1min，最后的延長步驟在72℃進行10min。退火溫度通過用所用引物的最低Tm減去5℃來確定(subtracting 5℃ to the lowest Tm)。如需要，利用NucleonSpin Extract kit(Machery-Nagel)純化PCR產(chǎn)物。利用電泳在0.7％瓊脂糖凝膠中分析擴增產(chǎn)物。
2.常規(guī)策略進行本試驗是為了通過兩種親本基因的體內(nèi)重組產(chǎn)生顯示優(yōu)勢性質(zhì)的新分子，所述基因共享不同程度的序列同一性。
所用策略如下將被重組的基因由核苷酸序列不顯示同源性的兩種不同的質(zhì)粒攜帶。第一種是大腸桿菌復(fù)制型質(zhì)粒，其賦予氯霉素(Cm)或四環(huán)素抗性(Tc)。其基于標(biāo)準(zhǔn)克隆載體pACYC184，其為獲自New England Biolabs的低拷貝數(shù)質(zhì)粒。
第二種是源自pIL253(Simon和Chopin，1988)的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒。其不能在大腸桿菌中復(fù)制，并且分別攜帶兩種針對壯觀霉素(Spc)和腐草霉素(Phleo)的抗生素抗性標(biāo)記。
為了重組這兩種載體攜帶的異源基因?qū)?，通過電穿孔將枯草芽孢桿菌質(zhì)粒引入含有復(fù)制型質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。該過程顯示于圖1。所述菌株是錯配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)高效型(proficient)(+)或缺陷型(-)，其控制誘變以及重組。
電穿孔后，利用枯草芽孢桿菌賦予對其的抗性(Spc和Phleo)的抗生素選擇轉(zhuǎn)化體。這種選擇壓力強制異源基因之間的重組，這是由于僅僅攜帶枯草芽孢桿菌與大腸桿菌質(zhì)粒之間的共整合子的細(xì)胞可在這些條件下生長。雜合質(zhì)粒賦予對Spc和Phleo的抗性，并自大腸桿菌起點復(fù)制，這是由于枯草芽孢桿菌的起點無功能。此外，其攜帶兩種重組基因R1和R2。
第一步驟是在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌載體中克隆最初被選為靶標(biāo)以評價重組有效性的基因。
oxa基因之間的重組試驗在野生型和錯配修復(fù)缺陷菌株中進行。在相同或趨異的成對基因之間進行試驗。
質(zhì)粒DNA在接受電穿孔之前進行UV照射，這是由于顯示所述照射導(dǎo)致重組頻率增加10倍。
重組也在通過2-氨基嘌呤處理而成為暫時的增變株的菌株中進行。2-氨基嘌呤是腺苷酸類似物，其在細(xì)菌生長過程中摻入DNA并飽和MMR系統(tǒng)。因此，產(chǎn)生瞬時突變株表型，這是由于去除2-氨基嘌呤之后，可恢復(fù)野生狀態(tài)。對錯配修復(fù)活性的臨時控制為菌株在重組中提供穩(wěn)定的背景，避免突變在其基因組中的累積。
2.結(jié)果構(gòu)建枯草芽孢桿菌載體為構(gòu)建用于攜帶重組靶基因的枯草芽孢桿菌，兩種賦予對抗生素壯觀霉素(specR)和腐草霉素(phleoR)抗性的基因標(biāo)記分別根據(jù)兩步克隆策略被克隆入質(zhì)粒pIL253。
第一，specR基因作為長度1294bp的SacI片段自質(zhì)粒pic156獲得。所述片段經(jīng)純化連接于SacI-消化的pIL253?？莶菅挎邨U菌DSM4393感受態(tài)細(xì)胞用連接混合物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體在含有75μg ml-1壯觀霉素的LBA板上選擇。獲自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析證實了它們含有攜帶specR基因的pILF253-衍生物。
第二個步驟中，將phleoR基因克隆入pIL253-spec。質(zhì)粒pUC19-phleo利用EcoRI和SalI限制酶消化，對應(yīng)phleoR的長度574bp的片段利用凝膠純化并與已經(jīng)用相同的兩種酶消化的pIL253-spec連接?？莶菅挎邨U菌DSM4393的感受態(tài)細(xì)胞利用連接混合物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體在含有60μg ml-1腐草霉素的LBA板上選擇。獲自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析證實了它們含有攜帶specR和phleoR基因的預(yù)期的6.69-kb質(zhì)粒，所述質(zhì)粒命名為pMIX91(見圖3)。
構(gòu)建轉(zhuǎn)化效率對照載體構(gòu)建用作在壯觀霉素和腐草霉素選擇下在重組實驗中大腸桿菌菌株的轉(zhuǎn)化效率的對照載體。所述載體如下構(gòu)建在利用BamHI和EcoRI消化pic156后，作為1.25kb的片段獲得壯觀霉素抗性基因(spe)。其被克隆入pUC-phleo的相應(yīng)位點，與腐草霉素抗性基因(phleo)相鄰。用連接混合物對大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞(component cells)進行電穿孔以后，在含有終濃度分別為60μg/ml和1μg/ml的兩種抗生素LBA板上選擇壯觀霉素和腐草霉素抗性集落。分離自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析顯示它們對應(yīng)命名為pMIX92的長度4.46kb的預(yù)期構(gòu)建體(見圖3)。
將編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因克隆入大腸桿菌和枯草芽孢桿菌載體編碼β-內(nèi)酰胺酶的四種基因被選作為評價野生型和MutS突變體大腸桿菌菌株中的重組效率的靶標(biāo)。所述基因諸如oxa7(GenBank保藏號X75562)，oxa11(GenBank保藏號Z22590)，oxa5(Gen-Bank保藏號X58272)和oxa1(GenBank保藏號J02967)顯示其核苷酸序列有不同程度的趨異度。oxa1的序列與oxa5，oxa7和oxa11的序列的趨異度分別為40％。oxa5的序列與oxa7和oxa11的序列的趨異度分別為22％。oxa7的序列與oxa11的序列的趨異度為5％。
將四種oxa基因克隆入大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184，并將oxa7，oxa11和oxa1克隆入枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91。所述基因的克隆如下進行利用設(shè)計為分別在擴增的DNA的5′和3′末端導(dǎo)入ScaI和PpuM1位點的引物通過PCR擴增oxa7(引物OLG1的具有序列SEQ ID No.1，OLG2具有序列SEQID No.2)。PCR產(chǎn)物利用這些限制酶消化，產(chǎn)生的991bps片段連接于已經(jīng)用相同的酶切割的pMIX91?？莶菅挎邨U菌DSM4393感受態(tài)細(xì)胞利用連接混合物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體在含有75μg ml-1壯觀霉素的LBA板上選擇。獲自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析證實了它們含有攜帶oxa7的預(yù)期的6.89-kb質(zhì)粒pMIX94(見圖3)。
為將oxa7克隆入大腸桿菌載體pACYC184，上述PCR產(chǎn)物以及pACYC184，利用PpuMI和ScaI消化。平末端通過利用DNA聚合酶I的Klenow片段自消化的DNA產(chǎn)生，連接它們。用連接混合物對大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞進行電穿孔以后，在含有終濃度12.5μg ml四環(huán)素的LBA板上選擇轉(zhuǎn)化體。分離自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析顯示它們對應(yīng)命名為pMIX93的長度4.33kb的預(yù)期構(gòu)建體(見圖3)。
為將oxa11，oxa5和oxa1克隆入大腸桿菌載體pACYC184，利用設(shè)計為分別在擴增的DNA的5′和3′末端導(dǎo)入BamHI和EcoO109I位點的引物通過PCR擴增基因。分別使用OLG3(SEQ ID No.3)/OLG4(SEQ ID No.4)，OLG5(SEQ ID No.5)/OLG6(SEQ ID No.6)和OLG7(SEQ ID No.7)/OLG8(SEQ ID No.8)擴增oxa11，oxa5和oxa1。PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoO109I消化，產(chǎn)生的997bps(oxa11)和830bps(oxa5)和936bps(oxa1)片段獨立連接于已經(jīng)用相同的酶切割的pACYC184。用連接混合物對大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞進行電穿孔以后，在含有終濃度30μg/ml氯霉素的LBA板上選擇轉(zhuǎn)化體。分離自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析顯示它們對應(yīng)6.89kb質(zhì)粒spMIX95(3.72kb)，pMIX96(3.55kb)和pMIX97(3.66kb)預(yù)期質(zhì)粒(見圖3)。
為將oxa11和oxa1克隆入大腸桿菌載體pMIX91，利用設(shè)計為分別在擴增的DNA的5′和3′末端導(dǎo)入ScaI和EcoO109I位點的引物通過PCR擴增基因。分別使用OLG9(SEQ ID No.9)/OLG10(SEQ ID No.10)和OL11(SEQ IID No.11)/OLG8擴增oxa11和oxa1。PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoO109I消化，產(chǎn)生的995bps(oxa11)和934bps(oxa1)片段獨立連接于已經(jīng)用相同的酶切割的pMIX91。用連接混合物對枯草芽孢桿菌DSM4393感受態(tài)細(xì)胞進行電穿孔以后，在含有終濃度75μg/ml壯觀霉素的LBA板上選擇轉(zhuǎn)化體。分離自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的限制分析顯示它們對應(yīng)預(yù)期的質(zhì)粒pMIX98(6.89kb)和pMIX99(6,83kb)(見圖3)。
MutS-的大腸桿菌相比oxa基因在wt中的體內(nèi)重組第一個步驟中，大腸桿菌AB1157及其MutS-突變體大腸桿菌MXP1的感受態(tài)細(xì)胞通過用攜帶oxa基因的pACYC184-衍生質(zhì)粒pMIX93，pMIX95，pMIX96或pMIX97進行電穿孔來獨立轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體基于它們對四環(huán)素或氯霉素的抗性來選擇。適宜質(zhì)粒的存在隨后通過限制和/或PCR分析來證實。
第二步中，攜帶復(fù)制型質(zhì)粒的野生型和MutS-菌株自含有四環(huán)素或氯霉素的選擇培養(yǎng)基上制備。隨后，所述感受態(tài)細(xì)胞利用攜帶oxa基因的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX94，pMIX98或pMIX99電穿孔來獨立轉(zhuǎn)化。
電穿孔后，在含有枯草芽孢桿菌賦予針對其的抗性的抗生素即終濃度分別為60μg ml-1和1μg ml-1的壯觀霉素和腐草霉素的LBA板上選擇轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化壓力使得oxa基因之間發(fā)生重組，這是由于僅僅含有枯草芽孢桿菌與大腸桿菌質(zhì)粒之間形成的雜合質(zhì)粒的細(xì)胞在所述條件下生長。37C過夜保溫該板，然后通過利用限制酶消化分析轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA以保證它們含有攜帶兩種重組基因R1和R2的雜合質(zhì)粒(長度大約10.5kb)。一些情況中，重組基因通過PCR擴增并經(jīng)測序。如果居留的質(zhì)粒是pMIX93，用OLG12(SEQ ID No.12)/OLG13(SEQ ID No.13)擴增R1，用OLG15(SEQ ID No.15)/OLG17(SEQ ID No.17)擴增R2；如果居留質(zhì)粒是pMIX95，pMIX96 orpMIX97，用OLG12/OLG14(SEQ ID No.14)擴增R1，用OLG16 SEQ ID No.16)/OLG17擴增R2。
重組實驗中，枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91用作陰性對照，而大腸桿菌質(zhì)粒pMIX92用作在壯觀霉素和腐草霉素存在下的轉(zhuǎn)化效率對照。pMIX92可在含有pACYC 184-衍生質(zhì)粒的菌株中復(fù)制，這是由于它們的復(fù)制起點(分別為ColE1和p15)是相容的。質(zhì)粒DNA在電穿孔前接受UV照射(200J/m2)，這是由于顯示所述照射導(dǎo)致重組頻率增加10倍。
重組頻率也通過用每個枯草芽孢桿菌質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)化效率除以對照載體pMIX92所得轉(zhuǎn)化效率來計算。轉(zhuǎn)化效率也可作為以前描述的條件下每μgDNA獲得的集落形成單位(cfu)的數(shù)目計算。
所得結(jié)果總結(jié)于表3。野生型菌株中，在利用相同或具有5％趨異度的oxa基因的實驗中獲得轉(zhuǎn)化體，而在MutS-突變體中，重組也在經(jīng)由22％趨異度的基因之間發(fā)生。
表3野生型和MutS-大腸桿菌菌株中oxa基因之間的體內(nèi)重組頻率

與2-氨基嘌呤(2-AP)處理的大腸桿菌相比Oxa基因在野生型中的體內(nèi)重組第一步中，大腸桿菌AB1157的感受態(tài)細(xì)胞利用攜帶oxa11基因的pACYC184-衍生質(zhì)粒pMIX95進行電穿孔來轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體基于其抗性選擇。適當(dāng)質(zhì)粒的存在通過限制和/和PCR分析證實。
第二步中，該菌株的感受態(tài)細(xì)胞在存在200μg/ml 2-AP的情況下制備，并利用攜帶oxa7的枯草芽孢桿菌pMIX94和攜帶oxa11的pMIX98獨立電穿孔。
枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91用作陰性對照。而攜帶SpcR和PhleoR標(biāo)記的大腸桿菌質(zhì)粒用作轉(zhuǎn)化效率對照。質(zhì)粒DNA在電穿孔前進行UV照射，以增加重組效率。
結(jié)果總結(jié)于表4。野生型菌株中，重組體在利用相同的oxa基因的實驗中獲得，而在2-AP處理的菌株中，重組也在具有5％趨異度的基因之間發(fā)生。
表4野生型和2-AP處理的大腸桿菌菌株中獲得的oxa基因之間的體內(nèi)重組頻率

值得注意的是重組出現(xiàn)在具有22％趨異度的基因之間，其中序列同一性的最長片段分別為22個核苷酸(oxa5/oxa11)和18個核苷酸(oxa5/oxa7)(見圖5和圖6)。已經(jīng)報道低于最小同源性長度已知為MEPS(最小有效加工片段)時重組無效。MEPS的長度根據(jù)重組途徑不同，但據(jù)描述其范圍為23到90個堿基對(5)。
對涉及5％和22％趨異度基因的實驗中獲得的54種雜合質(zhì)粒攜帶的基因R1和R2的序列分析顯示，所述雜合質(zhì)粒中有46種相互不同。該結(jié)果表明它們對應(yīng)不同重組事件，因此，高遺傳多樣程度通過體內(nèi)重組產(chǎn)生。
在4-101個核苷酸的不同序列同一性片段中通過非交互單次交換產(chǎn)生大多數(shù)重組基因。一些情況中，觀察到多重交換，其產(chǎn)生R1或R2嵌合基因。oxa7/oxa5與oxa11/oxa5之間的重組基因顯示于圖4。
重組基因的DNA以及推定的氨基酸序列的比較顯示其中有53％對應(yīng)新的oxa基因(見表4)。由于沒有移碼或終止密碼子在重組過程中產(chǎn)生，推定它們編碼38種新的有功能的β-內(nèi)酰胺酶。
表4通過體內(nèi)重組獲得的重組oxa基因的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列的比較

實施例2用于異源基因的體內(nèi)重組的雙質(zhì)粒系統(tǒng)(大腸桿菌/枯草芽孢桿菌)，由此通過對四環(huán)素的抗性選擇重組DNA序列設(shè)計另一種雙質(zhì)粒系統(tǒng)來驗證實施例1中所得結(jié)果并促進基因的克隆和重組。該系統(tǒng)基于四環(huán)素抗性細(xì)胞的選擇。
1.細(xì)菌菌株和質(zhì)粒用于該實施例的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒分別顯示于表5和表6。
表5細(xì)菌菌株

表6質(zhì)粒

2.結(jié)果2.1構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100質(zhì)粒pMIX100攜帶pACYC184的復(fù)制起點以及其氯霉素抗性基因。pMIX100也攜帶來自pBluescript SK+的基因lacZ，其促進克隆實驗中的選擇。lacZ編碼β-半乳糖苷酶的片段，其提供在含有X-Gal和IPTG的培養(yǎng)基中對重組體進行藍/白選擇的α-補充(complementation)。因此，含有pMIX100的集落在該培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)是藍色的，攜帶具有插入多聚接頭(MCS)的基因的質(zhì)粒的那些應(yīng)為白色。質(zhì)粒pMIX100的物理圖譜顯示于圖5。
2.2構(gòu)建枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101質(zhì)粒pMIX101是枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pIL253的衍生物。由于賦予紅霉素抗性的pIL253標(biāo)記ErmR不能用于大腸桿菌，導(dǎo)入允許在重組實驗中選擇雜合分子的四環(huán)素抗性標(biāo)記。四環(huán)素抗性標(biāo)記擴增自質(zhì)粒pACYC184。因此pMIX101攜帶兩種標(biāo)記ErmR作為在枯草芽孢桿菌中克隆靶基因的選擇標(biāo)記，以及TcR用于在大腸桿菌中選擇重組雜合分子。質(zhì)粒pMIX101的物理圖譜顯示于圖6。
2.3構(gòu)建轉(zhuǎn)化效率對照質(zhì)粒pMIX102和pMIX103由于枯草芽孢桿菌載體不能在大腸桿菌中復(fù)制，轉(zhuǎn)化效率對照對于評估重組效率而言是必要的。由于重組體通過四環(huán)素抗性選擇，在對照質(zhì)粒中必需存在相同的標(biāo)記。pBluescript SK+的衍生物質(zhì)粒含有擴增自pACYC184的TcR基因。在pMIX102中，TcR基因通過plac啟動子驅(qū)動。質(zhì)粒pMIX102的物理圖譜顯示于圖7。
在第二對照載體pMIX103中，TcR基因以與plac相反的方向克隆。因此其從其自身啟動子表達。質(zhì)粒pMIX103的物理圖譜顯示于圖8。
2.4將oxa7，oxa19和oxa5克隆入大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100為證實實施例1中獲得的具有0％，5％和22％趨異度的oxa基因之間的重組試驗的結(jié)果，將oxa7，oxa11和oxa5克隆入大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100。所述基因利用5’末端含有PstI或XhoI的引物擴增。利用所述的酶進行消化之后，擴增的DNA片段分別與已經(jīng)用PstI+XhoI消化的pMIX100連接。，大腸桿菌DHB10的感受態(tài)細(xì)胞利用連接混合物進行電穿孔，含有陽性克隆的集落通過在含有Cm(30,μg/ml)+X-Gal(80g/ml)+IPTG(0.5mM)的LB板上通過氯霉素抗性/白色來進行表型選擇。對于每種oxa的克隆，分析5種所述的轉(zhuǎn)化體。
獲得質(zhì)粒DNA并通過限制作圖分析。結(jié)果證實pMIX104攜帶oxa7，pMIX106攜帶oxa11，pMIX107攜帶oxa5。
為了克隆入枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101，通過用PstI和XhoI限制從pMIX104獲得作為0.9kb的片段oxa7，并將其與已經(jīng)用相同的酶切割的pMIX101連接。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A423感受態(tài)細(xì)胞之后，在含有0.5μg紅霉素(Erm)的LB上選擇細(xì)胞。質(zhì)粒DNA獲自24種轉(zhuǎn)化體，并通過限制分析。結(jié)果證實所有克隆均含有7-kb質(zhì)粒pMIX105。
oxa7，oxa11和oxa5基因向大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100內(nèi)以及枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101內(nèi)克隆的策略顯示于圖9。
2.5與MutS-突變體相比野生型中oxa基因的體內(nèi)重組大腸桿菌AB1157 hsdR-及其MMR-突變體大腸桿菌AB1157 hsdR-CΔmutS，利用質(zhì)粒spMIX104(oxa7)，pMIX106(oxa11)和pMIX107(oxa5)分別進行電穿孔來轉(zhuǎn)化。
為重組oxa基因，含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌菌株利用pMIX105(oxa7)進行電穿孔?？莶菅挎邨U菌質(zhì)粒pMIX101用作陰性對照，而攜帶TcR標(biāo)記的大腸桿菌質(zhì)粒pMIX102用作在四環(huán)素選擇下的轉(zhuǎn)化效率的對照。所有DNA在進行電穿孔前都接受UV照射，以增加重組頻率。
重組頻率也通過用枯草芽孢桿菌質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)化效率除以對照載體pMIX92所得轉(zhuǎn)化效率來計算。轉(zhuǎn)化效率也可作為以前描述的條件下每μgDNA獲得的集落形成單位(cfu)的數(shù)目計算。
所得結(jié)果總結(jié)于表7。野生型菌株中，在利用相同或具有5％趨異度的oxa基因的實驗中獲得轉(zhuǎn)化體，而在MutS-突變體中，重組也在經(jīng)由22％趨異度的基因之間發(fā)生。
表7野生型和MutS-大腸桿菌菌株中oxa基因之間的體內(nèi)重組頻率

重組頻率與利用以前的雙質(zhì)粒系統(tǒng)所得的結(jié)果相一致。
為了證實重組，使pMIX105轉(zhuǎn)化體生長于含有四環(huán)素(12,5μg/ml)的液體培養(yǎng)基。獲自這些培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA顯示它們含有攜帶oxa重組基因的二聚體，以及居留質(zhì)粒(pMIX104或pMIX106)的情況也如此(together withresident plasmids)。此外，利用特異性引物，重組基因R1和R2通過PCR從兩種集落以及質(zhì)粒DNA成功擴增。
結(jié)果證實利用第二雙質(zhì)粒系統(tǒng)以四環(huán)素抗性作為選擇壓力可產(chǎn)生重組體。
序列表序列表<110>麥克西斯法國股份有限公司(Mixis France S.A.)<120>通過利用兩種染色體外元件在原核細(xì)胞中產(chǎn)生重組基因<130>18249<140>
<141>
<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>1gcgcagtact cctcactcgg ggcggaaaag g 31<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2gcgcaggtcc cgtttgagct caggccgcg29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3gcggatccat gcctgcaggg acgcctttg29<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4gcgcagggcc tggtcacgat gctgtacttt gtg 33<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5gcggatcctg ttagccacca aggtacca 28<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6gcgcagggcc tttagccacc aatgatgatg c 31<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7gcggatcccc ctttaccaaa ccaatac 27<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8gcgcagggcc taagggttgg gcgattttg29<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>9gcgcagtact atgcctgcag ggacgccttt g 31<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>10tcgcgggacc tggtcacgat gctgtacttt gtg 33<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11gcgcagtact gggcgaaccc ggagcctcat 30<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12aagaaggagt gattacatga ac 22<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13cgcatctcgg gcagcgttg 19<210>14<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>14gcagatccgg aacataatgg 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>15tgtcggcaga atgcttaatg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>16cactatcgac tacgcgatca 20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>17gcttccccat gataagagc 19
權(quán)利要求
1.在原核細(xì)胞中產(chǎn)生并檢測重組DNA序列的方法，包括以下步驟a)產(chǎn)生含有受體DNA分子以及供體DNA分子的第一原核細(xì)胞，所述受體DNA分子包含待重組的第一DNA序列并可在所述原核細(xì)胞中自主復(fù)制，所述供體DNA分子包含待重組的第二DNA序列以及編碼基因產(chǎn)物的至少第一標(biāo)記序列并不能在原核細(xì)胞中自主復(fù)制，b)如果第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物被表達，在僅允許所述細(xì)胞的生長和增殖的選擇性條件下培養(yǎng)第一原核細(xì)胞，和c)分離第二原核細(xì)胞，其在選擇性條件下生長和/或增殖，并且由于第一和第二DNA序列之間的重組，含有具有至少第一標(biāo)記序列以及第一和第二重組的DNA序列的雜合DNA分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中供體DNA分子和受體DNA分子是不同的線性或環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，具體是不同的質(zhì)?；蚴删w。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述受體DNA分子是質(zhì)粒，其可在大腸桿菌中復(fù)制。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述受體DNA分子是大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或大腸桿菌質(zhì)粒pMIX100或其衍生物。
5.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述供體DNA分子不具有復(fù)制起點。
6.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述供體DNA分子具有非功能性復(fù)制起點。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述供體DNA分子和/或其復(fù)制起點源自除在其細(xì)胞中導(dǎo)入了供體DNA分子的原核種類以外的原核種類。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述供體DNA分子是枯草芽孢桿菌質(zhì)粒，其不能在大腸桿菌中復(fù)制。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中的供體DNA分子是包含specR標(biāo)記和phleoR標(biāo)記的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91或包含tcR標(biāo)記的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101。
10.權(quán)利要求6的方法，其中供體DNA的復(fù)制起點的功能受到突變的破壞。
11.權(quán)利要求1-10之一的方法，其中供體DNA結(jié)構(gòu)的第一標(biāo)記序列選自營養(yǎng)標(biāo)記，抗生素抗性標(biāo)記和編碼酶的亞基的序列組成的組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予抗生素敏感細(xì)胞以抗生素抗性。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述第一標(biāo)記序列是其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞壯觀霉素抗性的specR，其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞腐草霉素抗性的phleoR，或其基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞四環(huán)素抗性的tcR。
14.權(quán)利要求1-13之一的方法，其中所述供體DNA分子含有第二標(biāo)記序列。
15.權(quán)利要求1-14之一的方法，其中所述受體DNA分子含有第三標(biāo)記序列以及可選的第四標(biāo)記序列。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述第二、第三或第四標(biāo)記序列是蛋白質(zhì)編碼型或非編碼型序列，其選自下組營養(yǎng)標(biāo)記，色素標(biāo)記，抗生素抗性標(biāo)記，抗生素敏感性標(biāo)記，限制酶位點，引物識別位點以及編碼酶亞基的序列。
17.權(quán)利要求16的方法，其中受體DNA分子的第三和第四標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予抗生素敏感性細(xì)胞以抗生素抗性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述第三標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對四環(huán)素的抗性。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述第四標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予細(xì)胞對氯霉素的抗性。
20.權(quán)利要求1-19之一的方法，其中待重組的第一和DNA序列的至少兩個核苷酸是趨異的。
21.權(quán)利要求1-20之一的方法，其中待重組的第一和第二DNA序列是天然存在的序列。
22.權(quán)利要求21的方法，其中待重組的第一和/或第二DNA序列源自病毒，細(xì)菌，植物，動物和/或人。
23.權(quán)利要求1-20之一的方法，其中待重組的第一和/或第二DNA序列是人工序列。
24.權(quán)利要求1-23之一的方法，其中待重組的第一和第二DNA序列各自包含一或多個蛋白質(zhì)編碼型序列和/或一或多個非編碼型序列。
25.權(quán)利要求1-24之一的方法，其中所述第一原核細(xì)胞通過將受體DNA分子和供體DNA分子同時或序貫引入原核細(xì)胞來產(chǎn)生。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述受體和供體DNA分子通過轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)和/或電穿孔引入原核細(xì)胞。
27.權(quán)利要求1-26之一的方法，所述第一原核細(xì)胞培養(yǎng)在存在至少一種抗生素的條件下，其中第一標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物賦予對該抗生素的抗性。
28.權(quán)利要求27的方法，所述第一原核細(xì)胞還培養(yǎng)在存在第二、第三或第四抗生素的條件下，其中第二、第三和第四標(biāo)記序列的基因產(chǎn)物分別賦予對所述抗生素的抗性。
29.權(quán)利要求1-28之一的方法，其中所述原核細(xì)胞是古細(xì)菌(archaebacterium)或真細(xì)菌(eubacterium)的細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述真細(xì)菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌或藍細(xì)菌(cyanobacterium)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌。
32.權(quán)利要求1-31的方法，其中所述原核細(xì)胞具有有功能的錯配修復(fù)系統(tǒng)。
33.權(quán)利要求1-31之一的方法，其中所述原核細(xì)胞的錯配修復(fù)系統(tǒng)暫時性或永久性缺陷。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述錯配修復(fù)系統(tǒng)的暫時性或永久性缺陷是由于參與錯配修復(fù)系統(tǒng)的一或多個基因的突變、缺失和/和可誘導(dǎo)表達或阻抑，利用使得錯配修復(fù)系統(tǒng)飽和的藥劑進行處理和/或利用全面敲除錯配修復(fù)的藥劑進行處理造成的。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述原核細(xì)胞具有突變的mutS基因和/或突變的mutL基因。
36.權(quán)利要求1-35之一的方法，其中包含在第二原核細(xì)胞的雜合DNA分子中的第一和第二重組的DNA序列被選擇和/或分離和/或分析。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述第一和第二重組DNA序列通過限制酶切割來分離。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述第一和第二重組DNA序列通過PCR擴增。
39.權(quán)利要求36-38之一的方法，其中所述分離的第一和第二重組DNA序列分別被插入供體DNA分子和受體DNA分子，進行另一輪重組。
40.枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91，其包含specR標(biāo)記和phleoR標(biāo)記以及限制位點ScaI，PpuMI和EcoO109I，用于插入外來DNA序列。
41.枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX101，其包含tcR標(biāo)記序列以及限制位點XhoI和PstI，用于插入外來DNA序列。
42.枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMIX91或pMIX101作為供體DNA分子在權(quán)利要求1-40之一的方法中的用途，其用于在原核宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生和/或檢測重組的DNA序列。
43.大腸桿菌質(zhì)粒pACYC184或pMIX100或其衍生物作為受體DNA分子在權(quán)利要求1-40之一的方法中的用途，其用于在原核宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生和/或檢測重組的DNA序列。
44.試劑盒，其至少包含含有大腸桿菌菌株AB1157或大腸桿菌菌株MXP1或大腸桿菌菌株DHB10的細(xì)胞的第一容器，含有質(zhì)粒pACYC184的大腸桿菌菌株AB1157的細(xì)胞或含有質(zhì)粒pMIX100的大腸桿菌菌株DHB10的細(xì)胞的第二容器，以及含有質(zhì)粒pMIX91的枯草芽孢桿菌菌株DSM4393的細(xì)胞或含有質(zhì)粒pMIX101的枯草芽孢桿菌菌株1A423的細(xì)胞的第三容器。
45.試劑盒，其至少包含含有大腸桿菌菌株AB1157或大腸桿菌菌株MXP1或大腸桿菌菌株DHB10的細(xì)胞的第一容器，含有質(zhì)粒pACYC184或質(zhì)粒pMIX100的DNA的第二容器，以及含有質(zhì)粒pMIX91或質(zhì)粒pMIX101的DNA的第三容器。
46.在原核細(xì)胞中制備雜合基因和/或雜合基因編碼的蛋白質(zhì)的方法，其中進行權(quán)利要求1-39之一的方法，在原核細(xì)胞中產(chǎn)生所述雜合基因和/或所述雜合基因編碼的蛋白質(zhì)，在表達后在原核細(xì)胞中選擇和/或從原核細(xì)胞中分離所述雜合基因和/或編碼的蛋白質(zhì)。
47.可通過權(quán)利要求46的方法獲得的雜合基因。
48.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求47的雜合基因編碼，并可通過權(quán)利要求46的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及在真核細(xì)胞具體是細(xì)菌中產(chǎn)生和檢測的重組DNA序列的方法，所述方法通過利用兩個不同的染色體外元件以及具體是可用于進行本發(fā)明的方法的質(zhì)粒的染色體外元件來進行。用于這些方法的DNA序列包括蛋白質(zhì)編碼型和非編碼型序列。
文檔編號C12N1/20GK1946844SQ200580013174
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者阿納·羅德里格斯-戈梅斯, 塔特賈納·加利克, 瑪麗-阿格尼絲·珀蒂, 伊凡·馬蒂克, 米羅斯拉夫·拉德曼 申請人:麥克西斯法國股份有限公司