專利名稱：聚合酶群落熒光原位測(cè)序珠子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小型化的、高密度、基于珠子的陣列，生產(chǎn)和使用小型化的、高密度、基于珠子的陣列的方法，和生產(chǎn)和使用它的組分的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶群落(polymerase colony，polony)技術(shù)是可以以高度并行方式闡明每個(gè)單獨(dú)分子的序列的單分子擴(kuò)增技術(shù)。然而，聚合酶群落技術(shù)的通量與單獨(dú)的群落的大小成反比，其范圍從數(shù)十到數(shù)千微米。
產(chǎn)生克隆微球體(clonal microspheres)(即，帶有克隆性地?cái)U(kuò)增的DNA的珠子)的群體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，Dressman(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1008817；Brenner et al.(2000)Nat.Biotech.18630)。然而，這些方法有一些缺點(diǎn)。在Dressman et al.中，通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析珠子，其操作昂貴，并且通量太低(即，低于每秒70,000事件)而不能處理數(shù)億的珠子。在Brenner et al.中，操作珠子以形成包裝的平面陣列，物理的包裝限制了珠子的分散。
概述本發(fā)明部分地基于有效的低成本產(chǎn)生基于珠子的陣列的新方法的發(fā)現(xiàn)。這種陣列對(duì)于遺傳學(xué)研究和診斷應(yīng)用特別有用。在此描述的方法和組合物容許以經(jīng)濟(jì)的方式在合理的時(shí)間內(nèi)搜尋數(shù)千萬到數(shù)十億個(gè)離散的核酸序列。
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及基于珠子的陣列和制造基于珠子的陣列的方法。根據(jù)某些實(shí)施方式，提供了具有多個(gè)珠子的陣列，其中單個(gè)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其中所述基本上同一的核苷酸序列群體在序列上不同于附著于其它珠子上的基本上同一的核苷酸序列群體。多個(gè)珠子被固定在半固體(semi-solid)介質(zhì)上形成陣列。所述半固體介質(zhì)可以由聚丙烯酰胺、纖維素、聚酰胺、交聯(lián)的瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖或交聯(lián)的聚乙二醇制成。在某些方面，所述半固體介質(zhì)具有x、y和z軸，多個(gè)珠子相對(duì)于x和y軸隨機(jī)地排列。珠子可以固定為單層，例如，接近所述半固體介質(zhì)的頂面。
在某些方面，所述半固體介質(zhì)可以附著于固相支持物，例如顯微鏡載玻片或流動(dòng)池(flow cell)。固相支持物可以附著于半固體介質(zhì)的底面。
在其它方面，兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)不同的基本上同一的核酸序列群體可以附著到珠子上。在其它方面，所述珠子是克隆珠子。在其它方面，所述珠子包括文庫(kù)。
在其它實(shí)施方式中，制造基于珠子的陣列的方法包括提供附著有基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子，將所述珠子固定在半固體介質(zhì)中以形成陣列，以及擴(kuò)增基本上同一的核酸序列群體以形成附著有擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子。在某些方面，所述半固體介質(zhì)包括擴(kuò)增引物。在其它方面，所述半固體介質(zhì)包括在半固體介質(zhì)中形成空隙(voids)的添加劑，例如陽離子脂質(zhì)、多胺或聚陽離子。
在其它實(shí)施方式中，制造基于珠子的陣列的方法包括提供附著有基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子，以及擴(kuò)增基本上同一的核酸序列群體以形成附著有擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)固定的珠子。然后將珠子固定在半固體介質(zhì)上形成陣列。在某些方面，通過乳狀液PCR(emulsionPCR)進(jìn)行擴(kuò)增。
在其它實(shí)施方式中，制造基于珠子的陣列的方法包括提供附著有基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子，以及擴(kuò)增基本上同一的核酸序列群體以形成附著有擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子。富集具有附著于其上的擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子，以形成富集的珠子群體，將珠子固定在半固體介質(zhì)中以形成陣列。
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及富集附著有第一核酸序列的珠子群體的方法。這些方法包括提供珠子群體，其中所述群體的至少一部分包括附著有第一核酸序列的珠子。使所述珠子群體接觸與所述第一核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列，一同孵育所述珠子群體和所述第二核酸序列，從而發(fā)生雜交以形成雜交珠子的群體和未雜交珠子的群體。然后從未雜交珠子的群體中分離雜交珠子的群體。在某些方面，所述第二核酸被固定在捕捉珠子(capture bead)上。在其它方面，通過密度或親合性從未雜交珠子的群體中分離雜交珠子的群體。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，提供了試劑盒，其含有在半固體介質(zhì)中固定了多個(gè)珠子的陣列，其中基本上同一的核酸序列群體附著在所述珠子上。
附圖的簡(jiǎn)要說明根據(jù)以下的結(jié)合附圖對(duì)說明性實(shí)施方式的詳細(xì)說明，將更完整地理解本發(fā)明的上述和其它特征和益處。
附

圖1描繪了生物素化的引物(SEQ ID NO1)和鏈霉抗生物素蛋白包被的珠子的示意圖。
附圖2A-2C描繪了經(jīng)歷了在此描述的富集程序的珠子。(A)描繪了未富集的珠子。包含擴(kuò)增的序列的珠子(″擴(kuò)增的″)是紅色，不具有擴(kuò)增的序列的珠子(“空”)是綠色。(B)描繪了富集的擴(kuò)增的珠子。(C)描繪了來自顯示大比例空珠子的團(tuán)粒部分的珠子。
附圖3描繪了本文所述的單層化(monolayering)程序的示意圖。
附圖4描繪了聚焦圖。
附圖5描繪了在高密度下用透射的明視野的單層珠子的圖像。
附圖6描繪了對(duì)偶聯(lián)到8.8微米珠子的寡核苷酸的平行測(cè)序。各帶有五個(gè)80mer寡核苷酸之一的珠子群體被固定在丙烯酰胺中，并經(jīng)歷多輪熒光原位測(cè)序(FISSEQ)直到獲得五至八個(gè)堿基對(duì)讀取結(jié)果。這個(gè)處理后的圖像顯示了玻片的區(qū)域，偽彩色代表單個(gè)的序列(深藍(lán)色代表“噪聲標(biāo)志”(noise signitures))。顯示了600×600像素區(qū)，其中在每個(gè)維度上分辨率是每像素約0.5微米。在倒置落射熒光顯微鏡上采集圖像。
附圖7描繪了對(duì)偶聯(lián)到1微米珠子的寡核苷酸的平行測(cè)序。各帶有三個(gè)80mer寡核苷酸之一的1微米珠子的群體被固定在丙烯酰胺中，并經(jīng)歷多輪FISSEQ直到獲得四個(gè)堿基對(duì)讀取結(jié)果?；旌线M(jìn)了較大的珠子(2.8微米)來充當(dāng)圖像配準(zhǔn)的參照參照標(biāo)記。正確的序列標(biāo)志是偽彩的紅色、白色、黃色；噪聲標(biāo)志是偽彩的深藍(lán)色；參照(fiduciary)標(biāo)記物是偽彩的綠色。顯示了200×200像素區(qū)，其中在每個(gè)維度上分辨率是每像素約0.5微米。在倒置落射熒光顯微鏡上采集圖像。
附圖8描繪了通過對(duì)流自組裝制備的順磁性聚苯乙烯微球體(1微米直徑)的單層。通過改變所添加去污劑(detergent)的量，單層可以是松散地包裝的(A)或更緊密地包裝的(B)。
附圖9A-9D描繪了沒有乳狀液的情況下在粒子上的核酸擴(kuò)增。
附圖10描繪了排除體積(excluded volume)法的示意圖。
附圖11描繪了文庫(kù)構(gòu)建的終產(chǎn)物的示意圖。
附圖12描繪了切割之后用于剪切片段的大小選擇的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠。
附圖13描繪了用于對(duì)選擇了大小的片段定量的PAGE凝膠。
附圖14描繪了MmeI消化的滾環(huán)擴(kuò)增(PCA)材料的診斷性6％PAGE。
附圖15描繪了凝膠純化的、無引物文庫(kù)的鑒定性6％PAGE凝膠。
附圖16描繪了最終文庫(kù)的鑒定性6％PAGE凝膠。
詳細(xì)說明本發(fā)明提供了制備和陣列化(arraying)帶有擴(kuò)增的DNA的大量微球體的方法。然后可以對(duì)擴(kuò)增的DNA應(yīng)用各種雜交和基于酶的方法，同時(shí)對(duì)陣列的珠子使用單個(gè)的小的試劑體積。在某些方面，平行的核酸分析，例如DNA測(cè)序和RNA表達(dá)譜分析(expression profiling)，可以與本發(fā)明的珠子組合。在此描述的珠子以及制造和使用基于珠子的、高密度陣列的方法，對(duì)于各種基于遺傳學(xué)的研究和診斷應(yīng)用是有用的，以下進(jìn)一步討論這一點(diǎn)。
本發(fā)明提供了與本領(lǐng)域已知的基于珠子的方法相比的優(yōu)點(diǎn)。例如，在此描述的方法通過將讀出(readout)降低到一個(gè)微米(single)的尺度，大大地提高了當(dāng)前的測(cè)序方法的分辨率。本發(fā)明的某些方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，將珠子包埋在聚合物或凝膠中增強(qiáng)了當(dāng)前的“聚合酶捕獲”(polymerasetrapping)方法。在此描述的某些方法的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于珠子以優(yōu)于0.4微米的精確度保持固定，包埋可以幫助圖像對(duì)準(zhǔn)。本發(fā)明還有利地提供了相對(duì)于未擴(kuò)增的珠子來富集擴(kuò)增的珠子的便利方法。在本發(fā)明的其它方面，包含單層的固定的珠子相對(duì)于Z軸是有序的，但對(duì)于X和Y軸是完全無序的。這提供了益處，容許人們產(chǎn)生珠子陣列而不需要使用在珠子模式上產(chǎn)生秩序的基質(zhì)(例如，具有珠子可以掉入的蝕刻孔的表面)。在此描述的方法關(guān)于包埋或者連接珠子的進(jìn)一步益處是，它可以整合到采集系統(tǒng)中，在該系統(tǒng)中珠子相對(duì)于檢測(cè)裝置是運(yùn)動(dòng)的，從而可以從比該檢測(cè)裝置通常所使用的元件更大的元件上收集數(shù)據(jù)。
本發(fā)明提供了珠子和基于珠子的陣列。如在此使用的，術(shù)語“珠子”是指離散的顆粒，其可以是球形的(例如，微球體)或具有不規(guī)則的形狀。珠子的直徑可以小到約0.1μm，或大到約幾毫米。珠子的大小范圍一般從直徑約0.1μm到200μm，從直徑約0.25μm到100μm，從直徑約0.5μm到50μm，從直徑約0.6μm到40μm，從直徑約0.7μm到30μm，從直徑約0.8μm到20μm，從直徑約0.9μm到10μm或從直徑約1μm到9μm。在某些方面，本發(fā)明的珠子直徑大約1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm或9μm。珠子可以包含各種材料，包括但不限于，順磁性物質(zhì)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸類聚合物、鈦、乳膠、瓊脂糖(sepharose)、纖維素、尼龍，等等。
根據(jù)某些實(shí)施例，珠子可以在它們的表面上具有官能團(tuán)，其可以用于將核酸序列結(jié)合到珠子上?？梢酝ㄟ^雜交(例如，與聚合物結(jié)合)、共價(jià)附著(covalent attachment)、磁附著(magnetic attachment)、親合性附著(affinityattachment)等將核酸序列附著到珠子上。例如，珠子可以包被有鏈霉抗生物素蛋白，核酸序列可以包括生物素部分。生物素能夠結(jié)合珠子上的鏈霉抗生物素蛋白，從而將核酸序列附著到珠子上。包被有鏈霉抗生物素蛋白、寡聚dT和組氨酸標(biāo)簽結(jié)合基質(zhì)的珠子是商業(yè)上可獲得的(Dynal Biotech，Brown Deer，WI)。也可以使用，例如，本領(lǐng)域已知的固相化學(xué)作用，例如用于產(chǎn)生核酸陣列的那些，如羧基、氨基和羥基，或功能化的硅化合物，來將珠子官能化(參見，例如，美國(guó)專利No.5,919,523，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)。
描述了將寡核苷酸固定到支持物上的方法，是本領(lǐng)域已知的(珠子Dressman et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1008817，Brenner et al.(2000)Nat.Biotech.18630，Albretsen et al.(1990)Anal.Biochem.18940，和Lang et al.Nucleic Acids Res.(1988)1610861；硝化纖維Ranki et al.(1983)Gene 2177；纖維素(Goldkom(1986)Nucleic Acids Res.149171；聚苯乙烯Ruth et al.(1987)Conference of Therapeutic and DiagnosticApplications of Synthetic Nucleic Acids，Cambridge U.K.；聚四氟乙烯-丙烯酰胺Duncan et al.(1988)Anal.Biochem.169104；聚丙烯Polsky-Cynkinet al.(1985)Clin.Chem.311438；尼龍Van Ness et al.(1991)NucleicAcids Res.193345；瓊脂糖Polsky-Cynkin et al.，Clin.Chem.(1985)311438；以及聚丙烯酰胺葡聚糖(sephacryl)Langdale et al.(1985)Gene36201；乳膠Wolfetal.(1987)Nucleic Acids Res.152911；為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)并且在本文中進(jìn)行了進(jìn)一步描述。
如在此使用的，術(shù)語“附著”(attach)是指共價(jià)相互作用和非共價(jià)相互作用兩者。共價(jià)相互作用是在兩個(gè)原子或基團(tuán)(radical)之間通過共用一對(duì)電子(即，單鍵)、兩對(duì)電子(即，雙鍵)或三對(duì)電子(即，三鍵)形成的化學(xué)鍵。共價(jià)相互作用在本領(lǐng)域也稱為電子對(duì)相互作用(electron pairinteractions)或電子對(duì)鍵(electron pair bonds)。非共價(jià)相互作用包括，但不限于，范德華相互作用、氫鍵、弱化學(xué)鍵(即，通過短程的非共價(jià)力)、疏水相互作用、離子鍵，等等。非共價(jià)相互作用的綜述可以在Alberts et al。in Molecular Biology of the Cell，3d edition，Garland Publishing，1994中找到，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。
本發(fā)明的實(shí)施方式提供了珠子，在其上附著了一個(gè)到數(shù)百萬個(gè)核酸序列(例如，寡核苷酸序列或多核苷酸序列)的拷貝。在一個(gè)方面，珠子可以具有附著于其上的單個(gè)核酸序列的多個(gè)拷貝(即，克隆珠子)。在另一個(gè)方面，珠子可以具有附著于其上的兩種、三種、四種、五種、十種或更多種核酸序列。例如，在一個(gè)方面，基因序列的兩種方向(即，正鏈和負(fù)鏈)都可以附著在珠子上。
在某些實(shí)施方式中，提供了其上附著有基本上同一的核酸序列群體的珠子。如在此使用的，術(shù)語“基本上同一的核酸序列”意圖包括，但不限于，相互具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的核酸序列。在某些方面，“基本上同一”包括100％的序列同一性。術(shù)語“基本上同一”適用于附著到珠子上的所有核酸序列、適用于附著在珠子上的引物和/或適用于附著在珠子上的擴(kuò)增產(chǎn)物。
如在此使用的，術(shù)語“寡核苷酸”意圖包括，但不限于，單鏈DNA或RNA分子，一般是通過合成方法制備的。本發(fā)明的核苷酸一般是天然存在的核苷酸，例如衍生自腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷的核苷酸。當(dāng)寡核苷酸被稱為“雙鏈的”時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的是，寡核苷酸的配對(duì)存在于的氫鍵鍵合的螺旋狀陣列中，該陣列通常與例如DNA聯(lián)系在一起。除了雙鏈寡核苷酸的100％互補(bǔ)形式之外，在此使用的術(shù)語“雙鏈的”還意味著包括那些形式，其包括諸如凸起(bulge)和環(huán)(loop)的結(jié)構(gòu)特征(參見，Stryer，Biochemistry，Third Ed.(1988)，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)。如在此使用的，術(shù)語“多核苷酸”是指可以是各種不同大小的核酸的鏈。多核苷酸可以是與寡核苷酸相同大小，或可以是寡核苷酸大小的兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更大。寡核苷酸和多核苷酸包括附著在珠子上和通過使用在此描述的任何方法擴(kuò)增制造的(即，“擴(kuò)增產(chǎn)物”)那些。
寡核苷酸和/或多核苷酸可以分離自天然來源或購(gòu)自商業(yè)的來源。寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以通過任何適合的方法制備，例如，Beaucage和Carruthers((1981)Tetrahedron Lett.221859)描述的亞磷酰胺法，或根據(jù)Matteucci et al.1981)J.Chem.Soc.1033185的三酯法，為了所有目的通過完全引用將兩者合并在此，或通過利用商業(yè)的自動(dòng)化寡核苷酸合成儀或在此描述的本領(lǐng)域已知的高通量、高密度陣列法(參見，美國(guó)專利No.5,602,244、5,574,146、5,554,744、5,428,148、5,264,566、5,141,813、5,959,463、4,861,571和4,659,774，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)的其它化學(xué)方法。也可以從各個(gè)供應(yīng)廠家商業(yè)性地獲得預(yù)先合成的寡核苷酸。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種微陣列技術(shù)來制備寡核苷酸和/或多核苷酸。預(yù)先合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以附著到支持物上或使用以下參考文獻(xiàn)中闡述的光指引(light-directed)法、流體通道(flow channel)和斑點(diǎn)(spotting)法、噴墨(inkjet)法、基于針(pin-based)的方法和基于珠子的方法來原位合成McGall et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9313555；Synthetic DNA Arrays In GeneticEngineering，Vol.20111，Plenum Press(1998)；Duggan et al.(1999)Nat.Genet.S2110；MicroarraysMaking Them and Using Them In MicroarrayBioinformatics，Cambridge University Press，2003；美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2003/0068633和2002/0081582；美國(guó)專利No.6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637；和PCT申請(qǐng)Nos.WO04/031399、WO 04/031351、WO 04/029586、WO 03/100012、WO 03/066212、WO 03/065038、WO 03/064699、WO 03/064027、WO 03/064026、WO03/046223、WO 03/040410和WO 02/24597；為了所有目的通過完全引用將它們合并在此。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的珠子對(duì)于分析文庫(kù)，例如，基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)等是有用的。用于分子文庫(kù)合成的方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域中找到，例如DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science 2611303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此。在本文進(jìn)一步描述了文庫(kù)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的珠子被固定在半固體介質(zhì)中。半固體介質(zhì)包括有機(jī)的和無機(jī)的物質(zhì)，包括但不限于，聚丙烯酰胺、纖維素和聚酰胺(尼龍)，以及交聯(lián)的瓊脂糖、葡聚糖或聚乙二醇。例如，在此描述珠子可以被物理地固定在聚合物凝膠中。凝膠可以在其X和Y維度(例如，幾個(gè)厘米)上比其Z維度(例如，約30微米)上更大，其中Z維度比固定在其中的珠子厚得多(例如，30微米的凝膠對(duì)比一微米的珠子)。
在某些方面，至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的固定在半固體介質(zhì)中的珠子具有附著于其上的核酸序列(例如，擴(kuò)增的核酸序列)。也就是說，固定在半固體介質(zhì)中的一些珠子可以是空的(即，不具有附著在其上的核酸序列)，一些可以僅具有擴(kuò)增引物(即，不具有附著在其上的擴(kuò)增的核酸序列)，并且/或者，一些可以具有附著在其上的異質(zhì)核酸群體(即，不是基本上同一的序列)。
在其它方面，含有附著在其上的核酸序列的每個(gè)固定的珠子將具有與其它固定的珠子不同的核酸序列。也就是說，50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的固定的珠子將具有連接在其上的核酸序列(例如，擴(kuò)增的核酸序列)，該核酸序列與附著在一個(gè)或多個(gè)其它固定珠子上的核酸序列基本上相同。附著在珠子上的核酸序列可以適用于附著在珠子上的所有核酸序列、適用于附著在珠子上的引物和/或適用于附著在珠子上的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在其它方面，本發(fā)明的半固體介質(zhì)與固相支持物一同使用。例如，在上述段落中描述的凝膠可以按這樣的方式被聚合，從而凝膠的一個(gè)表面附著在固相支持物(例如，玻璃表面)上，而凝膠的另一個(gè)表面是暴露的。在某些方面，可以以這樣的方式注入凝膠，從而珠子形成駐留于接近凝膠的暴露表面的單層。
本發(fā)明的固相支持物可以塑成各種形狀。在某些實(shí)施方式中，固相支持物基本上是平面的。固相支持物的實(shí)例包括平板如載玻片、微滴板、流動(dòng)池、蓋玻片、微芯片等，容器如microfuge管、試管等，管，薄片，墊片，薄膜等等。另外，固相支持物可以是，例如，生物的、非生物的、有機(jī)的、無機(jī)的，或它們的組合。在某些實(shí)施方式中，珠子和/或固相支持物可以被官能化，從而珠子可以結(jié)合到固相支持物上。在此進(jìn)一步討論了官能團(tuán)。
在某些實(shí)施方式中，珠子的陣列可以在標(biāo)準(zhǔn)的落射熒光顯微鏡上成像。使用固定的珠子容許陣列經(jīng)歷雜交/基于酶的操作的多個(gè)循環(huán)，繼之以對(duì)雜交到固定在珠子上的DNA的分子、或摻入到固定在珠子上的DNA本身中的視覺可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行視覺可檢測(cè)標(biāo)記的成像?？梢耘c在此進(jìn)一步描述的測(cè)序分析一同使用多種可檢測(cè)標(biāo)記。用于本發(fā)明的標(biāo)記的實(shí)例包括視覺上可檢測(cè)的標(biāo)記，例如熒光素(例如，F(xiàn)ITC)、羅丹明(例如，TRITC、RITC)、DAPI、BODIPY、Cy3、Cy5、Alexa、Texasred、Cascadeblue、綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、抗生物素蛋白、生物素、熒光素酶(例如，海腎(renilla)熒光素酶、螢火蟲熒光素酶)，等等。許多適合的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，可以從例如Molecular Probes(Eugene，OR)和Sigma-Aldrich(St.Louis MO)的目錄定購(gòu)，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此。
本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)一步涉及在珠子上擴(kuò)增核酸序列。在某些方面，擴(kuò)增寡核苷酸的方法包括乳狀液PCR，其在以下進(jìn)一步描述了。擴(kuò)增核酸序列的其它方法包括，但不限于，在乳狀液中使用有引物的珠子來捕獲反應(yīng)產(chǎn)物的滾環(huán)擴(kuò)增(高分支的或線性)；在水溶液中的滾環(huán)擴(kuò)增(高分支的或線性)，繼之以在珠子上的克隆“捕獲”；在乳狀液中的解旋酶置換擴(kuò)增(HDA)；和使用例如SiO2-表面低聚物(SiO2-surface oligos)、或薄凝膠固定的低聚層(oligo layer)的原位滾環(huán)擴(kuò)增。
在某些方面，擴(kuò)增寡核苷酸的方法包括使用PCR，例如錨式PCR或RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)PCR，或作為選擇，在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中(LCR)(參見，例如，Landegran et al.(1988)Science 2411077-1080；和Nakazawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91360-364；為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)?？蛇x擇的擴(kuò)增方法包括自保持的序列復(fù)制(self-sustained sequence replication)(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)，轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcriptional amplification system)(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.US.861173，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)，Q-Beta復(fù)制酶((Lizardi et al.(1988)BioTechnology 61197，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)，循環(huán)PCR(recursive PCR)(Jaffe et al.(2000)J.Biol.Chem.2752619；和Williams et al.(2002)J.Biol.Chem.2777790；為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)的任何其它核酸擴(kuò)增方法。在美國(guó)專利No.6,391,544、6,365,375、6,294,323、6,261,797、6,124,090和5,612,199中描述了各種擴(kuò)增方法，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此。
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及使用在此描述的擴(kuò)增方法來擴(kuò)增寡核苷酸的方法。在某些方面，通過使用常規(guī)方法使擴(kuò)增引物與寡核苷酸的3’末端的擴(kuò)增位點(diǎn)選擇性雜交來擴(kuò)增寡核苷酸。擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度是6-100、甚至達(dá)到1,000個(gè)核苷酸，但一般從10到40個(gè)核苷酸，不過不同長(zhǎng)度的寡核苷酸是有用的。擴(kuò)增引物可以存在于溶液中，例如乳狀液PCR那樣，和/或存在于在此描述的半固體介質(zhì)中。
一般地，當(dāng)兩個(gè)核酸序列是基本上互補(bǔ)的，即在至少14到25個(gè)核苷酸的序列段上至少約65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％互補(bǔ)。參見Kanehisa，M.，1984，NucleicAcids Res.12203，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。
總的說來，五個(gè)因素影響了引物與第二核酸分子雜交的效率和選擇性。當(dāng)設(shè)計(jì)非隨機(jī)引物序列時(shí)這些因素是重要的考慮內(nèi)容，它們是(i)引物長(zhǎng)度，(ii)核苷酸序列和/或組成(composition)，(iii)雜交溫度，(iv)緩沖化學(xué)和(v)引物需要與之雜交的區(qū)域中的空間阻礙。
在引物長(zhǎng)度和引物同目標(biāo)序列退火的效率與精確度之間存在正相關(guān)性；與較短的序列相比，更長(zhǎng)的序列具有更高的Tm，并且較少可能在給定的目標(biāo)序列內(nèi)重復(fù)，從而減少(cut down)混雜的雜交(promiscuous hybridization)。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列傾向于自我雜交，它們的預(yù)定目標(biāo)位點(diǎn)也是一樣，因?yàn)閱畏肿拥?、而不是雙分子的雜交動(dòng)力學(xué)一般地在溶液中是有利的；同時(shí)，設(shè)計(jì)含有足夠數(shù)量的G-C核苷酸對(duì)的引物以緊密地結(jié)合目標(biāo)序列是重要的，因?yàn)槊總€(gè)這種配對(duì)由三個(gè)氫鍵連接，優(yōu)于A和T堿基對(duì)時(shí)存在的兩個(gè)氫鍵。雜交溫度與引物退火效率成反比，可能被包括在雜交混合物中的有機(jī)溶劑例如甲酰胺的濃度也與引物退火效率成反比，而鹽濃度的增加促進(jìn)結(jié)合。在嚴(yán)格雜交條件下，與較短的探針相比，更長(zhǎng)的探針更有效地雜交，在更為許可的條件下較短的探針是足夠的。嚴(yán)格雜交條件一般包括低于約1M的鹽濃度，更通常地低于約500mM，優(yōu)選的低于約200mM。雜交溫度范圍從低至0℃到大于22℃、大于約30℃，和(最經(jīng)常地)超過約37℃。對(duì)于特異性雜交，更長(zhǎng)的片段可能需要更高的雜交溫度。由于幾個(gè)因數(shù)影響雜交的嚴(yán)格度，與任何單獨(dú)一個(gè)參數(shù)的絕對(duì)大小相比，參數(shù)的組合是更重要的。雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。
注意上述前四個(gè)考慮內(nèi)容設(shè)計(jì)引物。雖然多數(shù)序列的相對(duì)優(yōu)點(diǎn)是心理估計(jì)的，已經(jīng)設(shè)計(jì)了計(jì)算機(jī)程序來幫助評(píng)估這幾個(gè)參數(shù)和優(yōu)化引物序列(參見，例如，Hoover et al.(2002)Nucleic Acids Res.30e4和Rouillard et al.(2004)Nucleic Acids Res.32W176，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)。
根據(jù)某些實(shí)施例，提供了富集其上附著有目的核酸序列的珠子的方法。通過在容許目的核酸序列與互補(bǔ)核酸序列雜交的條件下，使珠子的群體(其中珠子的至少一個(gè)具有附著在其上的目的核酸序列)同與所述目的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列接觸，可以富集具有目的核酸序列的珠子。然后使用本領(lǐng)域公知的方法從雜交的珠子中分離未雜交的珠子，雜交的珠子含有附著在其上的目的核酸序列。在某些方面，與在起始珠子群體中其上附著有目的核酸序列的珠子的百分比相比，其上附著有目的核酸序列的珠子被富集至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在某些實(shí)施方式中，互補(bǔ)核酸序列被固定在支持物上。適合的支持物包括，但不限于，合成聚合物支持物，例如，聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯(例如，胺化或羧化的聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯等等，聚合物珠子、磁性珠子、玻璃珠子、瓊脂糖(sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素，或任何在親和層析中有用的材料。在此進(jìn)一步描述了富集具有目的核酸序列的珠子的方法。
根據(jù)某些實(shí)施例，提供了在珠子上測(cè)序核酸序列的方法。本領(lǐng)域已知的一般測(cè)序方法，例如通過用可逆(reversible)終止子延伸的測(cè)序、熒光原位測(cè)序(FISSEQ)、焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)、大規(guī)模平行標(biāo)志測(cè)序(MPSS)等(描述于Shendure et al.(2004)Nat.Rev.5335，通過完全引用合并在此)，適合于同在此描述的珠子和基于珠子的陣列使用?？赡娼K止法使用分步式測(cè)序-合成(sequencing synthesis)生物化學(xué)，結(jié)合可逆的終止作用(reversible termination)和可去除的熒光(Shendure et al.同上，和美國(guó)專利No.5,750,341和6,306,597，通過引用合并在此)。FISSEQ中通過向反應(yīng)中添加單種熒光標(biāo)記的三磷酸核苷(nucleotide triphosphate)、洗去未摻入的核苷酸、通過測(cè)量熒光檢測(cè)核苷酸的摻入并重復(fù)該循環(huán)，延伸了DNA。在每個(gè)循環(huán)，來自前一循環(huán)的熒光被漂白或用數(shù)字化手段減去，或熒光基團(tuán)從核苷酸上裂解并被洗去。在Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.32055中進(jìn)一步描述了FISSEQ，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。焦磷酸測(cè)序中在每個(gè)核苷酸摻入事件(即，當(dāng)核苷酸被添加給生長(zhǎng)的多核苷酸序列時(shí))期間釋放焦磷酸(PPi)。通過ATP硫酸化酶和熒光素酶，在能夠可視地檢測(cè)的偶聯(lián)反應(yīng)中，檢測(cè)在DNA聚合酶催化反應(yīng)中釋放的PPi。通過核苷酸降解酶，添加的核苷酸被連續(xù)地降解。在第一次添加的核苷酸被降解之后，可以添加下一個(gè)核苷酸。隨著上述過程的重復(fù)，模板序列的更長(zhǎng)的片段可以推斷出來。在Ronaghi et al.(1998)Science 281363中進(jìn)一步描述了焦磷酸測(cè)序，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。MPSS同時(shí)地在微珠上利用了基于連接的DNA測(cè)序。包含所有可能的突出端的標(biāo)記的接頭的混合物與四個(gè)核苷酸的目標(biāo)序列退火。在成功的連接接頭時(shí)檢測(cè)標(biāo)記。然后使用限制性內(nèi)切酶來裂解DNA模板以暴露下四個(gè)堿基。在Brenneret al.(2000)Nat.Biotech.18630中進(jìn)一步描述了MPSS，為了所有目的通過完全引用將它合并在此。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，實(shí)施例不應(yīng)被看作是限制。在整個(gè)本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容為了所有目的通過完全引用將它們合并在此。
實(shí)施例I克隆珠子步驟1將寡核苷酸偶聯(lián)到珠子上使用從Integrated DNA Technologies獲得的商業(yè)上可獲得的寡核苷酸(Coralville，IA)。通過寡核苷酸5′末端的雙生物素部分將寡核苷酸附著到鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁性珠子(1μM MYONETM珠子(Dynal Biotech，Brown Deer，WI))上(附圖1)。寡核苷酸的序列與以下的文庫(kù)產(chǎn)生程序(實(shí)施例VI)中描述的文庫(kù)分子的PR1-F切片相同。在這個(gè)步驟之后，在此處描述的模板文庫(kù)的擴(kuò)增期間，這容許珠子固定化的寡核苷酸充當(dāng)PCR引物。在此處描述的方案中，這個(gè)序列被稱為“正向”PCR引物。
產(chǎn)生負(fù)載正向引物的珠子的步驟如下1)使用磁場(chǎng)將珠子吸引到微離心管的側(cè)面，在200μl TE中洗滌1×109個(gè)MYONETM鏈霉抗生物素蛋白順磁性珠子(100μL的貯存溶液)一次。
2)將珠子重懸浮在180μl結(jié)合(Bind)&洗滌(Wash)緩沖液(5mMTris-HCl pH 7.5，0.5mM EDTA，1.0M NaCl)中3)在25℃將珠子與20μl 100μM(2nmole)5′生物素化的PCR引物PR1-F-2BIO2Bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO1)孵育30分鐘4)使用磁場(chǎng)將珠子吸引到微離心管的側(cè)面，用200μl TE洗滌珠子兩次。
5)將珠子重懸浮在200μl TE(5×108個(gè)珠子/μl)中，并保存在4℃直到用于隨后的步驟。
步驟2制備微乳狀液在油包水乳狀液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。乳狀液的使用使得非常小體積的乳狀液的水性成分互相隔離，因而，在熱循環(huán)反應(yīng)的過程中PCR試劑和PCR反應(yīng)的產(chǎn)物被相互隔離。使用固定到珠子(例如，步驟1的珠子)上的寡核苷酸作為兩個(gè)PCR引物之一，產(chǎn)生了在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)被物理地固定在珠子上的PCR產(chǎn)物。用于PCR反應(yīng)的模板包括多核苷酸的復(fù)雜混合物，這些多核苷酸含有兩個(gè)側(cè)翼“共有”區(qū)，以及分子與分子間不同的間插序列。在這個(gè)實(shí)施例中，使用了E.coli基因組文庫(kù)。側(cè)翼于這個(gè)文庫(kù)的獨(dú)特區(qū)域的共有序列在此稱為“PR1-F”和“PR1-R”。使用低濃度的模板用于PCR，從而在PCR反應(yīng)開始時(shí)，含有珠子的乳狀液的大部分水性區(qū)室(compartment)含有零個(gè)或一個(gè)模板。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，許多珠子是“空的”(empty)，因?yàn)樗鼈兲幵诓缓腥魏文０宓膮^(qū)室中。其它的珠子是“克隆的”(clonal)，因?yàn)樗鼈兒邢嗤琍CR產(chǎn)物的數(shù)千個(gè)拷貝。每個(gè)克隆珠子的PCR產(chǎn)物不同于其它克隆珠子的PCR產(chǎn)物。較不常見的、但也存在的是，珠子存在于有兩個(gè)或多個(gè)模板的區(qū)室中。這個(gè)第三種“非克隆”(non-clonal)珠子含有來自多于一個(gè)模板的PCR產(chǎn)物的混合物。因而，珠子的分布分出三個(gè)種類空的、克隆的和非克隆的，其可以使用泊松分布(Poisson distribution)來模型化。
A.乳狀液油相的制備令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，乳狀液的穩(wěn)定性對(duì)于油相的每種成分的比例非常敏感。因此，當(dāng)測(cè)量每種成分以確保一個(gè)實(shí)驗(yàn)與下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的最小差異性時(shí)要格外小心(例如，使用反向移液(reverse pipetting)，通過正置換注射器來測(cè)量，等等)。使用注射器來量出10％(v/v)Span 80實(shí)現(xiàn)了乳狀液PCR的一致的性能。
1)制備10％的(v/v)Span 80的礦物油溶液，使用10ml或1ml注射器和16號(hào)針頭來測(cè)量a)9ml輕質(zhì)礦物油b)1ml SPAN80(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)2)通過反向移液向微離心管中添加以下的a)545μl輕質(zhì)礦物油(Sigma-Aldrich)b)450μl礦物油中的10％SPANc)4μl TWEEN80(Sigma-Aldrich)d)0.5μl TRITONX-100(Sigma-Aldrich)3)將溶液渦旋30秒以徹底地混合。
B.乳狀液水相的制備已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將核苷酸的濃度提高到以下列出的高量，在此處描述的珠子-凝膠-成像系統(tǒng)中產(chǎn)生了更多的信號(hào)。MgCl2濃度上的同時(shí)增加對(duì)于保持核苷酸∶MgCl2的比例足夠接近10∶1也是必要的。
將以下的添加到微離心管中，輕輕地吹吸混合8.0μl 10×MgCl2-PLATINUMTaq PCR緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)；30μl 50mM MgCl2(18.75mM)(Invitrogen)；11.3μl 25mM(每一種)dNTP混合物(3.5mM)(Invitrogen)；1.0μl 2mM未修飾的反向PCR引物PR1-R(Integrated DNA Technologies(IDT)，Coralville，IA)CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO2)；0.4μl 10μM未修飾的短正向PCR引物PR1-3LFIDT，CCTCTCTATGGGCA GTCGGTGAT(SEQ ID NO3)；5μl帶有PR1-F正向引物的1微米珠子；20.5μl無菌dH2O；4.5μl PLATINUMTaq(Invitrogen；5U/μl)；和0.25μl 1nM模板DNA。
C.油包水乳狀液的制備以下的乳狀液制備是用于5μl(大約2.5×109個(gè))珠子。使用的模板的量一般產(chǎn)生10％擴(kuò)增的珠子。一般地，在不富集時(shí)使用每載玻片5-50μl珠子，或使用每載玻片50-200μl富集的珠子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，油相與水相的比例影響乳狀液的穩(wěn)定性，已經(jīng)確定了1∶6的水∶油比例產(chǎn)生一致地穩(wěn)定的乳狀液。
1)在具有磁攪拌子的設(shè)置為1400RPM的閉環(huán)磁力攪拌板上，將400μl油相添加到2ml圓底凍存管中。
2)將75μl水相滴加到攪動(dòng)的油相中。
3)在VWR科學(xué)型565磁性攪拌器上用磁攪拌子(no.58948-353，VWRScientfic，West Chester，PA)在1400RPM將混合物攪動(dòng)30分鐘。
4)將試管的內(nèi)含物分到8×200μl試管中(每個(gè)50μl)D.熱循環(huán)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，提高PCR循環(huán)數(shù)和增加延伸時(shí)間提高了信號(hào)。因此使用120個(gè)PCR循環(huán)和75秒的延長(zhǎng)階段。
根據(jù)以下程序?qū)⑷闋钜簾嵫h(huán)(分:秒)a)94℃2:00b)94℃0:15c)57℃0:30d)70℃1:15e)再重復(fù)步驟b)-d)119次f)72℃2:00g)4℃待用E.從乳狀液中回收珠子使用以下方案來從乳狀液中回收珠子1)將8×200μl PCR試管的內(nèi)含物集中到單個(gè)1.5μl微離心管中。
2)添加800μl NX緩沖液(100mM NaCl；1％TRITONX-100；10mMTris-HCl pH 7.5；1mM EDTA)。
3)將試管渦旋30秒。
4)在11,000RPM將試管離心1.5分鐘。
5)不擾動(dòng)沉淀地除去約1150μl上清液。
6)再重復(fù)兩次(teo more times)步驟2-5。
7)使用磁性分離將珠子吸引到微離心管的側(cè)面，除去剩余液體。
8)用50μl TE洗滌珠子兩次。
9)將珠子重懸浮在5μl TE中。
F.核酸外切酶處理以從珠子上除去未延伸的正向引物在乳狀液PCR之后，“擴(kuò)增的”珠子帶有PCR產(chǎn)物(雙鏈的，一條鏈固定在珠子上)和殘余的、未延伸的正向引物(單鏈的)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，殘余的、未延伸的正向引物在隨后的核酸分析步驟中可能是背景信號(hào)的來源。因此，希望消除它。使用核酸外切酶I來選擇性地消化殘余的未延伸引物。
1)混合以下的86μl珠子+dH2O10μl 10×核酸外切酶I反應(yīng)緩沖液(New England Biolabs，Beverly，MA)4μl of核酸外切酶I(20單位/μl，New England Biolabs)2)在37℃孵育混合物1小時(shí)，在30分鐘時(shí)點(diǎn)混合一次以打散沉積的珠子。
3)將混合物在80℃孵育20分鐘以鈍化核酸外切酶。
4)使用磁力分離，用200μl NX緩沖液洗滌珠子5次。
5)將珠子保存在4℃待用。
G.用氫氧化鈉使結(jié)合珠子的產(chǎn)物單鏈化(single-stranding)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)步驟對(duì)于實(shí)現(xiàn)珠子固定化的PCR產(chǎn)物的單鏈化是重要的。
1)通過磁力分離從珠子中除去所有液體2)添加50μl 0.1M NaOH并與珠子混合3)在25℃孵育10分鐘4)用50μl 0.1M NaOH洗滌一次5)用TE洗滌兩次6)將珠子重懸浮在50μl TE中這種方案允許文庫(kù)的擴(kuò)增，與使用本領(lǐng)域已知的基于珠子的方法產(chǎn)生的庫(kù)相比，該文庫(kù)更復(fù)雜幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
可以通過將200μl水相滴加到2ml圓底凍存管(no.430661，Corning)中的400μl油相中來制備油包水微乳狀液。當(dāng)混合物在VWR 565磁性攪拌器上用磁攪拌子(no.58948-353，VWR Scientific，West Chester，PA)在1,400rpm攪動(dòng)時(shí)，可以進(jìn)行滴加1分鐘。在加入水相之后，可以攪拌混合物30分鐘的總時(shí)間。通過將兩個(gè)試管放置在置于磁性攪拌器中心的支架中，可以一次制備兩個(gè)乳狀液。
實(shí)施例II珠子的富集以下方案可用于從克隆珠子中分離空珠子。乳狀液PCR反應(yīng)中的低模板濃度以及富集程序(protocol)的組合使用，與其它可能的手段相比，產(chǎn)生了更高比率(fraction)的“克隆擴(kuò)增的’’珠子。富集的基礎(chǔ)是使用第二組大的(3微米直徑)、無磁性的珠子(即，“捕獲珠子”)，其包括具有與“反向”PCR引物序列(PR1-R)相同序列的引物。由于與反向PCR引物互補(bǔ)的序列將僅存在于PCR反應(yīng)產(chǎn)物的DNA的鏈上，擴(kuò)增的珠子選擇性地與這些大的捕獲珠子雜交，而空的珠子不與捕獲珠子有效地雜交。根據(jù)它們的密度差異(例如，通過在密度梯度溶液中離心珠子)，將與1微米擴(kuò)增珠子雜交的3微米捕獲珠子從1微米空珠子中分離。
如下制備捕獲珠子將50μl SPHEROTM聚苯乙烯鏈霉抗生物素蛋白包被的珠子(非順磁性的，3微米直徑珠子，Spherotech，Libertyville，IL)移入1.5μl微離心管，在13.2krpm下離心30秒沉淀，重懸浮在50μl的結(jié)合&洗滌緩沖液中。將珠子再次離心，從珠子沉淀中吸出所有液體，將珠子重懸浮在49.5μl的結(jié)合&洗滌緩沖液中。添加0.5μl的1mM生物素修飾的“捕獲引物”PR1-R-BioXL生物素-5′-cgtaccccgcttggtctttctcccgtaccccgcttggtctttctccCTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO4)。在室溫下將珠子孵育20分鐘，其間不時(shí)混合。將珠子離心30秒沉淀，除去液體，添加50μl的結(jié)合&洗滌緩沖液。重復(fù)這個(gè)洗滌步驟，將珠子重懸浮在10μl的結(jié)合&洗滌緩沖液中。將捕獲珠子保存在4℃待用。
將TE中40μl 1微米的處理的珠子(在上一節(jié)中產(chǎn)生的擴(kuò)增的和未擴(kuò)增的珠子的混合物)重懸浮在20μl的結(jié)合&洗滌緩沖液中。將10μl 3微米捕獲珠子添加到20μl的1微米處理的珠子中，吹吸混合珠子。通過在56℃孵育混合物10分鐘使捕獲珠子與處理的珠子雜交。然后將混合物小心地吸移到1.5μl微離心管中150μl 60％甘油(v/v)的頂端。在13.2kpm將微離心管離心1分鐘。由于非磁性3微米珠子和磁性1微米珠子的不同密度，3微米珠子保留在上清液中(帶有與它們雜交的擴(kuò)增的1微米珠子)，而未雜交的、未擴(kuò)增的1微米珠子在試管的底部形成沉淀。從微離心管吸出液體(不擾動(dòng)試管底部的珠子沉淀)，并移液到新的微離心管中。與捕獲珠子雜交的擴(kuò)增的珠子在這個(gè)上清液中被富集。
接下來，從捕獲珠子中純化出擴(kuò)增的1微米珠子的富集部分。向含有上清液的新試管中添加1mL水，吹吸混合，在13.2krpm離心2分鐘。吸出所有的液體，只留下20至30μl，添加50μl新水，混合，在13.2krpm再次離心2分鐘。從珠子的沉淀除去所有的液體，將珠子重懸浮在50μl的0.1M氫氧化鈉中。將珠子孵育10分鐘并不時(shí)混合以使1微米珠子與3微米捕獲珠子分開。向微離心管施加磁場(chǎng)來將磁性1微米珠子吸引到試管的側(cè)面，除去所有上清液。含有3微米捕獲珠子的上清液是白色云霧狀的。在0.1MNaOH中洗滌1微米珠子一次，在1×PCR緩沖液中洗滌三次。將1微米珠子重懸浮在5μL的TE中，保存在4℃。
附圖2A-2C描繪了經(jīng)歷了如上所述的程序的一組珠子。珠子取自各個(gè)步驟以檢查擴(kuò)增的珠子相對(duì)于空的珠子的比率。在這些偽彩色的附圖中，綠色珠子是空的，紅色珠子是擴(kuò)增的。在由乳狀液PCR產(chǎn)生的、經(jīng)過處理的但未經(jīng)過富集的1微米珠子的起始材料中，大約8％的珠子是擴(kuò)增的(附圖2A)。在通過上述過程汰棄的珠子組中，低于1％是擴(kuò)增的(附圖2C)。在富集了擴(kuò)增珠子的材料的部分中，擴(kuò)增珠子的比率從8％提高到43％(附圖2B)，即5.5倍的富集。
實(shí)施例III無序的、固定的珠子的單層在高分辨率顯微鏡的視野深度下，可以了解單層化(monolayering)的關(guān)鍵性質(zhì)。例如，20× Plan Apo(NA＝0.75)物鏡就分辨率而言商業(yè)上可獲得的最好的物鏡之一，其的視野深度是1.9微米。當(dāng)克隆微球體僅有1微米直徑時(shí)，如果顯著地偏離單層，將不可能在對(duì)陣列的珠子成像的同時(shí)將焦點(diǎn)維持在給定視野內(nèi)的所有珠子上。
在擴(kuò)增(例如，通過制造克隆微球體群體的方法)之前或之后，及任選的，在已經(jīng)進(jìn)行了珠子富集方案之后，可以采取以下步驟。在已經(jīng)使珠子單層化之后可以進(jìn)行平行測(cè)序或其它形式的循環(huán)核酸分析。
為了形成珠子的單層，使用以下程序?；旌弦韵略噭?.00μl珠子(以期望的密度)；5.10μl的dH2O；1.50μl的丙烯酰胺:雙(38％丙烯酰胺，2％雙丙烯酰胺；Roche)；0.60μl的RHINOHIDETM(聚丙烯酰胺凝膠加強(qiáng)劑)(Molecular Probes，Eugene，OR)；1.20μl的5％N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)；和1.80μl的過硫酸銨溶液(APS)(0.5％)。
將混合的試劑傾倒在聚四氟乙烯(teflon)包被的顯微鏡用載玻片和蓋玻片之間，使其聚合，產(chǎn)生30微米厚的凝膠。蓋玻片或顯微鏡載玻片包被有結(jié)合硅烷(Bind Silane)(3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷)，因而聚合之后凝膠將粘在顯微鏡用載玻片上或蓋玻片上。例如，在Mitra et al.(同上)中描述了在結(jié)合硅烷中包被玻璃表面的程序。簡(jiǎn)言之，將220μl乙酸和4mL的結(jié)合硅烷試劑混合到1升dH2O中。通過溫和振蕩下浸泡1小時(shí)將玻璃表面暴露在這個(gè)溶液中。通過在dH2O中浸泡三次和在100％乙醇浸泡一次來洗滌玻璃表面。將載玻片風(fēng)干并干燥保存。
在聚合作用期間，將顯微鏡載玻片和聚合凝膠置于一個(gè)朝向，使得珠子向著凝膠的期望的側(cè)面沉積。因而，相對(duì)于凝膠的暴露表面，珠子將形成“頂層”或“底層”(附圖3)。為了在固定到珠子的DNA上進(jìn)行雜交和酶反應(yīng)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在“頂層的”凝膠中的珠子對(duì)于施加到它們上的酶和寡核苷酸而言更加可及，容許更為有效的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。這不是令人驚訝的，因?yàn)樵S多用于搜尋凝膠的酶反應(yīng)通過酶來進(jìn)行，如果珠子實(shí)際上在凝膠內(nèi)的深部，酶將難以接近珠子。凝膠是30微米厚的，而珠子僅1微米厚。雖然凝膠孔是大的，例如，如果珠子位于凝膠的底部，酶和或寡核苷酸擴(kuò)散通過凝膠孔將是緩慢的。
最終產(chǎn)物由經(jīng)由結(jié)合硅烷試劑附著了丙烯酰胺凝膠的玻璃表面組成(附圖3)。凝膠大約30微米厚。珠子存在于凝膠頂部的單層中(即，最遠(yuǎn)離于經(jīng)由結(jié)合硅烷附著了凝膠的玻璃蓋玻片)。
這個(gè)實(shí)施例規(guī)定，催化試劑(APS和TEMED)的濃度比本領(lǐng)域一般用于聚合凝膠的低得多，因而在傾倒凝膠之后，它將以緩慢的速率聚合(約一小時(shí))，容許珠子通過重力沉積到凝膠的一個(gè)表面的單層中。已經(jīng)確定了，如果聚合過程太急速，珠子沒有足夠的時(shí)間沉積到單層中，結(jié)果是一層不能在單個(gè)焦平面中顯現(xiàn)的珠子。翻轉(zhuǎn)聚合凝膠的動(dòng)作從而珠子沉積到凝膠的暴露表面的單層中，對(duì)于允許隨后用于在珠子上操作DNA的酶反應(yīng)是有益的。
使用珠子或其它基質(zhì)的“有序”陣列(即，技術(shù)中基于珠子的陣列)的動(dòng)機(jī)是對(duì)于進(jìn)行相同特征的重復(fù)獨(dú)立觀察的期望，或者說對(duì)于“可尋址性”的期望，一般采用帶有笛卡爾(Cartesian)座標(biāo)的有序陣列的形式。在這個(gè)實(shí)施例中描述的陣列對(duì)于Z軸是有序的，因?yàn)樗鼈兪菃螌拥?，但是?duì)于X和Y軸是無序的。在高密度下顯現(xiàn)和辨別了單個(gè)珠子，并且進(jìn)行了重復(fù)；對(duì)凝膠的給定分區(qū)進(jìn)行了獨(dú)立的觀測(cè)，并與對(duì)凝膠的相同分區(qū)的先有觀測(cè)對(duì)準(zhǔn)，這樣就使在每個(gè)分區(qū)內(nèi)對(duì)單個(gè)珠子的多次獨(dú)立觀測(cè)成為可能。珠子位置即使在多次酶操作、暴露于95℃的熱等條件下仍然保持不變。這樣，使用無序的單層避免了許多與產(chǎn)生有序陣列相關(guān)的難點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)了相同的目標(biāo)。
實(shí)施例IV引物雜交和通過單堿基延伸測(cè)序在所述程序的這個(gè)步驟中，珠子存在于本身附著于玻璃蓋玻片的丙烯酰胺聚合物凝膠的暴露表面處的單層中。珠子表面上的DNA因而可以容易地暴露于各種試劑和條件而不影響它們?cè)谀z中的絕對(duì)位置。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以在以這種形式固定的DNA上進(jìn)行各種酶反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)，包括但不限于，序列特異性寡核苷酸雜交、聚合酶驅(qū)動(dòng)的引物延伸、限制性內(nèi)切酶驅(qū)動(dòng)的序列特異性裂解、連接酶驅(qū)動(dòng)的寡核苷酸連接、核酸外切酶驅(qū)動(dòng)的DNA降解等。
作為這些酶反應(yīng)的實(shí)例，描述了雜交寡核苷酸引物然后用熒光核苷酸進(jìn)行聚合酶驅(qū)動(dòng)的單堿基延伸的方案。
由于珠子上的PCR產(chǎn)物已經(jīng)被單鏈化，現(xiàn)在它們從5′到3′由下列組成將鏈固定到珠子上的雙生物素部分、PR1-F正向引物序列、未知序列(取決于來自所構(gòu)建庫(kù)的材料，珠子與珠子間也有不同)，和與PR1-R引物互補(bǔ)的序列。為了將PR1-R引物雜交到珠子固定化的DNA上，將100μl的雜交緩沖液(6× SSPE和0.01％TRITONX-100)中1μM PR1-R施加到凝膠，使用125μl的FrameSeal室將液體密封與凝膠接觸。在56℃將載玻片加熱10分鐘，除去FrameSeal室，將載玻片浸入1×洗滌緩沖液(10mM Tris，pH7.5；50mM KCl；2mM EDTA；0.01％TRITONX-100)。在洗滌液中振蕩孵育載玻片2分鐘，在1×洗滌緩沖液中洗滌兩次。從而PR1-R引物與DNA雜交。PR1-R引物的3′末端位置緊密鄰近于珠子固定化分子的未知序列。
為了通過聚合酶驅(qū)動(dòng)的單堿基延伸搜尋第一個(gè)未知堿基的同一性，制備以下混合物，含有聚合酶和熒光團(tuán)標(biāo)記的ddNTP122μl的1×ThermoSequenaseTM緩沖液(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、1μl的ThermoSequenaseTM(4u/uL，Amersham BioSciences)、0.5μl的R110-ddGTP(100μM，PerkinElmer，Wellesley，MA)、0.5μl的Cy5-ddCTP(100μM，PerkinElmer)、0.5μL的Cy3-ddUTP(100μM，PerkinElmer)和0.5μl的Texas-Red ddATP(100μM，PerkinElmer)。
使用125μl FrameSeal室將混合物施加到上述載玻片上，在42℃孵育5分鐘來延伸。在室溫下緩慢振蕩在1×洗滌緩沖液中洗滌浸液2分鐘，在成像前重復(fù)洗滌1到2次。在裝備有氙燈光源和對(duì)在此使用的熒光團(tuán)適合的濾光器組的落射熒光顯微鏡上進(jìn)行成像。每個(gè)珠子通過相應(yīng)于四種熒光基團(tuán)的僅一種的濾光器發(fā)射熒光，從而揭示了摻入的堿基的身份以及DNA序列中未知位置的身份。
實(shí)施例V在落射熒光顯微鏡上成像珠子被固定在固定到玻璃蓋玻片上的凝膠上。凝膠和玻璃都可以貫穿地成像。已經(jīng)確定，丙烯酰胺凝膠在所使用的％下不產(chǎn)生顯著的自身熒光或?qū)馔干涞母蓴_。
為了使被摻入或位于與固定到珠子的DNA相連的分子上的熒光部分成像，使用了具有自動(dòng)的X-Y平臺(tái)(Prior)和聚焦控制的落射熒光顯微鏡(Nikon TE2000)。落射熒光照明是通過汞弧燈、氙弧燈、或鹵化汞弧光燈。通過安裝在顯微鏡上的基于CCD的檢測(cè)器采集圖像。使用長(zhǎng)焦距物鏡或高數(shù)值光圈物鏡，典型的放大率從10×到40×。一般地，珠子被固定在附著于顯微鏡載玻片的凝膠中。做為選擇，固定化的珠子-凝膠偶爾附著于玻璃蓋玻片上，該玻璃蓋玻片被安裝在流動(dòng)池(flow cell)或流動(dòng)池中安裝的顯微鏡載玻片中。流動(dòng)池或顯微鏡載玻片裝入平臺(tái)中的零件中。對(duì)于顯微鏡載玻片來說，在圖象獲取的循環(huán)之間可以移開載玻片以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序(例如，測(cè)序)。與在圖象獲取循環(huán)之間從平臺(tái)移開載玻片相關(guān)的一個(gè)問題是，不能在微米精確度上將載玻片精確復(fù)位到顯微鏡平臺(tái)上。一般地，人們可以預(yù)期100微米或更多的復(fù)位誤差。在7微米CCD像素大小和40×放大率下，由于從一個(gè)循環(huán)到下一個(gè)的圖像不對(duì)準(zhǔn)，這個(gè)誤差將產(chǎn)生75％或更多的數(shù)據(jù)損失。應(yīng)注意的是，即使不從顯微鏡上移開載玻片或流動(dòng)池，但如果進(jìn)行的涉及載玻片或流動(dòng)池的溫度上的波動(dòng)的實(shí)驗(yàn)程序，這個(gè)問題也可能較小程度地發(fā)生。這種溫度的改變將引起載玻片或流動(dòng)池的幾何形狀方面的機(jī)械變化，可以引起圖像不對(duì)準(zhǔn)。為了在成像和載玻片移開的逐次循環(huán)之后在X、Y和Z軸上精確地復(fù)位顯微鏡平臺(tái)達(dá)到X和Y上的幾個(gè)微米之內(nèi)并在Z上低于1微米，可以使用以下步驟步驟1在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，產(chǎn)生要成像的表面的“焦點(diǎn)圖”。這個(gè)焦點(diǎn)圖是珠子陣列上x、y、z座標(biāo)的列表，用于顯微鏡在每個(gè)采集循環(huán)期間來訪問。通常通過在列表中的每個(gè)x、y位置進(jìn)行“自動(dòng)對(duì)焦”程序以產(chǎn)生相應(yīng)的z位置來產(chǎn)生這個(gè)焦點(diǎn)圖。使用的自動(dòng)對(duì)焦算法通過METAMORPH采集軟件(UniversalImaging Corporation，Downingtown，PA)實(shí)現(xiàn)，使用透射亮視野圖像、反射亮視野圖像、或落射熒光圖像，其中目的珠子已經(jīng)用一或多種熒光分子標(biāo)記了。
步驟2在每個(gè)成像循環(huán)開始時(shí)，軟件回到焦點(diǎn)圖中的第一個(gè)x、y、z硬件位置。對(duì)這個(gè)特定的視野執(zhí)行自動(dòng)對(duì)焦程序來補(bǔ)償z軸上的定位誤差。然后采集圖像并傳送給圖像配準(zhǔn)軟件程序，其在x和y軸中找到合適的偏移量來轉(zhuǎn)換新的圖像以將它與該幀的原始圖像配準(zhǔn)(到一個(gè)像素內(nèi)；由像素大小給出按微米的距離，通常約7μm)。由于珠子是固定的，它們可以充當(dāng)參照(fiduciary)標(biāo)記物，避免了向陣列中引入額外特征的需要。因而，當(dāng)進(jìn)行精確的圖像比對(duì)時(shí)，無序的珠子有很大的優(yōu)勢(shì)。然后根據(jù)這些偏移量在x和y上移動(dòng)顯微鏡平臺(tái)。然后珠子陣列處在接近步驟1的原始位置的x、y、z位置上。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用該方法可以將圖像在亞微米分辨率下進(jìn)行比對(duì)。進(jìn)行第二次自動(dòng)對(duì)焦以確保新的x、y位置處在焦點(diǎn)中。在這個(gè)新的位置重新設(shè)置起點(diǎn)。
步驟3通過訪問原始焦點(diǎn)圖中的每個(gè)位置來采集圖像。這些圖像在所有之前的循環(huán)時(shí)互相對(duì)準(zhǔn)的，容許提取每個(gè)幀中大多數(shù)或所有珠子的數(shù)據(jù)。典型的“焦點(diǎn)圖”的標(biāo)繪坐標(biāo)的實(shí)例在附圖4中示出，其顯示了有兩個(gè)大孔的圓形凝膠(約1cm直徑)。紅色的點(diǎn)表明單個(gè)幀(frame)的相對(duì)XYZ座標(biāo)。附圖5描繪了在高密度用透射的亮視野的單層珠子的樣品圖像。
實(shí)施例VI配對(duì)標(biāo)簽(paired-tag)體外文庫(kù)構(gòu)建已經(jīng)開發(fā)了產(chǎn)生線性dsDNA分子池的體外文庫(kù)構(gòu)建程序，其中每個(gè)分子長(zhǎng)度大約134-136bp，并包括來自目的基因組的17-18bp標(biāo)簽的獨(dú)特的配對(duì)。這些獨(dú)特的標(biāo)簽的側(cè)翼是一組與通用引物互補(bǔ)的序列(PR1-R和PR1-F)，由附加的通用間隔區(qū)序列(“T30”)分隔(附圖11)。獨(dú)特的標(biāo)簽是“配對(duì)的”，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀康幕蚪M上方向相同，在目的基因組上它們的分離落入了限制范圍(例如1000+/-100個(gè)堿基)。該程序是獨(dú)特的，因?yàn)樗峭耆w外的；不需要轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)。
通過體外方法按這種形式構(gòu)建的文庫(kù)，提供了相對(duì)常規(guī)的基因組鳥槍測(cè)序(genomic shotgun sequencing)的以下益處(a)乳狀液PCR程序?qū)τ跀U(kuò)增短序列顯著地更有效；因而存在著最小化庫(kù)中每個(gè)可擴(kuò)增分子的總長(zhǎng)度的動(dòng)機(jī)；(b)基于Sanger的基因組計(jì)劃的經(jīng)驗(yàn)表明，配對(duì)的讀取結(jié)果對(duì)于基因組重測(cè)序是極其有用的，特別是當(dāng)基因組含有重復(fù)元件時(shí)；(c)在此描述的測(cè)序獨(dú)特堿基的方法依靠經(jīng)由通用“錨”序列的定位。在這種文庫(kù)格式中，對(duì)于兩個(gè)標(biāo)簽存在近端和遠(yuǎn)端的錨，有效地允許人們通過對(duì)每個(gè)標(biāo)簽獨(dú)立地應(yīng)用測(cè)序方法來使讀出長(zhǎng)度加倍。
文庫(kù)構(gòu)建方案有以下步驟1.基因組DNA的純化2.剪切基因組DNA以產(chǎn)生片段3.DNA片段的末端修復(fù)(end-repair)和A加尾4.剪切的片段的PAGE大小選擇5.用T尾的間隔寡核苷酸(“T30”)環(huán)化6.用隨機(jī)六聚物滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)7.用MmeI消化(II型)來釋放配對(duì)的標(biāo)簽8.標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽文庫(kù)的PAGE純化9.標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽文庫(kù)的末端修復(fù)10.FDV2(PR1-F)和RDV2(PR1-R)引物寡核苷酸的連接11.配對(duì)的標(biāo)簽庫(kù)的PAGE大小選擇12.切口平移以消除dsDNA庫(kù)中的切口13.配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)的PCR擴(kuò)增14.配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)的PAGE大小選擇15.經(jīng)由克隆和Sanger測(cè)序的文庫(kù)驗(yàn)證以下給出了每個(gè)上述步驟的詳細(xì)方案，進(jìn)行它們來為“M”和“R”大腸桿菌菌株構(gòu)建了配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)。
基因組DNA的純化對(duì)于每個(gè)大腸桿菌菌株“M”和“R”，在3mL的LB中使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過夜，用Qiagen DNEASYTissue試劑盒根據(jù)廠家的程序分離。每次基因組DNA純化的產(chǎn)量是大約30μg(Qiagen Inc.，Valencia，CA)。
用寬的大小分布剪切基因組DNA來產(chǎn)生片段由Agencourt Bioscience Corporation(Beverly，MA)進(jìn)行來自兩個(gè)菌株的基因組DNA的剪切。產(chǎn)生的DNA片段的大小分布是相當(dāng)寬的，這可以在以下的凝膠上看到(附圖12)。
DNA片段的末端修復(fù)和A加尾除非另有說明，所有的DNA定量在Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)上進(jìn)行。
剪切的基因組“M”DNA定量為57ng/μl，剪切的基因組“R”DNA定量為55ng/μl。用EpiCentre END-ITTM DNA末端修復(fù)試劑盒(Madison，WI)對(duì)剪切的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)。對(duì)每個(gè)文庫(kù)，制備以下混合物170μl剪切的大腸桿菌DNA(～9-10μg)、25μl的10× END-ITTM緩沖液、25μl的10×END-ITTMATP、25μl的10× END-ITTMdNTPs和5μl的END-ITTM酶，總體積250μl。
在室溫下孵育反應(yīng)1小時(shí)。根據(jù)廠家對(duì)于PCR產(chǎn)物純化的推薦，在Qiagen QIAQUICK柱上純化DNA。使用約90μl的緩沖液EB(10mMTris·Cl，pH 8.5)用于洗脫?！癕”DNA定量為96.5ng/μl，“R”DNA定量為75.1ng/μl。將每個(gè)體積分配到4個(gè)大約22μl的試管。為了消除殘余的酶活性，將試管加熱到70℃15分鐘。如下制備A尾的主混合物100μl的10×PCR緩沖液(無MgCl2)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、60μl的50mM MgCl2(Invitrogen)(終濃度3mM)、5μl的100mM dATP(Invitrogen)(終濃度0.5mM)、5μl的Taq(5U/uL)(New England Biolabs，Beverly，MA)和610μl的dH2O。
在熱鈍化之后，將78μl的主混合物添加到含有22μl剪切的、末端修復(fù)的DNA片段的每個(gè)試管中。在熱循環(huán)儀中在70℃將試管孵育30分鐘。通過將試管冷卻到4℃結(jié)束循環(huán)程序。然后將試管直接從熱循環(huán)儀轉(zhuǎn)移到冰上。
通過苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀(P∶C∶P)純化DNA，如下
1.添加等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)2.添加0.1體積的3M NaOAc(pH 5.2)3.添加1.0μl的糖原(20μg/μl)4.添加2.5體積的冷100％乙醇(來自瓶裝保存在-20℃的)5.通過翻轉(zhuǎn)混合6.將試管置于-70℃～30-60分鐘7.在4℃的室內(nèi)在微離心機(jī)上以最大數(shù)度旋轉(zhuǎn)10分鐘8.除去上清液9.添加1ml 80％乙醇10.在室溫下在微離心機(jī)上以最大速度旋轉(zhuǎn)5分鐘11.除去上清液12.將試管置于真空離心蒸發(fā)濃縮器(Speed-Vac)上～5分鐘13.在40μl緩沖液EB或TE中重懸浮沉淀剪切的片段的PAGE大小選擇將來自每個(gè)文庫(kù)的一半材料加載到預(yù)先成形(pre-cast)的6％TBE-PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。將20μl的DNA與5μL 5×高密度樣品緩沖液(Novex，San Diego，CA)混合。在這個(gè)程序中，將相同的加載緩沖液用于所有隨后的PAGE凝膠。每個(gè)泳道加載12.5μl的樣品/加載緩沖液混合物(每個(gè)文庫(kù)兩個(gè)泳道)。在標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備上運(yùn)行凝膠，在最小地暴露于UV的情況下切下與大約1000堿基對(duì)片段相應(yīng)的區(qū)域。用剃刀將凝膠片段切成小塊，將每個(gè)文庫(kù)的片段轉(zhuǎn)移到600μl的PAGE洗脫緩沖液中(10mMTris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA(pH 8.0))。試管在37℃孵育過夜。
第二天，在微離心機(jī)中以最大速度旋轉(zhuǎn)洗出物一分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新試管。為了改善回收率，用額外的200μL PAGE緩沖液洗滌凝膠片段。使用P∶C∶P方案純化DNA，將每個(gè)沉淀重懸浮在22μl的緩沖液EB中。
重復(fù)A加尾步驟使可能在凝膠純化期間發(fā)生的A尾部的可能部分降解的影響最小化。進(jìn)行末端修復(fù)和A加尾都可以在基于PAGE的大小選擇之后而不是之前進(jìn)行。如下制備A尾的主混合物25.00μl的10× PCR緩沖液(無MgCl2)、15.00μl的50mM MgCl2(終濃度3mM)、1.25μl的100mMdATP(終濃度0.5mM)、1.25μl的Taq(5U/μl)和152.50μl的dH2O。
將78μl的A加尾主混合物添加到含有22μl重懸浮的DNA的每個(gè)試管中，到總體積100μl。對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，將這分成各50μl的兩個(gè)熱循環(huán)儀兼容的試管中。在熱循環(huán)機(jī)中在70℃將試管孵育30分鐘。通過將試管冷卻到4℃結(jié)束循環(huán)程序。然后將試管直接從熱循環(huán)儀轉(zhuǎn)移到冰上。通過P∶C∶P方案純化DNA。將每個(gè)文庫(kù)重懸浮在10μl緩沖液EB中并置于冰上。
為了測(cè)定回收率和估計(jì)回收的片段的大小范圍，使用20％純化的材料運(yùn)行預(yù)成形的6％TBE PAGE凝膠(Invitrogen)(附圖13)?！癕”基于凝膠的定量為“M”＝43ng(在2μl中，或20％的總量)；范圍＝大約850-1150，平均＝大約1000。“R”基于凝膠的定量＝18ng(在2μl中，或20％的總量)；范圍＝大約900-1250；平均＝大約1075。在為每個(gè)文庫(kù)保留的大約8μl體積中，存在約171ng的“M”片段和約73ng的“R”片段。
用T尾的間隔寡核苷酸(“T30”)環(huán)化然后，使用T尾的間隔寡核苷酸“T30”將A尾的文庫(kù)片段環(huán)化。通過使兩個(gè)32bp寡核苷酸退火產(chǎn)生具有單堿基“T”突出端的30bp dsDNA片段，來制備T30片段。
5’GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’(SEQ IDNO5)3’TCAGCCTCCGGTTCCGCCGGCATGCAGGTTG 5’(SEQ IDNO6)T30片段的側(cè)翼是面朝外(outward facing)的MmeI位點(diǎn)。
低聚物的退火是這樣進(jìn)行的將低聚物混合到每個(gè)低聚物50μM的終濃度、在熱循環(huán)儀中加熱到95℃10分鐘、關(guān)閉熱循環(huán)儀并容許混合物在一小時(shí)的過程中慢慢冷卻回室溫。
使用QUICK LIGATIONTM試劑盒(New England Biolabs，Beverly，MA)進(jìn)行T30片段與A尾的文庫(kù)片段的連接。如下制備反應(yīng)物?！癕”文庫(kù)環(huán)化反應(yīng)(總體積80μl)來自“R”試管的8.0μl A尾的片段(在1000bp～171ng＝0.2599pmol)；27.2μl dH2O；0.8μl的T30(1μM起始濃度(0.8pmol，過量3倍摩爾數(shù)))；40.0μl的2× QUICK LIGATIONTM緩沖液；和4.0μl的QUICKTMT4 DNA連接酶?！錜″文庫(kù)環(huán)化反應(yīng)(總體積30μl)來自″R″試管的8.0μl A尾的片段(在1075bp～73ng＝0.1032pmol)；5.2μl dH2O；0.3μl的T30(1μM起始濃度(0.3pmol，過量3倍摩爾數(shù)))；15.0μl的2× QUICK LIGATIONTM緩沖液；和1.5μl的QUICKTMT4 DNA連接酶。在將酶添加到每個(gè)試管之前和之后混合每個(gè)反應(yīng)物。在室溫下孵育反應(yīng)物10分鐘，然后移到冰上。
在熱循環(huán)儀上在65℃將連接酶熱鈍化10分鐘。為了破壞所有非環(huán)化的材料，添加核酸外切酶混合物。如下制備核酸外切酶混合物4.0μl的核酸外切酶I(20U/μl)(New England Biolabs，Beverly，MA)、0.4μl的核酸外切酶III(100U/μl)(New England Biolabs，Beverly，MA)和35.6μl的TE。將10μl核酸外切酶混合物添加到80μl“M”反應(yīng)物中，將3.75μl核酸外切酶混合物添加到30μl“R”反應(yīng)物中。試管在熱循環(huán)儀上在37℃孵育45分鐘，繼之以80℃20分鐘來使核酸外切酶熱鈍化。在下一步的RCA反應(yīng)中直接使用這個(gè)材料不用任何純化。
用隨機(jī)六聚物滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)使用REPLIPHITMphi29試劑盒(EpiCentre，Madison，WI)進(jìn)行高分支(hyperbranched)的RCA來擴(kuò)增文庫(kù)材料的量。如下制備主混合物32.0μl的dNTP混合物(各25μM)、80.0μl的10× REPLIPHITM phi29反應(yīng)緩沖液、40.0μl的隨機(jī)DNA六聚物(1mM，合成為5′-NNNN*N*N-3′，其中“*”代表硫代磷酯鍵)、552.0μL的dH2O和16.0μl的5× SybrGreen。將主混合物分入兩個(gè)270μl的試管，在試管中30μl的“M”或“R”材料被混合到總體積300μl。然后將每個(gè)試管分入6個(gè)50μl的試管。為了使環(huán)化的模板變性，將試管加熱到95℃5分鐘，隨后快速冷卻到4℃。將2.5μl的phi29酶添加到冰上的每個(gè)試管，到每試管52.5μl的總體積。良好地混合試管并保持在冰上。在熱循環(huán)儀中在30℃將試管孵育過夜。
在實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)儀上進(jìn)行RCA反應(yīng)，通過存在于反應(yīng)中的SybrGreen染料觀察擴(kuò)增。在2小時(shí)的時(shí)點(diǎn)，dsDNA含量已經(jīng)上升并且變平，表明運(yùn)行反應(yīng)過夜可能不是必需的。
用MICROCON-30柱(Millipore，Billerica，MA)純化DNA，用總共1mL的TE洗滌。沉淀有相當(dāng)?shù)牧?。采用MICROCON-30膜的幾次洗滌來最大化回收率。使用在50℃加熱和添加額外的重懸浮緩沖液(緩沖液EB)的組合來重懸浮DNA。每個(gè)文庫(kù)回收了大約750μL。
在NANODROP儀(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)上測(cè)定樣品“M”＝230ng/μL和“R”＝204ng/μL。因而RCA反應(yīng)產(chǎn)生每個(gè)文庫(kù)～150μg。
用MmeI消化(IIs型)來釋放配對(duì)的標(biāo)簽用MmeI消化每個(gè)文庫(kù)的約40μg。由于在T30片段中MmeI位點(diǎn)在遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)處切割，在T30片段的兩個(gè)末端都有面朝外的MmeI位點(diǎn)，這個(gè)消化預(yù)期釋放側(cè)翼是具有2bp突出端的～18bp標(biāo)簽的T30片段。由于在MmeI消化之前用T30環(huán)化基因組片段，預(yù)期這些標(biāo)簽相對(duì)于它們起點(diǎn)的位置是配對(duì)的。
如下制備反應(yīng)物。從New England Biolabs(Beverly，MA)獲得MmeI、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和NEBuffer 4(10×)。32mM SAM在1× NEBuffer4中按1∶20稀釋(-＞1.6mM)。
反應(yīng)“M” 反應(yīng)“R”DNA 173.9 196.0dH2O 664.5 642.4NEBuffer 4(10×)100.0 100.01.6mM SAM 1.6 1.6MmeI(2U/μl)60.060.0總體積(μl) 1000.0 1000.0表1.
在冰上制備反應(yīng)物，在添加酶之前良好地混合試劑。每個(gè)反應(yīng)分到8個(gè)125μl的試管，在37℃在熱循環(huán)儀上孵育30分鐘。P∶C∶P純化如上述，只是僅使用2體積的乙醇而不是2.5體積，沒有最初的熱鈍化。將每個(gè)文庫(kù)的消化的片段重懸浮在80μl的TE中。正如所料，在“M”和“R”泳道觀察到了約70bp的條帶(附圖14)。
標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽文庫(kù)的PAGE純化每個(gè)文庫(kù)的所有量如上述在10泳道預(yù)成形的6％PAGE凝膠上運(yùn)行，每個(gè)文庫(kù)使用4個(gè)泳道(20μl的文庫(kù)和5μl的5×染料)。切下在約70堿基對(duì)處的鮮明條帶。核定每個(gè)文庫(kù)類型的所有泳道的片段，如上所述進(jìn)行凝膠萃取，只是洗脫為大約3小時(shí)。在P∶C∶P回收之后，將每個(gè)文庫(kù)的DNA重懸浮在約20μl的TE中。運(yùn)行鑒定性凝膠來測(cè)定回收的材料(附圖15)?！癕”和“R”文庫(kù)都被估計(jì)為大約12.5ng/μl，在此時(shí)各保留了18μl。
標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽文庫(kù)的末端修復(fù)在MmeI消化之后，標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽分子含有2bp的3’突出端。如上所述使用EpiCentre END-ITTMDNA末端修復(fù)試劑盒(Madison，WI)對(duì)修復(fù)末端。如下制備反應(yīng)物8.50μl的“M”或“R”片段(12.5ng/μl約100ng)；1.25μl的10× END-ITTM緩沖液、1.25μl的10× END-ITTMATP、1.25μl的10×END-ITTM dNTPs和0.25μl的END-ITTM酶，總體積12.5μl。
在室溫下孵育反應(yīng)物45分鐘，然后直接移到4℃。通過添加40μl的TE將體積增加到50μl，如上所述P∶C∶P抽提反應(yīng)物。沉淀步驟在-70℃過夜。回收的DNA重懸浮在8μl的TE中。
FDV2(PR1-F)和RDV2(PR1-R)引物寡核苷酸的連接1∶1混合(50μM的終濃度)通過退火完全互補(bǔ)的寡核苷酸(100μM，HPLC純化的)來制備引物-接頭(dsDNA，F(xiàn)DV2和RDV2)，加熱到95℃10分鐘，然后讓反應(yīng)物在1小時(shí)的過程中慢慢地冷卻。
在“退火”形式中，F(xiàn)DV2和RDV2如下FDV25’-AACCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO7)3’-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA(SEQ ID NO8)RDV25’-AACTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO9)3’-TTGACGGGGCCCAAGGAGTAAGAGA(SEQ ID NO10)FDV2和RDV2分子是未磷酸化的，因而預(yù)期不能自身-自身連接，也不能相互連接。末端修復(fù)的連接分子是磷酸化的，因而，使用過量的FDV2和RDV2來最小化文庫(kù)分子的連環(huán)化(concatamerization)事件。引物-接頭與文庫(kù)分子的連接是平末端-平末端的，因而在存在聚乙二醇(PEG)的情況下進(jìn)行以改善連接效率。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置如下12.3μl的dH2O、8.0μl純化的平末端化的文庫(kù)片段(“M”or“R”；大約100ng，即，大約2pmol)、1.0μl的RDV2(50μM，50pmol)、1.0μl的FDV2(50μM，50pmol)、2.5μl的10× T4連接酶緩沖液(New England Biolabs，Beverly，MA)、21.2μl的40％PEG(40％聚乙二醇8000)和2.0μl的T4連接酶(2000U/μL)(NewEngland Biolabs)。通過混合除了PEG和連接酶的試劑在室溫制備反應(yīng)物。然后添加和混合入PEG，并添加和混合入連接酶。在16℃孵育反應(yīng)物過夜。為了純化，用TE將反應(yīng)體積增加到100μl，并P∶C∶P純化。將沉淀重懸浮在10μl的緩沖液EB中。
配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)的PAGE大小選擇在連同合適的階梯(ladder)的10孔6％PAGE凝膠上運(yùn)行整個(gè)反應(yīng)物。使凝膠跑動(dòng)足夠遠(yuǎn)，從而未連接的RDV2和FDV2(相對(duì)于文庫(kù)以大量的摩爾過量存在)預(yù)計(jì)已經(jīng)跑出凝膠。正如所料觀察到合適大小的條帶的三聯(lián)體(triplet)(產(chǎn)自RDV2/文庫(kù)片段/RDV2連接，RDV2/文庫(kù)片段/FDV2連接或FDV2/文庫(kù)片段/FDV2連接)。切下含有完整三聯(lián)體的區(qū)域，如上所述純化凝膠，只是洗脫是三個(gè)小時(shí)，在-70℃乙醇沉淀過夜。樣品各自重懸浮在20μl的緩沖液EB中。
斷口翻譯以消除dsDNA文庫(kù)中的切口由于在連接中僅文庫(kù)分子是5′磷酸化的，預(yù)計(jì)連接產(chǎn)物含有必需修復(fù)的切口。用剩余材料的一半繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，如下進(jìn)行切口平移10.0μl的文庫(kù)(假定100％的回收率，這應(yīng)該是50ng的標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽分子加上連接的引物-接頭的質(zhì)量)；0.5μl的dNTP混合物(25mM，即每種核苷酸的終濃度500μM)、2.5μl的10× NEBuffer-2(New England Biolabs)、1.0μl的大腸桿菌DNA聚合酶I(10U/μl)(New England Biolabs)和11.0μl的dH2O。在冰上制備反應(yīng)物并混合，然后在16℃孵育30分鐘。為了純化，用TE將反應(yīng)物的體積增加到100μl，反應(yīng)物用P∶C∶P純化，重懸浮在10μl的TE中。
配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)的PCR擴(kuò)增在這個(gè)階段進(jìn)行PCR以1)增加我們必需操作的文庫(kù)材料的數(shù)量，和2)在單個(gè)步驟中消除無關(guān)的連接產(chǎn)物。不希望受理論的限制，這個(gè)步驟中描述的PCR所應(yīng)該產(chǎn)生的唯一連接產(chǎn)物具有在兩邊側(cè)翼是正確定向的RDV2和FDV2的標(biāo)簽-T30-標(biāo)簽(注意到，T30片段本身不是對(duì)稱的，因而相對(duì)于RDV2和FDV2片段可能是在任何方向上)。
在復(fù)雜的混合物被PCR擴(kuò)增時(shí)，關(guān)鍵的是在引物分子耗盡前停止PCR反應(yīng)。這是由于這樣的事實(shí)，一旦引物已經(jīng)用完，文庫(kù)分子將開始相互充當(dāng)引物，并且文庫(kù)分子有足夠的相似性(～134個(gè)中～100個(gè)相同的堿基)，因而在變性之后不太可能的是，給定的單鏈文庫(kù)分子將與其完全互補(bǔ)的配偶體退火。在引物耗盡后變性和退火所產(chǎn)生的文庫(kù)可能含有許多“雜交”文庫(kù)分子。
在實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增(OPTICONTM2，MJ Research，Bio Rad，Waltham，MA).
每50μl ×20(總體積1000μl)10×PCR緩沖液 5 10025mM(每種)dNTPs 0.4 8
50mM MgCl21.530Platinum Taq 0.2μl 4水 42.7 853RDV2-T(100μM) 0.12FDV2-T(100μM) 0.12SybrGreen(200×) 0.0025 0.5表2.
主混合物(在表2中列出)被分成兩個(gè)499.5μl的試管，向每個(gè)試管添加0.5μl的文庫(kù)材料(“M”或“R”)。每個(gè)文庫(kù)的PCR被分入各50μl的8個(gè)試管(總體積400μl)，來在熱循環(huán)儀上操作。熱循環(huán)如下進(jìn)行1.94℃2分鐘2.94℃30秒3.55℃30秒4.72℃90秒到步驟2在15個(gè)循環(huán)之后停止反應(yīng)，因?yàn)镈NA的數(shù)量開始達(dá)到穩(wěn)定。將每個(gè)文庫(kù)的反應(yīng)物合并到單個(gè)試管，用QIAQUICK(Qiagen，Valencia，CA)柱根據(jù)廠家對(duì)于PCR產(chǎn)物純化的推薦來純化。重懸浮是在100μl的緩沖液EB中。該體積對(duì)于下一個(gè)步驟來說太大，所以對(duì)樣品進(jìn)行乙醇沉淀(如同P∶C∶P方案中，只是不進(jìn)行苯酚抽提)，在10μl TE中洗滌和重懸浮。
配對(duì)的標(biāo)簽文庫(kù)的PAGE大小選擇在6％PAGE凝膠上運(yùn)行反應(yīng)物。如先前所述切下“最終”文庫(kù)條帶(約135堿基對(duì)處的鮮明條帶)，并洗脫和純化。這是最后的純化步驟，因此，為嘗試得到盡可能嚴(yán)格的凝膠純化以最小化可能存在的非文庫(kù)分子的污染，這是關(guān)鍵的。運(yùn)行PAGE凝膠時(shí)不使用階梯，因?yàn)檫@些分子也可能是常見的污染物，并以垂直斬落式(guillotine-type)動(dòng)作使用刀片，而不是解剖刀。
在過夜沉淀的P∶C∶P純化之后，將回收的文庫(kù)材料重懸浮在10μl的TE中。為了給文庫(kù)定量，運(yùn)行具有合適標(biāo)記物的6％PAGE凝膠(附圖16)。根據(jù)文庫(kù)和階梯條帶的相對(duì)強(qiáng)度，估計(jì)濃度為2ng/μl，即約9*2＝18ng的每個(gè)文庫(kù)剩余。如果文庫(kù)是135bp，則濃度是大約23nM。在TE中將文庫(kù)稀釋到用于乳狀液PCR的各種水平，原始的文庫(kù)和它們的稀釋物都保存在-20℃。
經(jīng)由克隆和Saneer測(cè)序的文庫(kù)驗(yàn)證為了驗(yàn)證文庫(kù)標(biāo)簽如預(yù)期的那樣是大腸桿菌衍生的和配對(duì)的，用Invitrogen TOPOTM-4試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆“R”文庫(kù)片段，隨后使用M13F/M13R進(jìn)行PCR，以及Sanger測(cè)序(每個(gè)克隆單個(gè)讀取結(jié)果)。盡管提交了96個(gè)PCR產(chǎn)物用于測(cè)序，其中20個(gè)返回的不是垃圾結(jié)果，就是與載體或污染物相關(guān)。正如所料，剩余的76個(gè)插入物顯示其為RDV2和FDV2片段所適當(dāng)?shù)貍?cè)翼。這76個(gè)中一個(gè)是6bp插入序列(TTATCA)；一個(gè)是大腸桿菌基因組片段(長(zhǎng)度65bp；在BLAST上63/63100％與大腸桿菌MG1655基因組匹配)；一個(gè)是大腸桿菌基因組片段(長(zhǎng)度70bp；在BLAST上69/69100％與大腸桿菌MG1655基因組匹配)；一個(gè)含有側(cè)翼是～27bp的RDV2引物，在NCBI數(shù)據(jù)文庫(kù)中沒有顯著的匹配；正如所料，七十二個(gè)含有被T30片段分隔的兩個(gè)標(biāo)簽。
在這72個(gè)中，標(biāo)簽長(zhǎng)度有以下的分布1個(gè)標(biāo)簽為9bp；1個(gè)標(biāo)簽為11bp；2個(gè)標(biāo)簽為13bp；1個(gè)標(biāo)簽為14bp；1個(gè)標(biāo)簽為15bp；2個(gè)標(biāo)簽為16bp；73個(gè)標(biāo)簽為17bp；62個(gè)標(biāo)簽為18bp；以及1個(gè)標(biāo)簽為22bp。對(duì)于配對(duì)而言，匹配大腸桿菌基因組的標(biāo)簽如下4個(gè)的情況是一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)簽都不具有與大腸桿菌基因組的任何理想匹配(可能由于測(cè)序錯(cuò)誤或非規(guī)范序列)；1個(gè)是“未配對(duì)的”，因?yàn)閮蓚€(gè)標(biāo)簽都匹配獨(dú)特的位置，但似乎不來源于相同的基因組區(qū)域；以及67個(gè)作為配對(duì)的標(biāo)簽與大腸桿菌基因組匹配(相同的方向，標(biāo)簽間距離在預(yù)期的限制之內(nèi))。對(duì)于這76個(gè)配對(duì)的標(biāo)簽，配對(duì)的標(biāo)簽的距離分布是951+/-90bp。最小距離是729bp，最大距離是1162bp。
因而，68個(gè)讀取結(jié)果的配對(duì)率(paring rate)是67/68，即，大約98.5％。在文庫(kù)中，呈現(xiàn)由T30片段分隔的配對(duì)的大腸桿菌標(biāo)簽的、可被乳狀液PCR擴(kuò)增的分子的比率，最低的估計(jì)是67/76，即，88％。如果四個(gè)讀取結(jié)果中有一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)簽不匹配，而這樣的四個(gè)讀取結(jié)果確實(shí)代表由于Sanger測(cè)序錯(cuò)誤或“R”菌株與規(guī)范的基因組序列參照之間的差異而不能匹配的配對(duì)的讀取結(jié)果，實(shí)際的比率可能稍微更高。
盡管樣本容量很小(n＝72)，在標(biāo)簽序列中觀察到偏離了25/25/25/25的頻率，其可能是顯著的傾向(在表3中列出)。第一欄中的數(shù)字代表標(biāo)簽堿基在一個(gè)或另一個(gè)引物或在T30片段中的位置。表中所列的堿基頻率是來自這樣的鏈如果人們從所述引物或T30片段起進(jìn)行延伸測(cè)序(5’到3’)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)上述頻率。。括號(hào)中的數(shù)字是實(shí)際的計(jì)數(shù)數(shù)目(與頻率相對(duì))。
引物/標(biāo)簽連接A GC T+1 0.315(45) 0.315(45)0.154(22) 0.217(31)+2 0.340(49) 0.104(15)0.208(30) 0.347(50)+3 0.292(42) 0.208(30)0.146(21) 0.354(51)+4 0.229(33) 0.250(36)0.264(38) 0.257(37)+5 0.333(48) 0.194(28)0.243(35) 0.229(33)T30/標(biāo)簽連接A GC T+1 0.299(43) 0.194(28)0.326(47) 0.181(26)+2 0.299(43) 0.319(46)0.146(21) 0.236(34)+3 0.312(45) 0.222(32)0.222(32) 0.243(35)+4 0.188(27) 0.236(34)0.264(38) 0.312(45)+5 0.252(36) 0.196(28)0.273(39) 0.280(40)表3.
實(shí)施例VII對(duì)與珠子偶聯(lián)的寡核苷酸進(jìn)行平行測(cè)序在實(shí)驗(yàn)中對(duì)經(jīng)由生物素聯(lián)結(jié)到鏈霉抗生物素蛋白包被的超順磁性珠子的寡核苷酸獲得了5到8個(gè)堿基對(duì)的讀取結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖6所示。珠子被固定在丙烯酰胺中。與早先已知的方法相比，在附圖6中列出的珠子組容許本領(lǐng)域技術(shù)人員在單個(gè)載玻片的每個(gè)單位面積上測(cè)序更多10,000倍的特征。
為了進(jìn)一步小型化，在1微米珠子上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來產(chǎn)生短序列讀取結(jié)果(每個(gè)模板4個(gè)堿基對(duì))(附圖7)。這些結(jié)果接近“每個(gè)像素1個(gè)序列讀取結(jié)果”的分辨率，因?yàn)槊總€(gè)珠子僅由約1到4個(gè)有效像素代表。在這個(gè)證明了的珠子大小和密度下，可以從3英寸顯微鏡載玻片的每1英寸超過3千萬個(gè)獨(dú)立的珠子獲得測(cè)序讀取結(jié)果。
實(shí)施例VIII微球體的單層在實(shí)施例III中闡述的程序的變體利用了自組裝單層中的親合性來為擴(kuò)增珠子的富集提供條件。這避免了與當(dāng)前的擴(kuò)增程序有關(guān)的問題。在這種程序中，使用稀的目的DNA來避免每個(gè)珠子上出現(xiàn)兩個(gè)擴(kuò)增子，因而具有零個(gè)目標(biāo)DNA的珠子數(shù)目接近泊松分布。
本發(fā)明還包括使用類似的乳狀液來在載玻片上的核酸樣品(例如，組織切片中的RNA、微陣列、伸展的(streched)染色體)的“原位”形成密封室(來限制擴(kuò)增的蔓延)。使用固定的乳狀液還將有助于限制、穩(wěn)定和產(chǎn)生更均勻分布的乳滴大小。
為了獲得3英寸顯微鏡載玻片的每1英寸上數(shù)億到數(shù)十億個(gè)獨(dú)立的測(cè)序讀取結(jié)果，可以以高密度包裝相同的1微米珠子。產(chǎn)生超順磁性珠子的自組織單層(SOM)(附圖8)。也可以使用橫向磁場(chǎng)來構(gòu)建多層。從完好地包被有1微米珠子的單層獲取30堿基對(duì)讀取結(jié)果將產(chǎn)生～560億(billion)個(gè)堿基的序列。
實(shí)施例IX無乳狀液在粒子上擴(kuò)增核酸不受理論的限制，降低聚合酶群落的形體尺寸到微米或亞微粒大小將改善通量至少1000倍。這可以通過將一擴(kuò)增引物限制在聚合物珠子(例如1μm順磁性的珠子、可從Dynal，Oslo，Norway獲得)、聚合物網(wǎng)絡(luò)或聚合物納米結(jié)構(gòu)上來實(shí)現(xiàn)。因而，聚合酶群落形體尺寸由珠子或聚合物基質(zhì)的大小來決定，因而與孔隙大小和/或聚合物基質(zhì)(丙烯酰胺凝膠)的交聯(lián)含量(crosslinking content)、和目標(biāo)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度無關(guān)。類似于常規(guī)的聚合酶群落PCR，在聚合物基質(zhì)(例如丙烯酰胺凝膠)中對(duì)聚合酶群落珠子進(jìn)行實(shí)際的擴(kuò)增步驟，這有助于保持單個(gè)珠子的位置和部分地限制擴(kuò)增子的擴(kuò)散。本發(fā)明的一個(gè)重要的部分是包含添加劑(例如陽離子脂質(zhì)、多胺、聚陽離子，等等)，其形成凝膠中的(in-gel)空隙，例如微團(tuán)或聚集物(aggregate)，圍繞著聚合物珠子并容許在固相中有效的擴(kuò)增(附圖9A-9D)。這個(gè)改進(jìn)的主要益處是目標(biāo)擴(kuò)增子和另一個(gè)擴(kuò)增引物被差異性地分配到珠子附近，其提高了擴(kuò)增效率和/或?qū)χ樽拥慕咏潭取Ｋ苊饬诵纬扇闋钜旱谋匦栊?，因此容許更簡(jiǎn)單的多重?cái)U(kuò)增，甚至保存要擴(kuò)增的分子的起始組的2D或3D排列。
作為選擇，可以將第二擴(kuò)增引物固定到聚合物基質(zhì)中(例如，通過acrydite修飾或其它交聯(lián)方法)。因而，擴(kuò)增只需很少或無需游離的第二引物。這將消除擴(kuò)增期間珠子之間的交叉(crossover)并因而增強(qiáng)克隆性(clonality)。除了聚合物基質(zhì)之外(例如，丙烯酰胺凝膠)，膠粒團(tuán)或聚集物的形成可以進(jìn)一步限制游離擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)散，如果存在任何產(chǎn)物的話(即，如果存在殘余的游離第二擴(kuò)增引物，或在擴(kuò)增期間使用游離第二引物)。聚陽離子層(或網(wǎng)絡(luò))內(nèi)聚陰離子(例如，DNA)的移動(dòng)性相對(duì)于從聚陽離子自由擴(kuò)散開是快的，因而反應(yīng)可以接近指數(shù)的，直到陽離子層被填充因而幾乎停住，進(jìn)一步增強(qiáng)隨后的圖像的鮮明度。
附圖9A-9D描繪了通過生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用預(yù)先交聯(lián)到1μm Dyna珠子的一擴(kuò)增引物的拷貝。其它擴(kuò)增引物被acrydite修飾以允許它通過聚合作用(左)摻入到聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)中。兩個(gè)引物，以及目的核酸擴(kuò)增模板被組裝到丙烯酰胺基質(zhì)中。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后是變性和Cy3標(biāo)記的探針的雜交?？梢詸z測(cè)到很少的擴(kuò)增產(chǎn)物(右)。與(左)相比，當(dāng)將陽離子脂質(zhì)添加到組合混合物并孵育15分鐘時(shí)，擴(kuò)增效率大大地提高，這由更亮的信號(hào)證明了。
實(shí)施例X使用聚合酶群落測(cè)序分析DNA修飾甲基(CH3)基團(tuán)與CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基的5′碳的連接(這被稱為外遺傳修飾(epigenic modification))構(gòu)成了控制細(xì)胞基因表達(dá)的重要機(jī)制。在基因組甲基化模式的動(dòng)力學(xué)方面的定量的知識(shí)會(huì)地對(duì)生物學(xué)，包括發(fā)育控制和病理狀態(tài)產(chǎn)生很大的影響。對(duì)異常DNA甲基化的全基因組(genome-wide)檢測(cè)依靠甲基化特異性酶的限制性消化，繼之以差異展示(MCA-RDA；Ueki et al.(2001)Cancer Res.618540，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)或微陣列分析(DMH(Yan et al.(2000)Clin.CancerRes.61432)、ECIST(Shi et al.(2002)Cancer Res.623214，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)。雖然可以鑒定候選的差異性甲基化基因座，它們都不能監(jiān)測(cè)對(duì)于任何給定的CpG島是獨(dú)特的組合的甲基化事件?？梢皂樖降?in cis)搜尋多個(gè)甲基化的關(guān)系的唯一的技術(shù)是甲基化特異性測(cè)序。然而，單個(gè)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組片段的克隆和常規(guī)測(cè)序的性能使得這種方法是勞動(dòng)密集的和低通量的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在聚合酶群落平臺(tái)上應(yīng)用甲基化特異性測(cè)序，帶來了相對(duì)傳統(tǒng)的甲基化測(cè)序方法的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。在固相或半固相(這里是丙烯酰胺)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA片段可以被直接擴(kuò)增，因而消除了克隆步驟的勞動(dòng)力需求和由差別的克隆效率引入的可能的偏倚。(2)甲基-dC的檢測(cè)可以按高度并行方式實(shí)現(xiàn)，同時(shí)搜尋數(shù)千到數(shù)百萬的單個(gè)分子。兩種方法，重復(fù)探測(cè)(repetitive probing)和FISSEQ(Zhu et al.(2003)Science301836；Mitra et al.(2003)Analyt.Biochem.32055，為了所有目的通過完全引用將它們合并在此)可以用于監(jiān)測(cè)差異甲基化事件。重復(fù)探針適合于研究少量的已知基因座，而FISSEQ對(duì)于整個(gè)基因組研究當(dāng)然地具有優(yōu)勢(shì)(參見(4)，下文)。(3)由于聚合酶群落平臺(tái)是基于單個(gè)分子的技術(shù)，需要的輸入材料很少。因而可以利用單個(gè)細(xì)胞和/或染色體。單獨(dú)的細(xì)胞和/或染色體(例如，染色體分散(chromosome spread))可以包埋到聚合物基質(zhì)或凝膠(例如，聚丙烯酰胺)中，隨后是固相亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增。這將消除DNA純化步驟，并避免了樣品制備期間樣品損耗和污染的可能性。(4)作為(3)的延伸，多重PCR和/或完整基因組擴(kuò)增(用，例如，Phi29)可以用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和/或染色體進(jìn)行。這容許在單個(gè)細(xì)胞和/或單個(gè)染色體水平確定完整基因組DNA的甲基化狀態(tài)。
實(shí)施例XI熒光共振能量傳遞(FRET)通過對(duì)單個(gè)FISSEQ步驟使用形成FRET供體-受體對(duì)的兩種不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP，例如Cy3-dATP供體加上Cy5-dATP受體，人們可以在均聚物操作中辨別零個(gè)、一個(gè)和兩個(gè)相同的堿基。首先用供體dNTP的激發(fā)波長(zhǎng)來激發(fā)并尋找在供體發(fā)射波長(zhǎng)和接受體波長(zhǎng)處的發(fā)射。然后用受體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)并尋找在接受體發(fā)射波長(zhǎng)處的發(fā)射。人們可以將該順序反過來，并首先激發(fā)接受體以最小化FRET導(dǎo)致的受體熒光基團(tuán)的光漂白。
例如，如果有零個(gè)dA殘基要摻入到給定循環(huán)中，則人們將觀察不到(或低的)信號(hào)。1個(gè)dA將導(dǎo)致對(duì)每個(gè)由于FRET的發(fā)生而被激發(fā)的熒光團(tuán)的相應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)被檢測(cè)到。當(dāng)在供體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，作為發(fā)生FRET的結(jié)果，兩個(gè)dA將產(chǎn)生接受體波長(zhǎng)處的發(fā)射。作為2dA實(shí)例的定量性變體，可以測(cè)定三個(gè)或更多dA。
實(shí)施例XII文庫(kù)用于滾環(huán)/擴(kuò)增的文庫(kù)直接從基因組DNA產(chǎn)生環(huán)形大文庫(kù)的一個(gè)方法是使用末端處的隨機(jī)N-mer以及沒有用于微陣列雜交的內(nèi)部標(biāo)簽例如
NNNNNN...(通用引物(common primer)1)..(切割位點(diǎn))..(通用引物2)..NNNNNN這些N-mer可以用來隨機(jī)地與DNA雜交。不同于本領(lǐng)域的系統(tǒng)，N-mer可以互相隔開一定距離而不是單個(gè)堿基。將由所利用的寡核苷酸的長(zhǎng)度限制這種距離。
聚合酶、連接酶和dNTPs可以用于缺口填充和連接以產(chǎn)生“掛鎖的”(padlocked)探針。不同于通過重新環(huán)化釋放掛鎖，可以用限制性內(nèi)切酶(具有不存在于寡核苷酸中的位點(diǎn))和核酸外切酶消化基因組DNA，僅留下含有一段基因組堿基的環(huán)化的探針。該環(huán)形物可以用于滾環(huán)方法。做為選擇，如果使用乳狀液方法，可以通過裂解環(huán)形物來釋放掛鎖，留下側(cè)翼是通用引物的基因組序列。
跳查(jumping)文庫(kù)這個(gè)實(shí)施例闡述了一種方法，通過這種方法經(jīng)由phi29滾環(huán)擴(kuò)增引物可以產(chǎn)生準(zhǔn)備好聚合酶群落的文庫(kù)。為了使用MmeI(或EcoP15I)產(chǎn)生跳查文庫(kù)，可以進(jìn)行以下步驟(1)用核酸內(nèi)切酶完全或部分裂解基因組(例如NlaIII(CATG^)或CviJI**(NG^CN)或甚至DNase；4bp突出端可能是起始的最干凈的位置)；(2)可選的大小選擇(大小選擇越精確，則在復(fù)雜重復(fù)區(qū)域中序列的裝配越精確)；(3)連接雙標(biāo)簽雙MmeI接頭，從而形成環(huán)形物；(4)可選的大小選擇；(5)用MmeI切割，鈍化和再次環(huán)化；和(6)通過隨機(jī)地切口，通過序列特異性切口酶，通過用DNA、PNA、RNA引物的鏈侵入，或通過RNA聚合酶或引物酶引發(fā)，環(huán)形物可以被引發(fā)進(jìn)入滾環(huán)。
除了最初的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的信息之外，這種方法將從每個(gè)末端產(chǎn)生多達(dá)27個(gè)堿基對(duì)的序列信息(對(duì)于NlaIII總共62個(gè)堿基對(duì))，并且更重要地容許裝配跨越更長(zhǎng)的從頭序列(de novo sequence)。
用于非滾環(huán)文庫(kù)和本發(fā)明的非滾環(huán)文庫(kù)的特定限制性內(nèi)切酶的非限制性實(shí)例如下SAGEBsmFI，可從New England Biolabs(NEB)，Beverly，MA獲得(VelculeScu et al.(1995)Science 5235484，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)；LongSageMmeI，可從NEB獲得(Saha et al.(2002)Nat Biotechnol.20508，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)；CAGEMmeI，可從NEB獲得(Shiraki et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10015776，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)；SuperSageEcoP15I(Matsumura et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10015718，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)；SAGSBsaXI，可從NEB獲得(Torsteinand Meyerson，Serial Analysis of Genome Subsets)。BsmFI和EcoP15I具有5′突出端，而MmeI具有3′突出端。對(duì)于MmeI，通過連接互補(bǔ)配對(duì)，3′的2個(gè)堿基對(duì)信息被保留)；快速鳥槍克隆利用了兩個(gè)堿基識(shí)別核酸內(nèi)切酶CviJI(Fitzgerald et al.(1992)Nucleic Acids Res.203753，為了所有目的通過完全引用將它合并在此)。
實(shí)施例XIII排除體積(excluded volume)的延伸這個(gè)實(shí)施例提供能夠以高的擴(kuò)增珠子反應(yīng)物體積比產(chǎn)生克隆擴(kuò)增珠子，而不需要PCR的手段。一聚合物(或顆粒)與另一聚合物(或顆粒)相互作用可以防止與其它附近的粒子進(jìn)一步相互作用。通過滾環(huán)擴(kuò)增預(yù)先擴(kuò)增模板來產(chǎn)生長(zhǎng)的、大體積的連環(huán)體(concatamers)。這樣，使用過量的這種模板(附圖10)，人們可以飽和試管中的所有珠子而無需每個(gè)珠子發(fā)生多次連環(huán)體結(jié)合事件。
例如，使用60-mer切口環(huán)形物的文庫(kù)，各具有30堿基對(duì)的通用標(biāo)簽和來自基因組文庫(kù)的30堿基對(duì)的插入序列。使用phi29滾環(huán)(沒有不同于切口的任何引物)進(jìn)行約一小時(shí)，直到有的接近14個(gè)串聯(lián)的單鏈重復(fù)懸掛于初始環(huán)形物。在低鹽下，其將有約65bp(＝200微米延伸)的長(zhǎng)度，和幾立方微米的排阻體積。如果模板的稀溶液與攜帶互補(bǔ)通用標(biāo)簽的1微米珠子相互作用，則首先接觸珠子的模板將在許多位點(diǎn)結(jié)合并排除其它模板的結(jié)合(在附圖10中闡述)。人們可以在低鹽下洗滌珠子(來降低與其它模板的聚集)，然后重新開始滾環(huán)擴(kuò)增(僅用結(jié)合珠子的引物)。不受理論的限制，這將產(chǎn)生用于測(cè)序的足夠的單鏈模板(由于每個(gè)引物將與許多串聯(lián)的單鏈重復(fù)結(jié)合，這甚至可能產(chǎn)生比PCR獲得的更多)。這種方法將避免熱循環(huán)或珠子分選的需要。
實(shí)施例XIV
參考文獻(xiàn)為了所有目的通過完全引用將每個(gè)參考文獻(xiàn)合并在此。
Aach and Church(2004)J.Theor.Biol.22831Merritt et al.(2003)Nucleic Acids Res.31e84Mikkilineni et al.(2003)Biotechnol.Bioeng.86117Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.320(1)55Zhu et al.(2003)Science 301(5634)836Butz et al.(2003)BMC Biotechnol.3111Denkov et al.(1992)Langmuir 83183Dressman et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1008817Brenner et al.(2000)Nat.Biotechnol.18630Mitra et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1005926Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.32055Zhu et al.(2003)Science 301836
序列表序列表<110>哈佛大學(xué)的校長(zhǎng)及成員們(PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE)<120>聚合酶群落熒光原位測(cè)序珠<130>10498-00083<150>60/548,631<151>2004-02-27<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>雙生物素部分(Dual biotin moieties)<400>1ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t41<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>2ctgccccggg ttcctcattc tct23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>3cctctctatg ggcagtcggt gat23<210>4<211>69
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的俘獲(capture)引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>生物素部分(biotin moiety)<400>4cgtaccccgc ttggtctttc tcccgtaccc cgcttggtct ttctccctgc cccgggttcc60tcat tctct 69<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的T尾的間隔寡核苷酸(T-tailed spacer oligonucleotide)<400>5gtcggaggcc aaggcggccg tacgtccaac t 31<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的T尾的間隔寡核苷酸<400>6gttggacgta cggccgcctt ggcctccgac t 31<210>7<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>7aaccactacg cctccgcttt cctctctatg ggcagtcggt gat 43<210>8<211>43<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的PCR引物<400>8atcaccgact gcccatagag aggaaagcgg aggcgtagtg gtt 43<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>9aactgccccg ggttcctcat tctct 25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>10agagaatgag gaacccgggg cagtt 2權(quán)利要求
1.包含多個(gè)珠子的陣列，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體，且其中所述多個(gè)珠子被固定在半固體介質(zhì)中以形成陣列。
2.權(quán)利要求1的陣列，其中所述半固體介質(zhì)附著在固相支持物上。
3.權(quán)利要求2的陣列，其中所述支持物是顯微鏡載玻片或流動(dòng)池。
4.權(quán)利要求1的陣列，其中所述單獨(dú)的珠子包含附著于其上的兩種、三種或四種不同的基本上同一的核酸序列群體。
5.權(quán)利要求1的陣列，其中至少40％的所述單獨(dú)的珠子包括附著于其上的基本上同一的核酸序列群體。
6.權(quán)利要求1的陣列，其中所述珠子被固定為單層。
7.權(quán)利要求1的陣列，其中所述半固體介質(zhì)具有x、y和z軸，且所述多個(gè)的珠子相對(duì)于x和y軸隨機(jī)地排列。
8.權(quán)利要求1的陣列，其中所述半固體介質(zhì)具有頂和底表面，且所述多個(gè)珠子被固定在接近頂表面。
9.權(quán)利要求2的陣列，其中所述半固體介質(zhì)具有頂和底表面，且所述固相支持物附著于底表面。
10.權(quán)利要求1的陣列，其中所述半固體介質(zhì)選自由聚丙烯酰胺、纖維素、聚酰胺、交聯(lián)的瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖和交聯(lián)的聚乙二醇構(gòu)成的組。
11.權(quán)利要求1的陣列，其中所述多個(gè)珠子包含多個(gè)克隆珠子。
12.權(quán)利要求1的陣列，其中所述多個(gè)珠子包含文庫(kù)。
13.產(chǎn)生陣列的方法，包括步驟a)提供多個(gè)珠子，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體；和b)將所述珠子固定在半固體介質(zhì)上形成陣列。
14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括在步驟b)中將半固體介質(zhì)附著到固相支持物上。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述支持物是顯微鏡載玻片或流動(dòng)池。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述多個(gè)珠子包含附著于其上的兩種、三種或四種不同的基本上同一的核酸序列群體。
17.權(quán)利要求13的方法，其中至少40％的所述單獨(dú)的珠子包括附著于其上的基本上同一的核酸序列群體。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述珠子被固定為單層。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述半固體介質(zhì)具有x、y和z軸，且所述多個(gè)珠子相對(duì)于x和y軸隨機(jī)地排列。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述半固體介質(zhì)具有頂和底表面，且所述多個(gè)珠子被固定在接近頂表面。
21.權(quán)利要求14的方法，其中所述半固體介質(zhì)具有頂和底表面，且所述固相支持物附著于底表面。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述半固體介質(zhì)選自由聚丙烯酰胺、纖維素、聚酰胺、交聯(lián)的瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖和交聯(lián)的聚乙二醇構(gòu)成的組。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述多個(gè)珠子包含多個(gè)克隆珠子。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述多個(gè)珠子包含文庫(kù)。
25.產(chǎn)生陣列的方法，包括步驟a)提供多個(gè)珠子，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體；b)將所述珠子固定在半固體介質(zhì)上形成陣列；和c)擴(kuò)增所述基本上同一的核酸序列群體以形成具有附著于其上的擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述半固體介質(zhì)包括擴(kuò)增引物。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述半固體介質(zhì)包括在所述半固體介質(zhì)中形成空隙的添加劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述添加劑選自由陽離子脂質(zhì)、多胺和聚陽離子構(gòu)成的組。
29.產(chǎn)生陣列的方法，包括步驟a)提供多個(gè)珠子，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體；b)擴(kuò)增所述基本上同一的核酸序列群體以形成具有附著于其上的擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)固定的珠子；和c)將所述珠子固定在半固體介質(zhì)上形成陣列。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述擴(kuò)增通過乳狀液PCR進(jìn)行。
31.產(chǎn)生陣列的方法，包括步驟a)提供多個(gè)珠子，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體；b)擴(kuò)增所述基本上同一的核酸序列群體以形成具有附著于其上的擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子；c)富集具有附著于其上的擴(kuò)增的基本上同一的核酸序列群體的多個(gè)珠子以形成富集的珠子群體；和d)將所述珠子固定在半固體介質(zhì)上形成陣列。
32.富集具有附著于其上的第一核酸序列的珠子群體的方法，包括步驟a)提供珠子群體，其中單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的核酸序列群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體；b)使所述珠子群體與同所述第一核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列接觸；c)一同孵育所述珠子群體和所述第二核酸序列，從而發(fā)生雜交以形成雜交珠子的群體和未雜交珠子的群體；和d)從未雜交珠子的群體中分離雜交珠子的群體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述第二核酸被固定在捕獲珠子上。
34.權(quán)利要求32的方法，其中通過密度或親和性從未雜交珠子的群體中分離雜交珠子的群體。
35.含有陣列的試劑盒，所述陣列包含固定在半固體介質(zhì)中的多個(gè)珠子，其中所述多個(gè)珠子包括單獨(dú)的珠子，所述單獨(dú)的珠子具有附著于其上的基本上同一的氨基酸群體，其在序列上不同于附著于其它單獨(dú)的珠子上的基本上同一的核酸序列群體。
36.權(quán)利要求1的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
38.權(quán)利要求13的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
39.權(quán)利要求13的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
40.權(quán)利要求25的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
41.權(quán)利要求25的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
42.權(quán)利要求29的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
43.權(quán)利要求29的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
44.權(quán)利要求31的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
45.權(quán)利要求31的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
46.權(quán)利要求32的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。
47.權(quán)利要求32的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是擴(kuò)增的核酸序列。
全文摘要
提供了小型化、高密度、基于珠子的陣列。還提供了產(chǎn)生和使用克隆珠子以及產(chǎn)生和使用小型化、高密度、基于珠子的陣列的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1950519SQ200580013556
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者喬治·M·丘奇, 杰伊·申杜爾, 格雷戈里·J·波雷卡, 朱均 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)的校長(zhǎng)及成員們