專利名稱：增強(qiáng)細(xì)胞粘連特性的方法和組合物的制作方法
優(yōu)先權(quán)要求根據(jù)35 U.S.C§119(e)，本發(fā)明要求2004年4月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)朜o.60/566,613的權(quán)利，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。
政府支持的陳述涉及本發(fā)明的研究由(至少部分由)NIH/NHLBI授予的美國政府資助號(hào)No.HL51818支持。政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中具有增強(qiáng)粘連特性的修飾細(xì)胞以及制造和使用這些細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人胚腎(HEK)239細(xì)胞是被廣泛用于商業(yè)上和研究中的各種不同細(xì)胞的一個(gè)例子，主要由于它們易于生長和它們能夠被外源DNA有效轉(zhuǎn)染的能力。但是，293細(xì)胞和各種其它細(xì)胞衍生物的一個(gè)問題在于它們經(jīng)常很難粘附到組織培養(yǎng)容器。這使這些細(xì)胞的操作困難?？朔@個(gè)問題的一個(gè)方式是以玻連蛋白或聚賴氨酸涂覆細(xì)胞培養(yǎng)容器，其既影響成本又影響處理這樣的細(xì)胞培養(yǎng)的簡易性，使這種方法對(duì)于大規(guī)模細(xì)胞生產(chǎn)是不期望的。
通過提供方法和組合物，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中之前的缺點(diǎn)，細(xì)胞借助它們可以被修飾以在細(xì)胞表面上表達(dá)整聯(lián)蛋白以增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的粘連。
附圖簡要說明

圖1A-F.B-241細(xì)胞中人整聯(lián)蛋白cDNAs的細(xì)胞表面表達(dá)。以不同人整聯(lián)蛋白cDNAs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-241細(xì)胞系從組織培養(yǎng)板受胰蛋白酶作用。完整的活細(xì)胞以小鼠單克隆抗體染色，所述抗體結(jié)合到用于檢測α亞基的熒光素(FITC)或是用于檢測β3亞基的藻紅蛋白(PE)。所用抗體對(duì)人β3整聯(lián)蛋白(BD Bioscences，目錄號(hào)555754)、人αv整聯(lián)蛋白(Chemicon International，Inc.，目錄號(hào)CBL490F)和人血小板糖蛋白(GP)IIb，也稱為整聯(lián)蛋白αIIb整聯(lián)蛋白亞基(ChemiconInternational，Inc.，目錄號(hào)CBL589F)是特異性的。板塊(panel)表示不同B-241細(xì)胞系衍生物的螢光分布。板塊A未修飾的B-241細(xì)胞。板塊B被修飾以表達(dá)人血小板GPIIIa，也稱為β3整聯(lián)蛋白亞基的細(xì)胞。板塊C被修飾以表達(dá)人αIIb整聯(lián)蛋白亞基的細(xì)胞。板塊D被修飾以表達(dá)αIIbβ3整聯(lián)蛋白受體的細(xì)胞，其用于幾種細(xì)胞外基質(zhì)分子，包括血纖蛋白原、von Willebrand因子、纖連蛋白和玻連蛋白。板塊E被修飾以表達(dá)αv整聯(lián)蛋白亞基的細(xì)胞。板塊F被修飾以表達(dá)用于玻連蛋白的αvβ3受體的細(xì)胞。
圖2.以人整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染后BiG-45包裝細(xì)胞增加的粘連。含有馬傳染性貧血癥病毒(EIAV)-綠色熒光蛋白(GFP)載體的BiG-45EIAV包裝細(xì)胞被以不同的人整聯(lián)蛋白cDNAs轉(zhuǎn)染。細(xì)胞被接種到常規(guī)組織培養(yǎng)板的孔中。接種后一個(gè)小時(shí)，在輕微洗滌之前和之后每個(gè)孔的GFP熒光被測定以確定粘連到板的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞熒光平板讀數(shù)器(Cytofluor plate reader)被用于測量熒光。
圖3.轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的帶有和不帶有人整聯(lián)蛋白cDNAs修飾的EIAV載體產(chǎn)生細(xì)胞系。每個(gè)瓶用7.75×107個(gè)細(xì)胞接種。
圖4.質(zhì)粒pEV53B。
圖5.質(zhì)粒pESIN6.1CpuroW。
圖6.質(zhì)粒pCXIP和pCXIH。
圖7.質(zhì)粒pEV53。
圖8.質(zhì)粒pEV53A。
圖9.質(zhì)粒pEC-lacZ。
圖10.質(zhì)粒pEC-puro。
圖11.質(zhì)粒pCI-VSV-G。
發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種修飾細(xì)胞，與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比，其具有增加到至少三倍(increased at least three fold)的粘連特性，其包括重組核酸或由重組核酸組成或基本由重組核酸組成，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本文還提供的是一種293.01細(xì)胞，其包括、由和/或基本由重組核酸組成，所述重組核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本發(fā)明另外提供一種將細(xì)胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，其包括、由或基本由以下組成a)向所述細(xì)胞中引入核酸，該核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；以及b)在所述細(xì)胞可以借以粘連到所述培養(yǎng)容器的表面的條件下，將所述細(xì)胞與所述培養(yǎng)容器表面接觸。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生修飾細(xì)胞的方法，與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比，所述修飾細(xì)胞具有增加到至少三倍的粘連特性，其包括、由或基本由以下組成向所述細(xì)胞中引入重組核酸，所述重組核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本文還提供的是一種在培養(yǎng)容器的細(xì)胞中產(chǎn)生病毒顆粒的方法，其包括、由或基本由以下組成a)向所述細(xì)胞中引入選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；b)將a)的細(xì)胞置于培養(yǎng)所述培養(yǎng)容器中；以及c)在病毒借以被產(chǎn)生的條件下，將感染性病毒顆粒引入b)的培養(yǎng)容器中。
此外，提供在培養(yǎng)容器中的293.101細(xì)胞中產(chǎn)生重組慢病毒顆粒的方法，其包括、由或基本由以下組成a)將重組核酸引入293.101細(xì)胞中，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的組合；b)將(a)的細(xì)胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在(b)的細(xì)胞中引入I)第一載體，其包括、由或基本由編碼慢病毒gag和慢病毒pol的慢病毒核酸序列組成，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的至少一個(gè)基因的至少一個(gè)缺陷，和(2)包括缺陷包裝信號(hào)；II)第二載體，其包括、由或基本由慢病毒核酸序列組成，該序列包括載體基因組反轉(zhuǎn)錄所需的的順式作用序列元件，其中所述載體(1)包括活性包裝信號(hào)，(2)包括異源基因；以及III)第三載體，其包括、由或基本由病毒的核酸序列組成，其中所述第三載體(1)表達(dá)病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包裝信號(hào)，其在重組慢病毒顆粒借以被產(chǎn)生的條件下進(jìn)行。
本文另外提供的是制造包裝細(xì)胞的方法，其包括、由或基本由以載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明的修飾細(xì)胞組成，所述載體包括、由或基本由慢病毒核酸序列組成，其中所述載體包括缺陷包裝信號(hào)。
在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明修飾細(xì)胞的包裝細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括編碼至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號(hào)缺陷的，如此該細(xì)胞自身產(chǎn)生至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但是不產(chǎn)生能夠復(fù)制的感染性病毒。
本發(fā)明的不同的其它目的和優(yōu)點(diǎn)從以下的詳細(xì)描述中將變得更加清晰。
發(fā)明詳述如本文所使用的，“a”，“an”或“the”可以意味著一個(gè)或多于一個(gè)。例如，“a”細(xì)胞可以意味著單細(xì)胞或多細(xì)胞。
還如本文使用的，“和/或”涉及并包括一個(gè)或更多相關(guān)所列項(xiàng)目的任何以及所有可能的組合，以及當(dāng)在可替換的情形(“或”)中說明時(shí)的缺少的組合。
本發(fā)明是基于意料不到的發(fā)現(xiàn)，所述發(fā)現(xiàn)為修飾細(xì)胞以表達(dá)整聯(lián)蛋白，導(dǎo)致比未修飾細(xì)胞更加堅(jiān)固的粘連到組織培養(yǎng)基的細(xì)胞。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾的細(xì)胞，其具有的粘連特性與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比被增加了，其包括重組核酸，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。所述細(xì)胞在整聯(lián)蛋白亞基編碼序列借以在細(xì)胞中被表達(dá)和/或過表達(dá)的條件下保持。在一些實(shí)施方式中，整聯(lián)蛋白亞基的編碼序列根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的方法在細(xì)胞中被瞬時(shí)表達(dá)以調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)，如此本發(fā)明編碼整聯(lián)蛋白亞基的核酸表達(dá)的時(shí)序和/或數(shù)量可以被控制。
與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比，粘連特性的增量可以是至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、或至少十倍。通過使如本文所描述的被修飾的或未修飾細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)[例如，塑料(例如，聚丙烯、聚乙稀、聚丙烯酸酯、聚山梨酯等)、玻璃、瓊脂、膠原質(zhì)、纖連蛋白、陶瓷、金屬、生物降解或非生物可降解的聚酯支架(scafffold)、導(dǎo)管等]接觸一段時(shí)間，該時(shí)間足以允許細(xì)胞粘連到基質(zhì)(substrate)，并根據(jù)本文所描述的方法，以及用于量化細(xì)胞的任何已知技術(shù)的方法，測定被粘連到基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量，從而測定粘連特性的增加。比未修飾細(xì)胞以更大數(shù)量粘連到組織培養(yǎng)基質(zhì)的被修飾細(xì)胞是具有增加的粘連特性的細(xì)胞。粘連特性的增加與被粘連細(xì)胞的增加數(shù)量相關(guān)并可以表達(dá)為X倍增量(例如，兩倍、三倍等)、表示為百分比(例如，粘連特性增加10％，其基于與未修飾細(xì)胞相比，被修飾細(xì)胞粘連到基質(zhì)的數(shù)目多10％)、和/或根據(jù)任何其它已知技術(shù)的值，其識(shí)別相對(duì)于基線測量的增加。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是任何類型的細(xì)胞，其可以在培養(yǎng)條件下生長和/或維持并可以攝取(take up)以及表達(dá)編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸。例如，本發(fā)明的細(xì)胞可以是，但不限于，BiG-45細(xì)胞、293.101細(xì)胞、B-241細(xì)胞、293T細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、Dami細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、HUVEC和MS-5細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以單獨(dú)地或以細(xì)胞群存在，并且本發(fā)明的細(xì)胞可以被包含在組織培養(yǎng)容器中，其可以是，但不限于，燒瓶、瓶子、轉(zhuǎn)瓶、管形瓶、試管、小室、燒瓶、皿、載玻片、板、組織培養(yǎng)孔、其可以呈現(xiàn)為單獨(dú)的孔或多孔板，和/或它們的任何組合。
通過引入編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸，本發(fā)明細(xì)胞被修飾，所述整聯(lián)蛋白可以是人整聯(lián)蛋白、并可以是但不限于整聯(lián)蛋白β3亞基、整聯(lián)蛋白αv亞基、整聯(lián)蛋白αIIb亞基、和/或這些整聯(lián)蛋白亞基以任何順序的任何組合。本發(fā)明還提供連接到細(xì)胞外基質(zhì)分子的任何整聯(lián)蛋白的組合，所述分子可通過細(xì)胞被涂覆或分泌到基質(zhì)上，細(xì)胞在所述基質(zhì)上生長。一些例子包括，但不限于，膠原質(zhì)受體α2-β1、層粘連蛋白受體α6-β4、幾種體外結(jié)合素受體αV-β5、和β1，其可以與不同的α亞基組合用于諸如纖連蛋白等受體細(xì)胞外基質(zhì)分子。本發(fā)明的整聯(lián)蛋白可以是來自任何物種，如作為實(shí)例，諸如雞、狗、大鼠、和小鼠。編碼這些整聯(lián)蛋白的核酸可以在一種或多于一種的核酸構(gòu)建體上被引入細(xì)胞中，該核酸從該構(gòu)建體被表達(dá)以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生整聯(lián)蛋白。
如本文所使用的“核酸”涉及單或雙鏈分子，其可以是由核苷酸堿基A、T、C和G組成的DNA，或由堿基A、U(代替T)、C和G組成的RNA。本發(fā)明的核酸可以代表編碼鏈或它的互補(bǔ)鏈。本發(fā)明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以與天然產(chǎn)生的序列在序列上相同，或由于核酸密碼的良好表征的簡并性而可以包括可替換的編碼相同氨基酸的密碼子，該氨基酸與見于天然存在的序列中的氨基酸相同。此外，本發(fā)明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以包括密碼子，該密碼子代表現(xiàn)有技術(shù)中被廣泛熟知的保守的氨基酸替換，如此所得到的多肽的生物活性可以被保留。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的用于分離核酸的方法，本發(fā)明核酸可以從細(xì)胞中被分離?？商鎿Q的，根據(jù)在文獻(xiàn)中廣泛描述的用于合成核酸的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本發(fā)明的核酸可以被合成。對(duì)所述發(fā)明的核酸的修飾也可以被預(yù)期，前提是由所述核酸編碼的多肽的必要的結(jié)構(gòu)和/或功能(即，生物活性)被保留。
“重組”核酸是使用現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的基因工程技術(shù)制造的一種核酸。
就術(shù)語核酸序列的“表達(dá)”(及其語法的等同物)來說，它意味著所述序列被轉(zhuǎn)錄，以及任選的被翻譯。
本發(fā)明的編碼整聯(lián)蛋白的核酸還可以包括指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)整聯(lián)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，在某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可被操作的連接到編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，導(dǎo)致細(xì)胞中整聯(lián)蛋白核酸的組成型表達(dá)，或所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，導(dǎo)致細(xì)胞中整聯(lián)蛋白核酸僅在激活啟動(dòng)子的誘導(dǎo)元素存在時(shí)表達(dá)，從而允許由重組核酸產(chǎn)生的整聯(lián)蛋白被控制。
本發(fā)明啟動(dòng)子的例子包括，但不限于，CMV立即早期啟動(dòng)子、勞斯內(nèi)瘤病毒啟動(dòng)子、延伸因子1α、β肌動(dòng)蛋白、真核起始因子4A1、復(fù)合CMV增強(qiáng)子/β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)、復(fù)合延伸因子1α啟動(dòng)子/HTLV 5′非翻譯區(qū)域、復(fù)合SV40增強(qiáng)子/人鐵蛋白重鏈-延伸因子1α啟動(dòng)子、復(fù)合CMV增強(qiáng)子/人鐵蛋白輕鏈延伸因子1α啟動(dòng)子和復(fù)合CMV啟動(dòng)子/四環(huán)素操縱基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以任何組合和/或順序存在于本發(fā)明重組核酸上根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的方法，本發(fā)明的核酸可以被引入細(xì)胞中，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，由病毒載體感染)、轉(zhuǎn)染(電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、顯微注射等)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供293.01細(xì)胞，其包括重組核酸，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)和(b)和(c)的組合。如本文注明的，編碼整聯(lián)蛋白的核酸可以以任何順序和/或組合出現(xiàn)在相同或不同的構(gòu)建體上，并可以同時(shí)的和/或次序的被引入細(xì)胞中。核酸可以被同時(shí)地和/或以任何順序和/或組合而被表達(dá)。
在特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供293.101細(xì)胞，其包括編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的重組核酸和編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的重組核酸。這些重組核酸可以出現(xiàn)在相同或不同的構(gòu)建體上，并可以同時(shí)的和/或次序的以任何組合和/或順序被引入細(xì)胞中，并可以同時(shí)地和/或以任何順序被表達(dá)。
本文進(jìn)一步提供的是用于生產(chǎn)本發(fā)明細(xì)胞的不同方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供將細(xì)胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，其包括a)將核酸引入細(xì)胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；以及b)在細(xì)胞可以借以粘連到培養(yǎng)容器表面的條件下，使(a)的細(xì)胞與培養(yǎng)容器表面接觸。
細(xì)胞可以借以粘連到培養(yǎng)器表面的條件在本文中被描述，并對(duì)于任何給定的細(xì)胞類型是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的，其根據(jù)被包括在培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，以及培養(yǎng)容器被維持時(shí)所處的環(huán)境(例如，溫度、濕度、二氧化碳含量等)。用于本發(fā)明細(xì)胞類型的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)被很好的建立。作為一個(gè)例子，HEK 293細(xì)胞在以下條件的培養(yǎng)中生長和維持在37℃并在5％CO2的保溫箱中，HEK293細(xì)胞在含有10％的胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM目錄編號(hào)11995-065，Invitrogen Corp)中被培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞成為90％融合時(shí)，它們被傳代以保持在1∶6的稀釋度。
本文另外提供的是生產(chǎn)被修飾細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞具有的粘連特性與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比增加到至少兩倍、至少三倍、和/或至少四倍，該方法包括將重組核酸引入細(xì)胞，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本發(fā)明的細(xì)胞在本文中顯示可以更好的經(jīng)受處理(諸如甘油休克或DMSO休克)，其通常用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以增加核酸攝取。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有增強(qiáng)的攝取核酸能力的本發(fā)明的細(xì)胞，并且根據(jù)本文描述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而進(jìn)一步提供制造這樣的細(xì)胞的方法，以及使用這樣的細(xì)胞用于產(chǎn)生病毒顆粒的方法，其具有如本文所描述的修改以提供對(duì)用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的處理的增強(qiáng)的耐受能力。
本發(fā)明的細(xì)胞可以被用于各種商業(yè)的和研究的應(yīng)用，包括細(xì)胞內(nèi)不同材料的產(chǎn)生(例如，蛋白質(zhì)、病毒等)，其產(chǎn)量可以被提高，因?yàn)橛捎谔岣吡苏尺B特性，在培養(yǎng)容器中可用于生產(chǎn)的細(xì)胞的數(shù)量增加。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在培養(yǎng)容器中的細(xì)胞中制造病毒顆粒的方法，其包括a)將重組核酸引入細(xì)胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的組合；b)將(a)的細(xì)胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在病毒顆粒借以產(chǎn)生的條件下，將感染性的病毒顆粒引入(b)的培養(yǎng)容器中。
本發(fā)明的病毒可以是可在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的任何病毒，包括但不限于，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、副黏病毒、正黏病毒、黃病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、桿狀病毒、微小核糖核酸病毒、α-病毒、冠狀病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤多型空泡形病毒(papovavirus)、布尼亞病毒、環(huán)狀病毒、痘病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、肝脫氧核糖核酸病毒(hepadnavirus)和纖絲病毒，以及可在細(xì)胞中產(chǎn)生的現(xiàn)在已知或之后被鑒定的其它病毒。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述病毒可以是慢病毒，其可以是靈長類慢病毒(例如，HIV-1、HIV-2、SIV)、非靈長類慢病毒(例如，F(xiàn)IV、BLV、EIAV、CEV和綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒(visnavirus))，和/或現(xiàn)在已知或之后被鑒定的任何其它病毒。
此外，本發(fā)明還提供在培養(yǎng)容器中的細(xì)胞中產(chǎn)生重組慢病毒顆粒的方法，其包括a)將重組核酸引入細(xì)胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)(i)和(ii)和(iii)的任何組合；b)將(a)的細(xì)胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在(b)的細(xì)胞中引入I)第一載體，其包括編碼一個(gè)或更多慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的至少一個(gè)基因中的至少一個(gè)缺陷，和(2)包括缺陷包裝信號(hào)；II)第二載體，其包括慢病毒核酸序列，該序列包括載體基因組反轉(zhuǎn)錄所需的的順式作用序列元件，其中所述載體包括活性(competent)包裝信號(hào)，以及III)第三載體，其包括病毒的核酸序列，其中所述第三載體(1)表達(dá)病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包裝信號(hào)，其在重組慢病毒顆粒被產(chǎn)生的條件下進(jìn)行。
在某些實(shí)施方式中，以上方法的第二載體對(duì)于表達(dá)至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如，gag、pol或env)可能是有缺陷的。在其它實(shí)施方式中，第一載體可以是gag-pol表達(dá)載體，其不具有env基因或具有的env基因包括使它不能從第一載體被表達(dá)的缺陷。在env基因中的缺陷可以是缺失、替換和/或添加突變，它們使基因不能夠從第一載體被表達(dá)。
在其它實(shí)施方式中，第一和第二載體可以都缺失env基因或都可以包括env基因，此基因包括可以是缺失、替換和/或添加突變的缺陷，其使所述基因不能從第一載體被表達(dá)。
以上所述方法的第三載體可以包括編碼病毒包膜蛋白的核酸，該核酸可以是慢病毒env基因，和/或所述第三載體可包括編碼病毒包膜蛋白的核酸，該包膜蛋白非慢病毒包膜蛋白。例如，由第三載體的核酸編碼的包膜蛋白可以是皰疹性口炎病毒G(VSV-G)糖蛋白。
以上所述方法的第二載體可以包括多克隆位點(diǎn)，異源核酸序列可以被插入其中，和/或一種或更多異源核酸。本發(fā)明的異源核酸可以編碼蛋白質(zhì)或多肽，當(dāng)在異源核酸被引入的細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，其可以是抗原性的、免疫原性的和/或治療性的。
詞匯“異源核酸”是本領(lǐng)域廣泛熟知的并將被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易的理解為一種核酸，其在它已經(jīng)被引入的細(xì)胞中通常是不存在的，和/或是在通常不出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)元件的控制下被表達(dá)的核酸。本發(fā)明的異源核酸還可以是以一定數(shù)量出現(xiàn)或以一定數(shù)量表達(dá)的核酸，該數(shù)量通常不同于在此核酸已經(jīng)被引入的細(xì)胞中存在的數(shù)量?！爱愒春怂帷睂⑼ǔＪ羌?xì)胞中非天然產(chǎn)生的序列?？商鎿Q的，異源核苷酸序列可以指被置于非天然環(huán)境中的序列(例如，通過與啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)，其不是天然關(guān)聯(lián)的)。
根據(jù)制造核酸序列的標(biāo)準(zhǔn)方法，本發(fā)明的第一載體、第二載體、和第三載體可以被制造以制造載體構(gòu)建體，以及在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的第一、第二和/或第三載體可以來自慢病毒基因組的cDNA克隆。
作為一些例子，本發(fā)明的第一載體可以是質(zhì)粒pEV53、質(zhì)粒pEV53A和/或質(zhì)粒pEV53B；本發(fā)明的第二載體可以是質(zhì)粒pEC-lacZ、質(zhì)粒pEC-puro、質(zhì)粒pESIN6.1GpuroW、質(zhì)粒pESIN6.1G3W、質(zhì)粒pE11.1G3W和/或質(zhì)粒pESIN11.1G3W；以及本發(fā)明的第三載體可以是質(zhì)粒pCI-VSV-G。
pEV53B類似于pEV 53，除了直到主要剪接供體位點(diǎn)上游3nt的所有EIAV前導(dǎo)序列被移除。為了構(gòu)建pEV53B，gag基因和部分pol從pEV53由PCR擴(kuò)增，使用引物5’-TTTGGCGCGCCAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGAC-3’(正向)(SEQ ID NO1)和5’-CTACTTGATCCTTCTCCTTGAC-3’(反向)(SEQ ID NO2)。AscI抑制位點(diǎn)(下劃線)被包括在用于克隆目的的正向引物中。用于正向引物中的gag的ATG翻譯起始位點(diǎn)被以粗體指示，以及EIAV序列被顯示為斜體用于正義引物。所得到的1.4kb的PCR產(chǎn)物用AscI和BsrGI消化并克隆到AscI-BsrGI消化的pEV53A中。這樣得到pEV53B。序列分析被用于證實(shí)由PCR擴(kuò)增的gag-pol序列是正確的。
本發(fā)明第二載體的例子是質(zhì)粒pESIN6.1CpuroW，一種6866bp的質(zhì)粒，源自表達(dá)鏈霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素報(bào)道基因的EIVA。所述質(zhì)粒含有兩個(gè)CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域(位于bp1-734和1863-2384)；來自EIAV長末端重復(fù)(LTR)的R-U5序列區(qū)域(bp735-857)；引導(dǎo)序列，其含有EIAV RNA的包裝信號(hào)(～bp870-1200)、變異的tat翻譯起始位點(diǎn)(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供體位點(diǎn)、變異的gag翻譯起始位點(diǎn)(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣(flap)”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤區(qū)(bp1314-1330)和中心終止信號(hào)序列(bp1422-1448)；嘌呤霉素編碼序列(bp2480-3105)；旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(bp3110-3996)；刪除EIAV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列的EIAV自身滅活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌體f1區(qū)域(bp4280-4735)；氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp5174-6034)；以及DAN復(fù)制的ColE1起始點(diǎn)(origin)(bp5554-6228)。
第二載體的另一個(gè)例子是pE6.1CpuroW，其類似于pESIN6.1CpuroW，除了SIN LTR被野生型EIAV LTR取代。其它的例子包括pESIN6.1CW和pE6.1CW，它們分別類似于pESIN6.1CpuroW和pESIN6.1CpuroW，除了嘌呤霉素抗性基因已經(jīng)被擴(kuò)展的多克隆位點(diǎn)取代，以便于感興趣的其它基因或序列的插入。第二載體的進(jìn)一步的改善是可能的例如，pESIN11.1CW和pE11.1CW是載體的例子，該載體的引導(dǎo)區(qū)域已經(jīng)被重排列并被優(yōu)化以提供更高的效價(jià)。
根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的慢病毒顆粒能夠感染細(xì)胞并在傳遞異源核酸到靶細(xì)胞的過程中進(jìn)行一輪復(fù)制。這種技術(shù)的一方面是核酸傳遞系統(tǒng)，其排除病毒基因到靶細(xì)胞的傳遞。這通過將編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體與編碼異源核酸的載體物理分隔而實(shí)現(xiàn)。分開的載體被引入受納細(xì)胞(“包裝細(xì)胞”)。病毒結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于病毒顆粒產(chǎn)生是必要的，但是編碼這些蛋白的基因出現(xiàn)在包括缺陷包裝信號(hào)或沒有包裝信號(hào)的載體上，如此以致結(jié)構(gòu)蛋白基因沒有被包裝到在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒中。所得到的慢病毒顆粒是“復(fù)制缺陷的”，其中被包裝的載體不含有編碼顆粒組裝所需的所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸。
因此，在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制造包裝細(xì)胞的方法，其包括以包括慢病毒核酸序列的載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明的修飾細(xì)胞，其中所述載體包括缺陷包裝信號(hào)。所述載體可以是gag-pol表達(dá)載體，并在某些實(shí)施方式中，所述載體可以是質(zhì)粒pEV53B。
本文額外提供的是含有本發(fā)明修飾細(xì)胞的包裝細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括編碼至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號(hào)缺陷的，如此所述細(xì)胞自身產(chǎn)生至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但是不產(chǎn)生能夠復(fù)制的感染性病毒。
特別是，關(guān)于本發(fā)明的慢病毒載體，在某些實(shí)施方式中，所述載體源自EIAV。天然EIAV核酸可以從感染病毒的細(xì)胞分離，并從其制備載體。用于制備EIVA載體的示例性的方法在Perry等人的J.Virol.664085-4097(1992)中被提供。例如，使用本領(lǐng)域已知的方法，通過逆轉(zhuǎn)錄酶，從EIAV RNA可以產(chǎn)生cDNA。那么雙鏈EIAV cDNA可以被制造并克隆到克隆載體中，諸如細(xì)菌克隆載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和使用的任何克隆載體可以被使用，諸如細(xì)菌、酵母或真核載體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體可以包括cDNA分子，其可以包括互補(bǔ)于至少部分EIAV基因組的一個(gè)或更多核酸序列，并包括用于基因組復(fù)制所需的RNA基因組的一部分，所述cDNA分子被置于在靶細(xì)胞中功能性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以包括真核和/或原核來源的啟動(dòng)子，足以指導(dǎo)細(xì)胞中遠(yuǎn)處定位的序列(即，連接到啟動(dòng)子序列5’末端的序列)的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域還可以包括用于增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄的控制元件。適合的啟動(dòng)子的例子是巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(pCMV)，勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)啟動(dòng)子(pRSV)、和SP6、T3、或T7啟動(dòng)子。啟動(dòng)子上游的增強(qiáng)子序列或編碼區(qū)域下游的終止子序列可以任選的被包括在本發(fā)明的載體中以便于表達(dá)。本發(fā)明的載體還可以含有額外的核酸序列，諸如多腺苷酸化(polyadenylation)序列、定位序列和/或信號(hào)序列，足以允許細(xì)胞有效率的和有效的表達(dá)載體的異源核酸。可能的多腺苷酸化序列的例子是SV40早期區(qū)多腺苷酸化位點(diǎn)(Hall等人.，J.Molec.App.Genet.2101(1983))和SV40晚期區(qū)多腺苷酸化位點(diǎn)(Garswell and Alwine，Mol.Cell Biol.94248(1989))。這樣的附加序列被插入到載體中，如此如果轉(zhuǎn)錄是被期望的，它們被可操作的與啟動(dòng)子序列連接，或者如果翻譯和加工是被期望的，額外的與起始和加工序列連接?？商鎿Q的，被插入的序列可以被置于載體中的任何位置。所述詞匯“可操作的連接”被用于描述在核酸序列和啟動(dòng)子和/或其它調(diào)節(jié)或加工序列之間的連接，如此核酸序列的轉(zhuǎn)錄由可操作連接的啟動(dòng)子序列而指導(dǎo)，所述序列的翻譯由可操作連接的翻譯調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)，以及所述序列的轉(zhuǎn)錄后加工由可操作連接的加工序列指導(dǎo)。
用于構(gòu)建本發(fā)明載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)于所述領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛熟知的，并可以見于這樣的文獻(xiàn)，如Sambrook等人的.，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY，1989)。各種策略可用于連接DNA片斷，它的選擇依賴于DNA片斷末端的性質(zhì)，和哪種選擇可以由技術(shù)人員容易的作出。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，重組慢病毒表達(dá)系統(tǒng)包括三種載體。第一載體包括至少部分EIAV基因組的核酸序列，其中載體(i)包含在編碼EIAV結(jié)構(gòu)蛋白的至少一個(gè)基因中的至少一個(gè)缺陷，以及(ii)包含缺陷包裝信號(hào)。第二載體包括至少部分EIAV基因組的核酸序列，其中載體(i)包含活性的包裝信號(hào)，以及(ii)包含異源基因可以被插入其中的多克隆位點(diǎn)。第三載體包括病毒核酸序列，其中載體(i)表達(dá)病毒包膜蛋白，以及(ii)包含缺陷包裝信號(hào)。
在發(fā)明的另一實(shí)施方式中，第一載體是gag/pol表達(dá)載體。Gag/pol表達(dá)載體表達(dá)用于從細(xì)胞組裝和釋放病毒顆粒所需的EIAV蛋白，并包括編碼病毒多蛋白Gag和Gag-Pol的基因。第一載體還可以表達(dá)編碼輔助蛋白R(shí)ev和Tat的基因。編碼功能未知的蛋白的開放閱讀框架S2可以額外的被包括在第一載體中。所述第一載體被構(gòu)建以包含排除逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的病毒基因轉(zhuǎn)移的突變。這樣的突變可以是病毒env基因中的序列缺失的形式，因此排除產(chǎn)生活性復(fù)制的EIAV的可能性，或可以是在基因組3’末端的某些順式作用序列元件的缺失，其為病毒逆轉(zhuǎn)錄和整合所需。因此，即使來自這種構(gòu)建體的病毒基因被包裝到病毒顆粒中，它們將不被復(fù)制，以及活性復(fù)制的野生型病毒將不能產(chǎn)生。
在另一實(shí)施方式中，表達(dá)系統(tǒng)的第一載體是質(zhì)粒pEV53bB，其可以是11874bp的質(zhì)粒和cDNA克隆，其在堿基對(duì)209-863含有CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域，它位于EIAV主剪接供體位點(diǎn)(bp915-916)，gag編碼區(qū)域(bp920-2380)，pol編碼區(qū)域(bp2137-5578)和ORF S2編碼區(qū)域(bp5741-5938)的上游。載體還包括部分env編碼區(qū)域(bp5767-7437)和rev編碼區(qū)域(bp5892-5992和6954-7358)。已知的Rev效應(yīng)元件(Rev Responsive Element)(RRE)被包含在rev的第一編碼區(qū)域(bp5892-5992)。載體不表達(dá)功能性tat基因，由于tat的第一外顯子的缺失，但是tat的第二外顯子出現(xiàn)在bp5590-5730。牛生長激素(BGH)的多腺苷酸化信號(hào)被提供(bp7463-7677)，還提供了噬菌體f1區(qū)域(bp7741-8154)，SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域和復(fù)制起點(diǎn)(bp8218-8543)，新霉素抗性編碼區(qū)域(bp9389-9628)，SV40多腺苷酸化信號(hào)(bp9389-9628)，復(fù)制的Col E1起始點(diǎn)(bp10060-10733)，以及β-內(nèi)酰胺酶(氨芐青霉素抗性)的編碼區(qū)域(bp10878-11739)。
本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的第二載體被設(shè)計(jì)為用于核酸傳遞的載體，并包含支持載體核酸的殼體化和逆轉(zhuǎn)錄(復(fù)制)所需的所有順式作用元件，以及用于插入編碼異源核酸的cDNAs的多克隆位點(diǎn)。在本發(fā)明中，包括異源核酸的載體是重組EIAV衍生載體，其挾帶將被轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞中的遺傳信息，以及對(duì)于病毒基因組的包裝和整合必要的順式作用序列元件。第二載體可以包含gag編碼序列的一些部分，由于人們相信gag序列的某些部分在包裝EIAV基因組中起作用。第二載體還可以包含所謂的慢病毒“DNA瓣”區(qū)域，它是來自慢病毒DNA的順式作用序列并含有涉及逆轉(zhuǎn)錄的中心聚嘌呤區(qū)(tract)(cPPT)和中心終止位點(diǎn)(CTS)序列。此外，第二載體可以包含順式作用元件以促進(jìn)新合成的RNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的有效輸出。RNA輸出信號(hào)的例子包括同源慢病毒Rev效應(yīng)元件(RRE)，其與Rev一起工作，以及異源的土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)，其還可以通過RNA穩(wěn)定作用或其它方法增加基因表達(dá)。此外，被包含在LTR的中5’剪接供體位點(diǎn)可以含有增加所產(chǎn)生病毒的效價(jià)的突變，如在例如，Tan等人.，J.Virol.703645-3658(1996)所描述的。
本發(fā)明第二載體的例子是質(zhì)粒pESIN6.1CpuroW，一種6866bp的質(zhì)粒，源自表達(dá)鏈霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素報(bào)道基因的EIVA。所述質(zhì)粒含有兩個(gè)CMV立即早期增強(qiáng)子啟動(dòng)子區(qū)域(位于bp1-734和1863-2384)；來自EIAV長末端重復(fù)(LTR)的R-U5序列區(qū)域(bp735-857)；引導(dǎo)序列，其含有EIAV RNA的殼體化信號(hào)(～bp870-1200)、變異的tat翻譯起始位點(diǎn)(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供體位點(diǎn)、變異的gag翻譯起始位點(diǎn)(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤區(qū)(cPPT，bp1314-1330)和中心終止位點(diǎn)(CTS)序列(bp1422-1448)；病毒剪接受體序列(bp1753-1754)；Rev效應(yīng)元件(RRE，bp1755-1857)；嘌呤霉素編碼序列(bp2480-3105)；旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(bp3110-3996)；刪除EIAV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列的EIAV自身滅活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌體f1區(qū)域(bp4280-4735)；氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp5174-6034)；以及復(fù)制的ColE1起始點(diǎn)(bp5554-6228)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是，異源核酸的核苷酸序列可以是任何核苷酸序列。例如，異源核酸可以是報(bào)道基因序列或可選擇的標(biāo)記基因序列。如本文使用的報(bào)道基因序列是任何基因序列，當(dāng)其被表達(dá)的時(shí)候，導(dǎo)致其存在或活性可以被檢測的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。適合的報(bào)道基因的例子包括半乳糖激酶，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-內(nèi)酰胺酶等的基因?？商鎿Q的，報(bào)道基因序列可以是任何基因序列，它的表達(dá)產(chǎn)生以某種可檢測的方式影響細(xì)胞生理學(xué)的基因產(chǎn)物。
可選擇的標(biāo)記基因序列是能夠被表達(dá)以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的任何基因序列。它的存在允許人們選擇性的繁殖包含它的細(xì)胞?？蛇x擇的標(biāo)記基因的例子包括能夠給予宿主抗生素抗性(例如，嘌呤霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等)、能夠給予宿主對(duì)氨基酸類似物的抗性、和/或允許細(xì)菌在額外的碳源上或在本來不允許的培養(yǎng)條件下生長的基因序列?；蛐蛄屑瓤梢允菆?bào)道基因，也可以是可選擇的標(biāo)記基因序列。本發(fā)明報(bào)道基因的例子是lacZ基因，其編碼E.Coli的β-半乳糖苷酶活性，以及編碼嘌呤霉素抗性的基因。
本發(fā)明的報(bào)道基因或可選擇的標(biāo)記基因序列是那些足以允許普通細(xì)胞中載體的識(shí)別或選擇的基因序列。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道基因序列將編碼酶或其它蛋白質(zhì)，其通常不出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并且它的存在可以因此確定的證實(shí)在這樣的細(xì)胞中的所述載體的存在。
本發(fā)明的異源核酸還可以包括所需產(chǎn)物的編碼序列，所述產(chǎn)物諸如適合的生物活性蛋白或多肽，免疫原性的或抗原性的蛋白或多肽，或治療活性蛋白或多肽?？商鎿Q的，異源核酸可以包括互補(bǔ)于RNA序列的序列，諸如反義RNA序列，該反義序列可以對(duì)受試者給藥以抑制在受試者細(xì)胞中的互補(bǔ)多聚核苷酸的表達(dá)。
異源核酸的表達(dá)可以提供免疫原的和/或抗原的蛋白和/或多肽以獲得免疫反應(yīng)，其可以包括抗體反應(yīng)。這樣的抗體可以在疫苗接種中有效賦予患者治療效果和/或所述抗體可從諸如血液、血清或腹水等動(dòng)物體液中被收集。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，第三載體包括編碼病毒包膜蛋白的核酸。這樣的載體將相應(yīng)的包括編碼在適合的啟動(dòng)子控制之下的病毒蛋白的核酸序列。病毒包膜蛋白可以是慢病毒包膜蛋白。但是，可能的是改變本發(fā)明的病毒載體可以感染的細(xì)胞的宿主范圍，通過利用來自另一病毒的包膜蛋白基因來進(jìn)行。換而言之，可能的是擴(kuò)展本發(fā)明EIAV載體的宿主范圍，通過利用某些病毒的包膜蛋白的能力以參與其它病毒的殼體化(encapsidation)。水泡性口膜炎病毒的G-蛋白(VSV-G；見Rose和Gillione，J.Virol.39519-528(1981)；Rose andBergmann，Cell 30753-762(1982))有效的形成帶有其它病毒的基因組和基質(zhì)成分的假型病毒體。這些VSV-G假型載體具有非常寬的宿主范圍并可以通過超速離心法被濃縮到高的效價(jià)。如本文所使用的，詞匯“假型”是指病毒顆粒，其含有一個(gè)病毒的核酸以及另一個(gè)病毒的包膜蛋白。
本發(fā)明第三載體的例子是質(zhì)粒和cDNA克隆pCI-VSV-G，一種用于包膜糖蛋白VSV-G的表達(dá)載體。所述質(zhì)粒含有5679個(gè)堿基對(duì)并包括CMV立即早期增強(qiáng)子啟動(dòng)子區(qū)域(bp1-795)、嵌合內(nèi)含子區(qū)域(bp857-989)，VSV-G編碼區(qū)域(bp1088-2633)、噬菌體f1區(qū)域(3093-3548)、SV40晚期多腺苷酸化信號(hào)(bp2782-3003)，DNA復(fù)制的ColE1起始點(diǎn)(bp4992-5666)和氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp3987-4847)。
在本發(fā)明的方法中，感染性的、復(fù)制缺陷的EIAV顆粒可根據(jù)本文所公開的方法結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)而制備。所述方法包括以本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染慢病毒受納細(xì)胞；被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生EIAV衍生的顆粒；并從細(xì)胞收集病毒顆粒?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合的方法來實(shí)施轉(zhuǎn)染慢病毒受納細(xì)胞的步驟。例如，在本發(fā)明的方法中，本文所述的三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)被用于通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生EIAV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。作為另一個(gè)例子，載體攝取到細(xì)胞中可以通過任何適合的方法而實(shí)現(xiàn)，諸如，例如，以DEAE-葡聚糖處理細(xì)胞、添加到細(xì)胞之前以LIPOFECTIN處理載體-衍生的DNA或RNA，或通過電穿孔法。這些技術(shù)在現(xiàn)有領(lǐng)域中是已知的。
促進(jìn)細(xì)胞中感染性病毒顆粒產(chǎn)生的步驟使用常規(guī)技術(shù)實(shí)施，諸如通過在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛熟知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)生長技術(shù)。
收集感染性病毒顆粒的步驟也可以使用常規(guī)技術(shù)實(shí)施。例如，感染性病毒顆?？梢酝ㄟ^細(xì)胞溶解而被收集，或收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，如在現(xiàn)有技術(shù)中已知的?？蛇x的，如果需要，收集的病毒顆?？梢员患兓?。適合的純化技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛熟知的。
如果技術(shù)人員需要，慢病毒母液(stock solution)可以使用本發(fā)明的載體和方法被制備。制備病毒母液的方法在技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并通過例如，Soneoka等人.，Nucl.Acid Res.23628-633(1995)和Landau等人.，J.Virol.665110-5113(1992)而被說明。在本發(fā)明產(chǎn)生母液的方法中，本發(fā)明的慢病毒受納細(xì)胞用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染。于是，細(xì)胞在適合的細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長，且慢病毒顆?；蚴菑募?xì)胞本身或是從細(xì)胞培養(yǎng)基中被收集，如以上所描述的。
本發(fā)明的載體還用于制備包裝細(xì)胞(即，表達(dá)EIAV病毒蛋白的細(xì)胞，該細(xì)胞不能由自身產(chǎn)生感染性病毒顆粒)。制備表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的包裝細(xì)胞的方法在技術(shù)領(lǐng)域中是已知的并通過例如Temin等人的美國專利No.4,650,764中所闡述的方法而被舉例說明，以其整體引入本文以便于參考對(duì)于這些方法的教導(dǎo)。本發(fā)明的包裝細(xì)胞可以包括本發(fā)明的慢病毒受納細(xì)胞，包括編碼至少一種EIVA結(jié)構(gòu)蛋白的EIAV核酸，該核酸是包裝信號(hào)缺陷的，因此使細(xì)胞自身能夠產(chǎn)生至少一種EIAV結(jié)構(gòu)蛋白，但是不能夠產(chǎn)生復(fù)制活性的感染性病毒。那么，包裝細(xì)胞可以具有被引入的其它核酸序列(例如，pSIN61.CpuroW和/或pCI-VSV-G)，其可以包含異源核酸和適合的包裝信號(hào)。一旦以附加序列轉(zhuǎn)染，包裝細(xì)胞就被用于產(chǎn)生EIAV病毒的母液，所述EIAV病毒包含異源核酸，但是該病毒是不能自身復(fù)制的。
本發(fā)明在以下實(shí)施例中被更加詳細(xì)的描述，其僅作為說明，因?yàn)楸疚牡脑S多改變和變體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞HEK 293細(xì)胞來自美國典型培養(yǎng)物收藏所(American Type CultureCollection(ATCC))。這些細(xì)胞的克隆基因庫通過限制稀釋而被制備，并且被篩選以得到對(duì)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體顯示最大能力的細(xì)胞系(Johnson等人.″Effect of host modification and age on airwayepithelial gene transfer mediated by a murine leukemia virus-derivedvector″J.Virol.728861-72(1998))。這些克隆之一，293.101，被選擇用于構(gòu)建EIAV輔助細(xì)胞系和EIAV載體包裝細(xì)胞。B-241細(xì)胞系是EIAV載體輔助細(xì)胞系。這些細(xì)胞通過以表達(dá)載體(EV53B)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而由293.101細(xì)胞獲得，該表達(dá)載體由CMV啟動(dòng)子表達(dá)EIAV gag，pol，S2，以及rev基因。Big-45細(xì)胞系是EIAV包裝細(xì)胞系。這些細(xì)胞通過以質(zhì)粒表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而得自B-241細(xì)胞，該表達(dá)載體編碼四環(huán)素可調(diào)節(jié)的VSV-G包膜cDNA和CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素抑制物基因。BiG-45/8Z-20細(xì)胞來自以pONY8Z穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BiG-45細(xì)胞，該pONY8Z是編碼細(xì)菌lacZ報(bào)道基因的一種EIAV基因傳遞載體(Rohll等人.″Design，production，safety，evaluation，and clinicalapplications of nonprimate lentiviral vectors″Methods Enzymol346466-500(2002))。
整聯(lián)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCXIH表達(dá)載體被用于表達(dá)人αIIb或αv整聯(lián)蛋白亞基。pCXIP表達(dá)載體被用于表達(dá)野生型或突變的人β3整聯(lián)蛋白亞基。這些載體使用CMV啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)被插入的cDNA的表達(dá)，并包含連接到或潮霉素抗性基因(pCXIH)或嘌呤霉素抗性基因(pCXIP)的IRES序列，其用于動(dòng)物細(xì)胞中的選擇。
pCXIP質(zhì)粒是5562bp長度并是設(shè)計(jì)為表達(dá)靶基因以及嘌呤霉素可選標(biāo)記的雙順反子(bicistronic)表達(dá)載體。這種載體包括CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域(bp1-532)、用于插入將被表達(dá)的序列的多克隆位點(diǎn)區(qū)域(bp639-687)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(bp689-1261)、嘌呤霉素抗性基因(bp1298-1894)、來自鼠白血病病毒的poly A添加信號(hào)(bp2268-2693)、DNA復(fù)制的SV40起始點(diǎn)(bp2973-3259)、DNA復(fù)制區(qū)域的Col E1起始點(diǎn)(bp3580-4200)，和氨芐青霉素抗性基因(bp4340-5200)。
pCXIH質(zhì)粒是6161bp長度并是設(shè)計(jì)為表達(dá)靶基因以及潮霉素可選標(biāo)記的雙順反子(bicistronic)表達(dá)載體。這種載體包括CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域(bp1-532)、用于插入將被表達(dá)的序列的多克隆位點(diǎn)區(qū)域(bp640-680)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(bp689-1263)、潮霉素抗性基因(bp1287-2321)、來自鼠白血病病毒的poly A添加信號(hào)(bp2867-3292)、DNA復(fù)制的SV40起始點(diǎn)(bp3572-3858)、DNA復(fù)制區(qū)域的Col E1起始點(diǎn)(bp4179-4799)，和氨芐青霉素抗性基因(bp4939-5799)。
對(duì)于在BiG-45細(xì)胞中表達(dá)αv和β3兩個(gè)整聯(lián)蛋白亞基，pVITRO2-mcs表達(dá)載體(InvivoGen，San Diego)被使用。這種載體使用復(fù)合人鐵蛋白重鏈起動(dòng)子/SV40增強(qiáng)子序列以驅(qū)動(dòng)人αv整聯(lián)蛋白的表達(dá)，以及復(fù)合人鐵蛋白輕鏈啟動(dòng)子/CMV增強(qiáng)子序列以驅(qū)動(dòng)人β3整聯(lián)蛋白的表達(dá)。
基于293的EIAV產(chǎn)生細(xì)胞中整聯(lián)蛋白亞基的表達(dá)編碼αIIb、αv和β3亞基的整聯(lián)蛋白cDNAs被亞克隆到表達(dá)載體中，其中使用的CMV啟動(dòng)子，不同組合被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到B-241 EIAV輔助細(xì)胞系中以產(chǎn)生一系列細(xì)胞系。藥物選擇12天之后，來自每次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞菌落被混合并被分析各整聯(lián)蛋白亞基αIIb、αv和β3的細(xì)胞表面表達(dá)，或作為整聯(lián)蛋白受體αIIbβ3、αvβ3，通過由流式細(xì)胞計(jì)量法的活細(xì)胞免疫熒光法分析(圖1)。人們發(fā)現(xiàn)每個(gè)整聯(lián)蛋白都在B-241細(xì)胞的細(xì)胞表面被表達(dá)。與表達(dá)單獨(dú)的亞基相比，α和β亞基二者的表達(dá)共同增強(qiáng)它們?cè)诩?xì)胞表面的總表達(dá)。免疫熒光研究確認(rèn)每個(gè)整聯(lián)蛋白的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)源整聯(lián)蛋白的表達(dá)大大增強(qiáng)了。
整聯(lián)蛋白修飾的293細(xì)胞連接到組織培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞連接試驗(yàn)被用于測試β3整聯(lián)蛋白亞基單獨(dú)或與它的αIIb或αv結(jié)合配偶體一起表達(dá)是否將導(dǎo)致對(duì)組織培養(yǎng)基質(zhì)的增加的粘連。該試驗(yàn)涉及在基于293的BiG-45 EIAV包裝細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)整聯(lián)蛋白亞基，所述包裝細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。所述細(xì)胞在12孔板中每個(gè)孔被鋪板3×105個(gè)細(xì)胞。鋪板后1h通過測量在洗滌細(xì)胞之前和之后的細(xì)胞熒光，確定細(xì)胞的鋪板效率。與未修飾細(xì)胞相比，β3整聯(lián)蛋白亞基的過表達(dá)單獨(dú)導(dǎo)致293細(xì)胞對(duì)未處理組織培養(yǎng)板的粘連顯著增加(圖2)。αv的共表達(dá)進(jìn)一步的增加293細(xì)胞的粘連。β3亞基的突變型也被測試，當(dāng)與血小板上αIIb結(jié)合的時(shí)候，其引起αIIbβ3受體被永久激活。與野生型β3亞基相比較，單獨(dú)的或結(jié)合αIIb或αv的突變?chǔ)?亞基不提供任何細(xì)胞粘連的增加(圖2)。因此，在293衍生的細(xì)胞中野生型人αvβ3整聯(lián)蛋白受體的表達(dá)顯著增加了它們連接到常規(guī)組織培養(yǎng)板的能力。
整聯(lián)蛋白修飾對(duì)293細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的影響為了減少產(chǎn)生慢病毒載體所需的時(shí)間和努力，整聯(lián)蛋白-修飾細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中的連接和生長的能力被研究。在初期試驗(yàn)中，整聯(lián)蛋白β3修飾的B-241細(xì)胞或未修飾的B-241細(xì)胞被接種到轉(zhuǎn)瓶中。第二天，細(xì)胞以結(jié)晶紫染色并拍照(圖3)。β3修飾細(xì)胞粘連顯著優(yōu)于未修飾的細(xì)胞，即使一些細(xì)胞凝集是明顯的。為了測試β3與它的αv結(jié)合配偶體一起表達(dá)的效果，產(chǎn)生EIAV-lacZ載體(BiG-45/8Z-20)的BiG-45包裝細(xì)胞用表達(dá)兩種整聯(lián)蛋白的pVITRO2mcs載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并被接種到轉(zhuǎn)瓶中。接種后一天，細(xì)胞被染色用于表達(dá)帶有X-GaI的lazZ基因。如圖3示出的，與單獨(dú)以β3修飾的細(xì)胞相比，細(xì)胞顯示更加均一的連接而細(xì)胞凝集更少。在之后的試驗(yàn)中，接種到轉(zhuǎn)瓶中之后24h，整聯(lián)蛋白修飾的和未修飾的B-241細(xì)胞的鋪板效率被測定。對(duì)于β3和αvβ3二者修飾的B-241細(xì)胞，鋪板效率是98.3％±1.5％(n＝6)。與此相反，對(duì)于未修飾的B-241細(xì)胞，鋪板效率僅是45.7％±15.3％(n＝3)。
整聯(lián)蛋白表達(dá)對(duì)慢病毒載體生成的影響α在使用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)載體產(chǎn)生系統(tǒng)中，通過將編碼嘌呤霉素基因的EIAV載體(ESIN6.1CpuroW)以及編碼VSV-G包膜的載體共轉(zhuǎn)染到B-241輔助細(xì)胞系中，對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)對(duì)慢病毒載體生成的影響進(jìn)行測定。人們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的αIIb或αv整聯(lián)蛋白亞基表達(dá)對(duì)載體效價(jià)不具有影響(表1)。αIIb和β3的共表達(dá)一致地導(dǎo)致載體效價(jià)4-5倍的減少。相反，β3的單獨(dú)表達(dá)或與αv整聯(lián)蛋白的組合的表達(dá)導(dǎo)致載體的產(chǎn)生增加30-60％。
用αvβ3整聯(lián)蛋白對(duì)B-241細(xì)胞，或其它基于293的細(xì)胞系的修飾，導(dǎo)致細(xì)胞變平，如此整聯(lián)蛋白修飾的細(xì)胞比未修飾細(xì)胞占據(jù)更大的表面積。由于優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)計(jì)通常使用80-90％融合的培養(yǎng)物，這導(dǎo)致比未修飾細(xì)胞更少數(shù)量的整聯(lián)蛋白-修飾細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。為了進(jìn)一步表征從整聯(lián)蛋白-修飾細(xì)胞產(chǎn)生EIAV載體，每個(gè)細(xì)胞的感染性載體的產(chǎn)量被測定并與未修飾細(xì)胞比較。此外，用于增加DNA攝取效率的試劑(丙三醇或DMSO)的效果被測定(Lopata等人。1984.″High level transient expression of a chloramphenicol acetyltransferase gene by DEAE-dextran mediated DNA transfectioncoupled with a dimethyl sulfoxide or glycerol shock treatment″NucleicAcids Res 125707-17)。如表2示出的，使用以αvβ3整聯(lián)蛋白修飾的細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的載體產(chǎn)量增加3.6倍。此外，在整聯(lián)蛋白-修飾細(xì)胞中的載體產(chǎn)量可以進(jìn)一步增加近似3倍，其通過結(jié)合丙三醇或DMSO休克處理到試驗(yàn)設(shè)計(jì)中以增強(qiáng)DNA攝取(表2)。相反，從未修飾培養(yǎng)物的載體產(chǎn)生沒有通過以丙三醇或DMSO的處理而被增強(qiáng)。部分的，這被歸因于由于未修飾培養(yǎng)物的低粘連性的細(xì)胞損失。丙三醇或DMSO處理的期間減少到30秒，導(dǎo)致未修飾培養(yǎng)物的細(xì)胞損失減少，但是載體產(chǎn)量沒有被增加。
實(shí)施例2HEK 293細(xì)胞整聯(lián)蛋白表達(dá)分布的改變?cè)试S慢病毒載體的方便的大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)使用轉(zhuǎn)瓶的基于EIAV和HIV的慢病毒載體生產(chǎn)使用整聯(lián)蛋白-修飾的293細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)而可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高效價(jià)的載體生產(chǎn)的可能性被研究。在這些研究中，不同的方法被測試用于使用轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)生慢病毒載體。一些實(shí)施例在表3中示出。在一個(gè)實(shí)施例中，αvβ3修飾的B-241輔助細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物，該輔助細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)EIAV gag-pol基因，被編碼嘌呤霉素抗性基因和VSV-G包膜基因的EIAV載體(ESIN6.1CpuroW)共轉(zhuǎn)染。1000倍濃縮之后，以1.2×109感染單位/ml的效價(jià)制備的載體被獲得。這個(gè)水平的載體生產(chǎn)與在組織培養(yǎng)板中生長的未修飾細(xì)胞產(chǎn)生的載體產(chǎn)生水平相比較是有利的(表1)。
在第二實(shí)施例中，以EIAV lacZ基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BiG-45 EIAV包裝細(xì)胞系被誘導(dǎo)以產(chǎn)生濃縮后具有2×109效價(jià)的病毒。第三實(shí)施例顯示了該過程可以被擴(kuò)大以產(chǎn)生適用于動(dòng)物研究的數(shù)量的載體。在這種情況下，目標(biāo)是產(chǎn)生用于離體基因轉(zhuǎn)移到犬造血干細(xì)胞所需的載體數(shù)量(＞3×109總感染單位)。含有αvβ3修飾的293T細(xì)胞的12轉(zhuǎn)瓶的三日質(zhì)粒轉(zhuǎn)染被執(zhí)行以產(chǎn)生HIV-1載體。載體(90ml/轉(zhuǎn)瓶)在從轉(zhuǎn)染后48h開始的連續(xù)三天中被收集?？偣?240ml被收集并被濃縮近似550倍至6ml。總產(chǎn)量是1.4×1010感染載體顆粒，多于實(shí)施動(dòng)物研究所需的量。
人胚腎細(xì)胞(HEK 293)是最廣泛使用的用于產(chǎn)生病毒基因轉(zhuǎn)移載體的細(xì)胞類型。他們用編碼病毒蛋白的質(zhì)粒DNAs是高度可轉(zhuǎn)染的，使用許多轉(zhuǎn)染試劑和試驗(yàn)設(shè)計(jì)以瞬時(shí)表達(dá)重組病毒。許多穩(wěn)定的基于293的包裝細(xì)胞系還已經(jīng)產(chǎn)生用于病毒生產(chǎn)。根據(jù)非靈長類慢病毒馬傳染性貧血病毒(EIAV)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)，其利用穩(wěn)定的基于293細(xì)胞的可誘導(dǎo)包裝細(xì)胞系(BiG-45)用于高效價(jià)病毒生產(chǎn)。使用293細(xì)胞的載體的大規(guī)模生產(chǎn)通常是困難的，由于它們易于從規(guī)則的組織培養(yǎng)板分離。通過使細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中生長，這個(gè)問題可以被克服，但是這可以導(dǎo)致病毒效價(jià)的顯著損失?？商鎿Q的，培養(yǎng)物可以在容器中生長，所述容器以諸如纖維結(jié)合蛋白或聚賴氨酸等細(xì)胞連接基質(zhì)處理。但是，兩個(gè)策略顯著增加大規(guī)模載體生產(chǎn)的費(fèi)用。
在這個(gè)研究中，通過修飾它們的整聯(lián)蛋白表達(dá)分布而增加293細(xì)胞的粘連特性的新策略被測試。首先被測試的是整聯(lián)蛋白β3亞基單獨(dú)或與它的已知結(jié)合配偶體αv或αIIb組合的過度表達(dá)的影響。所述細(xì)胞粘連試驗(yàn)涉及在基于293的EIAV包裝細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)整聯(lián)蛋白亞基，所述包裝細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。所述細(xì)胞以2-4×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度被板在未經(jīng)處理的多孔板上。鋪板后1h通過測量洗滌細(xì)胞之前和之后的細(xì)胞熒光，所述細(xì)胞的鋪板效率被測定。被觀察到的是，與未修飾細(xì)胞相比，在293細(xì)胞中的β3整聯(lián)蛋白亞基的過度表達(dá)導(dǎo)致對(duì)未經(jīng)處理組織培養(yǎng)板的細(xì)胞粘連的顯著增加。αv但不是αIIb的共表達(dá)進(jìn)一步增加293細(xì)胞粘連。來自整聯(lián)蛋白-修飾的293細(xì)胞的基于HIV和EIAV二者的慢病毒載體的產(chǎn)生也被研究。作為這種修飾的結(jié)果，在靶細(xì)胞中的載體效價(jià)和報(bào)道基因表達(dá)不被損害，并且這導(dǎo)致在轉(zhuǎn)瓶中載體產(chǎn)生的擴(kuò)大，其用于產(chǎn)生用于體內(nèi)試驗(yàn)中的載體。
總而言之，293細(xì)胞中的αv和β3的過度表達(dá)增加了對(duì)規(guī)則的未經(jīng)處理的組織培養(yǎng)皿的粘連，并不危害病毒載體產(chǎn)生。
前述僅看作發(fā)明原理的說明。此外，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于想到許多修改和變化，將發(fā)明限制到本文示出和描述的精確的構(gòu)造和操作不是被期望的。因此，相應(yīng)的所有適合的修改和等同物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文所引用的所有公開出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它文獻(xiàn)被以其整體引入本文，以參考與該引用所出現(xiàn)的句子和/或段落相關(guān)的教導(dǎo)。

1B-241細(xì)胞以含有指明的人整聯(lián)蛋白cDNAs的表達(dá)載體修飾。
2細(xì)胞以編碼嘌呤霉素抗性的EIAV載體質(zhì)粒和VSV-G包膜表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h所產(chǎn)生病毒的效價(jià)被給出為每毫升未濃縮組織培養(yǎng)上清液的抗嘌呤霉素的菌落。
3相對(duì)于未修飾細(xì)胞的效價(jià)。

1B-241細(xì)胞用編碼αvβ3人整聯(lián)蛋白cDNAs的表達(dá)載體修飾。
2未修飾的細(xì)胞(1×106/6-孔板的35-mm孔)或αvβ3整聯(lián)蛋白修飾細(xì)胞(4.5×105/6-孔板的35-mm孔)以80％融合鋪板，并且用編碼嘌呤霉素抗性的EIAV載體質(zhì)粒和VSV-G包膜表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h產(chǎn)生的載體總產(chǎn)量(在2ml組織培養(yǎng)上清液中)被給出為每細(xì)胞載體的抗嘌呤霉素的菌落(感染單位)。結(jié)果代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
3加入CaPO4-DNA轉(zhuǎn)染混合物后4小時(shí)，培養(yǎng)基被去除，并且培養(yǎng)物以5ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次。所述細(xì)胞在室溫下以15％(v/v)的丙三醇在HEPES-緩沖鹽水(50mM HEPES(pH7.1)，280mMNaCl和1.5mM Na2HPO4)中處理2分鐘。丙三醇溶液被除去，并且培養(yǎng)物以PBS洗滌一次。常規(guī)生長培養(yǎng)基被加入，并且所述細(xì)胞被送回到37℃保溫箱。
4加入CaPO4-DNA轉(zhuǎn)染混合物后4小時(shí)，培養(yǎng)基被除去，并且培養(yǎng)物以5ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次。所述細(xì)胞在室溫下以PBS中的10％(v/v)的DMSO處理2.5分鐘。DMSO溶液被除去并且培養(yǎng)物以PBS洗滌兩次。常規(guī)生長培養(yǎng)基被加入并且所述細(xì)胞被送回到37℃保溫箱。

1在2-質(zhì)粒和3-轉(zhuǎn)染后，在轉(zhuǎn)染的B-241細(xì)胞和293T細(xì)胞中載體分別被產(chǎn)生。來自BiG-45/8Z-20細(xì)胞的載體產(chǎn)生，其挾帶整合的EIAV lacZ基因轉(zhuǎn)移載體，通過以10mM丁酸鈉和1.5μg/ml脫氧土霉素處理而被誘導(dǎo)。
2病毒載體以高速離心分離法而被濃縮以使編碼嘌呤霉素抗性的病毒(100,000×g-小時(shí)，在4℃)EIAV載體質(zhì)粒和VSV-G包膜表達(dá)載體成球狀。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)產(chǎn)生的病毒的效價(jià)被給出為每毫升組織培養(yǎng)上清液的抗嘌呤霉素菌落。
3載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml。
序列表<110>University of North Carolina at Chapel Hill<120>增強(qiáng)細(xì)胞粘連特性的方法和組合物<130>5470-412WO<150>US60/566,613<151>2004-04-29<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>1tttggcgcgc caggtaagat gggagaccct ttgac35<210>2<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2ctacttgatc cttctccttg ac 2權(quán)利要求
1.一種修飾細(xì)胞，與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比，其具有增加到至少三倍的粘連特性，其包括選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
2.一種293.01細(xì)胞，其包括選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
3.一種293.101細(xì)胞，其包括編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的重組核酸和編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的重組核酸。
4.一種細(xì)胞群體，包括權(quán)利要求1、2或3所述的細(xì)胞。
5.一種培養(yǎng)容器，其包括權(quán)利要求4的所述群體。
6.如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)容器，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉(zhuǎn)瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組。
7.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由BiG-45細(xì)胞、293.101細(xì)胞、B-241細(xì)胞、293T細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、Dami細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞、和MS-5細(xì)胞所組成的組。
8.如權(quán)利要求1、2或3所述的細(xì)胞，還包括可操作連接到所述重組核酸的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子選自由以下組成的組CMV立即早期啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子、延伸因子1α、β-肌動(dòng)蛋白、真核起始因子4A1、復(fù)合CMV增強(qiáng)子/β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)、復(fù)合延伸因子1α啟動(dòng)子/HTLV5′非翻譯區(qū)域、復(fù)合SV40增強(qiáng)子/人鐵蛋白重鏈-延伸因子1α啟動(dòng)子、復(fù)合CMV增強(qiáng)子/人鐵蛋白輕鏈延伸因子1α啟動(dòng)子以及復(fù)合CMV啟動(dòng)子/四環(huán)素操縱基因。
9.一種將細(xì)胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，包括在所述細(xì)胞可以借以粘連到所述培養(yǎng)容器的所述表面的條件下，將所述細(xì)胞與所述培養(yǎng)容器的所述表面接觸，其中所述細(xì)胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合。
10.一種產(chǎn)生被修飾細(xì)胞的方法，所述被修飾細(xì)胞具有的粘連特性與未修飾細(xì)胞的所述粘連特性相比增加到至少三倍，所述方法包括向所述細(xì)胞中引入選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
11.一種在培養(yǎng)容器中的細(xì)胞中產(chǎn)生病毒顆粒的方法，包括在病毒顆粒借以被產(chǎn)生的條件下，向所述培養(yǎng)容器的細(xì)胞中引入感染性病毒顆粒，其中所述細(xì)胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述病毒顆粒是選自由以下組成的組的病毒的顆粒慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、副黏病毒、正黏病毒、黃病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、桿狀病毒、微小核糖核酸病毒、α病毒、冠狀病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤多型空泡形病毒和纖絲病毒。
13.如權(quán)利要求9、10或11所述的方法，其中所述細(xì)胞選自由BiG-45細(xì)胞、293.101細(xì)胞、B-241細(xì)胞、293T細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、Dami細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞、和MS-5細(xì)胞所組成的組。
14.如權(quán)利要求9或11所述的方法，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉(zhuǎn)瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組。
15.一種在培養(yǎng)容器的細(xì)胞中產(chǎn)生重組慢病毒顆粒的方法，包括在重組病毒顆粒借以被產(chǎn)生的條件下，向所述培養(yǎng)容器的所述細(xì)胞中引入，其中所述細(xì)胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合，I)第一載體，包括編碼至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的至少一個(gè)基因中的至少一個(gè)缺陷，以及(2)包括缺陷包裝信號(hào)；II)第二載體，包括慢病毒核酸序列，所述序列包括所述載體基因組逆轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元件，其中所述載體包括活性包裝信號(hào)，以及III)第三載體，包括病毒核酸序列，其中所述第三載體(1)表達(dá)病毒包膜蛋白；以及(2)包括缺陷包裝信號(hào)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第二載體對(duì)于表達(dá)至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白是缺陷的。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)胞是293.101細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一載體是gag-pol表達(dá)載體，以及其中所述載體包括env基因中的缺陷。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中在所述env基因中的所述缺陷是缺失突變。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一載體和所述第二載體各包括在env基因中的缺陷。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第三載體編碼病毒包膜蛋白，其不是慢病毒包膜蛋白。
22.如權(quán)利要求21訴述的方法，其中所述第三載體編碼水泡性口膜炎病毒G糖蛋白。
23.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第二載體包括異源核酸。
24.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述慢病毒是非靈長類慢病毒。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非靈長類慢病毒是馬傳染性貧血病毒(EIAV)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一載體是質(zhì)粒pEV53B；所述第二載體是質(zhì)粒pESIN6.lCpuroW，以及所述第三載體是質(zhì)粒pCl-VSV-G。
27.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉(zhuǎn)瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組.
28.一種制造包裝細(xì)胞的方法，包括以包括慢病毒核酸序列的載體轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1、2或3所述的細(xì)胞，其中所述載體包括缺陷包裝信號(hào)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述載體是gag-pol表達(dá)載體。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒pEV53B。
31.一種包括權(quán)利要求1、2或3所述的細(xì)胞的包裝細(xì)胞，其包括編碼至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號(hào)缺陷的，如此所述細(xì)胞自身產(chǎn)生至少一種慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但不產(chǎn)生能夠復(fù)制的感染性病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供修飾細(xì)胞，其具有的粘連特性與未修飾細(xì)胞的粘連特性相比是增加的，其包括a)編碼整聯(lián)蛋白β
文檔編號(hào)C12N15/11GK1980955SQ200580013798
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者J·C·奧爾森, M·帕特爾, D·A·威爾科克斯 申請(qǐng)人:北卡羅來納-查佩爾山大學(xué), Mcw研究基金會(huì)公司