專利名稱：使用干燥的試劑借助pcr擴增dna的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種借助含DNA物質的熱循環(huán)通過PCR擴增DNA的方法。所述含DNA物質包括相應試劑。此外，本發(fā)明還涉及一種用來實施該方法的相應裝置。
為了對例如全血中的白血細胞進行核酸分析，以回答對人類基因組方面提出的問題，必須首先在樣品準備步驟中破碎細胞，并接著分離由此釋放的DNA。此外，還必須除去可能抑制隨后的PCR的血液成分，例如血紅蛋白、免疫球蛋白及乳鐵蛋白。
在實驗室中，這些操作步驟按照已充分為人所知的現有技術來進行。尤其是，為了進行分離，將DNA結合在所謂磁珠上。通過外磁場，磁珠可以與DNA一起有針對性地運送，并在預先確定的位置上積聚。接著，可將已分離的DNA從珠上洗脫，或與珠一起(作為DNA/珠復合物)用于PCR(聚合酶鏈反應)。
按照現有技術，將分離的基因組DNA加入PCR試劑溶液(聚合酶、引物、核苷酸、緩沖液、助劑)，并對所有配料進行對PCR合適的熱循環(huán)。
后一種方法的實現取決于現有的實驗室設備，例如PCR儀(熱循環(huán)儀)、所謂的Eppendorf反應器、移液器、試劑冷卻容器，而且須由接受過培訓的人員在遵守安全規(guī)章(傳染危險、廢棄物清除…)的條件下進行。必須進行試劑溶液的若干容量分析的準確藥量分配(用移液管移液)。另外，這些操作步驟還耗費時間。
由EP 0 572 057 A1已知一種用作PCR試劑的組合物，在該組合物中，試劑被一種可融化物質覆蓋，以防止不希望的反應。此外，從“Nucleic AcidsResearch”、Vol.20、NO 7、第1717-1723頁中的公開，還單獨記載了如何能夠在真正PCR發(fā)生之前避免誤反應。同時，在www.bioexpress.com上，還記載了所謂的熱啟動PCR(Hot-Start-PCR)，在該熱啟動PCR中以增高的啟始溫度作為出發(fā)點。
上述方法原則上適用于實驗室分析。此外，US 2002/0022261 A1中還記載了一種用于進行微型化的遺傳分析的系統(tǒng)，以及相應的操作方法，在該系統(tǒng)中使用一種筒盒(Cartridge)，所述筒盒具有至少一個通往通道的入口。與此同時，在通道中為隨后的PCR進行細胞分解。為PCR準備相關試劑。
由最接近的現有技術出發(fā)，本發(fā)明的任務是在整合的微型化的筒盒中實現PCR-反應，并為此設立一種合適的裝置。
該任務以本說明書起始部分所提及的方式的方法，根據本發(fā)明，用權利要求1中的所述措施得以解決。相應裝置在權利要求9中作了說明。該方法和裝置的優(yōu)選實施方案是各從屬權利要求的主題。
本發(fā)明以發(fā)明名稱為“分析裝置”的WO 02/0072262 A1作為出發(fā)點。該文獻中，已經記載了在“芯片卡”(chipcard)的微通道或微空腔中應用干燥儲藏的、室溫下穩(wěn)定的試劑，該試劑在使用前不久通過引入水而使之溶解。就此而言，現有技術提供預先分成份的干燥試劑，從而溶解后得到一種定量分析試劑。相比之下在本發(fā)明中，為了進行PCR以進行隨后的分析，為此，事先必須進行細胞分解，并尤其是從全血樣品中分離DNA。
與實驗室方法相比，采用本發(fā)明可獲得下列優(yōu)點-在封閉的、可一次性使用的筒盒(Cartridge)中，進行所有物質和方法的充分整合；-試劑的儲存以室溫下儲藏穩(wěn)定的形式進行；-除了在整合細胞分解和PCR的時候需要注入待擴增DNA或血樣之外，無需手工操作步驟；-由于血液、試劑和試劑廢棄物留在筒盒中，所以不直接接觸有害于健康的材料；-緊湊的筒盒的幾何形狀允許熱循環(huán)高效而快速地進行；-筒盒可成本低廉地制造。
如果PCR試劑以已被干燥的形式被預先分配劑量，則須在體積和組成方面注意液體的劑量分配，因為PCR反應的質與量決定性地取決于這些參數。液體流經被干燥試劑覆蓋的通道而不加以徹底攪拌均勻，會導致試劑的錯誤濃度。
在本發(fā)明的情況下，以有利的方式，有可能在PCR反應進行前，對于結合到生物容器(biological container)(例如，細胞)的DNA，進行容器的分解，并分離DNA。借助細胞的分解，從現在起就特別地可直接加工全血樣品。尤其是于是當例如為進行PCR而使用由全血細胞分解得到的結合于磁珠的DNA時，則必需從樣品中除去PCR抑制性物質。這可以特別有利地通過用磁場將磁珠固定在PCR室中、并洗滌磁珠來實現。應用干燥的PCR試劑時，必須有一種防止這些試劑在洗滌過程中溶解的機構。按照本發(fā)明，這通過引入保護層，例如石蠟，來解決。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可以在本發(fā)明中使用陣列裝置用于PCR反應。因而有可能同時檢驗不同的DNA目標序列，從而導致顯著節(jié)省時間。
根據本發(fā)明的裝置具有下列特征-設有至少一個微通道或微空腔。
引入微通道或優(yōu)選引入微空腔的PCR試劑具有下列性質-所述可干燥物質具有可忽略不計的蒸汽壓力；-在該蒸汽壓力下，室溫下儲存穩(wěn)定的物質保留了PCR可借以進行的那些特性。
-所述物質混合物附著在微通道或微空腔的壁上；-所述物質混合物形成薄膜；-所述物質混合物被非水溶性介質，尤其是薄石蠟層，以不漏水的方式覆蓋。
特別在與來自全血細胞分解組合的情況下，引入微空腔或優(yōu)選引入微通道的溶胞(lyse)試劑具有下列特性-對白血細胞及/或其他細胞、細菌、病毒存在溶胞特性；-同樣使用蒸汽壓可忽略不計的可干燥物質；-在此蒸汽壓力下，室溫下儲存穩(wěn)定的物質保持了細胞分解特性；-物質混合物附著在微通道或微空腔的壁上；-所述“溶胞通道”通往PCR空腔。
本發(fā)明的其他細節(jié)和優(yōu)點，可參照附圖并結合權利要求書由下面對實施例的描述得到。
附圖顯示

圖1為分析裝置的俯視圖，圖2至圖5各自為沿縱剖面從圖1中沿著線II-II的截面，以解釋清楚PCR準備情況，其中單獨的局部圖2至5各自為不同的功能步驟，圖6為陣列裝置的俯視圖，所述陣列裝置用于同時對不同DNA進行PCR，以及圖7至圖9各自為三個不同功能步驟的經由圖6中沿著線VII-VII的縱剖面。
在圖1中為一種分析裝置，其可作為集中或者分散式的測量裝置而加以形成。尤其是該分析裝置形成芯片卡(“芯片上的實驗室”)的類型，其包括用于處理與評價待測試樣的所有機構(means)。
舉例來說，所述裝置由卡片1組成，所述卡片具有入口與出口。尤其是，設有用來引入水的入口(端口)2，和用來引入待測樣品如血液的入口3(端口)。在此情況下重要的是，經由合適的流動裝置2至10，一方面是待測試樣，另一方面是溶劑，得以聚集在一起，并且在分離了待測樣品中所含的DNA以后，將后者引向PCR室20。
除了已經提及的水端口和樣品端口2、3之外，該流動裝置還包括兩個試劑通道4、4′，以及設有出口6的流通通道5，用于廢棄物的接收通道8，和另一個流動通道9。附圖標記10表示流通通道5中的中心混合區(qū)域，用于樣品預加工。
除了用于PCR的機構之外，卡片1(“筒盒”)還包括檢測模塊30，其設有用于信號處理的相應連接。此外，還設有容納殘留物用的機構。因此，保證了整合，由此沒有有害于健康的物質能向外逸散。
全血樣品的分解單獨地根據申請人同時的、具有相同申請優(yōu)先權的、發(fā)明名稱為“用干燥試劑來分離DNA的方法和裝置”的專利申請而加以記載。根據圖2至圖5可明白如何逐個地為DNA擴增進行準備設有空腔20，在其中進行PCR反應。PCR(聚合酶鏈反應)擴增可由現有技術充分悉知。由此按照規(guī)定溫度程序逐個進行熱循環(huán)。
圖2中，待測樣品在細胞分解以后，經由流通通道21抵達PCR空腔20中。在PCR空腔20中，儲存了儲藏穩(wěn)定、并且在運行時間內穩(wěn)定的PCR干燥試劑25。就此而論，儲藏穩(wěn)定的/長時間穩(wěn)定的固體，是指就此而論在室溫下至少放置數月仍保持引起PCR效果的特性的固體。
干燥試劑25是水溶性的，并且必須在真正PCR反應之前，也即在樣品預加工和沖洗階段中，保護其免受，例如分解試劑的溶解和變性。為此，在干燥試劑25上設有非水溶性介質26。為此目的，特別可以使用石蠟層。
借助于凝固的石蠟隔離層隔開兩種液體，目的在于通過石蠟的熔化使兩種液體匯合，已眾所周知。這特別用在所謂的經典“熱啟動”PCR上。但在本發(fā)明的情況下不是液體，而是用石蠟覆蓋的固體。
此外，圖2中還按功能指明了閥門22、22′和磁體15。其功能將在圖3至圖5的其他細分步驟中予以闡明從圖3中可以看出，閥門22、22′開啟時，待測溶液連同結合在磁珠12上的DNA一起到達測量空腔20。與此同時，DNA通過磁體效應而集中在相關磁極上。在此階段，可先進行洗滌流程，而在清洗以后，關閉閥門22、22’。
在相應的圖4中，在封閉的PCR空腔20從現在起有試劑25、覆蓋層26，和含有濃集DNA的水性溶液24。接著開始真正的PCR反應。在相當于PCR熱循環(huán)的首次加溫時，根據圖5所示，石蠟層26被融化，并分離成小球27、27’。與此相反，PCR試劑25則以相宜的劑量分配溶于溶劑或緩沖液24中。在PCR空腔20中，存在作為懸浮液28的濃集的、結合在磁珠13上的DNA。從現在起，可按已知方式，借助熱循環(huán)程序的多次過程來進行PCR。
圖2至圖5中作為PCR試劑擬定的固體，涉及選擇具有可忽略不計的蒸汽壓的、室溫下儲藏穩(wěn)定的物質。這些物質可以是材料混合物。重要的是，它們處于預先分配劑量的形式時，能長時間穩(wěn)定。也就是說，經數月，它們的那些PCR反應借以進行的特性仍可保持。
在圖6中，形成作為陣列進行PCR的裝置。這意味著，取代單個的PCR空腔，例如圖1至圖5中的空腔20，從現在開始在封閉的容積200中設有單個的PCR空腔201ik，其中下標意即i＝1至m，k＝1至n。室200具有入口205和出口206，分別供溶劑流入或流出之用。
圖6中的室200由基體210構成，其具有作為陣列分配的空腔201ik，由此在圖7中可見一行n。此外還設有蓋子220，借助該蓋子可將單個PCR空腔201ik各自彼此隔絕封閉。
這些單個PCR空腔201ik原則上按照圖2至圖5所示裝滿。這可由圖7至圖9清晰看出，這些圖以剖面描述了一系列單獨的測量空腔。在此重要的是，在這些測量空腔中，相應于行，引入第一種固體250a，b、c，…，其中這種固體作為干燥試劑各自特異于確定的DNA。在固體250a、b、c，…上面有密封性的介質260。通過入口205，待檢驗DNA混合物270在溶液中或作為懸浮液供給。
圖8中顯示，在向單個測量空腔201ik供給溶劑以后，將蓋子220關閉，從而從現在起單個PCR空腔被分開。當從現在開始按照圖9關閉蓋子進行熱循環(huán)時，在單個PCR空腔中，與樣品DNA一起，存在各自不同的、用于擴增的、對目標DNA特異的試劑。因此，可以對許多待分析DNA同時且同時進行(parallel)多個PCR反應。
相應于圖6的PCR陣列可以結合到相應于圖1的分析單元中。每個PCR空腔可以額外配備有檢測PCR產物用的傳感裝置，例如用于電檢測的貴金屬電極。此外，電極還可配備雜交探針，或者也可配備PCR引物。因此，提供改善的應用可能性，例如分析復雜的DNA混合物，這種分析借助復合PCR在單獨的PCR器中是不可能實現的。
在前面所描敘的方法和相應裝置中，下列措施或特征是重要的-在微通道或微空腔中，引入具有DNA結合特性的基質，例如結合DNA的磁珠；-溶胞試劑和磁珠可同時包括在一種單獨的基質中；-設有全血樣品輸入端口；-設有供水的機構，例如入口端口，用來連接外部供水源；-在微通道或者微空腔中用干燥的緩沖物質在供水后控制確定的離子強度；-設有用來混合全血樣品和水或緩沖溶液的機構；-設有使血液、或血液/水混合物，或血液/緩沖液混合物流過覆蓋有溶胞試劑/珠試劑的微通道或微空腔的機構。
-設有用來產生磁場以將DNA/磁珠-復合物固定在PCR空腔中的機構；-設有用來封閉PCR空腔的機構；-對于PCR，設有用于熱循環(huán)的機構；-所述PCR空腔具有用于至少部分均壓(pressure balance)的機構。
該裝置和方法的主要優(yōu)點是-制造筒盒時已進行了PCR試劑的精確劑量分配；-使用中，在充滿或者流過PCR空腔時，保持PCR試劑精確的量和組成。因此，不存在試劑標定濃度的改變，特別不存在稀釋效應；-PCR空腔的容積在充滿時是恒定并已知的；
-在石蠟隔離層熔化以后，干燥的PCR試劑與溶劑，尤其是水或低鹽含量的水合并，并可通過對流產生確定的PCR試劑溶液；-在與DNA結合到珠上(珠技術)相結合時，DNA必須不額外地在PCR空腔外被洗脫。
因此，保證了包括樣品準備在內的全部分析過程均在形成一次性筒盒的封閉系統(tǒng)內進行。
權利要求
1.借助含DNA的物質的熱循環(huán)用PCR法擴增DNA的方法，所述含DNA的物質包含相應試劑，該方法包括下列措施-所有材料和操作步驟的充分整合在封閉的分析單位中進行，所述封閉的分析單位帶有可一次性使用、并帶有微通道或微空腔的筒盒，在所述筒盒中至少儲存有室溫下穩(wěn)定存放、為PCR所必需的試劑，其中-首先，將水溶性試劑用非水溶性介質覆蓋，并-將待擴增DNA引入水性溶劑中，-接著消除非水溶性介質的覆蓋效果，由此-水溶性試劑溶于水性溶劑中，-據此啟動PCR-熱循環(huán)反應。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，作為用于PCR的試劑，使用無水、室溫下經數月可穩(wěn)定儲存的物質，其在引入水后能進行PCR。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于，對于結合在生物容器中的DNA，例如全血樣品，將容器的分解，例如白血細胞的細胞分解，與PCR整合在一起。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于，使用具有這樣的幾何形狀的分析單位(筒盒)，所述幾何形狀能使高效而快速的熱循環(huán)成為可能。
5.前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，使用一次性產品作為實施反應的分析單位，所述一次性產品可在批量生產中少量而低成本地制造。
6.前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，PCR反應在陣列裝置中進行，所述陣列裝置任選具有同時用于不同DNA擴增的不同引物。
7.權利要求6所述的方法，其特征在于，針對不同的DNA擴增使用不同組成的PCR試劑。
8.權利要求6所述的方法，其特征在于，在陣列中充滿DNA樣品，PCR空腔(250ik)的蓋子(210)被封閉并隔絕互相流動，使石蠟層(260)融化并同時進行單個的DNA擴增。
9.實施權利要求1的方法或權利要求2至8中任何一項所述方法的裝置，其帶有分析單位，所述分析單位作為可一次性使用的筒盒來實施，其中設有至少一個用來容納PCR試劑的微通道(5)及/或微空腔(20)，在那里，PCR試劑作為在室溫下形成穩(wěn)定物質的混合物被引入、并用水不溶性介質層(26)覆蓋。
10.權利要求9所述的裝置，其特征在于，所述混合物是無水固體。
11.權利要求9所述的裝置，其特征在于，所述固體(25)附著在微通道(5)或微空腔(20)的壁上。
12.權利要求9所述的裝置，其特征在于，用成膜劑形成PCR試劑膜。
13.權利要求9所述的裝置，其特征在于，所述水不溶性介質是石蠟。
14.權利要求9所述的裝置，其特征在于，所述石蠟具有確定的熔點以釋放PCR試劑。
15.權利要求9至13中任何一項所述的裝置，其特征在于，為了在微空腔(20)或微通道(5)中進行細胞分解，還存在溶胞試劑，所述溶胞試劑例如對白血細胞具有特異性質。
16.權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述溶胞試劑由可干燥物質組成，所述可干燥物質具有可忽略不計的蒸汽壓，所述可干燥物質在室溫下是儲藏穩(wěn)定的，并且所述溶胞試劑附著在微通道(5)的壁上，所述微通道(5)預先與PCR空腔(20)接通，其中溶胞物質的通道(5)通入PCR空腔(20)。
17.權利要求9至15中任何一項所述的裝置，其特征在于，在微通道(5)或微空腔(20)中設有基質，所述基質具有DNA結合性質。
18.權利要求17所述的裝置，其特征在于，所述DNA結合的基質是所謂磁珠。
19.權利要求9至19中任何一項所述的裝置，其特征在于，所述溶胞試劑和磁珠包含在共同的干燥基質中。
20.權利要求9至19中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有全血樣品輸入口(2)。
21.權利要求9至20中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有用來引入水的機構。
22.權利要求9至21中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有用來混合血液樣品和水或緩沖液的機構。
23.權利要求9至22中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有這樣的機構，所述機構用來使血液、血液/水、或者血液/緩沖液混合物流過覆有溶胞/珠試劑的微通道(5)或微空腔(20)。
24.權利要求9至23中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有用來產生磁場以使DNA-磁珠復合物固定在PCR空腔(20)中的機構(25)。
25.權利要求9至24中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有用于熱循環(huán)的機構。
26.權利要求9至25中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有使PCR空腔中至少部分壓力平衡的機構。
27.權利要求9至26中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有PCR空腔(210ik)的陣列。
28.權利要求9至27中任何一項所述的裝置，其特征在于，在PCR空腔(250ik)中儲存有不同的PCR試劑(251a、b、...)。
29.權利要求9至28中任何一項所述的裝置，其特征在于，設有用于在PCR過程中封閉PCR空腔(250ik)的蓋子(210)。
全文摘要
在通過PCR用來進行DNA擴增的方法中，所述PCR借助包含相應試劑的熱循環(huán)，其中在封閉的、可一次性使用的單位(所謂筒盒)中充分整合所有物質和操作步驟，在該單位中，試劑以在室溫下儲存穩(wěn)定的形式被儲存，水溶性試劑用非水溶性介質覆蓋，將待擴增DNA引入該單位，并去除非水溶性介質，以使水溶性試劑溶解，從而使PCR得以啟動。在相應裝置中，設有樣品單位，所述樣品單位作為一次性產品(所謂筒盒)，其中設有至少一個用來容納PCR試劑的微通道(5)或微空腔(20)，在所述微通道或微空腔中PCR試劑作為蒸汽壓力可忽略不計的、在室溫下形成儲存穩(wěn)定物質的可干燥混合物附著在微通道(5)或微空腔(20)的壁上，并形成薄膜(25)，所述薄膜用不溶性介質(26)覆蓋。
文檔編號C12N15/10GK1950522SQ200580013845
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權日2004年4月30日
發(fā)明者沃爾特·岡布里克特, 彼得·波里卡, 曼弗雷德·斯坦?jié)蔂?申請人:西門子公司