專利名稱：對伊馬替尼治療敏感的膠質(zhì)母細胞瘤亞群的鑒定和表征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用特定遺傳標(biāo)記物以體外診斷哺乳動物細胞增殖性疾病、預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種血小板衍生生長因子(PDGF)受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為、以及選擇患有細胞增殖性疾病且預(yù)測可對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)的哺乳動物的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)可將膠質(zhì)瘤分為四個級別。分級基于組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)如核異形性、有絲分裂活性、血管內(nèi)血栓形成、微血管增生和壞死。根據(jù)細胞類型起源，一般可將II級腫瘤分為星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤以及混合的少突星形膠質(zhì)細胞瘤。III級可分為間變性星形細胞瘤和間變性少突膠質(zhì)細胞瘤。最高形式IV級即為一般所知的多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)。
因此，膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)為成人最常見的惡性腦部腫瘤。目前治療基于手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。然而，這些治療手段的反應(yīng)極差。GBM患者的兩年生存率小于7.5％(Maher等人，2001)。因此很需要鑒定新的治療策略。
根據(jù)該病的臨床過程和對其遺傳改變的特征描述，GBM可粗略地分為原發(fā)性和繼發(fā)性GBM(如Maher等人，2002綜述)。原發(fā)性GBM與突變性改變的EGF受體的擴增有關(guān)，而繼發(fā)性GBM的特征在于p53突變以及PDGF和PDGF受體的過度表達。與原發(fā)性GBM相比，繼發(fā)性GBM見于更年輕的患者。最近的研究也鑒定了繼發(fā)性GBM中的一種新亞型，其特征在于染色體12q13-14上基因的過度表達(Mischel等人，2003)。
GBM亞型中PDGF和PDGF受體的聯(lián)合表達，與自分泌PDGF受體信號傳導(dǎo)在GBM中的功能環(huán)節(jié)相一致。這一提法已經(jīng)得到了實驗支持。首先，小鼠大腦中過度產(chǎn)生PDGF可在小鼠中誘導(dǎo)出類似GBM的腫瘤(Dai等人，2001；Uhrbom等人，1998)。其次，采用不同類型的PDGF受體抑制劑進行的實驗性治療研究顯示，通過干擾PDGF受體信號傳導(dǎo)可以阻斷GBM衍生細胞系的生長(Kilic等人，2000；Shamah等人，1993；Strawn等人，1994)。
可用于臨床的PDGF受體拮抗劑(如化合物I)的有效性，證實了通過干擾腫瘤中PDGF受體信號傳導(dǎo)而獲得治療效果的可能性(Pietras等人，2003綜述)。化合物I為可口服利用的酪氨酸激酶抑制劑，該抑制劑除PDGF受體外也阻斷c-Kit、c-Abl、Bcr-Abl和Arg的活性(Capdeville等人，2002綜述)。在對患有CML和GIST的病人(分別與Bcr-Abl和c-Kit的變異有關(guān))的研究中已經(jīng)很好地證實了化合物I的臨床功效(Demetri等人，2002；O′Brien等人，2003)。
如上所述，由于至今尚無令人滿意的GBM治療，需要尋找可成功治療患有GBM、及更廣泛而言患有細胞增殖性疾病的哺乳動物(優(yōu)選人)的新治療策略。
此處所用的“哺乳動物”為溫血哺乳動物，包括人類。
本發(fā)明中的“生物樣品”是指從分離自哺乳動物身體的任一生物材料中獲取的哺乳動物樣品，包括組織、細胞、血漿、血清、細胞或組織裂解物，且優(yōu)選腫瘤組織。此類樣品可通過如活組織檢查得到。
此處的表述“血小板衍生生長因子(PDGF)受體拮抗劑”是指可阻斷PDGF受體信號傳導(dǎo)的任一試劑，包括如針對PDGF配體或受體的抗體、可阻止PDGF與受體結(jié)合的重組可溶性受體或適體，以及直接干擾PDGF受體激酶活性的低分子量化合物，如化合物I(見下)和其他有相似作用機制的試劑，及其可藥用鹽。優(yōu)選用于實施本發(fā)明的PDGF受體拮抗劑為下文的化合物I，或其可藥用鹽。
表述“可藥用”是指可用于制備藥物組合物，一般安全、無毒、無生物學(xué)或其他非期望作用，也包括那些可用于哺乳動物(優(yōu)選人)制藥用途。
“可藥用鹽”是指保留具體化合物(例如，化合物I或其他PDGF受體拮抗劑)中游離酸和堿生物學(xué)有效性的鹽，且并非生物學(xué)或其他方面不可接受?？伤幱名}的實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、重亞硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二醇鹽、己炔-1，6-二醇鹽、安息香酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、乙酸苯酯、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽和扁桃酸鹽。
可以通過本領(lǐng)域已知的任一合適方法制備所需的鹽，包括用無機酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或有機酸(醋酸、蘋果酸、琥珀酸、扁桃酸、延胡索酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、吡喃糖苷酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α-羥酸(如檸檬酸或酒石酸)、氨基酸(如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(如安息香酸或苯乙烯酸)、磺酸(如對甲苯磺酸或乙磺酸)等)處理PDGF受體拮抗劑(如化合物I)的游離堿基。
對于固體的化合物、鹽或溶劑化物而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些化合物、鹽或溶劑化物可以以不同的結(jié)晶形式存在，所有這些形式均包括在本發(fā)明及具體化學(xué)式的范圍內(nèi)。
“藥物組合物”此處也以同義術(shù)語“藥物制劑”或“藥物”指代。
包括化合物I在內(nèi)的PDGF受體拮抗劑及其可藥用的鹽或溶劑化物，適于以任一技術(shù)人員認可合適的制藥形式的藥物組合物施用。合適的藥物形式包括固體、半固體、液體或凍干制劑，如片劑、粉劑、膠囊、栓劑、懸浮液、脂質(zhì)體及氣溶膠。根據(jù)特定用途或施用方式，藥物組合物也可包含合適的賦形劑、稀釋劑、溶媒和載體，以及其他藥用活性試劑。
可用于制備藥物組合物的合適藥物形式的方法通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，可按照常規(guī)藥物化學(xué)技術(shù)制備藥物制劑，其步驟包括如混合、填充以及恰當(dāng)溶解其成分，從而得到口服、胃腸外、局部、陰道內(nèi)、肛內(nèi)、氣管內(nèi)、眼內(nèi)、耳內(nèi)和/或直腸施用所需的產(chǎn)品。
藥物組合物中可使用固體或液體可藥用載體、稀釋劑、溶媒或賦形劑。示例性固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸氫鈣、硬石膏(terra alba)、蔗糖、滑石、凝膠、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂和硬脂酸。示例性液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽溶液和水。載體或稀釋劑中可含有合適的延長釋放材料，如單獨使用或聯(lián)合蠟質(zhì)使用的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。當(dāng)使用液體載體時，制劑形式可為糖漿、酏劑、乳劑、軟凝膠膠囊、無菌注射液(如溶液)，或為非水或水懸浮液。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任一通常接受的模式施用PDGF受體拮抗劑(特別是化合物I)及其可藥用鹽和溶劑化物。施用方法的示范性實例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、胃腸外、局部、經(jīng)皮和經(jīng)直腸。
一劑藥物組合物中含有至少為治療有效量的活性化合物(如化合物I或其可藥用鹽或溶劑化物)，且優(yōu)選由一個或多個藥物劑量單位組成。所選擇的劑量可以任一已知或適于施用該劑型的方法施用于需要該治療的哺乳動物，優(yōu)選人患者，包括局部(例如以油膏或霜劑形式)；口服；經(jīng)直腸(如以栓劑形式)；胃腸外(通過注射)；或經(jīng)陰道、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管或眼內(nèi)連續(xù)施用。
“治療有效量”是指當(dāng)施用于有需要的哺乳動物時，足以產(chǎn)生治療細胞增殖性疾病的活性劑的量。某一化合物的治療有效量根據(jù)具體的化合物、疾病狀況及其嚴重程度、需要該治療的哺乳動物等因素而有所不同，劑量慣例由技術(shù)人員決定。
“治療”某一疾病狀態(tài)包括
(1)預(yù)防疾病，即避免可能暴露于或易感于疾病狀態(tài)但還沒有經(jīng)歷或表現(xiàn)出該疾病癥狀的哺乳動物(優(yōu)選人)個體中出現(xiàn)疾病狀態(tài)的臨床癥狀；(2)抑制疾病狀態(tài)，即阻斷疾病狀態(tài)或其臨床癥狀的發(fā)展；或(3)緩解疾病狀態(tài)，即使疾病狀態(tài)或其臨床癥狀暫時或永久消退。
上文中使用的“疾病狀態(tài)”是指細胞增殖性疾病，也即某一類型的細胞發(fā)生累積，包括所有腫瘤、癌癥、癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤等。細胞增殖性疾病優(yōu)選為膠質(zhì)母細胞瘤。
術(shù)語“遺傳標(biāo)記”、“生物標(biāo)記”、“標(biāo)記”和“特征”為同義詞，在此處可交互使用。
化合物I為4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯]-苯甲酰胺，分子式如下 化合物I的游離堿基、其可藥用鹽及其制劑，公開于已授權(quán)的歐洲專利EP 0564409中，此處引用作為參考?；衔颕游離堿基為其活性部分?；衔颕為血小板衍生生長因子受體α和β(PDGFRα和β)、Bcr-Abl和c-kit酪氨酸激酶的抑制劑。
化合物的甲基磺酸加成鹽(此下稱為“鹽I”)及其優(yōu)選的結(jié)晶形式(如β結(jié)晶形式)，公開于已授權(quán)的歐洲專利EP 0998473中，此處引用作為參考。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及在體外診斷哺乳動物中細胞增殖性疾病的方法，包括至少a)提供所述哺乳動物的生物樣品；并b)測定所述樣品中至少2至40個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
在步驟b)中可以方便地只測定至少3至5個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
可以通過任一常規(guī)技術(shù)測定生物樣品中遺傳標(biāo)記的表達水平和/或磷酸化狀態(tài)，所述常規(guī)技術(shù)基于如，利用如RT-RNA技術(shù)測定RNA表達，或基于如利用如Western印跡、免疫組織化學(xué)或ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，包括免疫測定、免疫沉淀和電泳測定中的任一技術(shù)測定蛋白質(zhì)表達。優(yōu)選技術(shù)人員將測定樣品中的遺傳標(biāo)記的表達水平和/或其磷酸化水平。
例如，可以使用對非磷酸化形式、或磷酸化形式、或非磷酸化形式和磷酸化形式兩種遺傳標(biāo)記均具有特異性的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定測量所述標(biāo)記的表達和/或磷酸化水平。也可以通過利用如單克隆或多克隆抗體進行的ELISA類型的測定、免疫沉淀類型的測定、常規(guī)的Western印跡測定和免疫組織化學(xué)測定，來確定標(biāo)記的表達水平和/或磷酸化。
本發(fā)明的第二方面涉及預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為的方法，包括至少a)提供所述哺乳動物的生物樣品；并b)測定所述樣品中至少2至40個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
c)將步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，與根據(jù)表3計算得到的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進行比較，得出反應(yīng)性和無反應(yīng)性表達和/或磷酸化譜；并d)如下預(yù)測所述哺乳動物的行為-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的反應(yīng)性表達和/或磷酸化狀態(tài)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，則預(yù)測所述哺乳動物對該治療有反應(yīng)。
-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的無反應(yīng)性表達和/或磷酸化狀態(tài)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，則預(yù)測所述哺乳動物對該治療無反應(yīng)；且
-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的反應(yīng)性和無反應(yīng)性表達和/或磷酸化狀態(tài)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的范圍之外，則不能確定所述哺乳動物對該治療的反應(yīng)行為。
在具體的實施方案中，步驟b)中可以只測定至少3至5個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
本發(fā)明的第三方面涉及選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物的方法，所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)，所述方法包括至少a)利用上述方法預(yù)測所述哺乳動物的行為；且b)若預(yù)測所述哺乳動物對治療有反應(yīng)，則選擇該哺乳動物。
選擇該哺乳動物可有很多目的，例如進入一項臨床試驗，或向其施用使用至少一種PDGF受體拮抗劑或其可藥用鹽的藥物治療。
本發(fā)明的第四方面涉及用于體外分析哺乳動物中遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜的試劑盒，所述試劑盒含有選自表3中至少2至40個、優(yōu)選3至5個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
第五方面，本發(fā)明涉及用于體外分析哺乳動物中遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜的微陣列或生物芯片，其中含有選自表3中至少2至40個、優(yōu)選3至5個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
本發(fā)明的第六方面涉及將選自表3的至少一個基因和/或至少一個基因產(chǎn)物作為遺傳標(biāo)記用于-體外診斷哺乳動物的細胞增殖性疾??；和/或-預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為；和/或-選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物，其中所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)。
在這一方面，可方便使用對應(yīng)于所述基因的cDNA，和/或?qū)λ龌虍a(chǎn)物(其磷酸化形式、或非磷酸化形式、或兩者同時)具有特異性的抗體。
本發(fā)明的第七方面涉及將前述試劑盒、微陣列或生物芯片用于
-體外診斷哺乳動物的細胞增殖性疾病；和/或-預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為；和/或-選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物，其中所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)。
本發(fā)明的第八方面涉及至少一種PDGF受體拮抗劑在藥物制造中的用途，該藥物用于治療患有細胞增殖性疾病的反應(yīng)性哺乳動物，其中所述反應(yīng)性哺乳動物的選擇根據(jù)上述方法進行。
本發(fā)明也公開了治療需要該治療的反應(yīng)性哺乳動物的細胞增殖性疾病的方法，包括向其施用治療有效量的PDGF受體拮抗劑，所述反應(yīng)性哺乳動物的選擇根據(jù)上述方法進行。
在具體實施方案中，所述PDGF受體拮抗劑含于藥物組合物中。
通過以下


但并非限制本發(fā)明圖1.GBM培養(yǎng)物的生長速率和化合物I敏感性(A)以4000細胞/孔接種24孔平板，培養(yǎng)4天后確定其細胞數(shù)目，從而確定23個GBM培養(yǎng)物的生長速率。該值為培養(yǎng)期間的生長倍數(shù)，是兩項獨立實驗的平均值。(B)為確定對化合物I的敏感性，將除去7組生長最慢的培養(yǎng)物剩下的16個GBM培養(yǎng)物，各接種4000細胞于96孔平板的孔內(nèi)，令其在存在或缺乏1μM化合物I的情況下生長4天。通過結(jié)晶紫染色和光度測量，確定培養(yǎng)終末時的細胞數(shù)目。用經(jīng)化合物I處理而誘發(fā)的生長抑制百分比來表示對化合物I的敏感性。結(jié)果(包括標(biāo)準(zhǔn)差)來自3個獨立實驗，其中各組培養(yǎng)物均進行4次分析。(C)將結(jié)果顯示于散布圖(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.39)中，說明生長速率和化合物I敏感性間的相關(guān)性。
圖2.GBM培養(yǎng)物中的PDGF受體的表達和活化利用識別PDGFRα、PDGFRβ和磷酸化酪氨酸的抗體，對GBM培養(yǎng)物中的WGA級分進行連續(xù)免疫印跡，確定不同細胞培養(yǎng)物中PDGFα-和β-受體的表達水平和活化狀態(tài)。來自表達任一種受體的細胞的樣品用作特異性對照，并用于不同濾器的標(biāo)準(zhǔn)化。(A)GBM培養(yǎng)物和對照細胞中的代表性免疫印跡分析實例。GBM培養(yǎng)物中PDGFα-受體(B)和PDGFβ-受體(C)的表達。根據(jù)PDGFα-受體的表達水平對細胞系進行排序。將GBM培養(yǎng)物21值任意設(shè)定為1。插圖顯示根據(jù)免疫印跡和mRNA表達分析確定的PDGF α-和β-受體表達間的相關(guān)性(Pearson相關(guān)，PDGFα-受體r＝0.86，PDGFβ-受體r＝0.52)。(D)由磷酸化酪氨酸免疫印跡確定的PDGFR的酪氨酸磷酸化。分析對應(yīng)于PDGFα-和β-受體聯(lián)合遷移位置的過濾面積。細胞系排列同B和C。將GBM培養(yǎng)物21中的總PDGF受體磷酸化水平任意設(shè)定為1。
圖3.化合物I敏感性與PDGFR狀態(tài)的相關(guān)性顯示了化合物I敏感性與PDGFα-受體表達的相關(guān)性(上方左圖)、與PDGFβ-受體表達的相關(guān)性(上方右圖)、與PDGFα-和PDGFβ-受體聯(lián)合表達的相關(guān)性(下方左圖)，以及與總PDGF受體酪氨酸磷酸化之間的關(guān)系(下方右圖)。除去在化合物I敏感性實驗中顯示最大實驗內(nèi)差異的5個GBM培養(yǎng)物，對剩下的11個GBM培養(yǎng)物進行分析。
圖4.GBM培養(yǎng)物中ERK和Akt的磷酸化水平以及這些參數(shù)與化合物I敏感性或PDGF受體狀態(tài)間的相關(guān)性利用可識別p44/42MAPK、磷酸化p44/42MAPK Thr202/Tyr204、Akt和磷酸化Akt Ser473的抗體，通過免疫印跡測定ERK和Akt的特異性磷酸化。定量ECL信號，并利用對照裂解物來標(biāo)準(zhǔn)化濾器間轉(zhuǎn)移效率的不同。10個GBM培養(yǎng)物中ERK(A)和Akt(C)的相對磷酸化以及ERK、Akt磷酸化與化合物I敏感性(B、D，上方左圖)，PDGF受體表達(B、D，上方右圖)，以及PDGF受體磷酸化(B、D，下圖)的相關(guān)性。
圖5.化合物I對Akt和ERK磷酸化的影響分析，以及這些參數(shù)與化合物I敏感性和PDGF受體狀態(tài)間的相關(guān)性通過比較未處理細胞和在1μM化合物I中預(yù)孵育1小時的細胞中ERK和Akt的磷酸化，監(jiān)測化合物I在ERK和Akt中引發(fā)的改變?；衔颕引發(fā)的10個GBM培養(yǎng)物中ERK(A)和Akt(C)的磷酸化改變以及這些參數(shù)與化合物I敏感性(B、D，上方左圖)，PDGF受體表達(B、D，上方右圖)，以及PDGF受體磷酸化(B、D，下圖)的相關(guān)性。圖6.根據(jù)用于集群(hierarchical clustering)分析中選擇特征的3條不同標(biāo)準(zhǔn)，對23組膠質(zhì)母細胞瘤細胞培養(yǎng)物進行分級集群(A)根據(jù)與含有88個元件的基因列表的Pearson′s相關(guān)性進行分級集群，所述基因ANOVA檢驗p值小于0.05，且在至少3個GBM培養(yǎng)物中上調(diào)大于2倍，在另外至少3個GBM培養(yǎng)物中下調(diào)2倍。(B)根據(jù)包括2795項特征的列表集群GBM培養(yǎng)物，通過在ANOVA檢驗設(shè)定顯著性水平為0.05而得到所述列表。(C)同B，在得到包括311項特征的列表后集群，但設(shè)定ANOVA檢驗的顯著性為p＜0.000000001。利用色彩編碼說明不管使用何種標(biāo)準(zhǔn)選擇特征列表，形成了三個主要集群，它們顯示了23個GBM培養(yǎng)物中的17組在任一情況下的相同分布，例如GBM培養(yǎng)物5、7、8和11總是集群在一起。
圖7.定義GBM培養(yǎng)物三種亞型的基因的集群根據(jù)Pearson′s相關(guān)性，對圖6A中顯示的用于GBM細胞集群的特征進行分級集群，得出這些特征的關(guān)系樹。根據(jù)跨越23個GBM培養(yǎng)物表達模式相似性，這一集群對分析了若干組基因。紅色和綠色分別指示單個GBM培養(yǎng)物中基因的高表達和低表達。
圖8.獲得23個GBM培養(yǎng)物的生物表征及表達譜結(jié)果后的匯編所顯示的集群為選擇ANOVA檢驗中p值小于0.05的特征后得到的結(jié)果，所述特征還在至少3個GBM培養(yǎng)物中上調(diào)大于2倍，在另外至少3個GBM培養(yǎng)物中下調(diào)2倍(圖6A)。生長速率的描述如圖1A，其中數(shù)字表示在4天的培養(yǎng)期間細胞數(shù)目增加倍數(shù)。關(guān)于化合物I敏感性，16個分析過的GBM培養(yǎng)物分成6個反應(yīng)者(+，表示生長抑制大于40％)、7個無反應(yīng)者(-，表示生長抑制小于20％)以及3個中度反應(yīng)者(*；生長抑制為20-40％)。關(guān)于PDGF受體表達和磷酸化，將21個分析過的GBM培養(yǎng)物分成兩組，分別為高(+；10個GBM培養(yǎng)物)或低(-；11個GBM培養(yǎng)物)PDGF受體表達或磷酸化。
圖9.化合物I反應(yīng)者和無反應(yīng)者在留一法(leave-one-out test)測試中的的加權(quán)表決(weighted-voting)分類表現(xiàn)選擇細胞系6、7、9和31為反應(yīng)者，而5、18、21、30、35和38為無反應(yīng)者進行分類。x軸描述了用于分類的特征數(shù)目(1-250)，y軸描述了在留一法中誤分類的培養(yǎng)物分數(shù)。
圖10.分類器在訓(xùn)練集排除的5個GBM培養(yǎng)物中的表現(xiàn)利用由3-5項特征組成的分類器預(yù)測另外5個GBM培養(yǎng)物的反應(yīng)，所述特征為來自10個膠質(zhì)母細胞瘤細胞的信噪比排行基因列表中列于榜首者。分類圖表顯示了如圖1B所確定的培養(yǎng)物的化合物I敏感性。每一欄下給出了根據(jù)由3、4或5項特征組成的特征列表而得到的這5個GBM培養(yǎng)物的分類。利用不同分類器對每種細胞培養(yǎng)物進行預(yù)測的能力以置信值所示。
通過以下對實驗(包括實施例)的詳細描述能更好地理解本發(fā)明。然而，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道該實驗描述并無限制性，可以不背離本發(fā)明的范圍而進行多種修飾、替代、省略和改變。
實施例I-材料和方法I-1組織培養(yǎng)及GBM培養(yǎng)物生長速率和化合物I敏感性的測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Ponten和Westermark，1978)建立原發(fā)性GBM培養(yǎng)物。將來自膠質(zhì)母細胞瘤的原代細胞培養(yǎng)物，于37℃下含5％CO2的大氣中接種于添加10％FBS、10U/ml青霉素和10μg/ml鏈霉素的MEM中。
為確定生長速率，將細胞以每孔4000個細胞的密度接種于24孔平板上(Sarstedt)。培養(yǎng)4天后，通過胰蛋白酶消化收獲細胞，并以Coulter細胞計數(shù)器計數(shù)。生長速率用培養(yǎng)期間細胞的倍增數(shù)來表示。所提供的數(shù)據(jù)來自兩個獨立實驗，其中每一分析都以一試兩份進行。
I-2-化合物I誘導(dǎo)的生長抑制從Novartis Pharmaceticals獲取化合物I。對于每一實驗而言，將6mg化合物I溶解于10ml PBS中，然后用45μm濾器無菌過濾，制備新鮮的1mM化合物I儲備溶液。對于在4天期間生長速率沒有超過1.2倍的細胞培養(yǎng)物，不檢測其中化合物I誘導(dǎo)的生長抑制。為確定化合物I對細胞生長的影響，以每孔4000細胞的密度將細胞接種于96孔平板上(Sarstedt)。第二天將培養(yǎng)基換為含或不含1μM化合物I的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后(包括2天后更換培養(yǎng)基)，于含4％多聚甲醛(PFA)的冷PBS中固定細胞30分鐘，并于4％乙醇中用0.01％結(jié)晶紫染色30分鐘。用自來水洗滌樣品3次，空氣下干燥至少30分鐘。將染色細胞溶解于100μl 1％SDS中，并用Biomek 1000(Beckman)光度工具(600nm濾器)定量其吸光度。
用處理4天期間細胞數(shù)目增長的減少百分數(shù)來表示化合物I的作用，因此100％生長減少相當(dāng)于在培養(yǎng)期結(jié)束時和開始時細胞數(shù)目相同。每一實驗中包括曾顯示化合物I敏感性生長的細胞作為陽性對照(Sjblom等人，2001)。顯示的數(shù)據(jù)來自兩個或三個對化合物I在每一GBM培養(yǎng)物中作用的獨立分析，均以一試兩份/一試四份進行。
1-3-用于分析PDGF受體--ERK和Akt的表達和磷酸化狀態(tài)的對照細胞裂解物的制備利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PDGFα或β受體(分別為PAE/Rα和PAE/Rβ細胞(Claesson-Welsh等人，1988；Claesson-Welsh等人，1989))的豬主動脈內(nèi)皮細胞以高密度接種于10cm盤(Sarstedt)中。16小時后，除盡細胞中的血清，換為含有0.1％FBS的培養(yǎng)基24小時。然后于37℃下含或不含100ng/ml PDGF-BB的0.1％FBS的培養(yǎng)基中處理細胞5分鐘。用冰冷的PBS洗滌后，將細胞于1ml溶解緩沖液中冰上溶解10分鐘，所述溶解緩沖液中含有0.5％Triton X-100、0.5％脫氧膽酸、150mMNaCl、20mM Tris pH 7.5、10mM EDTA、30mM焦磷酸鈉十水合物、1％抑肽酶、0.5％苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.5％NaVO3。在15000xg下離心15分鐘后，收集細胞裂解物并用BCA蛋白質(zhì)測定試劑A試劑盒(Pierce)測量蛋白質(zhì)濃度。對蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化后，于4℃下與小麥細菌凝集素(WGA)-瓊脂糖孵育16小時，分離糖蛋白。在15000xg下離心樣品15分鐘，以沉淀WGA-瓊脂糖珠。移去上清留做分析ERK和Akt的對照。用1ml高鹽溶解緩沖液洗滌WGA珠3次，所述緩沖液中含有0.5％Triton X-100、0.5％脫氧膽酸、500mM NaCl、20mM Tris pH 7.5、10mM EDTA、30mM焦磷酸鈉十水合物、1％抑肽酶、0.5％PMSF和0.5％NaVO3。將細胞裂解物上清或WGA-瓊脂糖級分的糖蛋白與Laemmli緩沖液(0.0625M Tris-HCl、10％甘油、2％SDS、5％β-巰基乙醇、0.0125％溴苯酚藍)混合，加熱至95℃持續(xù)5分鐘，并貯存于-20℃。
I-4-PDGF受體表達和磷酸化的分析如上從保存于含10％FCS培養(yǎng)基的分會合培養(yǎng)物中，制備約500,000個GBM細胞的細胞裂解物。如上分離細胞裂解物中具有標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)含量的WGA級分。
利用7％聚丙烯酰胺凝膠對樣品進行SDS-PAGE。在每塊膠上放置來自未刺激或PDGF-BB刺激的PAE/Rα和PAE/Rβ細胞的對照樣品。然后電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Hydrobond-C-Extra濾器(Amersham Life Science)。為檢測PDGFRβ，將濾器在含5％BSA的TBS中封閉1小時，然后與一級PDGFRβ抗體溶液、含1μg/ml 958(Santa Cruz Biotechnologies)的TTBS(10mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、0.02％Tween-20)孵育過夜。進行3次10分鐘洗滌后，將濾器與1∶25000稀釋的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的驢抗兔抗體(Amersham Life Science)孵育1小時，并在TTBS中洗滌3次。利用Lumi-Light加上Western印跡底物(Roche)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明用Intelligent Darkbox II數(shù)碼掃描儀(FUJIFILM)通過強化化學(xué)發(fā)光檢測抗原。檢測后，在50℃下的剝離緩沖液(2％SDS、62.5mM TrisHCl pH 6.7和100mM β-巰基乙醇)中剝離濾器30分鐘，在TTBS中洗滌一次并于含5％BSA的TBS中封閉1小時。為檢測PDGFRα，用含1μg/mlPDGFRα抗體338(Santa Cruz Biotechnologies)的TTBS再次結(jié)合濾器并孵育過夜。如上所述實施操作并檢測。為檢測磷酸化PDGFR，用含1μg/ml磷酸酪氨酸特異性抗體PY99(Santa Cruz Biotechnologies)的TTBS再次結(jié)合濾器，并孵育過夜。如上所述實施操作并檢測，但使用于TTBS中1∶50000稀釋的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗小鼠抗體(Amersham LifeScience)為第二抗體。
使用AIDA軟件3.10.039版本(FUJIFILM)定量受體表達和磷酸化。通過聯(lián)系GBM培養(yǎng)物的值與對照樣品的值，標(biāo)準(zhǔn)化濾器間不同的轉(zhuǎn)移效率，任一將GBM培養(yǎng)物21的PDGFRα和PDGFRβ表達水平以及受體磷酸化的值定為1。
I-5-在含或不含化合物I時生長的GBM培養(yǎng)物中Akt和ERK表達和磷酸化的分析將膠質(zhì)母細胞瘤細胞培養(yǎng)物鋪滿置于12孔平板(Falcon)的孔內(nèi)。第二天細胞接受或不接受1μM化合物I處理1小時。如上制備細胞裂解物。
利用12％凝膠對標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)含量的樣品進行SDS-PAGE。在每塊膠上放置來自未刺激或PDGF-BB-刺激的PAE/Rα和PAE/Rβ細胞的對照裂解物。然后電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Hydrobond-C-Extra濾器(AmershamLife Science)。為檢測磷酸化形式的ERK和Akt，將濾器在含5％BSA的Tris緩沖鹽水pH 7.6(TBS)、0.137 MNaCl和0.0035M Tris-HCl中封閉1小時，然后與含1μg/ml抗磷酸-p44/42 MAPK Thr202/Tyr204(CellSignaling Technology)或1μg/ml抗磷酸化-Akt Ser473(Cell SignalingTechnology)的TBS及0.001％Tween-20(TTBS)孵育過夜。進行3次10分鐘TTBS洗滌后，將濾器與1∶25000稀釋的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗兔抗體(Amersham Life Science)孵育1小時，并在TTBS中洗滌3次，每次10分鐘。利用Lumi-Light加上Western印跡底物(Roche)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明用Intelligent Darkbox II數(shù)碼掃描儀(FUJIFILM)檢測抗原。檢測后，在0.4M NaOH中剝離濾器10分鐘，在TTBS中洗滌一次并于含5％BSA的TBS中封閉1小時。為檢測ERK和Akt表達，用含1μg/ml抗p44/42 MAPK(Cell Signaling Technology)和1μg/ml抗Akt(CellSighaling Technology)的TTBS再次探測濾器并孵育過夜。如上所述實施操作并檢測。使用AIDA軟件3.10.039版本(FUJIFILM)定量。
通過使用來自PAE/Rβ細胞的參照樣品，確定ERK和Akt在不同GBM培養(yǎng)物中的相對表達和磷酸化。用ERK和Akt特異性磷酸化倍數(shù)改變來表示對化合物I處理的反應(yīng)。
I-6-用于基因表達分析的RNA提取根據(jù)生產(chǎn)商的說明、利用RNAeasy試劑盒(Qiagen)，從23個GBM培養(yǎng)物中每一個的75cm2分會合培養(yǎng)盤內(nèi)提取RNA。分光光度法評估RNA的量，顯示不同的培養(yǎng)物中可產(chǎn)出10-100μgRNA。通過瓊脂糖凝膠電泳證實RNA的結(jié)構(gòu)完整性。
I-7-擴增和標(biāo)記RNA以進行競爭性雜交利用來自各細胞系的5μgRNA進行具有一些變化的線性擴增(VanGelder等人，1990)。簡言之，于42℃下，含5μg RNA、1μl細菌RNA混合物、1μl dT-T7引物(1μg/ml，SEQ ID No 1AAA CGA CGG CCAGTG AAT TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CGC TTT TTT TTTTTT TTT)、4μl 5X SuperscriptII反應(yīng)緩沖液(Invitrogen)、2μl DTT(Invitrogen)、1μl Ultrapure dNTP混合物(Clontech)、1μl RNA酶抑制劑(Ambion)、1μl模板轉(zhuǎn)換寡聚引物(1μg/ml，SEQ ID No 2AAA CAGTGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG)和2μl Superscript II(Invitrogen)的混合物中逆轉(zhuǎn)錄cDNA 1小時。為合成第二鏈，加入106μl水、15μl Advantage 10X PCR緩沖液(Clontech)、3μl Ultrapure dNTP混合物、1μl RNase H(Promega)和3μl cDNA聚合酶(Clontech)。然后將樣品在PCR機器(Applied Bio9systems)中、37℃下孵育2分鐘完成RNaseH降解。然后將樣品于94℃下孵育3分鐘變性、65℃下孵育3分鐘以使引物退火、75℃下通過cDNA聚合酶延伸。加入7.5μl 1M NaOH和2mMEDTA并在65℃下孵育10分鐘，中止反應(yīng)。通過用350μl水和500μl25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇為(Sigma)進行苯酚抽提，來清潔反應(yīng)混合物，在Microcon YM-100離心濾器中以500μl水洗滌3次，最后濃縮至體積為16μl。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA。如上所述，在Superscript II反應(yīng)中從該反義RNA再次逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后于DNA聚合酶反應(yīng)中產(chǎn)生雙鏈DNA。在擴增的第二步，UTP核苷酸混合物部分被1∶3混合的UTP和Cy-dye-UTP(Ambion)所取代。并行地，擴增由所有培養(yǎng)物的等量RNA組成的集合，以用作以下雜交實驗的參考。I-8-Cy-dye-標(biāo)記的反義RNA與正義cDNA芯片的雜交與集合培養(yǎng)物的參考樣品一起，雜交每一細胞培養(yǎng)物，進行雙重?zé)晒饨粨Q得到四份樣品。對于每一雜交而言，將體積為66μl的4μg標(biāo)記樣品和4μg標(biāo)記集合，與4μl cotDNA(1mg/ml，Invitrogen)、4μl聚腺苷酸(2μg/ml，Sigma)、8μl 70％乙醇和7μl 3M醋酸鈉pH 5.2混合。沉淀后于-70℃下孵育30分鐘，將樣品于15000xg、4℃下離心20分鐘。用70％乙醇洗滌沉淀并在空氣中干燥60分鐘，然后溶解于8μl水和40μl雜交緩沖溶液(5×SCC、6×Denhardt′s溶液、60mM Tris-HCl pH 7.6、0.12％N-十二烷基肌氨酸鈉、48％福爾馬林、無菌過濾后)，于100℃下加熱5分鐘并冷卻至室溫。將樣品置于預(yù)先冷卻的微陣列芯片(The WelcomeTrust Sanger Institute，人類版1.2.1，大約含有10 000個元件，對應(yīng)約6000個單個基因，http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)上，蓋上玻璃蓋，并在含有47℃的40μl 40％福爾馬林和2×SSC溶液的Corning雜交室中，于47℃下孵育16小時。用2×SSC一次洗滌芯片5分鐘，用0.1×SSC和0.1％SDS洗滌30分鐘共三次，再用0.1×SSC洗滌一次10分鐘。最后在1000rpm下離心2分鐘干燥芯片。
I-9-芯片的陣列掃描和數(shù)據(jù)選取利用ScannArray 3.1版本軟件(Packard BioChip Technologies)，用ScanArray 5000(GSI Lumonics)掃描芯片。采用QuantArray 3.0.0.0版本的軟件(Packard BioChip Technologies)量化表達強度值。手工標(biāo)記不可靠的點，并以柱狀圖方法定量信號。
I-10分級式集群將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneSpring軟件并進行LOWESS均一化。通過方差分析(即ANOVA)或任一設(shè)定取舍值，產(chǎn)生含有差異表達基因的列表。為在GeneSpring中使用方差分析，需放棄整體誤差的模型，因為假定樣品不會具有相同的方差，且采用Bonferroni模型來進行多重測試校正。有幾種不同的方法產(chǎn)生特征列表，但最終選擇3個版本進行最終展示。在第一份基因列表中，特征在ANOVA測試中的p值小于0.05，且須滿足標(biāo)準(zhǔn)即在至少3個樣品中上調(diào)超過2倍并在至少3個樣品中下調(diào)超過2倍，共得到88個特征基因。第二份和第三份基因列表含有2795和311個特征基因，分別為采用ANOVA p值小于0.05或0.000000001的納入標(biāo)準(zhǔn)得到。隨后根據(jù)Pearson相關(guān)性，將這三個基因列表用于細胞培養(yǎng)物的分級集群。
I-11-監(jiān)督(supervised)分析以鑒定化合物I反應(yīng)性的標(biāo)記基因?qū)⒓訖?quán)表決法(Golub等人，1999)用于在生長抑制實驗值上含有最小實驗間差異的10個細胞培養(yǎng)物。將來自10個細胞培養(yǎng)物的表達數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneCluster 2.1.3 β測試版本(http://www-EMI21.1qenome.wi.mit.edu/cancer/sofiware/qeneduster2/qc2.html)(見Golub等人，1999；Tamayo等人，1999)。用“留一法”交叉驗證測試不同長度特征列表的分類表現(xiàn)。分類性特征的選擇是基于使用具有最高中位信號與噪音比值的特征的允許數(shù)目。設(shè)定GeneCluster用于選取具有最高的絕對信號與噪音比值的特征，該列表中不必含有與信噪比基因排序表正反面相同數(shù)量的特征。
為評估獨立GBM培養(yǎng)物的分類器，建立具有3-5個特征的分類器。特征選擇是基于訓(xùn)練集(training set)中的反應(yīng)者和不反應(yīng)者之間的最高信噪比值。然后基于加權(quán)表決過程，將這些分類器用于5個獨立GBM培養(yǎng)物的分類，其化合物I敏感性已經(jīng)驗性決定。
II-結(jié)果II-1-GBM培養(yǎng)物的化合物I-敏感性描述在描述23個不同培養(yǎng)物對化合物I敏感性之前，通過確定4天期間在含有10％FCS的培養(yǎng)基中細胞數(shù)目的增長，分析各個培養(yǎng)物的生長特性。如圖1A，可見生長速率有很大的差異。生長最慢的培養(yǎng)物在4天期間細胞數(shù)目僅增加了1.2倍，而生長最快的培養(yǎng)物細胞數(shù)目則增加了18倍。
通過比較沒有或有化合物I時生長4天后的細胞數(shù)目，分析化合物I處理誘導(dǎo)的生長抑制。用4天處理期間細胞數(shù)目增長的減少百分數(shù)來表示化合物I的作用。在該分析中除去了7組生長最慢的培養(yǎng)物。對剩下16組培養(yǎng)物的3個體獨立實驗的結(jié)果如圖1B所示。不同的培養(yǎng)物對化合物I處理的反應(yīng)有很大區(qū)別。細胞培養(yǎng)物5、18、21、30、34、35和38的生長抑制均小于15％。相反培養(yǎng)物6、7、9、11、31和45的生長都減少了40％以上。培養(yǎng)物8、13和27反應(yīng)居中，生長抑制為20-40％。
為了分析生長抑制是否與生長速率有關(guān)，計算這兩個參數(shù)之間的相關(guān)性。如圖1C所示，這一分析并未提供在生長速率和對化合物I處理的反應(yīng)之間有很強的相關(guān)性。
II-2-GBM培養(yǎng)物中PDGF受體的表達和活化，及其與化合物I敏感性間的相關(guān)性PDGF受體是介導(dǎo)化合物I誘導(dǎo)GBM培養(yǎng)物生長抑制的生長抑制作用的最有可能的靶。因此，分析PDGF受體的表達和活化，并且這些參數(shù)與生長抑制相關(guān)(圖2和3)。
利用針對PDGFα和β受體的抗體以及針對磷酸化酪氨酸的抗體，通過對培養(yǎng)GBM細胞WGA級分的免疫印跡分析PDGF受體活化和表達。使用配體刺激或未刺激的轉(zhuǎn)染PDGFα和β受體的豬主動脈內(nèi)皮細胞作為陽性對照(圖2A)。隨意設(shè)定培養(yǎng)物21中受體表達以及總PDGF受體磷酸化的值為1。
如圖2B和C所示，這些培養(yǎng)物中PDGFα和β受體表達的差異大于100倍。將PDGF受體蛋白質(zhì)表達的估計值與基因表達分析的數(shù)據(jù)(見下)相比較，得出PDGFα和β受體的r值分別為0.86和0.52(圖2B和C，插圖)。此外，通過定量PDGFα和β受體的聯(lián)合遷移位點處磷酸化酪氨酸的信號，確定PDGF受體的磷酸化(圖2A、D)?？傊?，這一分析得出了組合PDGFα和β受體表達中得到的相似模式。因此，這一分析指示培養(yǎng)物中各受體具有相似的磷酸化。
這些數(shù)據(jù)與分析過的16個培養(yǎng)物中11個的化合物I敏感性之間相關(guān)性的結(jié)果如圖3所示。由于培養(yǎng)物11、45、8、27和34在生長抑制實驗中的巨大差異，這一分析省略了這些培養(yǎng)物。所有4個分析的PDGF受體相關(guān)參數(shù)與化合物I敏感性間具有高相關(guān)性，r值的范圍為0.85(PDGFα受體表達)至0.73(PDGFα受體表達)。
因此，這些分析顯示在GBM培養(yǎng)物中PDGF受體的表達具有廣泛的差異，同時也指示在PDGF受體表達和化合物I敏感性之間，以及總PDGF受體磷酸化和化合物I敏感性之間具有強相關(guān)性。
II-3-沒有或有化合物I時ERK和Akt的活化狀態(tài)蛋白激酶ERK和Akt為PDGF受體信號傳導(dǎo)的重要介質(zhì)，但也參與了由其他細胞表面受體(如整合素)觸發(fā)的下游信號傳導(dǎo)。這兩種酶都通過磷酸化而活化，因此利用對活化磷酸化形式特異的抗體進行的免疫印跡，可用于確定這些酶的活化狀態(tài)。于11個在生長抑制實驗中有強結(jié)果的培養(yǎng)物中，確定這些酶的活化狀態(tài)。ERK和Akt的活化狀態(tài)在細胞培養(yǎng)物之間均顯示很大的差異(圖4A和C)。當(dāng)聯(lián)系活化狀態(tài)與化合物I反應(yīng)時(圖4B和D，上方左圖)，未觀測到總PDGF受體表達(圖4B和D，上方右圖)或PDGF受體磷酸化(圖4B和D，下圖)間的相關(guān)性。
分析化合物I處理1小時所引發(fā)的ERK和Akt中的特異性磷酸化改變，以研究藥物引發(fā)的這些路徑的改變是否與化合物I反應(yīng)或受體表達相關(guān)?？傮w而言，藥物處理后僅觀察到ERK和Akt磷酸化的輕度改變(圖5A和C)。在化合物I引發(fā)的Akt磷酸化改變和化合物I反應(yīng)性或PDGF受體狀態(tài)間未觀測到相關(guān)性(圖5D)。然而，化合物I引發(fā)的生長抑制和ERK磷酸化減少之間存在相關(guān)性(r＝-0.47)。
因此，這些分析顯示，在細胞培養(yǎng)物間ERK和Akt活化有很大差異，指示這些路徑的基礎(chǔ)活化水平與PDGF受體狀態(tài)或化合物I敏感性無關(guān)。它們還確定，化合物I處理與這些信號傳導(dǎo)分子凈活化狀態(tài)的強改變并無關(guān)系。然而，生長反應(yīng)和化合物I引發(fā)的ERK磷酸化改變之間確實存在一些聯(lián)系。
II-4-來自GBM的原代培養(yǎng)物的基于基因表達集群為描述來自23個GBM的原代培養(yǎng)物之間基于基因表達的不同和相似處，繪制基因表達譜。從在10％FCS中生長的低通量培養(yǎng)物中分離RNA。為獲得足量RNA進行微陣列分析，進行兩輪RNA擴增。在第二輪擴增時RNA中摻入了熒光染料。利用含有約10000個人cDNA的cDNA陣列(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)，對每一培養(yǎng)均進行一試四份的分析。參照RNA由來自所有培養(yǎng)物的RNA庫組成。
分級性集群的結(jié)果見圖6。如圖所示，使用不同的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)確定哪些基因應(yīng)用于集群。不論采用何種標(biāo)準(zhǔn)，都可以觀測到涉及23個樣品中17個的某些固定模式。培養(yǎng)物18、21、35和38在所有的分析中都為一個集群(集群1)。同樣培養(yǎng)物5、7、8和11在所有分析中同時出現(xiàn)(集群2)。最后，不論采用何種選擇基因的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，都可見包括培養(yǎng)物9、10、15、16、31、34、37、43和45的組(集群3)。
圖7顯示了集群圖表，其為分析在3個樣品中至少調(diào)節(jié)2倍的基因而獲得，其中包括同樣列于表1和2的集群定義的基因。
表1中根據(jù)如基因本體論項目(ontology program)所述的其分子功能，將差異表達的基因分組。用于集群細胞的88個雜交信號代表了75個獨特的基因。這些基因中，有47個屬于基因本體論項目中的功能；而基因中的大多數(shù)則屬于信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者以及與黏附和增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)類別。
表2中按照它們在定義3個培養(yǎng)物集群的基因集群中的出現(xiàn)情況進行分類。突出它們在3個培養(yǎng)物集群中的平均表達，以說明其相對于這三個培養(yǎng)物集群的表達模式。一般而言，基因集群組III和VI是分別由在培養(yǎng)物集群2和3中上調(diào)的基因組成的。
除了一些例外，基因集群組I在培養(yǎng)物集群組1中幾乎總為高表達。與之相反，基因集群IV和V則含有在培養(yǎng)物集群1中下調(diào)的基因，而基因集群II由培養(yǎng)物3中低表達的基因組成。
II-5-基于基因表達的GBM培養(yǎng)物集群中生長性質(zhì)和PDGF受體狀態(tài)的比較將分析GBM培養(yǎng)物生長速率及其化合物I敏感性的結(jié)果，與培養(yǎng)物基于基因表達的分級集群結(jié)果聯(lián)合(圖8)?？梢杂^察到一些有意義的趨勢。在7個生長最慢的培養(yǎng)物中，有6個(用黑體字表示)見于集群3。6個反應(yīng)者集中于集群2和3。而屬于集群2者均出現(xiàn)在亞集群2b。在7個無反應(yīng)者中，4個培養(yǎng)物(18、21、35、38)組成了亞集群1b的全集。
同樣，也將來自PDGF受體狀態(tài)的結(jié)果與基于基因表達的培養(yǎng)物分組進行比較(圖8)。根據(jù)PDGF受體表達和磷酸化將培養(yǎng)物分為兩類，其中10個培養(yǎng)物具有高表達或磷酸化，而11個培養(yǎng)物為低表達或磷酸化。集群1中顯然富集了低受體表達和磷酸化的培養(yǎng)物，而集群2和3則均由兩類的混合物組成。這一數(shù)據(jù)匯集也強調(diào)了所有6個強化合物I無反應(yīng)組均顯示低受體表達和磷酸化，而與之相反，所有具有顯著反應(yīng)者的特征都在于高受體表達和磷酸化。
II-6-與化合物I反應(yīng)性相關(guān)的基因表達模式的監(jiān)督鑒定鑒于基因表達模式和化合物I反應(yīng)性之間存在相關(guān)性的指示，實施監(jiān)督分析以鑒定與化合物I反應(yīng)性之間最具相關(guān)性的基因表達模式。為此，將在化合物I敏感性分析中具有最顯著結(jié)果的10個培養(yǎng)物分為反應(yīng)者(培養(yǎng)物6、7、9和31)以及無反應(yīng)者(培養(yǎng)物5、18、21、30、35和38)(圖1B)。
利用加權(quán)表決的方法實施監(jiān)督分析，包括“留一法”證實。如圖9所示，當(dāng)利用2-40項特征分類時，所有10個培養(yǎng)物都可在留一法證實中正確分類?？傮w而言，在由4和10項特征組成的列表中分別使用8個及16個基因用于分類。在留一法檢測中所用的基因列于表3中。
利用來自10個培養(yǎng)物的表達數(shù)據(jù)，生成了具有3-5項特征的分類器(表4)。利用該分類器，可將用于建立該分類器的所有10個培養(yǎng)物正確地分為反應(yīng)者和無反應(yīng)者。為擴展這一分析，用該分類器對不包括在訓(xùn)練集中的5個培養(yǎng)物(培養(yǎng)物8、11、27、34和45)進行初步測試(圖10)。將這些分類器用于初步測試的結(jié)果見于圖10。有趣的是，與生長抑制實驗結(jié)果一致，培養(yǎng)物11、45在所有3個分類器中都被定義為反應(yīng)者。同樣與生長抑制實驗結(jié)果一致的是，培養(yǎng)物34一直都被分為無反應(yīng)者。具有中度反應(yīng)的培養(yǎng)物8和27，在所有3個分類器中都被分別定義為無反應(yīng)者和反應(yīng)者。
如上所示，原發(fā)性GBM培養(yǎng)物在化合物I敏感性上差異很大。通過描述PDGF受體的狀態(tài)，顯示在化合物I敏感性和PDGF受體表達和磷酸化之間具有顯著的相關(guān)性(圖1-3、8)?；衔颕敏感性或ERK和Akt的基礎(chǔ)磷酸化之間未見顯著相關(guān)(圖4)?；衔颕敏感性與化合物I誘導(dǎo)的ERK磷酸化減少之間存在一定的相關(guān)性(圖5)?；虮磉_譜指示存在在化合物I敏感性、生長速率以及PDGF受體磷酸化上有所不同的獨特GBM亞型(圖6-8)。最后，通過基因表達數(shù)據(jù)的監(jiān)督分析，可產(chǎn)生能預(yù)測化合物I反應(yīng)性的短基因列表(圖9、10)。
雖然先前的研究已經(jīng)報道了對GBM細胞系的抑制，但此處首次描述了PDGF受體抑制對GBM生長影響的系統(tǒng)性分析。
PDGF受體狀態(tài)和化合物I反應(yīng)性之間的相關(guān)性(圖3)令人驚異。對PDGF受體表達和磷酸化的分析指示這些參數(shù)之間存在很強的相關(guān)變異，指示培養(yǎng)物中的配體生成并無顯著差異。
在下游信號傳導(dǎo)分子Akt和ERK基礎(chǔ)活化狀態(tài)與PDGF受體狀態(tài)之間不存在相關(guān)性(圖4)，指示這些GBM培養(yǎng)物中Akt和ERK的活化處于多重信號傳導(dǎo)路徑的控制之下。此處應(yīng)當(dāng)注意生長抑制實驗以及Akt和ERK活化的分析都是在保存于10％FCS中的細胞中實施的。因此，PDGF受體信號傳導(dǎo)對這些路徑的潛在影響，有可能在其它培養(yǎng)條件下更易于檢測。
對化合物I引發(fā)的Akt和ERK磷酸化變化的分析，集中在10個選擇GBM培養(yǎng)物上，它們是具有明顯生長抑制反應(yīng)的培養(yǎng)物6、7、9和31以及6個無反應(yīng)培養(yǎng)物。考慮到Akt信號傳導(dǎo)在PDGF受體信號傳導(dǎo)中的重要性，在不存在Akt活化持續(xù)性降低的情況下能觀測到生長抑制效應(yīng)(可能是通過PDGF受體抑制達到的)有些令人驚異(圖5)。這些發(fā)現(xiàn)的一種可能解釋是，存在受PDGF受體抑制影響的PDGF受體依賴性pAkt，但當(dāng)血清成分可提供通過PDGF非依賴性途徑的Akt高活化時，該培養(yǎng)條件下保存的細胞內(nèi)不會檢測到該pAkt。還應(yīng)當(dāng)注意到，用于分析化合物I誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)變化的細胞裂解物來自僅在化合物I中暴露1小時的細胞。因此，必須在良好表征的PDGF依賴性對照系統(tǒng)中確認該時間長度足以引發(fā)ERK和Akt PDGF受體依賴性磷酸化的可檢測改變。
對基因表達譜和生物化學(xué)表征的組合分析揭示了一系列有意義的關(guān)系(圖6和8)。簡言之，集群1富集了具有低PDGF受體表達和低化合物I敏感性的培養(yǎng)物，集群2則富集了具有高PDGF受體表達的化合物I反應(yīng)物，而集群3主要是由不具備一致的PDGF受體表達的低生長率培養(yǎng)物組成。對在GBM培養(yǎng)物集群2(富集了化合物I反應(yīng)物)中過度表達的包含在基因集群III、IV和V中的基因的初步分析(圖7，表2)并未提示該GBM亞群的具體發(fā)育來源或特定生物學(xué)性質(zhì)。
利用基于對化合物I敏感性表征和該GBM組基因表達分析的監(jiān)督分析，產(chǎn)生了描述反應(yīng)者和無反應(yīng)者的分類器(圖9，表3)。一般而言，所述分類器具有至少兩種功能。首先，它們可用作發(fā)展診斷性或預(yù)后性工具的起始點。只要分類器的表現(xiàn)良好，可以發(fā)展分類器的這一功能而不關(guān)注組成分類器基因的生物學(xué)顯著性。其次，分類器能夠指明導(dǎo)致由該分類器鑒別的兩種表型(此處為化合物I敏感或耐受)的生物學(xué)關(guān)系。
參考文獻Barbero，S.，Bajetto，A.，Bonavia，R.，Porcile，C.，Piccioli，P.，Pirani，P.，Ravetti，J.L.，Zona，G.，Spaziante，R.，F(xiàn)lorio，T.，和Schettini，G.(2002).Expression of the chemokine receptor CXCR4 and its ligand stromal cell-derived factor 1 in h uman brain tumors and their involvement in glialproliferation in vitro.Ann.N.Y.Acad.Sci.973，60-69.
Capdeville，R.，Buchdunger，E.，Zimmermann，J.，和Matter，A.(2002).Glivec(ST1571，imatinib)，a rationally developed，targeted anticancerdrug.Nat.Rev.Drug Discov.1，493-502.
Claesson-Welsh，L.，Eriksson，A.，Moren，A.，Severinsson，L.，Ek，B.，Ostman，A.，Betsholtz，C.，和Heldin，C.-H.(1988).cDNA cloning andexpression of a human platelet-derived growth factor(PDGF)receptorspecific for B-chain-containing PDGF molecules. MoL Cell. Biol.8，3476-3486.
Claesson-Welsh，L.，Eriksson，A.，Westermark，B.，和Heldin，C.-H.(1989).cDNA cloning and expression of the human A-typeplatelet-derived growth factor(PDGF)receptor establishes structuralsimilarity to the B-type PDGF receptor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，4917-4921.
Dai，C.，Celestino，J.C.，Okada，Y.，Louis，D.N.，F(xiàn)uller，G.N.，和Holland，E.C.(2001).PDGF autocrine stimulation dedifferentiatescultured astrocytes and induces oligodendrogliomas andoligoastrocytomas from neural progenitors and astrocytes in vivo.GenesDev.15，1913-1925.
Demetri，G.D.，von Mehren，M.，Blanke，C.D.，Van den Abbeele，A.D.，Eisenberg，B.，Roberts，P.J.，Heinrich，M.C.，Tuveson，D.A.，Singer，S.，Janicek，M.，F(xiàn)letcher，J.A.，Silverman，S.G.，Silberman，S.L.，Capdeville，R.，Kiese，B.，Peng，B.，Dimitrijevic，S.，Druker，B.J.，Corless，C.，F(xiàn)letcher，C.D.，和Joensuu，H.(2002).Efficacy and safety ofimatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors.N Engl JMed 347，472-80.
Golub，T.R.，Slonim，D.K.，Tamayo，P.，Huard，C.，Gaasenbeek，M.，Mesirov，J.P.，Coller，H.，Loh，M.L.，Downing，J.R.，Caligiuri，M.A.，Bloomfield，C.D.，和Lander，E.S.(1999).Molecular classification ofcancerclass discovery and class prediction by gene expressionmonitoring.Science 286，531-7.
Kilic，T.，Alberta，J.A.，Zdunek，P.R.，Acar，M.，lannarelli，P.，O′Reilly，T.，Buchdunger，E.，Black，P.M.，和Stiles，C.D.(2000).Intracranialinhibition of platelet-derived growth factor-mediated glioblastoma cellgrowth by an orally active kinase inhibitor of the2-phenylaminopyrimidine class.Cancer Res.60，5143-5150.Lazarini，F(xiàn).，Tham，T.N.，Casanova，P.，Arenzana-Seisdedos，F(xiàn).，和Dubois-Dalcq，M.(2003).Role of the a-chemokine stromal cell-derivedfactor(SDF-1)in the developing and mature central nervous system.Glia42，139-148.
Maher，EA.，F(xiàn)urnari，F(xiàn)B，Bachoo，RM，Rowitch，DH.，Louis，DN.，Cavanee，WC.和DePinho，RA.(2002)Malignant gliomagenetics andBiology of a grave matter.Genes and Dev.15，1311-1333 Mischel，P.S.，Shai，R.，Shi，T.，Horvath，S.，Lu，K.V.，Choe，G.，Seligson，D.，Kremen，T.J.，Palotie，A.，Liau，L.M.，Cloughesy，T.F.，and Nelson，S.F.(2003).Identification of molecular subtypes of glioblastoma by gene expressionprofiling.Oncogene 22，2361-73.
O′Brien，S.G.，Guilhot，F(xiàn).，Larson，R.A.，Gathmann，I.，Baccarani，M.，Cervantes，F(xiàn).，Cornelissen，J.J.，F(xiàn)ischer，T.，Hochhaus，A.，Hughes，T.，Lechner，K.，Nielsen，J.L.，Rousselot，P.，Reiffers，J.，Saglio，G.，Shepherd，J.，Simonsson，B.，Gratwohl，A.，Goldman，J.M.，Kantarjian，H.，Taylor，K.，Verhoef，G.，Bolton，A.E.，Capdeville，R.，和Druker，B.J.(2003).Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine fornewly d iagnosed c hronic-phase c hronic m yeloid I eukemia.N Engl JMed 348，994-1004.
Pietras，K.，Sjblom，T.，Rubin，K.，Heldin，C.-H.，和Ostman，A.(2003).PDGF receptors as cancer drug targets.Cancer Cell 3，439-443.Ponten，J.和Westermark，B.(1987).Properties of human malignantglioma cells in vitro.Med.Biol.56，184-193.Rempel，S.A.，Dudas，S.，Ge，S.，和Gutierrez，J.A.(2000).Identificationand localization of the cytokine SDF1 and its receptor，CXC chemokinereceptor 4，to regions of necrosis and angiogenesis in human glioblastoma.Clin.Cancer Res.6，102-111.
Rubin，J.B.，Kung，A.L.，Klein，R.S.，Chan，J.A.，Sun，Y.，Schmidt，K.，Kieran，M.W.，Luster，A.D.，和Segal，R.A.(2003).A small-moleculeantagonist of CXCR4 inhibits intracranial growth of primary braintumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，13513-13518.
Shamah，S.M.，Stiles，C.D.，和Guha，A.(1993).Dominant-negativemutants of platelet-derived growth factor revert the transformedphenotype of human astrocytoma cells.Mol.Cell.Biol.13，7203-7212.Sjblom，T.，Shimizu，A.，O′Brien，K.P.，Pietras，K.，Dal Cin，P.，Buchdunger，E.，Dumanski，J.P.，Ostman，A.，和Heldin，C.-H.(2001).Growth inhibition of dermatofibrosarcoma protuberans tumors by theplatelet-derived growth factor receptor antagonistSTI571 throughinduction of apoptosis.Cancer Res.61，5778-5783.Strawn，L.M.，Mann，E.，Elliger，S.S.，Chu，L.M.，Germain，L.L.，Niederfellner，G.，Ullrich，A.，和Shawver，L.K.(1994).Inhibition ofglioma cell growth by a truncated platelet-derived growth factor-；receptor.J.Biol.Chem.269，21215-21222.
Tamayo，P.，Slonim，D.，Mesirov，J.，Zhu，Q.，Kitareewan，S.，Dmitrovsky，E.，Lander，E.S.，和Golub，T.R.(1999).Interpretingpatterns of gene expression with self-organizing mapsmethods andapplication to hematopoietic differentiation.Proc Natl Acad Sci USA96，2907-12.
Uhrbom，L.，Hesselager，G.，Nister，M.，和Westermark，B.(1998).Indnction of brain tumors in mice using a reeombinant platelet-derivedgrowth factor B-chain retrovirus.Cancer Res.58，5275-5279.
Van Gelder，R.N.，von Zastrow，M.E.，Yool，A.，Dement，W.C.，Barchas，J.D.，和Eberwine，J.H.(1990).Amplified RNA synthesized fromlimited quantities of heterogeneous cDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，1663-1667。
表1集群分組產(chǎn)物生物功能的本評論123解釋全體基因

來自用于產(chǎn)生圖6A和圖7中所示GBM集群的特征列表的差異表達基因的列表。根據(jù)基因本體論定義的功能來分類基因。
表2細胞培養(yǎng)物集群組產(chǎn)物解釋123生物加工的本評倫整體基因

來自用于產(chǎn)生圖6A和圖7中所示GBM集群的特征列表的差異表達基因的列表。根據(jù)差異表達基因(圖7)的集群分析結(jié)果來分類基因。
表2細胞培養(yǎng)物集群組產(chǎn)物解釋123 生物加工的本評論整體基因

來自用于產(chǎn)生圖6A和圖7中所示GBM集群的特征列表的差異表達基因的列表。根據(jù)差異表達基因(圖7)的集群分析結(jié)果來分類基因。
表3用于留一法測試中4特征列表的基因

用于留一法測試中10特征列表的基因

包含在4特征(上部)和10特征(下部)的分類器中的特征列表，所述分類器用于10個GBM培養(yǎng)物的加權(quán)表決分類。
顯示了分析中包括的10個GBM培養(yǎng)物中這些特征的相對表達。
表4

具有3、4或5個特征的分類器的組成，這些特征位于來自10個膠質(zhì)母細胞瘤細胞培養(yǎng)物的以信噪比排列基因列表的頂部。顯示了訓(xùn)練集的10個GBM培養(yǎng)物中以及測試集的5個GBM培養(yǎng)物中這些特征的相對表達。信噪比基于基于兩組中平均表達的差異。決定界線是反應(yīng)者和無反應(yīng)者中表達平均數(shù)的平均數(shù)。
權(quán)利要求
1.用于體外診斷哺乳動物細胞增殖性疾病的方法，包括至少a)提供所述哺乳動物的生物樣品；b)測定所述樣品中至少2至40個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜，c)將病人的基因表達譜與表3中的平均無反應(yīng)性表達譜進行比較；d)根據(jù)(b)中的比較確定兩個基因表達譜中的相似性；e)通過(c)中確定的相似性程度，確定病人的GBM狀況對藥物有反應(yīng)性的可能性。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟b)中測定至少3至5個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
3.預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為的方法，包括至少a)提供所述哺乳動物的生物樣品；b)測定所述樣品中至少2至40個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜；c)將步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，與根據(jù)表3計算的反應(yīng)性和無反應(yīng)性表達和/或磷酸化譜的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進行比較；并d)如下預(yù)測所述哺乳動物的行為-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的反應(yīng)性表達和/或磷酸化譜的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，則預(yù)測所述哺乳動物對該治療有反應(yīng)；-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的無反應(yīng)性表達和/或磷酸化譜的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，則預(yù)測所述哺乳動物對該治療無反應(yīng)；且-若步驟b)中得到的表達和/或磷酸化譜，處在計算的反應(yīng)性和無反應(yīng)性表達和/或磷酸化譜的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的范圍之外，則不能確定所述哺乳動物對該治療的反應(yīng)行為。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中步驟b)中測定至少3至5個選自表3的遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜。
5.選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物的方法，所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)，所述方法包括至少a)利用如權(quán)利要求3或4的方法預(yù)測所述哺乳動物的行為；并b)若預(yù)測所述哺乳動物對治療有反應(yīng)，則選擇該哺乳動物。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述哺乳動物為人。
7.用于體外分析哺乳動物中遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜的試劑盒，所述試劑盒含有選自表3中至少2至40個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
8.如權(quán)利要求7的試劑盒，其中包括選自表3中至少3至5個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
9.如權(quán)利要求7或8的試劑盒，其中所述哺乳動物為人。
10.用于體外分析哺乳動物中遺傳標(biāo)記的表達和/或磷酸化譜的微陣列或生物芯片，其中含有選自表3中至少2至40個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
11.如權(quán)利要求10的微陣列或生物芯片，其中含有選自表3中至少3至5個遺傳標(biāo)記的cDNA和/或抗體。
12.如權(quán)利要求10或11的微陣列或生物芯片，其中所述哺乳動物為人。
13.將選自表3的至少一個基因和/或至少一個基因產(chǎn)物作為遺傳標(biāo)記用于-體外診斷哺乳動物的細胞增殖性疾??；和/或-預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為；和/或-選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物，其中所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求13的用途，其中使用的是對應(yīng)于所述基因的cDNA和/或?qū)λ龌虍a(chǎn)物具有特異性的抗體。
15.如權(quán)利要求7至9中任一項的試劑盒的用途，用于-體外診斷哺乳動物的細胞增殖性疾??；和/或-預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為；和/或-選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物，其中所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)。
16.如權(quán)利要求10至12中任一項的微陣列或芯片的用途，用于-體外診斷哺乳動物的細胞增殖性疾病；和/或-預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為；和/或-選擇患有細胞增殖性疾病的哺乳動物，其中所述哺乳動物經(jīng)預(yù)測對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)。
17.至少一種PDGF受體拮抗劑在制造藥物中的用途，該藥物用于治療患有細胞增殖性疾病的反應(yīng)性哺乳動物，其中所述反應(yīng)性哺乳動物的選擇如權(quán)利要求5的方法進行。
18.如權(quán)利要求13至17中任一項的用途，其中所述哺乳動物為人。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用特定遺傳標(biāo)記體外診斷哺乳動物細胞增殖性疾病、預(yù)測患有細胞增殖性疾病的哺乳動物對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療的反應(yīng)行為、以及選擇患有細胞增殖性疾病且預(yù)測可對利用至少一種PDGF受體拮抗劑的藥物治療有反應(yīng)的哺乳動物的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1997755SQ200580015410
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者莫尼卡·尼斯特, D·黑格斯塔拉德, G·海塞拉格, A·奧斯特曼 申請人:路德維希癌癥研究所, 烏普薩拉大學(xué)醫(yī)院, 莫尼卡·尼斯特