專利名稱：自身遏制性乳桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組乳桿菌(Lactobacillus)菌株，其具有在環(huán)境中受限制的生長和生存力。更特別地，本發(fā)明涉及一種只能在含有胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中存活的重組乳桿菌。由于這種對胸腺嘧啶核苷的嚴(yán)格依賴性，在此重組菌株中迅速誘導(dǎo)胸腺嘧啶核苷缺陷致死。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是一種乳桿菌，其只能在存在胸腺嘧啶核苷的宿主生物體中存活，但是在所述宿主生物體體外缺乏此培養(yǎng)基化合物時(shí)不能存活。進(jìn)一步地，可以用預(yù)防性和/或治療性分子轉(zhuǎn)化所述乳桿菌菌株，從而可以將所述乳桿菌菌株用于治療疾病，例如但不限于炎性腸病。
背景技術(shù)：
長久以來在各種工業(yè)發(fā)酵過程中乳酸細(xì)菌都得到了廣泛的應(yīng)用。它們通常被認(rèn)為是安全的，這使得它們在生產(chǎn)商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)時(shí)成為潛在有用的生物體。事實(shí)上，在乳球菌屬(Lactococcus)物種中已經(jīng)成功地生產(chǎn)出了一些異源蛋白質(zhì)，例如白介素-2(Steidler et al.，1995)。然而，并不希望這些經(jīng)過遺傳修飾的微生物在環(huán)境中存活并且擴(kuò)散。
為了避免意外地釋放經(jīng)過遺傳修飾的微生物，已經(jīng)施行了用于安全操作的特殊指南和用于物理遏制(physical containment)的技術(shù)要求。盡管這在工業(yè)發(fā)酵中也許是有用的，但是所述物理遏制通常認(rèn)為是不夠的，還采取了另外的生物遏制(biological containment)措施以降低所述經(jīng)過遺傳修飾的微生物在環(huán)境中存活的可能性。在物理遏制是困難的甚至是不可能的情況下，生物遏制是極其重要的。所述情況例如是將經(jīng)過遺傳修飾的微生物用作活疫苗時(shí)或者是將其作為載體輸送治療性化合物時(shí)。這些應(yīng)用已經(jīng)在例如WO 97/14806中得到描述，其公開了通過重組非侵入性或非病原性細(xì)菌將生物活性肽例如細(xì)胞因子輸送至對象中。WO 96/11277描述了通過給予一種編碼治療性蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌將治療性化合物輸送給動物一包括人。Steidler et al.(2000)描述了通過給予分泌白介素-10的重組乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)治療大腸炎。這種輸送對于治療被疾病侵襲的人或動物體內(nèi)的疾病可能的確是極其重要的，但是當(dāng)所述重組細(xì)菌進(jìn)入未被疾病侵襲的對象體內(nèi)時(shí)也許會成為有害及病原性微生物，因此需要一種避免所述微生物意外擴(kuò)散的有效的生物學(xué)遏制措施。
盡管可以用乳球菌獲得足夠的治療，但是其主要缺點(diǎn)是所述細(xì)菌不能建群以及需要持續(xù)進(jìn)行藥物治療以確保效果。建群的菌株例如乳桿菌可以具有這樣的優(yōu)點(diǎn)可以用一次給藥或有限數(shù)次的給藥得到相似的效果。然而，與乳球菌的情況相似，需要一種嚴(yán)格的生物學(xué)遏制系統(tǒng)以避免所述細(xì)菌在環(huán)境中的傳播。
基于宿主對在外部環(huán)境中不存在或以低濃度存在的特殊生長因子或營養(yǎng)成分的嚴(yán)格要求，用于宿主生物體的生物學(xué)遏制系統(tǒng)可以是被動的；或者，基于宿主中所謂“自殺性遺傳元件”，所述生物學(xué)遏制系統(tǒng)可以是主動的，其中所述宿主在外部環(huán)境中被一種由基因編碼的細(xì)胞殺傷功能殺死，所述基因處于僅在特定環(huán)境條件下才表達(dá)的啟動子控制之下。
在微生物例如大腸桿菌(Escherichia coli)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已經(jīng)熟知被動生物學(xué)遏制系統(tǒng)。這些大腸桿菌菌株在例如US4100495中公開。WO 95/10621公開了乳酸細(xì)菌抑制子突變體及其在乳酸細(xì)菌中作為遏制手段的應(yīng)用，但是在這種情況下，所述遏制處于質(zhì)粒水平，而不是處于宿主菌株水平，并且其穩(wěn)定所述宿主菌株中的質(zhì)粒，但是對于被遺傳修飾的宿主菌株自身并不提供遏制。
一些作者已經(jīng)描述了主動自殺系統(tǒng)。這種系統(tǒng)包含兩個(gè)元件致死基因和在非許可條件下啟動所述致死基因表達(dá)的控制序列。WO95/10614公開了一種在胞漿中具有活性的截短的和/或突變的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶作為致死基因的應(yīng)用。WO96/40947公開了基于一種必需基因和/或一種致死基因的表達(dá)而具有環(huán)境限制活性(environmentally limited viability)的重組細(xì)菌系統(tǒng)，其中所述必需基因當(dāng)細(xì)胞處于許可環(huán)境時(shí)表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞處于非許可環(huán)境時(shí)不表達(dá)，所述致死基因的表達(dá)對于細(xì)胞是致死性的，并且所述致死基因當(dāng)細(xì)胞處于非許可環(huán)境時(shí)表達(dá)，但是當(dāng)細(xì)胞處于許可環(huán)境時(shí)不表達(dá)。WO 99/58652描述了基于relE細(xì)胞毒素的生物學(xué)遏制系統(tǒng)。然而，大多數(shù)系統(tǒng)是針對大腸桿菌(Tedin et al.，1995；Knudsen et al，1995；Schweder et al.，1995)或假單胞菌(Pseudomonas)(Kaplan et al.，1999；Molina et al.，1998)精心設(shè)計(jì)的。
一種令人感興趣的方式是將胸苷酸合酶基因中的突變用作遏制系統(tǒng)。具有這種突變的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都不能在低濃度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶中生長，并且對此饑餓應(yīng)答而經(jīng)歷細(xì)胞死亡。這一現(xiàn)象已知為胸腺嘧啶缺陷致死(thymineless death)(Goulian et al.，1986；Ahmad et al.，1998)。Fu和Xu(2000)描述了使用來自干酪乳桿菌(Lactococcus casei)的thyA基因作為選擇標(biāo)記的用于嗜酸乳桿菌(Lactococcus acidophilus)的基于此突變的遏制系統(tǒng)。所使用的thyA突變體已經(jīng)通過自發(fā)突變和三甲氧芐二氨嘧啶選擇而選擇出。這種突變易于發(fā)生回復(fù)突變，使用另一種乳桿菌物種的thyA基因以通過所述標(biāo)記基因的重組(inrecombination)避免所述回復(fù)突變。事實(shí)上，thyA突變的回復(fù)突變是一個(gè)問題，尤其是當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷時(shí)，所述突變會以高頻率回復(fù)，從而菌株逐漸喪失其遏制性質(zhì)。對于可接受的生物學(xué)遏制，需要一種非回復(fù)性突變體。
非回復(fù)性突變體可以通過基因破壞(gene disruption)獲得。在乳球菌中已經(jīng)描述了基于這種基因破壞的遏制系統(tǒng)(Steidler et al.，2003)。然而，盡管干酪乳桿菌的thyA基因已經(jīng)被克隆并且通過定向誘變被突變，但是其僅在大腸桿菌中進(jìn)行了測試，并且從來沒有在乳桿菌菌株中被用于基因置換。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員已知轉(zhuǎn)化乳桿菌的技術(shù)，但是在乳桿菌中thyA的基因破壞從未成功，很明顯這是非顯而易見的。
令人驚訝的是，我們在乳桿菌中構(gòu)建出了thyA的基因破壞。更加令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)這種基因破壞突變體的存活是嚴(yán)格胸腺嘧啶核苷依賴性的，并且所述突變體不能通過向培養(yǎng)基中加入胸腺嘧啶得到拯救。后者是尤其令人驚訝的，因?yàn)橥ǔＵJ(rèn)為thyA突變體可以通過向培養(yǎng)基中加入胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶得到拯救(Fu and Xu，2000；Ahmad et al.1998)。這種菌株的存活力在缺乏胸腺嘧啶核苷時(shí)(即使存在胸腺嘧啶)迅速降低，因此，當(dāng)需要生物學(xué)遏制時(shí)這是一種理想的宿主菌株。迅速的胸腺嘧啶核苷缺陷致死的誘導(dǎo)(其比前面描述的乳球菌菌株還要迅速)和所述菌株不能被胸腺嘧啶拯救的事實(shí)使其成為一種理想的用于向活體動物(包括人)體內(nèi)輸送預(yù)防性和/或治療性分子的菌株。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供一種合適的乳桿菌生物學(xué)遏制系統(tǒng)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面是一種乳桿菌物種的分離的菌株，其包括缺陷的重組胸苷酸合酶基因(thyA)，從而所述菌株的存活嚴(yán)格依賴于胸腺嘧啶核苷的存在。優(yōu)選地，所述缺陷的重組基因被置于染色體中并且通過基因破壞失活。如本文所用，基因破壞包括通過插入DNA片段破壞、通過缺失所述基因或其一部分破壞、以及通過用另一個(gè)DNA片段替換所述基因或其一部分破壞，并且所述破壞通過重組DNA技術(shù)誘導(dǎo)而不是通過自發(fā)突變誘導(dǎo)。優(yōu)選地，基因破壞是用另一個(gè)功能性基因替換所述基因或其一部分。優(yōu)選地，所述缺陷的重組胸苷酸合酶基因是非回復(fù)性突變基因。
如本文所用，非回復(fù)性突變體是指回復(fù)突變頻率低于10-8，優(yōu)選地，所述回復(fù)突變頻率低于10-10，更優(yōu)選地，所述回復(fù)突變頻率低于10-12，更優(yōu)選地，所述回復(fù)突變頻率低于10-14，最優(yōu)選地，所述回復(fù)突變頻率不能使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法檢測出。優(yōu)選地，所述乳桿菌物種是唾液乳桿菌(Lactococcus salivarius)。更優(yōu)選地，所述乳桿菌是唾液乳桿菌唾液亞種(Lactococcus salivarius subsp.salivarius)菌株UCC118。非回復(fù)性thyA突變體可以認(rèn)為是一種主動遏制的形式，因?yàn)槠鋵π叵汆奏ず塑震囸I應(yīng)答而經(jīng)歷細(xì)胞死亡(Ahmad et al.，1998)。
與以前描述的所有thyA突變體相反，所述突變體不能被胸腺嘧啶拯救，并且即使胸腺嘧啶存在于培養(yǎng)基中，其仍會經(jīng)歷細(xì)胞死亡。如本文所用，不能被拯救是指所述菌株不能在向含有除胸腺嘧啶核苷之外的所述菌株生長所需的全部必需化合物的培養(yǎng)基中添加一定濃度的胸腺嘧啶的情況下生長。優(yōu)選地所述突變體將會經(jīng)歷胸腺嘧啶核苷缺陷致死，即使胸腺嘧啶濃度為25μg/ml，更優(yōu)選地30μg/ml，更優(yōu)選地40μg/ml，更優(yōu)選地50μg/ml，最優(yōu)選地100μg/ml。所述突變體進(jìn)一步的特征是在培養(yǎng)基中缺乏胸腺嘧啶核苷時(shí)存活力迅速降低。優(yōu)選地，在缺乏胸腺嘧啶核苷時(shí)存活力的初始降低為在16小時(shí)中降低2log單位的菌落形成單位(colony forming units，cfu)，更優(yōu)選地，所述初始降低為在12小時(shí)中降低2log單位cfu，最優(yōu)選地，所述初始降低為在8小時(shí)中降低2log單位cfu。所述存活力的初始降低表示為當(dāng)所述菌株在清除胸腺嘧啶核苷的MRS培養(yǎng)基中維持在37℃時(shí)，相對于在時(shí)間0時(shí)的菌落形成單位，在時(shí)間X后的cfu(此處分別為16、12或8小時(shí))。
以前描述的乳桿菌thyA突變體與其他thyA突變體相似，通常都可以通過向培養(yǎng)基中加入胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷拯救。然而，特別是在胸腺嘧啶和/或胸腺嘧啶核苷的濃度不能被小心地控制的情況下，對培養(yǎng)基中的胸腺嘧啶核苷的嚴(yán)格依賴性是對于生物學(xué)遏制的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)。作為非限制性實(shí)例，這可能就是使用大量培養(yǎng)基的工業(yè)發(fā)酵中出現(xiàn)的情況，所述大量培養(yǎng)基可能被痕量胸腺嘧啶污染。進(jìn)一步地，本發(fā)明揭示了這種菌株在其被用作動物體內(nèi)(包括人體)的輸送載體的情況中是特別有用的。當(dāng)這種被轉(zhuǎn)化的菌株通過例如口服給予動物(包括人)時(shí)，其在消化道中存活，并且產(chǎn)生可能有益于所述動物的同源和/或異源蛋白質(zhì)，例如但非限于人白介素-10。所述突變體不能被胸腺嘧啶拯救的事實(shí)提供了一種更好的遏制手段，特別是當(dāng)用于不能控制糞便中的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的殘余濃度的人體和動物體時(shí)。
因此，本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的乳桿菌菌株作為生物學(xué)遏制菌株在輸送預(yù)防性和/或治療性分子中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述輸送在不能嚴(yán)格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶濃度的情況下需要生物學(xué)遏制，所述情況例如但不限于將所述預(yù)防性和/或治療性分子輸送至動物體(包括人體)以預(yù)防或治療疾病。如本文所用，不能嚴(yán)格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶濃度的情況是指對所述濃度沒有直接的控制，例如通過主動和受控添加或移除胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷而對所述濃度的控制。優(yōu)選地，所述胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷缺陷條件是通過天然過程產(chǎn)生的，例如由腸中胸腺嘧啶核苷吸收而導(dǎo)致的胸腺嘧啶核苷耗竭。作為非限制性實(shí)例，WO 97/14806和WO 98/31786中已經(jīng)公開了所述預(yù)防性和/或治療性分子的輸送。預(yù)防性和/或治療性分子包括但不限于多肽例如胰島素、生長激素、促乳素(prolactine)、降鈣素、1組細(xì)胞因子(group 1 cytokines)、2組細(xì)胞因子(group 2 cytokines)、3組細(xì)胞因子(group 3 cytokines)、神經(jīng)肽和抗體，以及多糖例如來自病原性細(xì)菌的多糖抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種乳桿菌菌株的thyA基因，優(yōu)選唾液乳桿菌的thyA基因，被破壞并且被功能性的人白介素-10表達(dá)盒取代，所述菌株可用于輸送白介素-10。所述白介素-10表達(dá)單位優(yōu)選地但不限于是人白介素-10表達(dá)單位或編碼人白介素-10的基因。因此，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是本發(fā)明的一種乳桿菌菌株在輸送人白介素-10中的應(yīng)用。輸送所述分子的方法和治療疾病例如炎性腸病的方法在Steidler et al.的WO 97/14806和WO 00/23471以及Steidler et al.(2000)中被詳細(xì)解釋，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文。本發(fā)明表明本發(fā)明的菌株令人驚訝地與對照菌株以同樣的速度通過消化道，并且顯示其存活力的喪失與對照菌株的確沒有差別。然而，所述菌株一旦被分泌至環(huán)境中，例如在糞便中，就不能存活。特別令人驚訝的是所述缺失突變體可以在腸內(nèi)特別是在回腸內(nèi)存活，因此可用作被生物學(xué)遏制的輸送菌株，而其僅依賴于胸腺嘧啶核苷。
本發(fā)明的另一方面是一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的乳桿菌物種thyA破壞突變體。作為非限制性實(shí)例，所述細(xì)菌可被包囊以促進(jìn)其輸送至腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知包囊的方法，所述方法公開于例如EP0450176。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的菌株在制備藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物用于治療克隆病(Crohn’s disease)和炎性腸病。
附圖簡述

圖1全部菌株唾液乳桿菌菌株在相關(guān)之處由其菌株編號(UCC118，TGB078，TGB092)表示。
A組UCC118 thyA(陰影線)和hIL-10(黑線)之間的基因交換示意圖。大小為1Kb的用于同源重組的靶DNA(灰色)位于UCC118的染色體上和非復(fù)制型紅霉素(Em)抗性標(biāo)記陽性質(zhì)粒上，其分別在thyA和hIL-10的上游和下游均存在。UCC118染色體DNA(粗黑線)位于靶DNA上游及下游側(cè)翼。在UCC118中引入所述非復(fù)制型質(zhì)粒后(1)，將轉(zhuǎn)化混和物在存在Em的情況下溫育，這使得可以對在靶的上游或下游的同源重組事件進(jìn)行選擇(2)，所述事件通過使用1F/1R或2F/2R寡核苷酸的PCR區(qū)分。在不存在Em和存在50μg/ml胸腺嘧啶核苷的情況下重復(fù)生長使得發(fā)生第二次重組(3)，其可由組合的1F/1R和2F/2R PCR檢測。Em陰性、1F/1R 2F/2R PCR陽性克隆具有所希望的遺傳結(jié)構(gòu)(4)。
B組親代菌株唾液乳桿菌UCC118和得到的菌株唾液乳桿菌TGB078以及唾液乳桿菌TGB092的詳細(xì)描述。TGB092攜帶乳酸乳球菌thyA啟動子(PthyA，GenBank AF462070)。
圖2唾液乳桿菌UCC118 thyA(陰影線)和hIL-10(黑線)之間的基因交換的PCR鑒別，其產(chǎn)生菌株唾液乳桿菌TGB078和唾液乳桿菌TGB092。全部菌株由其菌株編號(UCC118，TGB078，TGB092)表示。A組顯示了不同PCR反應(yīng)的示意圖。B組顯示了相關(guān)分子量大小間隔的瓊脂糖凝膠電泳數(shù)據(jù)。兩組中的數(shù)字1-8均表示不同的PCR反應(yīng)。
PCR1在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中檢測到thyAPCR2在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中檢測到hIL10PCR3在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中檢測到與靶區(qū)域外的上游基因組DNA相連的hIL10。大小的差別是由于hIL-10啟動子區(qū)域的差別所致，如圖1B中所詳示的。
PCR4在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中檢測到與靶區(qū)域外的下游基因組DNA相連的hIL10。
PCR5在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中檢測到與靶區(qū)域外的上游基因組DNA相連的hIL10。大小的差別是由于hIL-10啟動子區(qū)域的差別所致，如圖1B中所詳示的。
PCR6在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中檢測到與靶區(qū)域外的下游基因組DNA相連的hIL10。
PCR7在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中檢測到與靶區(qū)域外的上游基因組DNA相連的thyA。
PCR8在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中檢測到與靶區(qū)域外的下游基因組DNA相連的thyA。
圖3唾液乳桿菌UCC118、唾液乳桿菌TGB078和唾液乳桿菌TGB092的Southern印跡雜交。全部菌株由其菌株編號(UCC118，TGB078，TGB092)表示。完整染色體DNA用Qiagen Dneasy組織試劑盒根據(jù)制造商描述制備，其中在方案第一步中調(diào)整為細(xì)菌細(xì)胞壁用溶菌酶消化。DNA制備物用EcoRI切割，并與Roche DIG標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)記VII一起通過1.2％瓊脂糖凝膠分離。所述DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜并使用DIG標(biāo)記的thyA和hIL-10探針顯示。全部DIG標(biāo)記和檢測根據(jù)制造商(Roche)描述進(jìn)行。UCC118對thyA探針而不是hIL-10探針顯示了適當(dāng)大小的信號。TGB078和TGB092對thyA探針未顯示信號，但是對hIL-10探針顯示了適當(dāng)大小的信號。后者的大小差異是由于TGB078和TGB092啟動子結(jié)構(gòu)中的差異所致，如圖1所示出的。
圖4唾液乳桿菌UCC118、唾液乳桿菌TGB078和唾液乳桿菌TGB092產(chǎn)生IL-10。全部菌株由其菌株編號(UCC118，TGB078，TGB092)表示。全部菌株的單菌落接種在補(bǔ)充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS中并且在37℃溫育40小時(shí)。離心收集細(xì)菌，在補(bǔ)充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的BM9(緩沖的M9生長培養(yǎng)基)中重懸，并在37℃溫育5小時(shí)。通過ELISA(Becton Dickinson)確定培養(yǎng)基上清中的IL-10。
圖5唾液乳桿菌UCC118、唾液乳桿菌TGB078和唾液乳桿菌TGB092在缺乏胸腺嘧啶核苷的情況下的存活。全部菌株由其菌株編號(UCC118，TGB078，TGB092)表示。每毫升培養(yǎng)基的菌落形成單位(CFU)相對時(shí)間作圖。
圖6與乳酸乳球菌MG1363及其ThyA突變體Thy12相比，唾液乳桿菌UCC118、唾液乳桿菌TGB078和唾液乳桿菌TGB092在缺乏胸腺嘧啶核苷的情況下的存活。
每一種所示菌株的18個(gè)菌落接種于87mlA)MRSΔT(無胸腺嘧啶核苷的MRS，通過將全部胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ざ复僦苽?，在唾液乳桿菌UCC118(wt)或唾液乳桿菌TGB092(thyA缺陷)的情況下；B)GM17ΔT(無胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的GM17，通過在GM17中使用thyA缺陷的乳酸乳球菌對胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶進(jìn)行細(xì)菌耗竭、過濾及高壓滅菌，以及重新加入葡萄糖制備)，在乳酸乳球菌MG1363(wt)或乳酸乳球菌Thy12(thyA缺陷)的情況下。
均分懸浮物并向每種懸浮物中的任一半加入胸腺嘧啶核苷至1μM。
將所有懸浮物均分至適當(dāng)數(shù)量的小瓶中，并將這些小瓶在37℃(乳桿菌)或30℃(乳球菌)溫育。僅開啟小瓶一次，通過將適當(dāng)?shù)南♂屢褐貜?fù)三次鋪板確定每毫升菌落形成單位(cfu)。在此實(shí)驗(yàn)過程中，所有thyA缺陷菌株達(dá)到0cfu(即在用100μl 1∶1稀釋液鋪板的培養(yǎng)皿中，3個(gè)培養(yǎng)皿上有0個(gè)菌落)。TGB092在24h和48h后達(dá)到接近0cfu(當(dāng)用100μl 1∶1稀釋液鋪板時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)皿上最多只有1個(gè)菌落)，并且在使用0μM和1μM胸腺嘧啶核苷時(shí)分別在96h和72h后達(dá)到0cfu。
圖7在存在胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情況下野生型乳桿菌和ThyA突變體在29小時(shí)后的生長測量UCC118、TGB078和TGB092在MRS、含有200μM胸腺嘧啶核苷的MRS(MRSTd)或含有800μM胸腺嘧啶的MRS(MRSTm)中的600nm光密度(OD600)。MRS、MRSTd和MRSTm在37℃生長29小時(shí)后的OD600是0.000。
圖8在存在濃度增加的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情況下，2種不同的乳桿菌ThyA突變體的生長曲線。
24小時(shí)的OD600相對于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的濃度作圖。當(dāng)在相同的濃度范圍測量時(shí)，UCC118在24小時(shí)的OD600達(dá)到完全飽和，而不依賴于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶濃度。
圖9在存在濃度增加的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情況下，2種不同的乳桿菌ThyA突變體的生長曲線在低濃度的詳細(xì)情況。
24小時(shí)的OD600相對于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的濃度作圖。當(dāng)在相同的濃度范圍測量時(shí)，UCC118在24小時(shí)的OD600達(dá)到完全飽和，而不依賴于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶濃度。
圖10唾液乳桿菌UC118在不同濃度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶中的生長(24小時(shí)的OD600)，顯示所述突變體的缺乏生長不是由于胸腺嘧啶毒性所致。
實(shí)施例實(shí)施例中的材料和方法培養(yǎng)基除非另有說明，乳桿菌菌株在MRS(Merck)中培養(yǎng)。
本文所用特殊培養(yǎng)基是BM91升pH8.5的50mM CO3--緩沖液，補(bǔ)充有6g Na2HPO4/3g KH2PO4/1g NH4Cl/0.5g NaCl/1 mmol MgSO4/0.1mmol CaCl2/0.5％葡萄糖/0.5％酪胨(difco)MRSΔT(移除胸腺嘧啶核苷的MRS)MRS粉末(Merck)溶解于適當(dāng)體積(基于生產(chǎn)商的說明)的蒸餾水。所得溶液加熱至100℃，持續(xù)1分鐘，并使其冷卻至室溫。每毫升加入1.2單位胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(SIGMA)。所得溶液在37℃溫育20小時(shí)并接著進(jìn)行高壓滅菌。
菌株唾液乳桿菌UCC118(Dunne et al.，2001)用作受體菌株以構(gòu)建thyA突變體。
實(shí)施例1thyA突變體的構(gòu)建唾液乳桿菌thyA突變體的構(gòu)建基本上如對乳酸乳球菌所描述的(Steidler et al.，2003)進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行一些修改。圖1簡述了所述構(gòu)建。對唾液乳桿菌唾液亞種菌株UCC118的thyA區(qū)域進(jìn)行測序，包括編碼序列的上游和下游序列。了解這些序列對于對任何乳桿菌菌株通過下述途徑進(jìn)行遺傳工程操作都是極其重要的，因?yàn)樵摬呗詫迷趖hyA 5’末端的1000bp區(qū)域和3’末端的1000bp區(qū)域內(nèi)(“thyA靶”)進(jìn)行的雙重同源重組。
在菌株UCC118中，thyA基因被編碼一種蛋白質(zhì)的合成基因置換，所述蛋白質(zhì)具有一個(gè)在乳桿菌中有功能的分泌信號，所述分泌信號與具有與hIL-10成熟部分相同的氨基酸序列(其中位點(diǎn)2的脯氨酸被丙氨酸置換)的蛋白質(zhì)融合，所述合成基因與乳酸乳球菌thyA啟動子(PthyA，GenBank AF462070)可操縱地連接。啟動子與hIL-10基因的任何組合稱為hIL-10表達(dá)盒。
通過電穿孔在1.5kV，25mF，400Ω，2mm間隙長度條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
基本上如Biwas et al.(1993)所述，通過同源重組進(jìn)行thyA置換。如下所述得到thyA靶的質(zhì)粒衍生形式的適當(dāng)?shù)闹脫Q。
所述策略涉及輔助質(zhì)粒(helper plasmid)(攜帶氯霉素選擇標(biāo)記)，其已被預(yù)先導(dǎo)入靶乳桿菌菌株中，并涉及載體質(zhì)粒(carrier plasmid)(攜帶紅霉素抗性標(biāo)記)，其編碼側(cè)翼具有染色體thyA基因的上游及下游序列的hIL-10表達(dá)盒，如上所述。
輔助質(zhì)粒pTGB019是pVE6007的一種修飾形式。為了構(gòu)建pTGB019，通過使用寡核苷酸GCGAAGCTTCAAATAGGGGTTCCGCGC和GCGACTAGTGGGAAAACTGTCCATACCC進(jìn)行PCR擴(kuò)增從pKD20中產(chǎn)生一個(gè)3221bp插入體并用HindIII和SpeI進(jìn)行切割。所述片段編碼在大腸桿菌阿拉伯糖啟動子控制下的Redγ、β和exo基因，并被連接到HindIII-SpeI切開的pVE6007中。然而，這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)顯示在唾液乳桿菌中并不是功能性的。使用Western印跡檢測，向攜帶myc標(biāo)簽標(biāo)記的形式的各種RED重組酶基因的菌株中加入阿拉伯糖未顯示任何表達(dá)；同樣，使用通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分析，攜帶pTGB019的乳桿菌也沒有顯示任何一種RED基因的表達(dá)。相反，所述插入體會使得與pVE6007相比，輔助質(zhì)粒pTGB019在乳桿菌中的復(fù)制更加不穩(wěn)定。
所述載體質(zhì)粒被電穿孔導(dǎo)入具有pTGB019的乳桿菌菌株中。兩個(gè)質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存?，F(xiàn)在仍不清楚整合機(jī)制是如何發(fā)揮功能的。將電穿孔混和物鋪板至含有10μg/ml紅霉素和200μM胸腺嘧啶核苷的固體瓊脂MRS培養(yǎng)皿中并在42℃溫育24小時(shí)。
所述載體質(zhì)粒不能在乳桿菌中復(fù)制。因此將紅霉素抗性轉(zhuǎn)移至特定菌株的唯一途徑是在第一次同源重組發(fā)生時(shí)進(jìn)行，所述同源重組在thyA靶的5’1000bp或3’1000bp進(jìn)行。通過PCR檢測紅霉素陽性克隆以檢測這種同源重組的發(fā)生，如圖1所示。
一部分紅霉素陽性克隆仍攜帶pTGB019。這些克隆被用于分離顯示第二次交換的克隆。將適當(dāng)?shù)南♂屢涸?2℃鋪板至MRS固體瓊脂培養(yǎng)皿上，篩選不能在無胸腺嘧啶核苷的MRS中生長的、具有上游及下游重組的以及不存在thyA基因的紅霉素和氯霉素敏感克隆。
在thyA靶的3’1000bp或5’1000bp進(jìn)行的第二次同源重組獲得所希望的菌株。通過在不存在紅霉素和存在50μg/ml胸腺嘧啶核苷的情況下進(jìn)行重復(fù)生長選擇第二次重組。用PCR檢測克隆，如圖1所示。
得到的菌株稱為TGB078(人IL-10)和TGB092(可操縱地連接至thyA啟動子的人IL-10)。
實(shí)施例2鑒別thyA-和IL-10+乳桿菌通過PCR初步確認(rèn)thyA-和IL-10+攜帶hIL-10插入體的乳桿菌菌落由PCR檢測初步確認(rèn)，如圖2所示。使用了幾組引物以檢測thyA(圖2.1)、檢測IL-10(圖2.2)、檢測IL-10的側(cè)翼序列(圖2.3-6)、以及檢測thyA的側(cè)翼序列(圖2.7&8)。
結(jié)果很清楚地顯示在突變菌株TGB072和TGB092中，thyA的編碼序列已經(jīng)被人IL-10序列置換。
表1使用的引物通過Southern印跡確認(rèn)乳桿菌具有thyA-和IL-10+性質(zhì)為了確認(rèn)在基因組的其他位置不存在thyA或IL-10拷貝，用Southern印跡檢測整合。從不同的乳桿菌菌株中制備基因組DNA。基因組乳桿菌DNA用EcoRI消化并進(jìn)行Southern印跡。所述印跡用地高辛標(biāo)記的探針檢測以鑒別thyA(thyA探針，通過PCR引物對1獲得)或hIL-10(hIL-10探針，通過PCR引物對2獲得)。如同基于PCR結(jié)果所預(yù)測的，對于突變體，thyA探針信號呈陰性，印跡上的hIL-10探針信號呈陽性，而對于親代菌株，thyA探針信號呈陽性，hIL-10信號呈陽性。結(jié)果總結(jié)于表2。
表2PCR片段的預(yù)期長度實(shí)施例3thyA-和IL-10+乳桿菌產(chǎn)生人IL-10為了評價(jià)hIL-10分泌，將每種菌株的單一菌落在補(bǔ)充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS中生長。在37℃生長40小時(shí)后，離心收集細(xì)菌并重懸于補(bǔ)充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的緩沖的M9(BM9)。得到的懸浮液在37℃溫育5小時(shí)，然后通過ELISA(Becton Dickinson)確定人IL-10的量。結(jié)果示于圖4。包含人IL-10編碼序列的兩種菌株均產(chǎn)生IL-10，但是當(dāng)人IL-10編碼序列與乳酸乳球菌thyA啟動子可操縱地連接時(shí)產(chǎn)量高很多。盡管hIL-10的產(chǎn)量低于所描述的乳酸乳球菌的產(chǎn)量(Steidler et al.，2003)，其產(chǎn)量對于在體內(nèi)有效地治療慢性腸炎而言仍是足夠高的。
實(shí)施例4缺乏胸腺嘧啶核苷時(shí)的存活測試了兩種突變菌株及親代菌株在無胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中的存活。存活用作為時(shí)間的函數(shù)的每毫升培養(yǎng)基菌落形成單位(CFU)表示。結(jié)果示于圖5和圖6。
所有菌株的單一菌落接種于補(bǔ)充了25μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRSΔT中，在37℃溫育20小時(shí)。離心收集細(xì)菌，用1V MRSΔT洗兩次，重懸于1V MRSΔT中，在MRSΔT中以1∶20稀釋并在37℃溫育。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)通過在補(bǔ)充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS固體瓊脂培養(yǎng)皿上鋪板確定每毫升CFU。
如同所顯示的，500分鐘之后CFU減少了超過2log單位。在不到1000分鐘后CFU減少3log單位。這些結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于Steidler et al.(2003)在乳酸乳球菌中獲得的結(jié)果，即需要大約兩倍的時(shí)間才能得到CFU減少2log單位，需要50小時(shí)才能得到CFU減少3log單位。
重要的是應(yīng)當(dāng)注意這些結(jié)果是在存在胸腺嘧啶的情況下得到的。事實(shí)上，通過將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏さ拿柑幚韽呐囵B(yǎng)基中移除了胸腺嘧啶核苷。雖然有剩余濃度的胸腺嘧啶，但是胸腺嘧啶核苷饑餓誘導(dǎo)的死亡仍是極為迅速的，這表明所述菌株不能被胸腺嘧啶拯救。
實(shí)施例5乳桿菌ThyA突變體不能被胸腺嘧啶拯救唾液乳桿菌UCC118(thyA野生型)、TGB078和TGB092(兩者都是thyA缺陷型)在MRS、含有200μM胸腺嘧啶核苷的MRS(MRSTd)或含有800μM胸腺嘧啶的MRS(MRSTm)中生長。
在37℃生長29小時(shí)后測量600nm光密度。
得到的數(shù)據(jù)(圖7)顯示UCC118達(dá)到相似的光密度，與生長培養(yǎng)基無關(guān)。MRS中的胸腺嘧啶核苷濃度限制了TGB078和TGB092的生長。當(dāng)向MRS中加入200μM胸腺嘧啶核苷，TGB078和TGB092達(dá)到與UCC118相同的光密度。向MRS中加入800μM胸腺嘧啶不能支持TGB078和TGB092生長至更高的光密度。
如同圖7中可見的，MRS含有相當(dāng)量的胸腺嘧啶核苷。胸腺嘧啶核苷可被胸腺嘧啶核苷磷酸化酶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?。因此用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶消化MRS產(chǎn)生MRSΔT。將唾液乳桿菌UCC118(thyA野生型)、TGB078和TGB092(兩者都是thyA缺陷型)在MRSΔT中培養(yǎng)，其中加入不同濃度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶。在37℃生長24小時(shí)后，培養(yǎng)物達(dá)到飽和。在24小時(shí)的OD600相對于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶濃度作圖(圖8和圖9)。
這些結(jié)果顯示兩種thyA缺陷菌株都可以利用外源胸腺嘧啶核苷而非胸腺嘧啶生長，然而野生型生長不受添加胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影響(圖10)，證明缺乏生長不是由于胸腺嘧啶毒性。
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權(quán)利要求
1.乳桿菌物種(Lactobacillus sp.)的分離的菌株，其包含缺陷的重組thyA基因，其中所述菌株的存活嚴(yán)格依賴于存在胸腺嘧啶核苷。
2.權(quán)利要求1的乳桿菌物種的分離的菌株，其中所述乳桿菌物種是唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)。
3.權(quán)利要求1或2的乳桿菌物種的分離的菌株，其中所述乳桿菌物種是唾液乳桿菌唾液亞種菌株UCC118。
4.前述任一權(quán)利要求的乳桿菌物種的分離的菌株，其進(jìn)一步的特征是在缺乏胸腺嘧啶核苷時(shí)存活力的初始降低為在16小時(shí)中降低至少2 log cfu。
5.前述任一權(quán)利要求的乳桿菌物種的分離的菌株在輸送預(yù)防性和/或治療性分子中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5的乳桿菌物種的分離的菌株的應(yīng)用，其中所述輸送在不能嚴(yán)格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶濃度的情況下需要生物學(xué)遏制。
7.權(quán)利要求5或6的乳桿菌物種的分離的菌株的應(yīng)用，其中所述預(yù)防性和/或治療性分子是白介素10。
8.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的乳桿菌物種的分離的菌株。
9.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的乳桿菌物種的分離的菌株在制備藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的乳桿菌物種的分離的菌株在制備治療炎性腸病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組乳桿菌(Lactobacillus)菌株，其具有在環(huán)境中受限制的生長和生存力。更特別地，本發(fā)明涉及一種只能在含有胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中存活的重組乳桿菌。由于這種對胸腺嘧啶核苷的嚴(yán)格依賴性，在此重組菌株中迅速誘導(dǎo)胸腺嘧啶核苷缺陷致死。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是一種乳桿菌，其只能在存在胸腺嘧啶核苷的宿主生物體中存活，但是在所述宿主生物體體外缺乏此培養(yǎng)基化合物時(shí)不能存活。進(jìn)一步地，可以用預(yù)防性和/或治療性分子轉(zhuǎn)化所述乳桿菌菌株，從而可以將所述乳桿菌菌株用于治療疾病，例如但不限于炎性腸病。
文檔編號C12N9/10GK101052705SQ200580016028
公開日2007年10月10日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月18日
發(fā)明者洛塔爾·斯泰德勒爾, 薩拜因·內(nèi)瑞恩克 申請人:佛蘭芒語埋葬－大學(xué)生物技術(shù)研究所Vzw, 根特大學(xué), 國立科克大學(xué)