專利名稱：用于子宮頸疾病檢測的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測高度子宮頸疾病的方法和組合物。
背景技術：
宮頸癌是婦女中的第二大常見腫瘤，大約占所有女性癌癥的12％，每年導致大約250,000人死亡。Baldwin等人(2003)Nature ReviewsCancer 31-10。在許多不能進行大規(guī)模篩查程序的發(fā)展中國家，臨床問題更加嚴重。在這些國家，宮頸癌是婦女中癌癥死亡的頭號病因。
大部分宮頸癌的病例表現為鱗狀細胞癌，盡管也觀察到腺癌?？赏ㄟ^人群篩查來預防宮頸癌，因為其通過已完全明確的非浸潤上皮內階段演化而來，所述階段可通過形態(tài)學方法進行辨別。Williams等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514932-14937。盡管不知道正常細胞是如何開始轉化的，但從正常的復層上皮通過子宮頸上皮內贅瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)至浸潤性癌的組織病理學變化的連續(xù)譜的概念多年來已被廣泛接受。宮頸癌的前身是發(fā)育異常，在本領域也稱為CIN或鱗狀上皮內病變(squamousintraepithelial lesions，SIL)?？墒褂萌?three-tiered)(CIN)或二級(two-tiered)(Bethesda)系統(tǒng)將鱗狀上皮內異常分類。在Bethesda系統(tǒng)下，低度鱗狀上皮內病變(LSIL)，對應于CINI和HPV感染，通常代表了有效果的HPV感染，其發(fā)展成浸潤性疾病的風險相對較低。盡管LSIL和HSIL都被視為惡性腫瘤的潛在前身，但在三級系統(tǒng)中對應于CINII和CINIII的高度鱗狀上皮內病變(HSIL)，和LSIL相比顯示更高的發(fā)展成宮頸癌的風險。在該系統(tǒng)下，也可將患者的樣品分類為ASCUS(意義不明的非典型性鱗狀細胞，atypical squamouscells of unknown significance)或AGUS(意義不明的非典型性腺細胞，atypical glandular cells of unknown significance)。
已證實宮頸癌和通過高危型的人乳頭瘤病毒(HPV)例如16、18和31型的感染之間的強關聯性。事實上，大量流行病學和分子生物學證據已將HPV感染確定為宮頸癌的病因因素。此外，在85％或更多的高度子宮頸疾病的病例中發(fā)現了HPV。然而，HPV感染非常普遍，可能在5-15％超過30歲的婦女中發(fā)生，但很少有HPV陽性的婦女會發(fā)展成高度子宮頸疾病或癌癥。單獨的HPV存在只是感染的指標，而不是高度子宮頸疾病的指標，因此，只對HPV感染進行檢測導致許多假陽性。參見，例如，Wright等人(2004) Obstet.Gyhecol.103304-309。
目前的文獻表明HPV感染宮頸的深部組織內的基底干細胞。干細胞向成熟角質形成細胞的分化(結果導致所述細胞遷移至復層子宮頸上皮)和HPV病毒復制以及細胞的再傳染有關聯。在該病毒復制過程中，發(fā)生許多細胞變化，包括細胞周期失控(de-regulation)、活躍的增殖、DNA復制、轉錄激活和基因組的不穩(wěn)定性(Crum(2000)ModeriiPatliology 13243-251；Middleton等人(2003)J.Virol.7710186-10201；Pett等人(2004)CaracerRes.641359-1368)。
大多數HPV感染實際上是短暫的，因為病毒感染會在12個月內將其自身消解。對于那些因為一種或多種HPV的致癌亞型而發(fā)生持久性感染的個體，和無HPV感染的患者相比，存在發(fā)展瘤形成的風險。已知HPV在子宮頸瘤形成(cervical neoplasia)的發(fā)展上的重要性，在鑒定可能發(fā)生子宮頸瘤形成的患者上，HPV的臨床檢測已逐漸成為重要的診斷工具?；贖PV的子宮頸疾病的篩查的臨床功效在于其陰性預測價值。HPV陰性結果和正常的Pap抹片檢查史一起是無疾病狀況和在以后的1-3年期間較少可能發(fā)生子宮頸瘤形成的優(yōu)良指標。然而，陽性HPV結果不是子宮頸疾病的診斷，而只是感染的指征。盡管大多數HPV感染是短暫的并且會在12個月的時期內自發(fā)清除，但具有高危HPV病毒亞型的持續(xù)性感染預示著發(fā)生子宮頸瘤形成的更大可能性。為補充HPV檢測，預期和子宮頸瘤形成關聯的分子標志物的鑒定可提高針對子宮頸疾病診斷的臨床特異性。
對經帕帕尼古拉烏染色的子宮頸抹片(Pap抹片)進行細胞學檢查目前是檢測子宮頸癌所選用的方法。Pap抹片檢查是種主觀的方法，60多年來其基本上保持未變。然而，關于其性能存在幾個顧慮。報道的單一Pap檢查的靈敏度(檢查呈陽性的疾病陽性的比例)較低，并且顯示較寬的變化范圍(30-87％)。對于潛在的高度疾病的確定，單一Pap抹片檢查的特異性(經檢驗呈陰性的疾病陰性的比例)在篩查人群中低達86％，在ASCUS PLUS人群中更要低得多。參見，Baldwin等人，同上。相當比例的鑒定為LSIL或CINI的Pap抹片檢查實際上是高度病變陽性。此外，高達10％的Pap抹片檢查被分類為ASCUS(意義不明的非典型性鱗狀細胞)，即不太可能明確歸類為正常、中度或嚴重病變、或腫瘤。然而，經驗顯示高達10％的該ASCUS群體具有高度病變，所述病變因此而被忽略掉。參見，例如，Manos等人(1999) JAMA2811605-1610。
因此，需要這樣的用于診斷高度子宮頸疾病的方法，該方法不依賴于常規(guī)的Pap抹片檢查和針對高危HPV感染的分子檢測或者與其一起使用。該方法應當能夠特異性地鑒定存在于所有患者群體中的高度子宮頸疾病，包括通過Pap染色被分類為LSIL或CINI、而實際上是高度病變陽性(即，“假陰性”)的病例。因此，本領域需要這樣的特異的、可靠的診斷方法，該方法能夠檢測高度子宮頸疾病以及能夠區(qū)別高度疾病和不被當作臨床疾病的病癥例如早期HPV感染和輕度發(fā)育異常。
發(fā)明概述提供了用于診斷高度子宮頸疾病的組合物和方法。本發(fā)明的方法包括檢測至少一種生物標志物、特別是核生物標記物在機體樣品中的過表達，其中所述所述生物標志物的過表達的檢測特異性地鑒定顯示高度子宮頸疾病的樣品。本方法可將顯示高度子宮頸疾病的樣品和顯示良性增殖、早期HPV感染或輕度發(fā)育異常的樣品區(qū)分開。因此，該方法依賴于這樣的生物標志物的檢測，該生物標志物選擇性地在高度子宮頸疾病狀態(tài)中過表達，而不在正常細胞或不指示臨床疾病的細胞中過表達。
本發(fā)明的生物標志物是選擇性地在高度子宮頸疾病中過表達的蛋白和/或基因，包括由于HPV誘導的細胞周期功能失調和負責S期誘導的某些基因的激活造成的蛋白和/或基因的過表達。特別吸引人的生物標志物包括S期基因，其過表達是由于HPV誘導的細胞周期功能失調和隨后的轉錄因子SP-1和E2F的激活造成的。本發(fā)明的生物標志物基因或蛋白的過表達的檢測可區(qū)分顯示高度疾病的樣品(例如中度至嚴重的發(fā)育異常和宮頸癌)和正常細胞或不指示臨床疾病(例如，無發(fā)育異常的早期HPV感染和輕度發(fā)育異常)的細胞。
可在蛋白或核酸水平上估計生物標志物的過表達。在一些實施方案中，提供了利用抗體在子宮頸細胞學樣品中檢測生物標志物的過表達的免疫細胞化學技術。在本發(fā)明的該方面，使用至少一種針對感興趣的特定生物標志物的抗體。也可通過基于核酸的技術(包括，例如，雜交和RT-PCR)檢測過表達。此外還提供了包含用于實施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。
也可將本發(fā)明的方法和用于分析形態(tài)學特征或HPV感染狀況的常規(guī)婦科診斷技術結合使用。因此，例如，此處提供的免疫細胞化學方法可和Pap抹片檢查一起使用，這樣就保存了來自常規(guī)方法的所有形態(tài)學信息。通過這種方式，對在高度子宮頸疾病中選擇性地過表達的生物標記物的檢測可減少Pap抹片檢查的高假陽性率，從而有助于大規(guī)模自動化篩查。
附圖概述

圖1提供了子宮頸結構異常中的增殖和細胞周期失控的圖解概述。子宮頸瘤形成中的細胞周期變化和增殖控制缺陷。HPV感染和E6與E7癌蛋白(oncoproteins)的過表達引起了細胞周期和增殖控制中的一系列變化。HPV E6癌蛋白消除了G1/S和G2/M界線上的細胞周期關卡，結果DNA進行復制，產生體細胞突變。E7促進了加速進入S期，結果DNA復制所需的S期基因長時間表達(異常的S期誘導)。同樣，E6提高了端粒酶的表達，在增殖和細胞永生化期間確保了連續(xù)的染色體端粒完整性。最后，E7消除了TGF-β信號轉導途徑，從而消除了G1期阻滯的該控制機制和增殖的控制。
圖2提供了子宮頸瘤形成中的異常S期誘導的示意性圖解說明。HPV蛋白對細胞周期控制和增殖的作用包括p53和Rb腫瘤抑制途徑的失活、E2F-1轉錄的激活、S期基因MCM-2、MCM-6、MCM-7、TOP2A和細胞周期蛋白E1等的誘導。此外，E2和Sp-1轉錄因子相互作用，從而激活p21-waf-1的基因表達。
圖3提供了細胞周期的異常S期中關于細胞增殖的反饋回路的示意圖。S期中細胞周期蛋白E和CDK2的過表達導致允許誘導S期基因的獨立機制。
圖4提供了c-myc在異常S期誘導中的作用的示意圖。C-myc是細胞增殖中重要的轉錄激活物。編碼c-myc的基因位于染色體上。該位置與已證實了HPV18的整合以及該基因區(qū)域的相應擴增屬同一位置。c-myc基因的擴增將導致被編碼的蛋白的過表達，c-myc的增加的水平將獨立地促進S期基因轉錄，從而進一步加速細胞增殖。
圖5提供了針對MCM7轉錄體變體的TaqMan引物的示意圖。
圖6舉例說明了具有輕度發(fā)育異常的患者和患有鱗狀細胞癌的患者在IHC測定法中針對Claudin 1的抗體的差異染色模式。
圖7舉例說明IHC和ICC形式中針對Claudin 1的抗體的差異染色模式。顯示了正常細胞和指示CINIII和HSIL的細胞。
圖8舉例說明了用核生物標志物(即，MCM2)獲得的細胞核染色模式和用細胞質生物標志物(p16)獲得的細胞質染色模式。結果來自高度子宮頸疾病患者樣品的免疫細胞化學(ICC)測定。
圖9舉例說明在使用兩種不同的針對MCM6的抗體對來自患有高度子宮頸疾病的患者的宮頸組織進行的免疫組織化學(IHC)測定中期望的和不期望的抗體染色。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于鑒定或診斷高度子宮頸疾病的組合物和方法。該方法包括檢測選擇性地在高度子宮頸疾病(例如中度至嚴重的發(fā)育異常和宮頸癌)中過表達的特定生物標志物的過表達。即，本發(fā)明的生物標志物能夠區(qū)別HPV感染的細胞和癌變前、惡性的、或顯露癌性的HPV感染的細胞。用于診斷高度子宮頸疾病的方法包括來自患者的組織或體液樣品中檢測至少一種指示高度子宮頸疾病的生物標志物的過表達。在特定的實施方案中，使用抗體和免疫細胞化學技術檢測目的生物標志物的表達。此外還提供了用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒。
“診斷高度子宮頸疾病”包括，例如，診斷或檢測子宮頸疾病的存在、監(jiān)控疾病的進程，和鑒定或檢測指示高度子宮頸疾病的細胞或樣品。術語診斷、檢測和鑒定高度子宮頸疾病在此處可交換使用。“高度子宮頸疾病”是指通過陰道鏡被分類為癌前病理、惡性病理、中度至嚴重發(fā)育異常，和宮頸癌的病癥。潛在的高度子宮頸疾病包括CINII、CINIII、HSIL、原位癌、腺癌，和癌(FIGO I-IV期)的組織學鑒定。
如上所述，相當比例的表現Pap抹片檢查分類為正常、CINI或ASCUS的患者實際上具有高度子宮頸疾病特征性的病變。因此，本發(fā)明的方法允許在所有患者(包括這些“假陰性”患者)群體中鑒定高度子宮頸疾病，并且便于檢查患者樣品中的稀有異常細胞。盡管本發(fā)明的方法也可和常規(guī)診斷技術例如Pap抹片檢查、針對高危型HPV的分子檢測等一起使用，但其可不依賴于細胞形態(tài)學和HPV感染狀態(tài)進行診斷。
基于HPV型和宮頸癌以及癌前病變的相關性已將其分為高危型和低危型類別。低危HPV型包括6、11、42、43、44型，并且和增加的宮頸癌風險無關。相反地，高危HPV型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，和宮頸癌以及鱗狀上皮內病變強烈相關。參見，例如，Wright等人(2004)Obstet.Gynecol.103304-309。事實上，超過99％的宮頸癌和高危HPV感染相關。持久的高危HPV感染通過HPV基因E2、E6和E7的作用導致子宮頸細胞中細胞周期和有絲分裂關卡的破壞。具體地說，HPV E7導致細胞周期蛋白E的增加和隨后轉錄因子E2f從視網膜母細胞瘤(Rb)蛋白(Rb)的釋放。然后釋放的E2f轉錄因子觸發(fā)各種S期基因的轉錄，導致細胞周期控制的喪失，所述S期基因包括拓撲異構酶IIα(Topo2A)、MCM蛋白、細胞周期蛋白E1和E2以及p14α。HPV E2通過激活Sp-1轉錄因子進一步刺激S期基因例如p21Waf-1的過表達。由持久HPV感染引起的細胞周期的破壞可導致輕度宮頸結構異常，然后該疾病可發(fā)展為中度或嚴重發(fā)育異常，最終在一些情況下導致宮頸癌?！皩m頸癌”指和宮頸組織或子宮頸細胞相關的任何癌癥或癌癥病變。
宮頸角質形成細胞內的HPV感染導致破壞細胞周期內的活動的多種變化。高危HPV亞型的E6和E7癌蛋白參與許多這樣的細胞過程，所述細胞過程和被感染的角質形成細胞的增加的增殖和致瘤性轉化相關。E6蛋白參與兩個至關重要的過程。第一個過程是通過遍在蛋白介導的蛋白水解進行的P53腫瘤抑制蛋白的降解。功能性p53的除去消除了在進入DNA修復和有絲分裂前負責DNA修復的主要細胞周期關卡(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5383-391)。此外，已顯示E6和c-myc蛋白相互作用，負責hTERT基因的直接轉錄激活，隨后表達端粒酶(McMurray和McCance(2003)J Virol.779852-9861；Veldman等人(2003)Proc Natl Acad Sci U.S.A.1008211-8216)。端粒酶的活化是癌癥生物學中負責在復制染色體時保持端粒長度的關鍵步驟，該酶在細胞永生化期間可確保功能完整的染色體。
已知HPV癌蛋白E7通過兩個獨立的機制促進細胞增殖。第一機制是通過E7和Smad蛋白(Smad2、3和4)的直接相互作用，從而抑制其結合DNA的能力(Lee等人(2002)J Biol Chem 27738557-38564)，由此使負責將細胞周期阻滯在G1期的TGF-β腫瘤抑制途徑失活。同樣，已知E7特異性地和Rb腫瘤抑制蛋白相互作用。在細胞周期的G1期內，Rb和E2F轉錄因子復合，從而防止E2F激活基因轉錄。在G1/S邊界上，Rb蛋白被磷酸化，釋放出E2F轉錄因子，從而啟動E2F基因轉錄和進入細胞周期的S期。HPV E7癌蛋白通過直接結合Rb并從復合物中置換出E2F來消除該控制機制。這導致受E2F基因驅動的基因轉錄不依賴于正常的細胞周期控制(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5383-391；Duensing和Munger(2004)Int J Cancer 109157-162；Clarke和Chetty(2001)GynecolOncol.82238-246)。該E2F的釋放使基因轉錄和細胞周期控制解偶聯，從而導致負責DNA合成和細胞增殖的S期基因的長時間和異常轉錄。此外，已顯示E6和E7兩者的組合作用導致子宮頸瘤形成中的中心體異常和后來的基因組不穩(wěn)定性(Duensing和Munger(2004)Int JCancer 109157-162)。
盡管不想限制于特定的機制，但在一些實施方案中，作為HPV的致癌株系感染的結果，可將高度子宮頸疾病的分子行為表征為通常只在細胞周期的S期期間表達的離散基因的過表達。隨后不受控制的基因轉錄的激活和異常的S期誘導通過E2F-1轉錄因子途徑來介導。該行為似乎標示了高度子宮頸疾病并提供了致癌HPV感染和子宮頸瘤形成的分子行為之間的聯系。在分子診斷測定形式中使用這些子宮頸瘤形成的分子標志物可改進子宮頸疾病的檢測，使之具有比現有方法更高的靈敏度和特異性。一般參見圖1-4和Malinowski(2005)BioTechniques 381-8(即將出版)，在此以其全文引用作為參考。因此，在特定的實施方案中，用于診斷高度子宮頸疾病的方法包括檢測生物標志物的過表達，其中如此處描述的，該生物標志物的過表達標示了異常的S期誘導。在其他實施方案中，所述方法包括檢測生物標志物的過表達，其中該生物標志物的過表達標示了HPV E6和HPV E7基因的活躍轉錄或過表達。
以形態(tài)學術語常規(guī)地定義發(fā)育異常，表現在上皮細胞的正常定位的喪失、伴隨細胞和細胞核大小、形狀和染色特征上的改變。如通過癌前發(fā)育異常病癥例如CIN的鑒定所顯示的，根據細胞異常的程度對發(fā)育異常分級(即，輕度、中度、嚴重)，發(fā)育異常被廣泛視作從正常組織到子宮頸瘤形成的進程中的中間階段?；趯τ诟叨茸訉m頸疾病特異的生物標志物的過表達，本發(fā)明的方法允許鑒定高度子宮頸疾病，包括中度至嚴重發(fā)育異常以及宮頸癌(即，CINII病癥和以上病癥)。
和Pap抹片檢查和/或HPV感染檢測法相比，此處公開的方法提供了更優(yōu)越的高度子宮頸疾病檢測法。在本發(fā)明的特定方面，本方法的靈敏度和特異性等于或高于常規(guī)的Pap抹片檢查法。如此處所用的“特異性”是指本發(fā)明的方法可準確鑒定已通過陰道鏡被確定為NIL(即真陰性)的樣品的水平。即，特異性是試驗呈陰性的疾病陰性的比例。在臨床研究中，通過將真陰性的數目除以真陰性和假陽性之和來計算特異性?！办`敏度”是指本發(fā)明的方法可精確地鑒定已通過陰道鏡確定為高度子宮頸疾病陽性(即真陽性)的樣品的水平。因此，靈敏度是試驗呈陽性的疾病陽性的比例。在臨床研究中，通過將真實陽性的數目除以真陽性和假陰性之和來計算靈敏度。參見下面的實施例1-3。在一些實施方案中，用于高度子宮頸疾病檢測的所公開方法的靈敏度優(yōu)選地是至少大約70％，更優(yōu)選地至少大約80％，最優(yōu)選地至少大約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。此外，本方法的特異性優(yōu)選地為至少大約70％，更優(yōu)選地至少大約80％、最優(yōu)選地至少大約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。
術語“陽性預測值”或“PPV”是指當患者限定于通過使用本發(fā)明方法分類為陽性的患者時，該患者患有高度子宮頸疾病的概率。在臨床研究中，通過將真陽性的數目除以真陽性和假陽性之和來計算PPV。在一些實施方案中，用于診斷高度子宮頸疾病的本發(fā)明方法的PPV至少為約40％，同時保持至少大約90％，更優(yōu)選地至少大約95％的靈敏度。試驗的“陰性預測值”或“NPV”是當患者限定于所有試驗呈陰性的患者時，該患者不患有該疾病的概率。在臨床研究中通過將真陰性的數目除以真陰性和假陰性之和來計算NPV。
本發(fā)明的生物標志物包括基因和蛋白，以及其變體和片段。這些生物標志物包括這樣的DNA，該DNA包含編碼該生物標志物的核酸序列的完整或部分序列、或該序列的互補序列。生物標志物核酸也包括這樣的RNA，該RNA包含任何目的核酸序列的完整或部分序列。生物標志物蛋白是由本發(fā)明DNA標志物編碼的蛋白或對應于本發(fā)明DNA標志物的蛋白。生物標志物蛋白包含任何生物標記蛋白或多肽的完整的或部分氨基酸序列。
“生物標志物”是任何這樣的基因或蛋白，所述基因或蛋白在組織或細胞中的表達水平與正常的或健康的細胞或組織中的表達水平相比發(fā)生了改變。本發(fā)明的生物標志物是針對潛在的高度子宮頸疾病而言具有選擇性的。“在高度子宮頸疾病中選擇性過表達”是指目的生物標記物在高度子宮頸疾病中過表達，但不在被分類為LSIL、CINI的病癥、無任何發(fā)育異常存在的HPV-感染樣品、不成熟的完全發(fā)育細胞和不被當作臨床疾病的其他病癥中過表達。因此，本發(fā)明的生物標志物的檢測能夠區(qū)別指示潛在的高度子宮頸疾病的樣品和指示良性增殖、早期HPV感染或輕度發(fā)育異常的樣品?！霸缙贖PV感染”是指未發(fā)展成宮頸結構異常的HPV感染。如此處所用的，“輕度發(fā)育異常”是指其中無高度病變存在的LSIL和CINI。本發(fā)明的方法也可將指示高度疾病的細胞與正常細胞、不成熟的完全發(fā)育細胞和不指示臨床疾病的其他細胞區(qū)分開。這樣，本發(fā)明的方法允許準確地鑒定高度子宮頸疾病，即使在被常規(guī)的Pap抹片檢查錯誤地分類為正常、CINI、LSIL或ASCUS情況(即，“假陰性”)下亦如此。在一些實施方案中，作為對異常的或非典型的Pap抹片檢查的反映，進行診斷高度子宮頸疾病的方法。即，可進行本發(fā)明的方法以響應具有異?；蚍堑湫托訮ap抹片檢查結果的患者。在本發(fā)明的其他方面，將所述方法作為在一般的婦女人群中進行的高度子宮頸疾病的初步篩查來進行，就如同目前進行常規(guī)的Pap抹片檢查一樣。
本發(fā)明的生物標志物包括選擇性在上面定義的高度子宮頸疾病中過表達的任何基因或蛋白。這些生物標記物能夠在細胞學細胞懸浮物中鑒定癌前、惡性或顯現癌性的細胞。本發(fā)明的生物標志物檢測CINII病癥和以上病癥中的細胞，但不檢測CINI和其中不存在潛在的高度疾病的HPV感染細胞。特別感興趣的生物標志物包括參與細胞周期調控、細胞周期的HPV干擾、DNA復制和轉錄以及信號轉導的基因和蛋白。在一些實施方案中，生物標志物是S期基因，包括其表達受E2f轉錄因子或Sp-1轉錄因子刺激的基因。細胞核生物標志物可用于實施本發(fā)明的某些方面?！凹毎松飿酥疚铩笔侵钢饕诩毎募毎酥斜磉_的生物標志物。細胞核生物標志物可在細胞的其他部分以較低的程度表達。盡管標示高度子宮頸疾病的任何生物標志物可用于本發(fā)明，但在某些實施方案中，生物標志物，特別是細胞核生物標志物，選自MCM2、MCM6、MCM7、p21Waf1、拓撲異構酶IIα(Topo2A)、p14arf和細胞周期蛋白E。更具體地，生物標志物可以包含MCM蛋白。
微小染色體維持(MCM)蛋白在真核細胞DNA復制中起著非常重要的作用。微小染色體維持(MCM)蛋白通過在雙DNA鏈的從頭合成期間將復制前復合物(prereplication complex)加載至DNA上和充當解旋酶以幫助雙鏈DNA解鏈而在DNA復制的早期階段發(fā)揮作用。MCM蛋白中的每一個蛋白在其高度保守的中心結構域具有DNA依賴性ATP酶基元。當正常細胞從細胞周期的G0期進行至G1/S期時，MCM蛋白的水平通常以可變的方式增加。在G0期，MCM2和MCM5蛋白遠不如MCM7和MCM3蛋白豐富。MCM6和MCM2、MCM4以及MCM7形成結合組蛋白H3的復合物。此外，MCM4、MCM6和MCM7的亞復合物具有解旋酶活性，該活性是通過MCM6的ATP結合活性和MCM4的DNA結合活性介導的。參見，例如，Freeman等人(1999)Clin.Cancer Res.52121-2132；Lei等人(2001)J Cell Sci.1141447-1454；Ishimi等人(2003)Eur.J.Biochem.2701089-1101，所有文獻在此以其全文引用作為參考。
早期的出版物已顯示MCM蛋白，特別是MCM-5，可用于檢測子宮頸疾病(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.9514932-14937)以及其他癌癥(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.52121-2132)。已出版的文獻表明針對MCM-5的抗體能夠檢測子宮頸瘤形成細胞。MCM-5用于檢測高度子宮頸疾病的特異性未得到證實(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.9514932-14937)。MCM-5表達的檢測不限于高度子宮頸疾病，其還在經鑒定的低度發(fā)育異常和在用高危HPV感染后已進入細胞周期的細胞中被檢測到。使用針對MCM-5的抗體對子宮頸瘤形成的檢測顯示于圖4。除了MCM-5外，已顯示來自MCM家族的其他成員，包括MCM-2和MCM-7，是用于在組織樣品中檢測子宮頸瘤形成的可能有用的生物標志物(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.52121-2132；Brake等人(2003)Cancer Res.638173-8180)。近年來的結果已顯示MCM-7似乎是用于使用免疫化學形式檢測高度子宮頸疾病的特異性標志物(Brake等人(2003)Cancer Res.638173-8180；Malinowski等人(2004)Acta Cytol.43696)。
拓撲異構酶IIα(Topo2a)是參與DNA復制的基本的細胞核酶，其是許多用于癌癥治療的抗癌藥物的靶。Topo2a的減少的表達是對幾種化療劑的耐受性的最主要機制。在許多不同的腫瘤中已注意到該蛋白的表達范圍的重大變化。Topo2a主要存在于正在增殖的細胞中，其在M期在特定的位點被磷酸化修飾，這對有絲分裂染色體凝集和分離至關重要。
p21是由染色體6p上的WAFl/Cip1編碼的蛋白。經顯示該基因抑制幾種細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的活性，從而阻止細胞周期的進程。p21Waf1的表達介導p53的細胞周期阻滯功能。因為p21似乎介導p53的幾種生長調節(jié)功能，其表達可能比p53的積累更準確地反映p53的功能狀態(tài)。此外，p21Waf1可通過阻斷增殖細胞中的細胞核抗原(PCNA)的作用來抑制DNA復制。
細胞周期蛋白E是cdk-2的調控亞基，其在哺乳動物細胞周期中控制G1/S的轉變。細胞周期蛋白E的多種同種型只在腫瘤中表達而不在正常的組織中表達，這暗示著細胞周期蛋白E的轉錄后調控。體外分析表明，細胞周期蛋白E的這些截短的變體同種型能夠磷酸化組蛋白H1。細胞周期蛋白E上的變化已被認為是各種癌癥中預后差的指標。
盡管已詳細地討論了上述生物標志物，但可將在高度子宮頸疾病狀態(tài)(例如，CINII、CINIII和宮頸癌)中過表達的任何生物標志物用于實施本發(fā)明。其它感興趣的生物標志物包括對于G1/S期邊界點或S期特異的受細胞周期調控的基因。這些基因包括但不限于解旋酶(DDX11)、尿嘧啶DNA乙二醇酯酶(uracil DNA glycolase，UNG)、E2F5、細胞周期蛋白E1(CCNE1)、細胞周期蛋白E2(CCNE2)、CDC25A、CDC45L、CDC6、p21WAF-1(CDKN1A)、CDKN3、E2F1、MCM2、MCM6、NPAT、PCNA、莖環(huán)BP(SLBP)、BRCA1、BRCA2、CCNG2、CDKN2C、二氫葉酸還原酶(DHFR)、組蛋白H1、組蛋白H2A、組蛋白H2B、組蛋白H3、組蛋白H4、MSH2、NASP、核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)、核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)、胸苷合成酶(TYMS)、復制因子C4(RFC4)、RAD51、染色質因子1A(CHAF1A)、染色質因子1B(CHAF1B)、拓撲異構酶III(TOP3A)、ORC1、引發(fā)酶2A(PRIM2A)、CDC27、引發(fā)酶1(PRIM1)、瓣結構內切核酸酶(flap structure endonuclease，FEN1)、fanconi anemia comp.grp A(FNACA)、PKMYT1和復制蛋白A2(RPA2)。參見，例如，Whitfield等人(2002)Mol.Biol.Cell 131977-2000，以其全文在此引用作為參考。其他感興趣的S期基因包括細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、MCM3、MCM4、MCM5、DNA聚合酶Iα(DNA POL1)、DNA連接酶1、B-Myb、DNA甲基轉移酶(DNA MET)、中心粒周圍蛋白(pericentrin，PER)、KIF4、DP-1、ID-3、RAN結合蛋白(RANBP1)、間隙連接α6(GJA6)、氨基乙酰丙酸脫水酶(amino levulinatedehydratase，ALDH)、組蛋白2A Z(H2A.Z)、精胺合酶(SpmS)、增殖蛋白2、T淋巴細胞激活蛋白、磷脂酶A2(PLA2)和L6抗原(L6)。參見，例如，Neyins等人(2001)Mol.Cell.Biol.214689-4699，此處引用作為參考。
在本發(fā)明的一些方面，生物標志物包含由E2f轉錄因子誘導的基因。這些基因包括但不限于胸苷酸合酶(thymidylate synthase)、胸苷激酶1、核糖核苷酸還原酶M1、核糖核苷酸還原酶M2、CDK2、細胞周期蛋白E、MCM3、MCM7、PCNA、DNA引發(fā)酶小亞基、拓撲異構酶IIA(Topo2A)、DNA連接酶1、flap endonuclease 1、RAD51、CDC2、細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白B2、KI-67、KIFC1、FIN16、BUB1、輸入蛋白α-2、HMG2、zeste增強子、STK-1、組蛋白莖環(huán)BP、Rb、P18-INK4C、膜聯蛋白VIII、c-Myb、CDC25A、細胞周期蛋白D3、細胞周期蛋白E1、脫氧胞嘧啶激酶、DP-1、內皮素轉化酶(endothelin converting enzyme)、烯醇化酶2、P18 INK4C、核糖核苷酸還原酶和尿嘧啶DAN乙二醇酯酶2。參見，例如Nevins等人，同上；Muller等人(2000)Genes and Dev.15267-285。在特定的實施方案中，感興趣的生物標志物是由參與細胞周期調控和DNA復制的E2f轉錄因子誘導的基因，例如，細胞周期蛋白E2、Ki-67、p57KIP2、RANBPM和復制蛋白A1。一些E2f誘導的感興趣基因參與凋亡，其包括APAF1、Bc1-2、caspase 3、MAP3激酶5和TNF受體相關因子。其他E2f誘導的基因參與轉錄的調控，其包括例如ash2樣、polyhomeotic2、embryonic ectoderm protein、Zeste基因增強子、hairy/enhancerof split、同源異形盒A10、同源異形盒A7、同源異形盒A9、同源結構域TF1、早期前B細胞白血病FT3、YY1 TF、POU結構域TF、TAFII130、TBP因子172、堿性TF3、溴區(qū)結構(bromodomain)/鋅指、SWI/SNF、ID4、TEA-4、NFATC1、NFATC3、BT、CNC-1、MAF、MAFF、MAFG、核心結合蛋白、E74樣因子4、c-FOS、JUNB、鋅指DNA BP和Cbp/p300轉錄激活物。參與信號轉導的E2f誘導的基因也是潛在的目的生物標志物，其包括TGFβ、卵泡抑素(follistatin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogenetic protein 2)、BMP受體類型1A、曲蛋白同源物1(frizzled homolog1)、WNT10B、鞘氨醇激酶1、雙特異性磷酸酶7、雙特異性(Y)磷酸酶、FGF受體3、蛋白酪氨酸磷酸酶、雙特異性(Y)磷酸酶D6655、胰島素受體、成熟T細胞增殖蛋白1、FGF受體2、TGFα、CDC42效應蛋白3、Met、CD58、CD83、TACC1和TEAD4。
盡管本發(fā)明的方法要求在患者樣品中檢測至少一個生物標志物以檢測高度子宮頸疾病，但可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個生物標志物來實施本發(fā)明。已認識到對機體樣品中的超過一個生物標志物的檢測可用于鑒定高度子宮頸疾病的事件。因此，在一些實施方案中，使用兩種或更多種生物標志物，更優(yōu)選地，使用兩種或更多種互補生物標志物。“互補”是指機體樣品中生物標志物的組合的檢測導致比只使用其中一個生物標志物時以更大比例成功鑒定高度子宮頸疾病。因此，在一些情況下，可通過使用至少兩種生物標志物進行高度子宮頸疾病的更準確的確定。因此，當使用至少兩種生物標志物時，使用至少兩種針對不同生物標志物蛋白的抗體來實施此處公開的免疫細胞化學方法?？赏瑫r或共同地將抗體和機體樣品接觸。在本發(fā)明的某些方面，使用3種抗體檢測MCM2和Topo2A的過表達，其中抗體中的兩種抗體對于MCM2是特異性的，第三種抗體對于Topo2A是特異性的。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的診斷方法包括從患者收集子宮頸樣品，將樣品和至少一種對于目的生物標志物特異的抗體接觸，檢測抗體結合。表現本發(fā)明生物標志物的過表達的樣品，如通過抗體結合的檢測所確定的，被認為是高度子宮頸疾病陽性的。在特定的實施方案中，機體樣品是單層子宮頸細胞。在本發(fā)明的一些方面，在玻璃載片上提供單層子宮頸細胞。
“機體樣品”是指可檢測到生物標志物表達的細胞、組織或體液的任何取樣。這些機體樣品的示例包括但不限于血液、淋巴、尿、婦科流體(gynecological fluids)、活組織檢查和涂片?？赏ㄟ^各種技術，包括例如，通過刮取或擦拭表面或通過使用針頭抽取體液來從患者獲得機體樣品。用于收集各種機體樣品的方法在本領域是眾所周知的。在特定的實施方案中，機體樣品包括子宮頸細胞，作為宮頸組織樣品或如懸浮物中的子宮頸細胞，特別是基于液體的制備物。在一個實施方案中，按照基于液體的細胞學樣品制備指南，例如SurePath(TriPath Imaging，Inc.)或ThinPrep preparation(CYTYC，Inc.)所述收集宮頸樣品。可將機體樣品轉移至玻璃載片上以進行放大觀察。可對載片上的細胞使用固定液和染色液以保存樣品和幫助檢查。在一個實施方案中，收集宮頸樣品，對其進行處理以提供單層樣品，如美國專利號5,346,831(此處引用作為參考)中所示。
單層方法涉及在帶陽離子電荷的基底上制備單層細胞學材料的方法。該方法包括這樣的步驟，即在密度梯度上通過離心分離細胞學材料，產生該細胞學材料的緊密聚集的沉淀，混合該細胞學材料的沉淀，從混合的沉淀中取出預先確定體積的等分，將該等分和預先確定體積的水沉積在沉降容器中，該容器可移動地裝在帶陽離子電荷的基底上，從而可使細胞學材料在重力作用下沉淀在該基底上，在細胞學材料沉淀后，從沉降容器中除去水分。為了進行自動化分析，可將沉淀容器和基底分開?？赏ㄟ^本領域已知的任何方法，例如吹吸法(syringing)、胰蛋白酶法(trypsinizing)、超聲處理、震蕩、渦旋或通過使用美國專利5,316,814(其內容在此引用作為參考)中描述的裝置進行分離。在一些實施方案中，使用PrepStainTM載片處理器(TriPath Imaging，Inc.)從SurePathTM(TriPath Imaging，Inc.)制備包含單層子宮頸細胞的載片。
此處包括本領域可獲得的用于鑒定或檢測生物標志物的任何方法?？稍诤怂崴交虻鞍姿缴蠙z測本發(fā)明的生物標志物的過表達。為了確定過表達，可將要檢查的機體樣品和來源于健康人的對應的機體樣品進行比較。即，表達的“正常”水平是未遭受高度子宮頸疾病的人受試者或患者的子宮頸細胞中該生物標志物的表達水平。在一些實施方案中，特別是當機體樣品包含單層子宮頸細胞時，生物標志物過表達的確定不需要機體樣品和來源于健康人的對應機體樣品之間的比較。在該情況下，來自單一患者的單層子宮頸細胞可以每50,000個正常細胞包含少至1-2個異常細胞。這些異常細胞(通過本發(fā)明標志物的過表達鑒定的)的檢測，排除了和來源于健康人的對應機體樣品相比較的需要。
用于檢測本發(fā)明標志物的方法包括在核酸或蛋白水平上確定生物標志物的量或存在的任何方法。這些方法在本領域是熟知，包括但不限于western印跡法、Northern印跡法、southern印跡法、ELISA、免疫沉淀法、免疫熒光法、流式細胞術、免疫細胞化學法、核酸雜交技術、核酸逆轉錄法以及核酸擴增法。在特定的實施方案中，使用例如針對特定生物標志物蛋白的抗體在蛋白水平上檢測生物標志物的過表達。這些抗體可用于各種方法，例如western印跡法、ELISA、免疫沉淀法或免疫細胞化學技術。同樣，可將Pap抹片檢查的免疫染色和常規(guī)Pap染色結合，這樣可獲得形態(tài)學信息和免疫細胞化學信息。這樣，生物標志物的檢測可減少Pap抹片檢查的高假陰性率，從而可促進大規(guī)模自動化篩查。
在一個實施方案中，使用對于生物標志物蛋白特異的抗體檢測機體樣品中生物標志物蛋白的過表達。該方法包括從患者獲得機體樣品，將該機體樣品和至少一種針對于選擇性地在高度子宮頸疾病中過表達的生物標志物的抗體相接觸，和檢測抗體結合以確定該生物標志物在患者樣品中是否過表達。本發(fā)明的優(yōu)選的方面提供了用于診斷高度子宮頸疾病的免疫細胞化學技術。具體地，該方法包括患者樣品中的生物標志物的抗體染色，該生物標志物對于高度子宮頸疾病是特異性的。本領域技術人員認識到，可人工地或以自動化的方式(使用例如Autostainer Universal Staining System(Dako)或Biocare NemesisAutostainer(Biocare))進行本文下面描述的免疫細胞化學法。實施例1中提供了一個用于宮頸樣品的抗體染色(即免疫細胞化學)的方案。
在優(yōu)選的免疫細胞化學法中，將患者的宮頸樣品收集入液體培養(yǎng)基中，例如，在SurePathTM收集小瓶(TriPath Imaging，Inc.)中。使用自動化處理器，例如.PrepStainTM系統(tǒng)(TriPath Imaging，Inc.)，從液體培養(yǎng)基中收集細胞和將其沉淀在載玻片上的薄層內以待進一步分析?？晒潭ɑ虿还潭ㄝd片樣品，并可在制備后立即對其進行分析或可將其保存以待以后分析。在一些實施方案中，將制備的玻片貯存在95％的乙醇中最少24小時?？蛇x擇地，在其他實施方案中，如下所述將載片貯存在預處理緩沖液中。
為制備易于抗體結合的生物標志物抗原，可能需要對樣品進行修飾。在免疫細胞化學法的特定方面，將載片轉移至預處理緩沖液例如SureSlide制備緩沖液(TriPath Imaging，Inc.)和任選地將其加熱以增加抗原的易接近性。樣品在預處理緩沖液中的加熱快速地破壞了細胞的脂雙層，使得抗原(即，生物標志物蛋白)更容易進行抗體結合。預處理緩沖液可包含聚合物、去垢劑、或者非離子或陰離子表面活性劑例如乙氧基化的陰離子或非離子表面活性劑、鏈烷酸酯或烷氧基化物或甚至這些表面活性劑的混合物，或甚至使用膽鹽。在特定的實施方案中，預處理緩沖液包含非離子或陰離子去垢劑，例如和具有大約370kD分子量的烷氧基化物混合的具有大約183kD分子量的鏈烷酸鈉(在下文中稱作RAM)。在特定的實施方案中，預處理緩沖液包含1％RAM。在一些實施方案中，預處理緩沖液也可用作上面指出的載片貯存緩沖液。在另一個實施方案中，將0.1％至1％的脫氧膽酸、鈉鹽、一水合物的溶液用作貯存緩沖液和預處理緩沖液。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可將月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉(例如，Sandopan LS)或/和乙氧基化的陰離子復合物或甚至烷基芳基乙氧化羧酸的溶液用于貯存和預處理緩沖液。在本發(fā)明的特定方面，載片預處理緩沖液包含0.05％至5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉，優(yōu)選地0.1％至1％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉、更優(yōu)選地0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉。在一個實施方案中，載玻片可在預處理和染色處理前在緩沖液中貯存長達72小時?？蓪⒈景l(fā)明的預處理緩沖液用于制備在免疫測定法(例如，免疫細胞化學法和免疫組織化學法)中更容易進行抗體結合的抗原的方法。參見實施例14。術語“預處理緩沖液”和“制備緩沖液”在此處可交換使用，其是指這樣的緩沖液，該緩沖液用于制備，特別是通過增加抗原的對抗體結合的易接近性來制備用于免疫染色的細胞學或組織學樣品。
可將制備更容易進行抗體結合的抗原的任何方法用于本發(fā)明的實施，所述方法包括本領域已知的抗原修復法(antigen retrievalmethods)。參見，例如，Bibbo等人(2002)Acta.Cytol.4625-29；Saqi等人(2003)Diagn.CutopatlioL 27365-370；Bibbo等人(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.258-11，此處以其全文引用作為參考。在一些實施方案中，抗原修復包括將載片貯在95％的乙醇中至少24小時，將載玻片浸沒在預熱至95℃的1X Target RetrievalSolution pH 6.0(DAKOS1699)/dH2O浴中，將載玻片置于蒸器中25分鐘。參見下面的實施例2。
在進行增加抗原的易接近性的預處理或抗原修復后，使用合適的封閉試劑(例如，過氧化物酶封閉試劑例如過氧化氫)封閉樣品。在一些實施方案中，使用蛋白封閉劑封閉樣品以防止抗體的非特異性結合。所述蛋白封閉劑可包含，例如，純化的酪蛋白。然后將針對目的生物標志物的抗體，特別是單克隆抗體，和樣品一起溫育。如上面所指出的，本領域技術人員認識到，在一些情況下，通過在患者樣品中檢測超過一種生物標志物可獲得高度子宮頸疾病的更準確的診斷。因此，在特定的實施方案中，使用至少兩種針對兩種不同生物標志物的抗體檢測高度子宮頸疾病。當使用超過一種抗體時，可將這些抗體作為單個抗體試劑順次加入至單一樣品中或作為抗體混合物同時加入。參見下面實施例3?？蛇x擇地，可將各單一抗體加入至來自相同患者的分開的樣品，再將所得的數據合并。在特定的實施方案中，抗體混合物包含至少3種抗體，其中兩種抗體特異性地結合MCM2，第三種抗體特異性地結合Topo2A。
檢測抗體結合的技術在本領域是熟知的?？墒褂卯a生對應于抗體結合水平、因此對應于生物標志物蛋白表達水平的可檢測信號的化學試劑來檢測針對目的生物標志物的抗體結合。在本發(fā)明的其中一個免疫細胞化學法中，通過使用綴合了被標記的聚合物的第二抗體來檢測抗體結合。經標記的聚合物的示例包括但不限于聚合物-酶綴合物。一般將這些復合物中的酶用于催化色原在抗原-抗體結合位點的沉積，從而引起對應于目的生物標志物的表達水平的細胞染色。特別有吸引力的酶包括辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)?？墒褂蒙藤彨@得的抗體檢測系統(tǒng)，例如，Dako Envision+系統(tǒng)和Biocare Medical′sMach 3系統(tǒng)實施本發(fā)明。
在本發(fā)明的一個具體的免疫細胞化學法中，通過使用HRP標記的綴合了二抗的聚合物來檢測針對生物標志物的抗體結合。也可使用結合小鼠單克隆抗體的小鼠探針試劑和結合小鼠探針試劑的綴合HRP的聚合物來檢測抗體結合。使用色原3，3-二氨基聯苯胺(DAB)就抗體結合對載玻片進行染色，然后用蘇木精和任選地著色劑例如氫氧化銨或TBS/Tween-20進行復染。在本發(fā)明的一些方面，由細胞檢驗技術員和/或病理學家在顯微鏡下檢查載片以評估細胞染色(即，生物標志物的過表達)和確定是否存在高度子宮頸疾病。可選擇地，可通過自動化的顯微鏡方法或通過人工借助有助于鑒定陽性染色細胞的計算機軟件檢查樣品。
術語“抗體”廣義上包括天然發(fā)生的抗體形式和重組抗體例如單鏈抗體、嵌合抗體和人源化抗體和多特異性抗體以及所有前述抗體的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原結合位點?？贵w衍生物可包含綴合至所述抗體的蛋白或化學部分。
“抗體”和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同結構特征的糖蛋白。盡管抗體表現對抗原的結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子。后一種的多肽通過例如淋巴系統(tǒng)以較低的水平產生，在骨髓瘤中以增加的水平產生。
術語“抗體”以最廣的意義使用，其包括完全地組裝的抗體、可結合抗原的抗體片段(例如，Fab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、二價抗體(diabodies))和包含前述抗體的重組肽。
此處使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體的群體中獲得的抗體，即，構成該群體的各抗體是完全相同的，除了可能天然發(fā)生的可以少量存在的突變?！翱贵w片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選地完整抗體的抗原結合或可變區(qū)部分。抗體片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二價抗體；線性抗體(Zapata等人(1995)Protein Eng 8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶降解產生兩個完全相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各片段具有單個抗原結合位點，剩余的“Fc”片段，其名稱反應其容易地結晶35的能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點并能夠交聯抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是包含完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，該區(qū)域由一條重鏈可變結構域和一條輕鏈可變結構域通過緊密的、非共價締合形成的二聚體構成。在單鏈Fv種類中，可通過柔性肽連接體將一條重鏈可變結構域和一條輕鏈可變結構域共價連接，從而可使輕鏈和重鏈以類似于雙鏈Fv種類中的形式以“二聚”結構結合。正是處于該構型，各可變區(qū)的3個CDRs相互作用，從而在VH-VL二聚體的表面上確定了抗原結合位點?？傊?，6個CDRs為抗體提供了抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含3個特異于抗原的CDRs的Fv一半)也具有識別和結合抗原的能力，但以比完整結合位點更低的親合力結合。
Fab片段也包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CH1)。Fab片段和Fab′片段的不同在于在重鏈CH1結構域的羧基端加入了少數殘基，包括一個或多個來源于抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab′-SH在此處是Fab′的名稱，在所述Fab’中，恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有游離巰基。F(ab′)2抗體片段最初作為成對的Fab′片段(在其之間具有鉸鏈半胱氨酸)產生。
可通過用生物標志物蛋白免疫原免疫合適的受試者(例如，兔子、山羊、小鼠或其他哺乳動物)來制備多克隆抗體。可通過標準技術，例如采用使用固定的生物標志物蛋白的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)在一段時間內監(jiān)控被免疫的受試者中的抗體滴度。在免疫后的合適時間點，例如當抗體滴度最高時，可從受試者獲得抗體生產細胞，并通過標準技術將其用于制備單克隆抗體，所述標準技術是例如最先由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497描述的雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 472)、EBV雜交瘤技術(Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，ed.Reisfeld和Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)或trioma技術。用于生產雜交瘤的技術是熟知的(一般參見Coligan等人，編著(1994)Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等人(1977)Nature 266550-52；Kenneth(1980)in Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY)；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402)。
作為制備單克降抗體分泌性雜交瘤的另一選擇，可通過用生物標志物蛋白篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)從而分離結合該生物標志物蛋白的免疫球蛋白文庫成員來鑒定和分離單克隆抗體。可商購(例如，the Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，Catalog No.27-9400-01；和the StratageneSurfZAP 9 Phage Display Kit，Catalog No.240612)獲得產生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒。此外，特別適合用于產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的示例可見于例如美國專利號5,223,409；PCT
發(fā)明者T·J·費希爾, D·P·馬利諾夫斯基, A·J·泰勒, M·R·帕克 申請人:三路影像公司