專利名稱：：調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物在精子染色或分選方法中的用途的制作方法調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物在精子染色或分選方法中的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及分選染色精子細(xì)胞的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及分選精子細(xì)胞的方法，其中形成含有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物的精子細(xì)胞懸浮液。發(fā)明背景通過人工授精(AI)使動(dòng)物受精以及體外受精后的胚胎移植已經(jīng)是一項(xiàng)成熟的技術(shù)。在家畜產(chǎn)業(yè)中，能夠?qū)Ψ敝辰Y(jié)果施加影響而使其后代具有一種或多種期望特征，有明顯的優(yōu)勢(shì)。例如，乳制品產(chǎn)業(yè)中如能預(yù)先選擇后代有利于雌性而保證奶牛的產(chǎn)量，則會(huì)帶來經(jīng)濟(jì)效益。將精子分離為富集的帶有X和Y染色體的細(xì)胞群，即所謂的性別富集精液或性別富集精子，便是達(dá)到后代預(yù)選目的的方法之一。為得到性別富集精液，必須將精子細(xì)胞以染料染色，然后分選為帶有X和Y染色體的細(xì)胞。染色和分選過程的每一步對(duì)于精子細(xì)胞而言都是應(yīng)激，會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞的存活力或運(yùn)動(dòng)性，特別是前向性運(yùn)動(dòng)性降低。對(duì)精子細(xì)胞尤其具有壓力的是對(duì)之染色的過程，該過程中需要將細(xì)胞與染料接觸一定時(shí)間，而且通常是在典型精子細(xì)胞環(huán)境所不常有的溫度和pH條件下。發(fā)明概述本發(fā)明的多方面之一涉及精子懸浮液，所述精子懸浮液可用于如將精子分選為帶X或Y染色體的富集精子群的方法。因此，簡(jiǎn)言之，本發(fā)明涉及這樣的染色混合物，其含有活精子、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物、以及DNA選擇性染料，所述染色混合物中組合物若為丙酮酸鹽，則其濃度大于50nM。本發(fā)明還涉及染色精子細(xì)胞的方法，所述方法包括形成這樣的染色混合物，其含有完整活精子細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物、以及DNA選擇性染料，所述染色混合物中組合物若為丙酮酸鹽，則其濃度大于50nM。附圖簡(jiǎn)述圖1以圖表顯示了實(shí)施例1中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41°CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用400Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖2以圖表顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41°CTCA緩沖液或含有10fiM維生素K的TCA緩沖液中，用400pMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖3以圖表顯示了實(shí)施例3中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41°CTCA緩沖液或含有100nM維生素K的TCA緩沖液中，用400jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖4以圖表顯示了實(shí)施例4中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41。CTCA緩沖液或含有1mM硫辛酸的TCA緩沖液中，用400Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖5以圖表顯示了實(shí)施例5中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28°CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖6以圖表顯示了實(shí)施例6中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28°CTCA緩沖液或含有100維生素K的TCA緩沖液中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖7以圖表顯示了實(shí)施例7中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28°CTCA緩沖液或含有1mM硫辛酸的TCA緩沖液中，用600jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖8以圖表顯示了實(shí)施例8中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。CTCA緩沖液、含有2.5mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液、含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液、含有25mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液以及含有50mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖9以圖表顯示了實(shí)施例9中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28°CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用20SYBR-14染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖10以圖表顯示了實(shí)施例10中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用100jiMBBC染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖11以圖表顯示了實(shí)施例11中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。CTCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用200BBC染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖12以圖表顯示了實(shí)施例12中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。C含有10mM丙酮酸鹽的TCA或含有10mM丙酮酸鹽的二氧化碳?xì)鈱影腡CA中，用600Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖13以圖表顯示了實(shí)施例12中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。C含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH7.3基于碳酸鹽的抑制性緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖14以圖表顯示了實(shí)施例12中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。C含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑緩沖液中，用600nMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖15以圖表顯示了實(shí)施例13中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。C含有10mM丙酮酸鹽的TCA且隨后用含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用1000jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖16以圖表顯示了實(shí)施例13中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28。C(1)含有10mM丙酮酸鹽的TCA且用相同溶液1比3稀釋的情況下或(2)pH7.3基于碳酸鹽的緩沖液且用pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用1000nMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖17以圖表顯示了實(shí)施例13中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于28°C含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑中，用1000jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖18以圖表顯示了實(shí)施例14中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于4rc含有10mM丙酮酸鹽的TCA且隨后用含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用300pMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖19以圖表顯示了實(shí)施例14中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41。C(1)含有10mM丙酮酸鹽的TCA且用相同溶液1比3稀釋的情況下或(2)pH7.3基于碳酸鹽的緩沖液且用pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用300nMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。圖20以圖表顯示了實(shí)施例14中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測(cè)量了于41°C含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑中，用300jiMHoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。發(fā)明詳述令人驚訝的是，與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物接觸的精子往往更能耐受多個(gè)與分選精子細(xì)胞為帶有X或Y染色體的精子富集群通常相關(guān)的步驟。因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以制備性別富集精子群用于人工授精，所述精子群在染色后或分選后的組合物中，活細(xì)胞或可運(yùn)動(dòng)精子(特別是前向性運(yùn)動(dòng)精子)的數(shù)目增多。一般而言，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物中含有可以將電子從一種底物傳遞到另一種底物的組分。此類組合物可包含獲取或提取電子的組分(氧化劑或電子受體)，或提供電子的組分(還原劑或電子供體)。對(duì)于生物系統(tǒng)而言，將調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物視為可以對(duì)化合物添加或移去氧或氫的組合物更易理解。因此，一般而言，此類組合物可含有如丙酮酸鹽、維生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黃素、醌類、超氧化物歧化酶(SOD)以及SOD模擬物。精子懸浮液中可含有此類組合物，其濃度足以實(shí)現(xiàn)保護(hù)性作用而不會(huì)對(duì)精子健康產(chǎn)生有害作用。根據(jù)諸如所用的具體組合物或懸浮液中的精子濃度等因素，例示性的濃度范圍包括從約10fiM至約50mM。例如，若組合物中含有丙酮酸鹽，則其在精子懸浮液中的濃度為約0.5nM至約50mM，優(yōu)選為約1mM至約40mM，更優(yōu)選為約2.5mM至約25mM,還更優(yōu)選為約10mM至約20mM，甚至還更優(yōu)選為約15mM，最優(yōu)選為約10mM。若組合物中含有維生素K，則其在精子懸浮液中的濃度為約1至約100HM，優(yōu)選為約10nM至約100nM，更優(yōu)選為約50nM至約100nM，最優(yōu)選為約100nM。若組合物中含有硫辛酸，則其在精子懸浮液中的濃度為約0.1mM至約1mM，優(yōu)選為約0.5mM至約1mM，更優(yōu)選為約0.5mM，最優(yōu)選為約lmM。精子懸浮液中可含有任一種上述所列的組合物實(shí)施方案，或上述所列濃度的任意組合。例如，精子懸浮液中可含有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物，所述組合物中包含濃度為約10mM的丙酮酸鹽以及濃度為約100jiM的維生素K?；蛘?，精子懸浮液中還可含有包含濃度為約10mM的丙酮酸鹽及濃度為約1mM的硫辛酸的組合物。又一精子懸浮液的實(shí)例中含有包含濃度為約10mM的丙酮酸鹽、濃度為約100nM的維生素K以及濃度為約1mM的硫辛酸的組合物。一般而言，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物可以提供保護(hù)性作用，例如在含有該組合物的精子懸浮液中增加活細(xì)胞的數(shù)目或增加可運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)目，特別是增加前向性運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)目。此類組合物對(duì)精子細(xì)胞分選方法中形成的任何懸浮液都具有保護(hù)性作用的同時(shí)，在染色步驟中其益處具有特別的價(jià)值，其中此類組合物可有助于在染色溫度升高、染料濃度增加、染色時(shí)間增長(zhǎng)或其任意組合的情況下保持精子存活力。一般而言，細(xì)胞分選方法包括一系列分離步驟，即細(xì)胞樣本的收集、細(xì)胞染色、細(xì)胞分選、分選細(xì)胞的收集、任選地和分選細(xì)胞的冷凍伸展(cryoextension)。形成的精子懸浮液中最好含有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物，或在一個(gè)或多個(gè)這些步驟中采用所述組合物。勿應(yīng)^^品W僅漠可以收集牛、豬、馬或其它哺乳動(dòng)物完整的活精子細(xì)胞并將之與運(yùn)動(dòng)抑制劑接觸。已知多種收集活精子的方法，例如，包括如手握法、使用人工陰道以及電刺激射精。例如，可以將一般每毫升含有5億至100億精子細(xì)胞的牛精子樣品，直接由來源哺乳動(dòng)物收集于含有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物的容器中，以形成精子懸浮液?；蛘撸部梢詫⒕訕悠肥占诳杖萜髦?，隨后在收集的數(shù)小時(shí)內(nèi)將之與此類組合物接觸以形成精子懸浮液。精子樣品也可混合于緩沖物(以固體或溶液形式)中，以形成緩沖精子懸浮液。其中緩沖物通過緩沖pH或滲透壓的顯著變化，可以增強(qiáng)精子存活力。一般而言，緩沖物對(duì)細(xì)胞無毒，且與用于細(xì)胞染色的染料相容。例示性的緩沖物包括如磷酸鹽、二磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽以及它們的組合。目前優(yōu)選的緩沖物包括TCA、TEST、檸檬酸鈉、HEPES、TL、TES、檸檬酸一水合物、HEPEST(Gradipore，St.Louis，MO)、PBS(Johnson等人，GameteResearch,17:203-212(1987))、以及Dulbecco，sPBS(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)?？梢曰旌弦环N或多種緩沖物或者與下文討論的添加劑一同組成緩沖溶液，并將緩沖溶液與精子樣品一同混合成緩沖精子懸浮液。緩沖液中也可含有如下文更詳細(xì)論及的一種或多種添加劑，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)月包外氧化/還原反應(yīng)的組合物。緩沖溶液的實(shí)例見表I。優(yōu)選的緩沖溶液包4舌含有3%TRIS堿、2%檸檬酸一水合物，以及1%果糖(w/v)的pH為約7.0的水溶液；表I中命名為TCA#1的溶液；以及表I中命名為TCA#2的溶液。表I.緩沖溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>青霉素-G0.15g水l升l升l升l升l升l升目標(biāo)pH7.357.357.357,357.357.35目標(biāo)滲透壓(毫摩爾滲透壓/千克~314300316298~296水)所用緩沖物的量一般取決于幾點(diǎn)考慮，例如具體的緩沖物和緩沖精子懸浮液中且的精子濃度(精子數(shù)/ml)。因此，將使用足量緩沖物從而達(dá)到期望濃度的精子勿ml?？梢约尤刖彌_物以實(shí)現(xiàn)精子懸浮液中含有約lxl03精子/ml至約5xl(^精子/ml。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可加入緩沖物以獲得"相對(duì)低，，濃度精子的精子懸浮液，即加入緩沖物以實(shí)現(xiàn)精子懸浮液中含有少于約lxl0"精子/ml，優(yōu)選少于約lxl()S精子/ml，更優(yōu)選約^103精子/ml至約5xl06精子/ml，還更優(yōu)選約lxl()3精子/ml至約lxl()6精子/ml，甚至更優(yōu)選lxlO"精子/ml至約lxl()5精子/ml，最優(yōu)選約lxl()S精子/ml。在可選的實(shí)施方案中，可加入緩沖物以獲得"中間，，濃度精子的精子懸浮液，即加入緩沖物以實(shí)現(xiàn)精子懸浮液中含有約lxl(T至約lxl()S精子/ml。又在另一實(shí)施方案中，可加入緩沖物以獲得"相對(duì)高，，濃度精子的精子懸浮液，即加入緩沖物以實(shí)現(xiàn)精子懸浮液中含有多于約lxl()8精子/ml,優(yōu)選約lxl08精子/ml至約5xl(^精子/ml，更優(yōu)選約1.5xl0S精子/ml至約2xl0"精子/ml，甚至更優(yōu)選1.5xl()S精子/ml至約2xl()S精子/ml，還更加優(yōu)選約1.5xl()S精子/ml。確定所用緩沖物量(即該緩沖精子懸浮液是否將具有"相對(duì)低"、"中間"或"相對(duì)高"濃度的精子)的另一點(diǎn)考慮，包括隨后分選或富集精子細(xì)胞所用的方法。例如，可以利用如下文更為詳述的流式細(xì)胞術(shù)分選精子細(xì)胞。在這種情況下，緩沖精子懸浮液一般為"中間"或"相對(duì)高"濃度的精子/ml。其它分選或富集技術(shù)可能在精子細(xì)胞濃度較低時(shí)更利于使用，例如標(biāo)有標(biāo)記(如此處所述的染料和標(biāo)記)的"相對(duì)低"濃度的精子細(xì)胞?？蛇x地，也可以將精子與抑制性緩沖物混合，以形成受抑的精子懸浮液。抑制性緩沖物通過模擬哺乳動(dòng)物附睪或附睪管內(nèi)的液體環(huán)境，使精子細(xì)胞仿效哺乳動(dòng)物(如公牛)附睪中的精子細(xì)胞。此類緩沖液會(huì)降低或抑制精子的運(yùn)動(dòng)或代謝活性。例示性的該類緩沖物包括基于碳酸鹽的緩沖物，如Salisbury&Graves,丄/^/7/w/./^W/,，6:351-359(1963)中公開的那些。此類中的優(yōu)選緩沖物為每25ml純水中含有0.204gNaHC03、0.433gKHC03和0.473gC6H807H20(NaHC030.097mol/L、KHC030.173mol/L、C6H807.H200.090mol/L的水溶液)。此外，受抑精子懸浮液中還可含有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。除了緩沖物之外，精子懸浮液中也可含有一系列添加劑以增強(qiáng)精子存活力或運(yùn)動(dòng)性，或提供其它益處。例示性的添加劑包括能源、蛋白質(zhì)源以及抗生素?？梢栽诰彌_精子懸浮液形成前，向緩沖物或緩沖溶液中加入一種或多種此類添加劑；或者也可分別將其加入精子懸浮液中?？梢约尤胍环N或多種能源，以最大程度降低或抑制精子細(xì)胞中胞內(nèi)磷脂及其它細(xì)胞組分的氧化。能源的實(shí)例包括單糖(如果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)和雙糖(如蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖)，以及其它多糖。例如，產(chǎn)生的精子懸浮液中可含有約1%(w/v)至約4%(Wv)的能源。若含有能源，則能源優(yōu)選果糖，且精子懸浮液中含有量約2.5%(w/v)。緩沖物、緩沖溶液、精子懸浮液或緩沖精子懸浮液中也可含有蛋白質(zhì)源，以最大程度減小稀釋震蕩、為細(xì)胞提供支持或在整個(gè)懸浮液中分散細(xì)胞。例示性的蛋白質(zhì)源包括卵黃、卵黃提取物、乳(包括熱勻漿和脫脂乳乳)、乳提取物、大豆蛋白、大豆蛋白提取物、血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清替代物增補(bǔ)劑以及它們的組合。白蛋白特別是牛血清白蛋白(BSA),是優(yōu)選的蛋白質(zhì)源。例如，若含有BSA，則精子懸浮液中的BSA含量可少于約5.0%(w/v)，優(yōu)選少于約2%(w/v)，更優(yōu)選少于約1%(w/v),而最優(yōu)選其量為約0.1%(w/v)。單獨(dú)使用蛋白質(zhì)源(如BSA),可能會(huì)起始懸浮液中百分之一精子細(xì)胞的獲能過程。該過程優(yōu)選發(fā)生于雌性生殖道內(nèi)。因此，為了抑制稀釋過程以及隨后的染色和分選期間獲能的起始，精子懸浮液中可含有備選蛋白質(zhì)源或蛋白質(zhì)替代物。所述的備選蛋白質(zhì)源或蛋白質(zhì)替代物除了能夠抑制精子懸浮液中更大百分比的細(xì)胞起始獲能，還具有典型蛋白質(zhì)源(如BSA)的優(yōu)點(diǎn)。備選蛋白質(zhì)源的實(shí)例包括人血清替代物增補(bǔ)劑(SSS)(IrvineScientific,SantaAna，CA)以及膽固醇強(qiáng)化的BSA，而蛋白質(zhì)替代物的實(shí)例包括聚乙烯醇，例如一般分子量為約30,000至約60,000的低至中粘度聚乙烯醇。一般而言，若含有這些組合物，其含量與上述BSA的量相同；緩沖物或緩沖溶液中總白蛋白含量一般不超過約5.0%(w/v)。可以向精子懸浮液或緩沖精子懸浮液中加入抗生素，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。例示性的抗生素包括如，泰樂菌素、慶大霉素、林可霉素、壯觀霉素、利高霉素Linco-Spectii^(林可霉素羥氯化物-壯觀霉素)、青霉素、鏈霉素、替卡西林(ticarcillin)或其任意組合物。抗生素的濃度可為每ml精子中約50網(wǎng)至約800jig(不論精子是否為純凈的、緩沖性的或含有其它物質(zhì)，例如此處提及的任一種添加劑)。CertifiedSemenServices(CSS)和美國(guó)國(guó)家動(dòng)物育種協(xié)會(huì)(NAAB)已經(jīng)頒布了有關(guān)抗生素在精子收集和使用中應(yīng)用的綱要。法。一般而言，精子細(xì)胞染色方法中可包括形成染色混合物(有時(shí)稱為標(biāo)記混合物)，其中含有完整的活精子細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物，以及染料(有時(shí)稱為標(biāo)記)。在本發(fā)明的這一方面，可以將組合物與精子細(xì)胞接觸以形成精子懸浮液，然后將精子懸浮液與DNA選擇性染料相接觸。在該實(shí)施方案中，精子來源可為純精子，或者為通過離心或使用其它手段分離精子級(jí)分而得到的含有精子的精子衍生物。一經(jīng)獲得，則可以以純精子的形式、或者以由之獲得的懸浮液形式(例如上文"細(xì)胞樣品收集"中討論的精子懸浮液或緩沖精子懸浮液)將精子細(xì)胞引入染色混合物中。染料可以為純固體或液體組合物的形式。也可將染料溶解或分歉于非緩沖液體中以形成染料溶液，或者，染料還可以為染料懸浮液的形式，其中含有染料以及與精子細(xì)胞生物相容的緩沖物或緩沖溶液。上文"樣品收集，，中業(yè)已討論了多種緩沖物和緩沖溶液的實(shí)例。例如，可用的緩沖物包括含有3%TRIS堿、2%檸檬酸一水合物和1。/。果糖(w/v)的pH為約7.0的水溶液；或者每25ml純水中含有0.204gNaHC03、0.433gKHCO;j和0.473gC6H807.H20(NaHC030.097mol/L、KHC030.173mol/L、C6H807.H200.090mol/L的水溶液)基于碳酸鹽的緩沖溶液。因此，例如，可以通過將成染色混合物?；蛘?，也可以通過將純精子與緩沖物或緩沖溶液、染料以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物混合，形成染色混合物。此外，還可將精子懸浮液與染料混合形成染色混合物。如以前在美國(guó)專利號(hào)5，135，759和WO02/41906中所述，可4吏用一種或多種可經(jīng)UV或可見光激發(fā)的選擇性DNA染料可以形成染色混合物。經(jīng)紫外光(UV)激發(fā)的選擇性染料實(shí)例包括Hoechst33342和Hoechst33258，二者均可由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)購得。經(jīng)可見光激發(fā)的例示性染料包括可購于MoleqilarProbe,Inc.(Eugene,OR)的SYBR-14，以及WO02/41906中所描述的雙苯甲亞胺-BODIPY⑧綴合物6國(guó)([3-((2Z)-2-([l-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-lH-吡咯-2-基〗亞曱基)-27y-吡咯-5隱基)丙?；?氨基}-1\-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1仏3，^-2，5，-雙苯并咪唑-2，-基苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺("BBC")。這些染料中的每一種都可以單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用；或者，也可以將其它具有細(xì)胞滲透性的UV和可見光激發(fā)的染料單獨(dú)或與前述染料聯(lián)合使用，只不可接受的不良影響?；蛘撸€可利用熒光聚酰胺形成染色混合物，更具體而言是利用綴合有熒光標(biāo)記或報(bào)告子的聚酰胺。此類標(biāo)記在結(jié)合于核酸時(shí)會(huì)發(fā)出熒光。連接有熒光標(biāo)記或報(bào)告子的聚酰胺實(shí)例包括，如Best等人，尸roc.Vfl".5W.t/5^，100(21):12063-12068(2003);Gygi等人，A^/c/"c^"Vfe及仏，30(13):2790-2799(2002);美國(guó)專利號(hào)5,998,140;美國(guó)專利號(hào)6，143，卯1以及美國(guó)專利號(hào)6,090,947中所公開的那些，其中每一篇內(nèi)容均在此處引用作為參考。萸光核苷酸序列也可用于標(biāo)記精子細(xì)胞。此類核苷酸序列在與含有靶序列或互補(bǔ)序列的核酸雜交時(shí)會(huì)發(fā)出焚光，但在非雜交狀態(tài)時(shí)則不會(huì)發(fā)出熒光。此類核苷酸公開見于如美國(guó)專利申請(qǐng)^^開號(hào)2003/0113765(此處引用作為參考)。性別特異性抗體也可用于標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。例如在該實(shí)施方案中，性別特異性抗體可綴合于熒光部分(或等價(jià)報(bào)告分子)。由于抗體結(jié)合的抗原只存在于帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞上，根據(jù)其熒光(相對(duì)于無熒光的未標(biāo)記細(xì)胞)能夠選擇性地鑒定此類細(xì)胞。此外，可以同時(shí)使用分別與不同熒光部分相連的一種以上的性別特異性抗體。從而能根據(jù)帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞間的不同熒光，對(duì)之進(jìn)行區(qū)分。也可使用發(fā)光的色彩選擇性納米晶體標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。這些顆粒也稱為量子點(diǎn)，正如美國(guó)專利號(hào)6,322,901和美國(guó)專利號(hào)6,576,291所述為本領(lǐng)域所公知(均在此處引用作為參考)。這些納米晶體已被綴合于多種生物學(xué)材料，包括如肽、抗體、核酸、鏈霉親和素及多糖(見如美國(guó)專利號(hào)6，207，3926,423,551、5，9卯，479和6,326,144,均在此處引用作為參考)，且已用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)(見如美國(guó)專利號(hào)6,207,392和6,247,323，兩者均在此處引用作為參考)。染色混合物中DNA選擇性染料的濃度優(yōu)選為一系列變量的函數(shù)，所述變量包括細(xì)胞對(duì)于所選染料的滲透性、染色混合物的溫度、完成染色所需要的時(shí)間量、以及隨后的分選步驟中所期望的富集程度。一般而言，優(yōu)選的染料濃度足以在適度短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到所期望的染色程度，而不會(huì)對(duì)精子存活力產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的不良影響。例如，Hoechst33342、Hoechst33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約0.1pM至約1.0M之間，優(yōu)選為約0.1nM至約700jiM，更優(yōu)選為約100nM至約200jiM。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，Hoechst33342、Hoechst33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約400jiM至約500nM，最優(yōu)選為約450HM。因此，在一種染色條件^殳置下，Hoechst33342的濃度優(yōu)選為約100jiM。在另一種染色條件設(shè)置下Hoechst33342的濃度為約150jiM。又在另一種染色條件設(shè)置下，濃度優(yōu)選為約200pM。而在另一種染色條件設(shè)置下，Hoechst33342的濃度最優(yōu)選為約450nM。又例如，熒光聚酰胺的濃度(例如美國(guó)申請(qǐng)發(fā)明者C·L·路德維格,J·A·格雷厄姆,K·S·克勞利,M·安扎爾申請(qǐng)人:英格朗公司