專利名稱：防止aav載體聚集的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備和存儲防止聚集的AAV病毒粒子的組合物和方法。
背景技術(shù)：
重組腺相關(guān)病毒(rAAV)是用于人基因轉(zhuǎn)移的遠景載體。Grimm，D.和Kleinschmidt，J.A.(1999)Hum Gene Ther.102445-2450；High，K.A.(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.95364-67；Pfeifer，A.和Verma，I.M.(2001)Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2177-211。AAV是細小病毒科依賴病毒屬的成員。AAV血清型2(AAV2)由編碼兩側(cè)為末端反向重復(ITR)序列的復制(rep)和殼體化(cap)基因的4680個核苷酸的單鏈DNA分子構(gòu)成。Bers，K.I.(1996)Fields Virology(B.N.Fields等編輯)，pp.2173-2197。Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia?；蚪M由三個殼體蛋白(VP1、VP2和VP3)包裝，殼體蛋白是cap基因產(chǎn)物的氨基末端變體。所得到的二十面病毒顆粒具有～26nm的直徑。已經(jīng)報道了AAV2高度溶解的晶體結(jié)構(gòu)。Xie，Q等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9910405-10410。
純化AAV2病毒顆粒的溶解度是有限的，已經(jīng)描述了AAV2顆粒聚集是一個問題。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy 81281-1290；Huang，J.等(2000)Mol.Therapy 1S286；Wright，J.F.等(2003)Curr.Opin.Drug Disc.Dev.6174-178；Xie，Q.等(2004)J.Virol.Methods 12217-27。在常用的緩沖鹽水溶液中，1013顆粒/mL的濃度產(chǎn)生顯著的聚集，且在更高的濃度聚集增強。Huang和合作者報道了AAV載體經(jīng)受濃度依賴性的聚集。Huang，J.等，(2000)Mol.Therapy 1S286。Xie和合作者(Xie，Q.等(2004)J. Viral.Methods 12217-27)類似地報道了在超過0.1mg/ml的濃度，AAV2載體需要提高濃度的鹽來防止聚集。AAV2載體在常用中性緩沖溶液如磷酸鹽-和Tris-緩沖鹽水中顆粒濃度超過1013顆粒/mL產(chǎn)生聚集。這對應(yīng)于～0.06mg/mL的蛋白質(zhì)濃度，且強調(diào)這些條件下AAV2的低溶解度。對于使用柱色譜技術(shù)純化的載體，有效的載體濃度極限甚至更低，因為共同純化了過量的空殼體并歸因于顆粒濃度。
顆粒聚集對于腺病毒載體同樣是顯著的且是沒有完全解決的問題。最近報道了最新建立的腺病毒參照材料(ARM)的穩(wěn)定性。Adadevoh，K.等(2002)BioProcessingl(2)62-69。通過動態(tài)光散射、光子關(guān)聯(lián)能譜法和外觀來測量配制于pH8.0的20mM Tris，25mM NaCl和2.5％甘油中的參照材料的聚集。觀察三次凍-融循環(huán)或非冰凍存儲后載體聚集的可變水平，形成使用ARM的限制性實施方案。
聚集可能導致純化過程中的損耗和純化載體制劑測試中的不一致性。將AAV2載體在體內(nèi)給藥于特定部位，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可能需要小體積的高度濃縮載體，且最大可獲得的劑量受到低載體溶解度的限制。
載體聚集似乎還影響體內(nèi)給藥后的生物分布，并導致給藥后對載體的不利免疫應(yīng)答。如對于蛋白質(zhì)已經(jīng)報道的(Braun，A.等，(1997)Pharm.Res.141472-1478)，通過將載體對準抗原遞呈細胞并誘導對殼體蛋白和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物提高的免疫應(yīng)答，載體的聚集提高了免疫原性。臨床前(Chenuaud，P等(2004)Blood 1033303-3304；Flotte，T.R.(2004)Human Gene Ther.15716-717；Gao，G等，(2004)Blood 1033300-3302)和臨床(High，K.A.等，(2004)Blood 104121a)研究中對AAV載體免疫應(yīng)答的報道說明了需要解決引起載體免疫原性的所有因素。
表征純化載體的測試實驗方案似乎也受到載體聚集的影響。報道了載體感染性滴定度的測定對載體聚集高度敏感。Zhen，Z.等(2004)Human Gene ther.15709-715。重要的關(guān)注是載體聚集在體內(nèi)給藥后具有不利后果，因為它們的轉(zhuǎn)導效率、生物分布和免疫原性不同于單體顆粒。例如，將AAV載體脈管內(nèi)傳送至肝細胞需要穿過肝竇狀隙網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞層的載體。這些網(wǎng)狀布局具有50至150nm的半徑(Meijer，K.D.F.和Molema，G(1995)Sem.Liver Dis.15206)，預測該半徑使得單體AAV載體(直徑～26nm)能夠通過，但阻止較大載體聚集物的通過。小鼠體內(nèi)生物分布研究中，用熒光分子Cy3標記的聚集AAV2載體在脈管傳送后隔絕于肝巨噬細胞中。Huang，J.等(2000)Mol.Therapy lS286。
對于基于病毒的基因轉(zhuǎn)移載體的制劑研發(fā)是相對近期的研究領(lǐng)域，且只有少數(shù)描述最佳化AAV載體制劑和穩(wěn)定性的系統(tǒng)努力的研究得到了報道。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy 81281-1290；Wright，J.F.等(2003)Curr.Opin.DrugDisc.Dev.6174-178；Xie，Q.等(2004)J.Virol.Methods 12217-27。與最小化載體制劑改變的臨床前和臨床應(yīng)用相適的定義制劑是一貫獲得高度載體安全性和功能特征的重要要求。如對于蛋白質(zhì)治療公知的(Chen，B.等(1994)J. Pharm.Sci.831657-1661；Shire，S.J.等(2004)J. Pharm.Sci.931390-1402；Wang，W.(1999)Int.J. Pharm.185129-188；Won，C.M.等，(1998)Int.J.Pharm.16725-36)，載體穩(wěn)定性的重要方面是制備和存儲過程中的穩(wěn)定性，載體聚集是需要徹底解決的問題。載體聚集導致載體純化過程中的損耗，盡管可以通過過濾來除去聚集物，但當生產(chǎn)用于臨床前和臨床研究的載體時，產(chǎn)量損耗導致較高的成本和產(chǎn)量限制。甚至在過濾除去聚集物后，在緩沖鹽溶液中的濃縮AAV2載體制劑中形成新的聚集物。
存在對防止病毒顆粒聚集的用于純化和存儲AAV2載體如rAAV2的改良制劑和方法的需要。

發(fā)明內(nèi)容
通過本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中的上述這些和其它需要，本發(fā)明提供了用于制備和存儲AAV載體的高離子強度溶液，該AAV載體保持高感染性滴定度和轉(zhuǎn)導效率，甚至在凍-融循環(huán)后也是如此。
在本發(fā)明的一個方面中，涉及防止病毒粒子制劑中病毒粒子聚集的方法，該方法通過加入賦形劑來獲得足以防止聚集的離子強度。本發(fā)明的另一方面中，涉及具有足以防止聚集的離子強度的病毒粒子組合物。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述離子強度至少為約150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、600mM、700mM或更高。在一些實施方案中，使用含有一種或多種多價離子例如檸檬酸鹽、硫酸鹽、鎂或磷酸鹽的賦形劑來獲得這些離子強度。
在其它一些實施方案中，將病毒粒子制劑的摩爾滲透壓濃度維持于接近等滲水平，例如，200mOsm、250mOsm、280mOsm、300mOsm、350mOsm或400mOsm，即使離子強度足夠高來防止病毒粒子聚集。
在一些實施方案中，病毒粒子是腺相關(guān)病毒(AAV)的病毒粒子，例如AAV-2。
在本發(fā)明方法的其他一些實施方案中，用核酸酶例如Benzonase來處理病毒粒子的制劑。在進一步的實施方案中，將核酸酶處理與賦形劑的加入相結(jié)合，其中該賦形劑的加入獲得足以防止聚集的離子強度。
在本發(fā)明的一些實施方案中，將表面活性劑PluronicF68加入病毒粒子制劑中，例如至0.001％。在一個實施方案中，組合物包括純化的病毒顆粒、10mM Tris pH8.0、100mM檸檬酸鈉和0.001％的PluronicF68。
在一個實施方案中，可以將AAV載體作為本發(fā)明的組合物來存儲，濃度超過1×1013vg/mL，例如，2×1013、3×1013、4×1013、5×1013和高達6.4×1013vg/mL，而沒有顯著聚集。在一些實施方案中，使用本發(fā)明的方法和組合物存儲的AAV載體在4℃存儲5天時沒有呈現(xiàn)顯著的聚集。在其他實施方案中，作為這樣組合物存儲的AAV載體在-20℃或-80℃的一個、五個、十個或更多凍-融循環(huán)后沒有呈現(xiàn)顯著的聚集。
在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物存儲的病毒粒子制劑所呈現(xiàn)的平均顆粒半徑(Rh)(如通過動態(tài)光散射來測得的)表明沒有發(fā)生病毒粒子的顯著聚集。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物存儲的病毒粒子制劑呈現(xiàn)高于約15nm、20nm或30nm的平均顆粒半徑(Rh)。
在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物存儲的病毒粒子制劑在通過0.22μm濾器的過濾后回收的病毒粒子高于約85％、90％或95％。
在再一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明高離子強度制劑的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包括預先混合的賦形劑溶液。在另一實施方案中，所述試劑盒包括兩種或更多種分開的本發(fā)明高離子強度組合物的部分，通過使用者來混合。在一些實施方案中，所述試劑盒包括檸檬酸鈉、Tris和PluronicF68。在其他實施方案中，所述試劑盒進一步包括制備組合物或進行本發(fā)明方法的說明書。


圖1A和1B呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明了AAV2-FIX顆粒聚集作為各種緩沖組合物的摩爾滲透壓濃度(圖1A)或離子強度(圖1B)的函數(shù)。通過實施例1的方法2來制備AAV2-FIX載體。用10mM pH7.5的磷酸鈉緩沖的不同濃度的賦形劑稀釋載體后通過動態(tài)光散射(DLS)來測量平均顆粒半徑。所述賦形劑包括氯化鈉( )、檸檬酸鈉( )、磷酸鈉( )、硫酸鈉( )、硫酸鎂( )和甘油( )。
圖2呈現(xiàn)了AAV2-FIX聚集作為純化方法的函數(shù)的數(shù)據(jù)。用10mMpH7.5磷酸鈉緩沖的不同濃度的氯化鈉稀釋載體后通過動態(tài)光散射(DLS)來測量平均顆粒半徑。通過方法1(雙CsCl梯度)( )；方法2(陽離子交換色譜)( )；方法2加核酸酶消化( )；或方法3(色譜加上一個CsCl梯度)來純化載體。純化方法1-3描述于實施例1中。
圖3呈現(xiàn)了在高離子強度制劑( )或?qū)φ罩苿? )中制備并存儲的rAAV2-AADC病毒粒子轉(zhuǎn)導的D7/4細胞轉(zhuǎn)基因表達的數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)導后72小時通過ELISA來測量AADC的濃度(每個數(shù)據(jù)點重復三次)。誤差范圍表示標準偏差。
具體實施例方式
通常在載體的濃縮制劑中觀察到AAV2載體聚集并影響純化回收以及體內(nèi)的功效和安全性。因此，對于發(fā)展AAV2載體的重要目的是鑒定制備濃縮儲液時防止載體聚集的方法和制劑。
除非另外指出，如在此所用的術(shù)語“載體”指的是重組AAV病毒粒子或病毒顆粒，而不像在其他內(nèi)容中通常使用的“載體”那樣還指非病毒DNA分子(如質(zhì)粒)。
本發(fā)明部分基于如下觀察溶液離子強度是AAV載體聚集中的重要參數(shù)，意味著涉及聚集過程中病毒顆粒之間的離子相互作用。升高的離子強度提高了AAV2載體的溶解度與帶電賦形劑性質(zhì)無關(guān)的這一觀察支持了溶液離子強度本身(而非涉及特定離子物質(zhì)的相互作用)是相關(guān)的物理-化學參數(shù)的假設(shè)。防止在此研究的載體顆粒濃度的聚集需要至少200mM的極限離子強度。
實際應(yīng)用中，常用的緩沖鹽溶液具有的離子強度不足以防止?jié)舛瘸^1013顆粒/mL的AAV2載體的聚集。已知高鹽濃度提高AAV2載體的溶解度(例如，從梯度回收的高度濃縮AAV2載體通常在濃縮CsCl中保持溶解)。然而，用于臨床前和臨床研究的最佳制劑應(yīng)當接近于等滲(280-400mOsm)，尤其是對于將載體體內(nèi)給藥于高滲溶液稀釋緩慢的部位。在本發(fā)明的實施方案中，將離子強度和電荷價的指數(shù)關(guān)系用于發(fā)展具有高離子強度的等滲制劑。通常用作人非腸道制劑中賦形劑的具有多電荷價的鹽物質(zhì)(例如，硫酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽)以等滲濃度使用時可以提供防止AAV2載體聚集需要的離子強度水平。盡管等滲(150mM)氯化鈉具有150mM的離子強度，該數(shù)值不足以維持高載體濃度下AAV2溶解度，等滲檸檬酸鈉具有～500mM的離子強度，可以支持至少6.4×1013vg/ml的AAV2載體濃度而沒有聚集。
不希望受到理論的限制，AAV2顆粒的低溶解度是由高度對稱性質(zhì)結(jié)合聚集物中臨近顆粒之間互補電荷部分的穩(wěn)定效果而引起的?；贏AV2晶體結(jié)構(gòu)的表面電荷密度(Xie，Q.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9910405-10410)揭示了病毒表面上正電荷和負電荷的模式。之前的報道表明AAV2載體聚集是pH依賴性的，其假設(shè)了具有帶電側(cè)基的氨基酸涉及顆粒間結(jié)合。Qu，G等，(2003)Mol.Therapy7S238。這些報道假設(shè)了如果帶電的氨基酸側(cè)鏈涉及載體聚集，高濃度的游離氨基酸可以阻止載體顆粒的相互作用。然而，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有帶電側(cè)鏈的氨基酸在防止AAV2載體聚集中是無效的，超過它們對離子強度的貢獻。
還發(fā)現(xiàn)通過純化載體顆粒的有效核酸酶處理降低了但沒有防止低離子強度的載體聚集。純化過程早期的消化(澄清的HEK細胞裂解物)在載體純化后沒有降低聚集。大概是由于酶與核酸底物較高的比例，已經(jīng)純化的病毒粒子的消化更有效。解釋這些結(jié)果的一種機理是結(jié)合載體表面的殘余核酸雜質(zhì)(例如，宿主細胞和質(zhì)粒DNA)可以橋接至臨接病毒顆粒上的結(jié)合位點并因此引起聚集。已經(jīng)報道純化的AAV2載體(無空殼體)含有約1％的非載體DNA。Smith，P.等，(2003)Mol.Therapy 7S348。盡管報道了這種非載體DNA＞50％是核酸酶抗性的，且包裝于殼體顆粒中，一些雜質(zhì)DNA是核酸酶抗性的且似乎與純化的載體顆粒表面相連。有效核酸酶處理可以降低載體聚集的觀察表明不高于每個載體顆?！?5個核苷酸平均水平的與載體表面相連的核酸引起AAV載體聚集。
總之，在AAV2載體純化和最終的配制過程中高離子強度溶液的使用，和殘余載體表面DNA的有效去除是獲得用于臨床前和臨床研究中的高度濃縮AAV2溶液的兩種有效策略。高離子強度溶液和核酸酶處理可以結(jié)合使用或分開使用。盡管使用AAV2載體獲得了數(shù)據(jù)，本發(fā)明的組合物和方法對于其他AAV血清型/變體或其他病毒載體如腺病毒、晶狀體病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒也是有用的。
AAV聚集為賦形劑濃度的函數(shù)進行初始篩選實驗來闡明AAV載體聚集的機理并鑒定可以降低/防止聚集的賦形劑的類別。載體聚集可以由低濃度緩沖液(20mM磷酸鈉，pH7.2)的中性緩沖鹽水中載體的稀釋(5倍)引起。使用該“稀釋-應(yīng)力”方法來篩選賦形劑以鑒定包括于稀釋劑中時能夠防止載體聚集的賦形劑。為了篩選，通過動態(tài)光散射(DLS)來測量聚集。所研究賦形劑的類別包括選定的無機鹽、氨基酸、不帶電的碳水化合物和表面活性劑。結(jié)果呈現(xiàn)于表1中。
表1使用稀釋-應(yīng)力方法來篩選防止AAV2載體聚集的賦形劑

NIA沒有聚集抑制如表1中所說明的，當以足夠的濃度存在時，帶電的賦形劑(無機鹽和氨基酸)防止了聚集。然而，防止載體聚集所需要的鹽濃度是不同的，對于硫酸鎂為180mOsm，對于氯化鈉為320mOsm。氨基酸精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸和賴氨酸在200mOsm沒有防止聚集，但是賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在300-320mOsm防止了聚集。精氨酸、甘氨酸和組氨酸在200mOsm以外的濃度沒有測試。當以高達5％w/v的濃度存在時，選定的碳水化合物對載體顆粒聚集沒有效果。例如，5％w/v的甘油(543mOsm)沒有防止聚集。表面活性劑聚山梨酸酯80(1％w/v)和PluronicF68(10％w/v)使用“稀釋-應(yīng)力”方法相似地對聚集沒有效果。
AAV聚集作為摩爾滲透壓濃度和離子強度的函數(shù)圖1A和1B表明了載體聚集隨各種鹽濃度函數(shù)的更詳細分析的結(jié)果。圖1A表明了載體聚集為選定賦形劑摩爾滲透壓濃度的函數(shù)。對于帶電的物質(zhì)，觀察到AAV2載體聚集濃度依賴性的抑制。多價離子的鹽在低于單價氯化鈉的濃度獲得相似的聚集抑制程度。例如，200mOsm的硫酸鎂防止了聚集，而氯化鈉需要350mOsm來獲得相似的效果。檸檬酸鈉、硫酸鈉和磷酸鈉在防止載體聚集的效力中處于中間。
盡管圖1A和表1的結(jié)果表明高達5％濃度的甘油和特定的糖對低離子強度引起的AAV2載體聚集沒有效果，數(shù)據(jù)沒有排除甘油濃度高于5％時AAV2溶解度的提高。例如，Xie和合作者報道了25％(w/v)的甘油能夠使低離子強度溶液中的AAV2濃度達到非常高的濃度(4.4至18×1014顆粒/mL)。Xie，Q等，(2004)J. Virol.Methods 12217-27。
對于每種賦形劑，除了摩爾滲透壓濃度以外，圖1B顯示了圖1A的數(shù)據(jù)作為所計算離子強度函數(shù)的曲線。圖1B證明了當離子強度是～200mM或更高時防止了載體聚集，與使用哪種鹽無關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明溶液的離子強度(μ)(其為取決于溶質(zhì)濃度和電荷價兩者的參數(shù))是影響聚集的主要因素。
本發(fā)明實施方案中防止聚集有用的離子強度包括，例如，250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、600mM、700mM或更高的離子強度。在本發(fā)明的方法和制劑中優(yōu)選多價離子來獲得這些離子強度，如二價、三價、四價、五價離子和甚至更高價的離子。本發(fā)明溶液和制劑中的pH緩沖劑可以是磷酸鹽、Tris或HEPES(或其他Good’s緩沖劑)，但可以使用任何其他的合適pH緩沖劑。優(yōu)選實施方案中，選擇多價離子和緩沖劑與目標組織相容用于待制備的載體。
本發(fā)明方法和組合物中多價離子的使用使得可以形成高離子強度但摩爾滲透壓濃度相對低的組合物。本發(fā)明的高離子強度組合物可以接近等滲，并可以是，例如，約200mOsm、250mOsm、280mOsm、300mOsm、350mOsm或400mOsm，盡管其他摩爾滲透壓濃度對于組合物的一些用途也是可接受的。
AAV聚集作為AAV純化方法的函數(shù)期望使用不同方法(例如，密度梯度純化對離子交換色譜)純化的重組AAV2具有不同的雜質(zhì)特征。圖2表明了對于純化方法不同的幾種AAV制劑，載體聚集作為離子強度的函數(shù)。純化方法描述于實施例1中。使用氯化鈉來改變離子強度。通過雙氯化銫梯度超速離心(方法1)，通過陽離子交換柱色譜(方法2)，或通過結(jié)合的柱和氯化銫梯度超速離心(方法3)純化的AAV2-FIX載體各自證明了隨著離子強度降低相似的聚集響應(yīng)。相反，通過柱方法純化然后接受核酸酶消化步驟(方法2+核酸酶)的AAV2-FIX表明在低離子強度時聚集降低。
制備規(guī)模的AAV聚集表1以及圖1A、1B和2中的數(shù)據(jù)涉及分析級的載體聚集，使用DLS來測量聚集。相反，表2表明了升高的離子強度和核酸酶處理對更大規(guī)模AAV2載體聚集的效果，使用誘導和定量與制備級載體純化相關(guān)的載體聚集的方法。實施例2中提供了實驗的詳細內(nèi)容。將純化的AAV載體滲濾至各種離子強度的溶液中，降低體積來獲得高載體濃度，然后測量通過0.22μm濾器過濾后的載體回收來測量聚集。將通過第二個CsCl梯度離心步驟的方法1純化的AAV2-AADC載體單個集合的等份試樣(91mL中1.8×1015vg，1.8×1013vg/mL，～3MCsCl中)用作滲濾實驗中的起始原料。使用空心纖維的切向流過濾用于滲濾，因為其是可升級的且仍然能夠制備體積(分鐘.1.4mL)，并因此能夠制備AAV濃度，期望在中性緩沖鹽水中在該濃度聚集。
在實驗1中，將三個空心纖維裝置用于滲濾制劑CF、TF1或TF2中的AAV2-AADC載體，且將體積減少至2.5×1013vg/mL的目標。參見實施例2。然后將樣品通過0.22μm的濾器進行過濾。結(jié)果顯示于表2中。對于升高離子強度的制劑TF1(95±7.4％)和TF2(93±7.4％)的載體回收(“收率％”)顯著高于使用對照制劑CF(77±6.6％)所回收的。
表2處理級的AAV載體回收

在實驗2中，將AAV2-AADC在CF或TF2中濃縮至較高的目標值(6.7×1013vg/mL)。使用TF2(96±4.4％)的載體回收再次顯著高于使用CF所回收的(59±6.0％)。在所用測試的可變性內(nèi)，在使用TF2的兩個目標濃度全部回收了載體，表明聚集得到了防止。相反，在使用CF的兩個目標濃度觀察到顯著聚集，且聚集的程度(即，0.22μm過濾后的損耗)在較高的目標載體濃度較高。在另一實驗中(未顯示)，在實驗2的濃縮后但在0.22μm過濾步驟之前取出50μL的AAV2載體樣品，并通過光學顯微鏡來檢測。CF中濃縮的載體含有明顯量的可見物質(zhì)(未顯示)，然而在TF2中濃縮的載體中沒有看到這樣的物質(zhì)。
實驗3研究了純化載體預先核酸酶消化對聚集的效果。核酸酶消化不存在時，CF中AAV2-AADC回收為68±11％，與實驗1和2中的回收相似。相反，用核酸酶處理純化的載體，然后在CF中濃縮，獲得較高的回收(91±12％)。這些制備級結(jié)果反映出圖2中所示的使用“稀釋-應(yīng)力”(分析級)方法的核酸酶消化的相同結(jié)果。
表2中呈現(xiàn)的結(jié)果證明了本發(fā)明的方法和組合物提高了AAV載體的回收。例如，本發(fā)明的各種實施方案中，將回收從低于約80％提高至至少約85％、90％、95％或更高。
存儲或凍-融循環(huán)后的AAV穩(wěn)定性和活性Croyle和合作者報道了在磷酸鈉緩沖液中多次凍-融循環(huán)后AAV和腺病毒滴定度的顯著損耗，并證明了凍-融循環(huán)中通過磷酸鉀提供的較好的pH緩沖防止了滴定度損耗。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy81281-1290。我們使用磷酸鈉的凍-融穩(wěn)定性研究的結(jié)果支持這些發(fā)現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)盡管150mM的磷酸鈉提供了足夠的離子強度來防止?jié)饪sAAV2-AADC載體在制備和非冷凍存儲過程中的聚集，但是-20℃或-80℃的單次凍-融循環(huán)導致聚集。
在如下的本發(fā)明緩沖劑中測試存儲或凍-融(F/T)循環(huán)后的AAV穩(wěn)定性。將CF、TF1和TF2中制備的濃縮載體(表2，實驗1)接受短的穩(wěn)定性研究來調(diào)查研究是否在冷凍存儲過程中或在多次凍-融(F/T)循環(huán)后將發(fā)生聚集。使用未稀釋的樣品通過DLS來測量聚集，且認為Rh值＞20nm表示產(chǎn)生了一定水平的聚集。
表3AAV2載體的穩(wěn)定性

Pre0.2μm過濾后立即測量的DLS半徑。
載體濃度(vg/mL)CF1.93E13，TF12.38E13，TF22.33E13。
TH由于強烈的聚集，信號強度太高以致不能測量。
如表3所示，CF中制備的AAV2-AADC載體在4℃存儲5天后以及在-20℃或-80℃的一次或多次F/T循環(huán)后顯示出一些聚集。對于TF1中制備的載體，在4℃下5天后沒有產(chǎn)生聚集，但是在-20℃或-80℃的單次F/T循環(huán)后產(chǎn)生聚集，如通過DLS所示的信號強度太高以致不能測量。這些樣品的肉眼觀察表明了輕微的混濁，這與聚集相一致。對于TF2中制備的載體，在4℃或在-20℃高達10F/T后沒有觀察到聚集。在-80℃下在5和10F/T循環(huán)后觀察到一些聚集。
如下測量TF2中存儲或F/T循環(huán)后的AAV活性。如上所述，高離子強度的等滲制劑TF2有效地防止了濃縮和存儲過程中的載體聚集，并因此表明是用于進一步研究的遠景候選物。重要的問題是高離子強度TF2中的載體制備和存儲是否不利地影響了其功能活性。為了測試這個，進行了測試來測量在TF2中制備并存儲延長時間段的載體的感染滴定度和轉(zhuǎn)導效率。
對于感染性，使用了能夠檢測單次感染事件的高度靈敏感染性測試。Zhen，Z等，(2004)Human Gene Ther.15709-715。以6.4×1013vg/mL的濃度在TF2中制備AAV2-AADC。在4℃存儲45天后，與對于參照載體來說16vg/IU的值相比較，制劑具有的載體基因組對感染單位的比例為13(vg/IU)。設(shè)定該測試為報道的可變性(RSD～50％)，該差異不是顯著的。
通過D7/4細胞轉(zhuǎn)導后的ELISA測量AADC蛋白的表達來測試轉(zhuǎn)導效率。圖3顯示了對于10至105vg/細胞的載體輸入，TF2中制備的載體和參照對照之間沒有顯著差異。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明高離子強度TF2中的AAV2載體制備和存儲對載體感染性或轉(zhuǎn)導效率沒有不利影響。
結(jié)論測定離子強度(μ)對病毒顆粒相互作用的影響來闡明載體聚集的機理。中性緩沖等滲鹽水的離子強度(μ＝150mM)不足以防止通過梯度超速離心或通過陽離子交換色譜純化的濃度超過～1013顆粒/mL的AAV2載體的聚集。包括濃度高達5％(w/v)的糖(山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘油)或表面活性劑吐溫80(1％)或PluronicF68(10％)沒有防止載體顆粒的聚集。
相反，在純化和最終載體配制過程中使用升高的離子強度溶液(μ＞200mM)時載體顆粒保持溶解。使用用于體內(nèi)給藥的等滲賦形劑濃度的升高的離子強度溶液用多價離子鹽來制備，包括檸檬酸鈉、磷酸鈉和硫酸鎂。含有10mM Tris、100mM檸檬酸鈉、0.001％PluronicF68、pH8.0(μ～500mM)的等滲制劑能夠使AAV2-AADC載體的濃度達到6.4×1013vg/mL，在制備過程中和-20℃十次凍-融循環(huán)后觀察到?jīng)]有聚集。參見以下的表3和附帶的討論。在升高的離子強度制劑中制備并存儲延長時間段的AAV2-AADC載體保持高的感染性滴定度(13IU/vg)和轉(zhuǎn)導效率。
純化AAV2載體的核酸酶處理降低了載體聚集的程度，載體表面核酸雜質(zhì)涉及顆粒間相互作用。因此，有效除去載體表面殘余核酸的純化方法結(jié)合使用離子強度升高的等滲制劑，是防止AAV2載體聚集的有用方法。
實施例1AAV純化方法如之前所述的(Matsushita，T.等(1998)Gene Therapy 5938-945)通過HEK293細胞的三次轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生表達人凝血因子IX(FIX)或人氨基酸脫羧酶(AADC)的AAV2載體，進行了改進。對于大規(guī)模的制備，在850mm2的搖瓶(Corning)中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細胞。通過三種方法中的一種來純化載體。
在純化方法1中，從Matsushita改進，通過離心(1000g，15分鐘)來收集搖瓶中的轉(zhuǎn)染HEK293細胞，重懸浮于10mM磷酸鈉、500mM氯化鈉，pH7.2中，并通過三次凍/融循環(huán)來裂解(可替換的乙醇/干冰浴和37℃水浴)。通過離心來澄清細胞裂解物(8,000g，15分鐘)。然后通過加入10mM磷酸鈉，pH7.2將上清液稀釋至200mM NaCl并用Benzonase(Merck，純度級1；200U/mL，1h，37℃)消化。使用1M儲液將裂解物調(diào)節(jié)至25mM CaCl2，并在4℃孵育一小時。
將混合物離心(8,000g，15分鐘)，并收集含有載體的上清液。為了從澄清的細胞裂解物沉淀病毒，加入聚乙二醇(PEG8000)至8％的終濃度，將混合物在4℃孵育三小時，然后離心(8,000g，15分鐘)。將含有載體的丸粒通過混合重懸浮于0.15M NaCl、50mM Hepes、25mMEDTA，pH8.0中并在4℃孵育16小時。合并重懸浮的物質(zhì)，并加入固體氯化銫至1.40gm/ml的最終密度。然后使用Beckman型號LE-80離心機通過超速離心將載體分層(SW28，27,000rpm，24h，20℃)。將離心管分級，并合并含有載體的1.38至1..42gm/mL的密度。將該物質(zhì)通過超速離心來第二次分層(NVT65轉(zhuǎn)子，65,000rpm，16h，20℃)，并合并含有純化AAV2載體的級分。為了濃縮載體并進行緩沖液交換，將濃縮氯化銫溶液中的載體通過如下所述(實施例2)的切向流過濾接受超濾/滲濾(UF/DF)。
在純化方法2中，將含有AAV的細胞收集物微流體化并按序通過0.65和0.22μm的濾器(Sartorius)過濾。如之前所述的通過陽離子交換色譜使用Poros HS50樹脂從澄清的細胞裂解物純化病毒。U.S.專利No.6,593,123。對于圖2中所述的核酸酶消化，用100U/mL Benzonase和10U/mL DNA酶I(無RNA酶，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)孵育柱純化的載體(4h，RT)。
對于純化方法3，在UF/DF之前，將陽離子交換色譜純化的AAV2載體接受另外的氯化銫梯度超速離心步驟(SW28，27,000rpm，20h)來除去空殼體。
如之前所述的使用實時定量PCR(Q-PCR)來定量AAV制劑。Sommer，J.M.等，(2003)Mol.Therapy 7122-128。通過SDS-PAGE/銀染分析來分析三種方法各自純化的載體，且在所有情況中，VP1、VP2和VP3以預期的比例存在，殼體蛋白表示＞總蛋白的95％，如通過掃描顯像測密術(shù)所測定的。然而，與使用方法1和3純化的梯度純化AAV2載體不同，通過方法2(柱色譜)純化的載體含有空殼體，每個載體基因組含有3-10個空殼體。
實施例2超濾和滲濾來檢測AAV聚集將可隨意使用的空心纖維切向流過濾裝置(Amersham BioSciences8”Midgee，100kDa額定孔徑大小)用于濃縮和滲濾通過上述方法純化的AAV2載體，且用于表2中所述的UF/TF實驗。對于所有的UF/DF程序，使用對應(yīng)于10×產(chǎn)物體積的滲濾緩沖液體積，并以～1mL的增量加至接近連續(xù)滲濾。使用該方法，滲濾后所計算的殘余CsCl＜0.5mM。
將以下三種制劑用于UF/DF對照制劑(CF140mM氯化鈉、10mM磷酸鈉、5％山梨糖醇，pH7.3)；測試制劑1(TF1150mM磷酸鈉，pH7.5)；和測試制劑2(TF2100mM檸檬酸鈉、10mM Tris，pH8.0)。對于表2中所示的實驗1，在對應(yīng)于1×1013vg/mL載體濃度的體積進行滲濾，滲濾后體積減少至對應(yīng)于2.5×1013vg/mL的值(假設(shè)沒有載體損耗)。
對于實驗2，在對應(yīng)于2×1013vg/mL體積進行滲濾，然后體積減少至對應(yīng)于6.7×1013vg/mL的值。
對于實驗3(CF±Bz)，首先將AAV2-AADC(大約1.2×1014vg)滲濾至TF1中(與核酸酶活性相容的制劑)，然后通過0.22μm的濾器。測定這種物質(zhì)的滴定度，并將體積調(diào)節(jié)至對應(yīng)于1×1013vg/mL的濃度。向10mL該物質(zhì)中，加入MgCl2至2mM的濃度，然后分成兩個等份試樣。一個等份試樣用Benzonase孵育(200U/mL，4h，RT)，第二個為模擬孵育。然后在對應(yīng)于2×1013vg/mL載體濃度的體積將每個等份試樣滲濾，然后濃縮至3.6×1013vg/mL目標。所有UF/DF實驗方案后，將來自1％儲液的PluronicF-68(BASF Corp.，Mount Olive，NJ)加入載體產(chǎn)物中至0.001％的最終濃度，將溶液通過0.22μm注射器濾器(Sartorius)。所有UF/DF程序在層流室里進行。
實施例3通過動態(tài)光散射來測量載體聚集通過動態(tài)光散射(DLS)使用蛋白質(zhì)溶液DynaPro99(λ＝825.4nm)來分析純化載體的聚集。原始數(shù)據(jù)(顆粒半徑-Rh，在30個循環(huán)中測量的平均值，10個循環(huán)/分鐘)用于所報道的全部分析。將“稀釋-應(yīng)力”方法用于測試各種賦形劑對載體聚集的影響。在該方法中，將80μL測試稀釋劑加入20μL載體溶液中，并混合于用于DLS測量的實際比色皿中，并在混合10秒內(nèi)開始收集數(shù)據(jù)。在加入測試稀釋劑之前，測量AAV2載體制劑的Rh值并證實＜15nm來確保起始原料是單體的。將不是100％單體的樣品穿過0.22μm注射器盤式過濾器(Sartorius，低蛋白質(zhì)結(jié)合)來除去聚集物。
使用混合物(即，稱重的測試稀釋劑(80％)和起始載體制劑(20％))中存在的所有賦形劑來計算圖1和2中給出的摩爾滲透壓濃度和離子強度。根據(jù)等式摩爾滲透壓濃度＝ci來計算摩爾滲透壓濃度，其中ci是每種溶質(zhì)物質(zhì)的摩爾濃度。根據(jù)等式μ＝1/2cizi2來計算離子強度(μ)，其中zi是每種物質(zhì)上的電荷。在導致載體聚集(例如，低μ)的條件下，觀察到隨著數(shù)據(jù)收集的過程Rh漸進性的增加。為了確定稀釋后3分鐘間隔所測量的平均Rh能用作聚集的可靠測量，還測定了相同時間間隔Rh增加的平均速率(ΔRh/Δt)(未顯示)。ΔRh/Δt的分析給出了與使用圖1和2中所記載的平均Rh值獲得的那些相一致的結(jié)果。
實施例4AAV病毒粒子感染性使用如之前所述的高度靈敏測試來測定AAV2-AADC載體的感染性。Zhen，Z等，(2004)Human Gene Ther.15709-715。簡而言之，將樣品連續(xù)稀釋(10-倍稀釋，10個平行測定/稀釋)并加入生長于96孔組織培養(yǎng)平板(Falcn，cat.#353227)上含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中的D7/4細胞中(表達AAV rep和cap的改造Hela細胞)。將腺病毒(Ad-5，100vp/細胞)加入每個孔中來提供輔助功能。48h后，通過Q-PCR使用轉(zhuǎn)基因-特異性引物和探針來定量每個孔中AAV載體的復制，并通過Karber方法來計算感染性滴定度以分析極限稀釋度的感染頻率。同時用之前在CF中制備并存儲于-80℃的AAV2-AADC參照來運行試樣。
通過全細胞ELISA來定量AAV2載體的轉(zhuǎn)導效率。用10倍連續(xù)稀釋的試樣和參照載體感染生長于96孔平板中的D7/4細胞，對應(yīng)于10至105vg/細胞輸入(5個平行測試/稀釋度)。在48h后，除去培養(yǎng)基，用200μL的PBS(10mM磷酸鈉、140mM氯化鈉，pH7.2)將細胞洗滌兩次。然后通過將100μL含有0.5％曲通X-100和4％多聚甲醛的PBS加入每個孔中(15分鐘)來透化并固定細胞。除去固定溶液，并用含有0.5％曲通X-100的PBS將細胞洗滌兩次。通過加入含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.5％曲通X-100的PBS來阻斷非特異性位點(60分鐘)。
洗滌后，用兔子抗-ADCCIgG抗體(Chemicon，AB136)將細胞孵育一小時，并洗滌。然后用堿性磷酸鹽偶聯(lián)的山羊抗-兔子IgG將細胞孵育一小時，并洗滌。將抗體以1∶1000稀釋于含有1％BSA、0.5％曲通X-100的PBS中。然后加入底物(PNPP，Pierce，cat.#34047)(1X二乙醇胺底物緩沖液中1mg/mL，Pierce，cat.#34064)，孵育30分鐘后，通過分光光度測量分裂底物的濃度(λ＝405nm)。使用適配曲線(SigmaPlot)來符合人ADCC表達隨載體輸入函數(shù)。同時用試樣測量AAV2-AADC參照載體。
盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選示范性實施方案，可以形成沒有脫離本發(fā)明的各種改變和改進是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，且確定所附的權(quán)利要求涵蓋了落入本發(fā)明真實的精神和范圍內(nèi)的所有這樣的改變和改進。
權(quán)利要求
1.一種防止病毒粒子制劑中病毒粒子聚集的方法，包括將一種或多種賦形劑加入病毒粒子制劑中來獲得至少約200mM的離子強度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒粒子是AAV病毒粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括用核酸酶處理所述的病毒粒子制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述核酸酶是Benzonase。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種賦形劑包括多價離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述多價離子是檸檬酸根。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在加入一種或多種賦形劑后病毒粒子制劑的摩爾滲透壓濃度不高于約280mOsm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在加入一種或多種賦形劑后，病毒粒子制劑中通過動態(tài)光散射測量的病毒粒子平均顆粒半徑(Rh)低于約20nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在加入一種或多種賦形劑后，病毒粒子制劑通過0.22μm濾器過濾后的病毒粒子回收至少約90％。
10.一種用于存儲純化病毒顆粒的組合物，包括純化的病毒顆粒；pH緩沖劑；和含有一種或多種多價離子的賦形劑；其中組合物的離子強度高于約200mM。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述純化的病毒顆粒是AAV病毒顆粒。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述一種或多種多價離子中的一種是檸檬酸根。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，進一步包括PluronicF68。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述PluronicF68以0.001％存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述pH緩沖劑是10mM Tris，pH8.0，且賦形劑包括100mM檸檬酸鈉。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中通過動態(tài)光散射測量的純化病毒顆粒的平均顆粒半徑(Rh)低于約20nm。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中在病毒粒子組合物通過0.22μm濾器過濾后，純化病毒顆粒的回收至少為約90％。
18.一種防止病毒粒子制劑中病毒粒子聚集的方法，包括用Benzonase處理所述的病毒粒子制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在Benzonase處理后，病毒粒子制劑中通過動態(tài)光散射測量的病毒粒子平均顆粒半徑(Rh)低于約20nm。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在Benzonase處理后，在病毒粒子制劑通過0.22μm濾器過濾后的病毒粒子回收至少為約90％。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備濃縮AAV病毒粒子儲液而沒有聚集的組合物和方法。用于AAV制備和存儲的制劑是與確定的目標組織等滲的高離子強度溶液(例如，μ～500mM)。使用高價鹽如檸檬酸鈉來獲得這種高離子強度和適度摩爾滲透壓濃度的結(jié)合。使用本發(fā)明的制劑獲得高達6.4×10
文檔編號C12N7/02GK101018858SQ200580017618
公開日2007年8月15日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日
發(fā)明者J·F·賴特, G·曲 申請人:建新公司