專利名稱：陽離子脂質(zhì)及應(yīng)用方法
陽離子脂質(zhì)及應(yīng)用方法對相關(guān)申請的交叉參考本申請要求提交于2004年6月7日的美國臨時專利申請?zhí)?0/ 578,075，提交于2004年9月17日的60/610,746，和提交于2005年5月9 日的60/679,427的權(quán)益，出于所有目的將其每個的全部內(nèi)容特此并入作為 參考。發(fā)明背景有效和安全的基因遞送系統(tǒng)是將在臨床上有用的基因治療所需要的。 病毒載體是相對有效的基因遞送系統(tǒng)，但是遭遇到多種局限，諸如逆轉(zhuǎn)成 野生型的可能以及免疫應(yīng)答問題。結(jié)果，非病毒基因遞送系統(tǒng)正在受到越 來越多的關(guān)注(Worgall， " a/.， T/wwa" T7zera;^ 8:37-44 (1997); Peeters， a/" //wma" Gewe TTzerapy 7:1693-1699 (1996); Yei, ef "/.， 772era/7_y 1:192-200 (1994); Hope, ef a/" M /腦/ar Mem&r匿萬油gy 15:1-14 (1998))。質(zhì)粒DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物是目前最常用的非病毒基因遞送 載亍本(Felgner， 5"",ew/zy c ^wen'caw 276:102-106 (1997); Chonn， ef a/" Cw re/^ C^/m'o"/"所ofec/2"o/ogy 6:698-708 (1995))。然而，復(fù)合物較大，系統(tǒng)很不 確定，其不適于全身應(yīng)用并可激發(fā)相當(dāng)大的毒性副作用(Harrison, " a/.， 5/otec/2w/《was1 19:816-823 (1995); Huang, ef a/" A^fwre 5/o&c/zwo/ogy 15:620-621 (1997); Templeton, " a/.,淑,飾&c/7wo/ogv 15:647-652 (1997); Hofland， da/"尸/2^macewfea/Ae化a廠c/z 14:742-749 (1997》。最近的工作已經(jīng)顯示質(zhì)粒DNA可被包封在小的( 70 nm直徑)"穩(wěn)定的 質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒"(SPLP)中，其由包封在雙層脂質(zhì)載體中的單一質(zhì)粒組成 (Wheeler, "a/. Ge"e T7zera; 少6:271-281 (1999))。這些SPLPs典型地包含"融 合性的(fosogenic)"脂質(zhì)二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)，低水平的陽離子脂 質(zhì)，并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣時在水性介質(zhì)中是穩(wěn)定的。SPLP具有
全身應(yīng)用，因?yàn)樵陟o脈內(nèi)(i.V.)注射后，它們顯示延長的循環(huán)生存期，由于 在這些區(qū)域增加的血管通透性，它們優(yōu)先聚集在遠(yuǎn)側(cè)腫瘤位點(diǎn)，并可在這些腫瘤位點(diǎn)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在i.v.注射包含螢光素酶標(biāo)記基因的SPLP 后，在腫瘤位點(diǎn)觀察到的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平優(yōu)于使用質(zhì)粒DNA-陽離子脂 質(zhì)體復(fù)合物(lipoplexes)或裸DNA可獲得的水平。盡管如此，對于一些應(yīng) 用中的理想治療益處，可能需要提高水平的表達(dá)(見，例如，Monck，eM/., / Z>wg 7^g. 7:439-452 (2000))。典型地，脂質(zhì)體和SPLPs都包括陽離子脂質(zhì)。通常，所述陽離子脂質(zhì) 具有2條烷基鏈，醚(氧)鍵，和胺頭部基團(tuán)諸如，例如DODAC和DODMA。 典型地，烷基鏈包括不飽和的單一位點(diǎn)。不幸的是，僅具有不飽和單一位 點(diǎn)的陽離子脂質(zhì)可缺乏柔性。包含這些陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體或SPLP可缺 乏足夠的膜流動性，因此影響將生物活性劑遞送到細(xì)胞或患者中的功效。脂質(zhì)柔性在開發(fā)脂質(zhì)體或SPLP藥物遞送系統(tǒng)中是重要的。因此，理 想的是開發(fā)更具有柔性的陽離子脂質(zhì)，由此增加脂質(zhì)體或SPLP的膜流動 性。本發(fā)明滿足了這個和其它的需要。本發(fā)明提供新的陽離子脂質(zhì)，與常用的陽離子脂質(zhì)(諸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具體地，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā) 明的陽離子脂質(zhì)通過增加脂質(zhì)體或SPLP的膜流動性而提高了脂質(zhì)體以及 核酸-脂質(zhì)顆粒(SPLPs)的性質(zhì)，由此增加在脂質(zhì)體和SPLP中遞送生物活 性劑的功效。具體而言，本發(fā)明提供具有下列結(jié)構(gòu)的式I的化合物在上述式I的化合物中，R1和W獨(dú)立地是H或C,-C3垸基。R3和 W在式I的化合物中進(jìn)行獨(dú)立地選擇并且是具有約10-約20個碳原子的烷發(fā)明概述 基基團(tuán)，并且R3和W至少其中之一包括至少兩個不飽和位點(diǎn)。R3和R4 可以是相同的或不同的。如果是不同的，R3和W可以在垸基鏈長度方面， 在不飽和的位點(diǎn)方面，或在不飽和的位點(diǎn)的數(shù)目方面是不同的。R3和R4 可以包括至少兩個不飽和位點(diǎn)(例如R3和R"可以是，例如十二碳二烯基、 十四碳二烯基、十六碳二烯基、亞油基(linoleyl)、 二十碳二烯基)。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，R3和R"都是亞油基。R3和R"可以包含至少三個不飽和 位點(diǎn)(例如R3和R"可以是，例如，十二碳三烯基、十四碳三烯基，十六 碳三烯基、亞麻基和二十碳三烯基)。本發(fā)明還提供具有下列結(jié)構(gòu)的式II的化合物I x-R1__N+_R3R4 (II).在上述式II中，R1和R2進(jìn)行獨(dú)立地選擇并且是H或CrC3烷基。R3 和^進(jìn)行獨(dú)立地選擇并且是具有約10-約20個碳原子的烷基基團(tuán)，其中 R3和W至少一個包括至少兩個不飽和位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，R3和 R"都是相同的，即R3和W都是亞油基(C18)等。在另一個實(shí)施方案中， R3和W是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亞油基(C18)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)是對稱的，即R3和R"都是相 同的。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R"都包含至少兩個不飽和位點(diǎn)。 在一些實(shí)施方案中，R3和W獨(dú)立地選自十二碳二烯基，十四碳二烯基， 十六碳二烯基，亞油基和二十碳二烯基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R4 都是亞油基。在一些實(shí)施方案中，R3和R"包含至少三個不飽和位點(diǎn)并且 獨(dú)立地選自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亞麻基 和二十碳三烯基。在另一個方面，本發(fā)明提供脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包含式I，式II或其 組合的陽離子脂質(zhì)。所述脂質(zhì)體還可以包含PEG-脂質(zhì)(例如，PEG-二?；?甘油，PEG-二垸氧基丙基，PEG-神經(jīng)酰胺，PEG-磷脂酰乙醇胺或其混合 物)。所述脂質(zhì)體可以是空載的，或備選地，所述脂質(zhì)體還可以包含一種或 多種生物活性劑。適合的生物活性劑包括，但不限于，抗腫瘤藥、抗生素、
免疫調(diào)節(jié)劑，消炎藥和作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的藥劑。類似地，適合的生物活性劑包括，但不限于，肽、蛋白質(zhì)和核酸(例如單或雙鏈DNA，單鏈 或雙鏈RNA，包括siRNA)。在另一個方面，本發(fā)明提供將生物活性劑遞送到細(xì)胞的方法，所述方 法包括使細(xì)胞與包含式I，式II或其組合的陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體接觸，其 中所述生物活性劑被包封在脂質(zhì)體中。類似地，在另一個方面，本發(fā)明提 供將生物活性劑遞送給患者的方法，所述方法包括向患者施用包含式I， 式II或其組合的陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體，其中所述生物活性劑被包封在脂質(zhì) 體中。在另一個方面，本發(fā)明提供核酸-脂質(zhì)顆粒，所述核酸-脂質(zhì)顆粒包含 核酸；式I，式II，或其組合的陽離子脂質(zhì)；非陽離子脂質(zhì)；和PEG-脂質(zhì) 綴合物。在另一個方面，本發(fā)明提供將核酸引入細(xì)胞的方法，所述方法包括使 細(xì)胞與核酸-脂質(zhì)顆粒接觸，所述核酸脂質(zhì)顆粒包含式I，式n，或其組合 的陽離子脂質(zhì)，非陽離子脂質(zhì)，PEG-脂質(zhì)綴合物，和核酸。本發(fā)明的其它特征，目標(biāo)和優(yōu)勢及其優(yōu)選實(shí)施方案將通過下面的詳細(xì) 描述，實(shí)施例，權(quán)利要求和附圖而變得顯而易見。附圖簡述

圖1舉例說明本發(fā)明的兩個示范性陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu):l,2-二亞油基氧 基-N,N-二甲基氨基丙垸(DLinDMA)和1，2-二亞麻基氧基-N，N-二甲基氨 基丙烷(DLenDMA)。圖2舉例說明DLinDMA的合成路線。圖3舉例說明DLenDMA的合成路線。圖4舉例說明顯示結(jié)合在SNALP中的陽離子脂質(zhì)的表觀pKa的數(shù)據(jù)。 圖5舉例說明顯示31P-NMR分析的結(jié)果的數(shù)據(jù)，所述"P-NMR用于 確定不飽和對相變溫度的影響。圖6舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在體外轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)螢光素 酶的Neuro2a細(xì)胞后，由SPLP(gp， SNALP)使基因表達(dá)的沉默，所述SPLP 包含DODAC, DODMA,或DLinDMA并包封抗螢光素酶siRNA序列。圖7舉例說明顯示體外SNALP介導(dǎo)的基因沉默的數(shù)據(jù)。 圖8舉例說明顯示在靜脈內(nèi)遞送包封編碼螢光素酶的質(zhì)粒的SPLP后 48小時，在腫瘤中螢光素酶基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。所述SPLP包括PEG-C-DMA 綴合物和DODMA或DLinDMA其中任一。所述PEG部分具有2000或 750的分子量。圖9舉例說明顯示在靜脈內(nèi)施用包封編碼螢光素酶的質(zhì)粒的SPLP后 48小時，在攜帶Neuro2A腫瘤的雄性A/J小鼠中螢光素酶基因表達(dá)的數(shù) 據(jù)。所述SPLP包括各種比例的(即15%, 10%, 5%或2.5 %)的PEG-C-DMA 和DODMA或DLinDMA 。圖10舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在單一靜脈內(nèi)施用包含不 同比例(即2%， 5%， 10%，或15%)的PEG-C-DMA的3H-CHE-標(biāo)記的 SPLP或SNALP或空載小泡后，在雄性A/J小鼠的血漿中剩余的SPLP、 SNALP或空載小泡的注射劑量的百分比。圖11舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在單一靜脈內(nèi)施用包含各 種比例的PEG-C-DMA的SH-CHE-標(biāo)記的制劑后48小時，在攜帶Neuro-2A 腫瘤的雄性A/J小鼠中，SPLP， SNALP或空載小泡的生物分布。所述 SNALP和空載小泡包括DLinDMA。所述SPLP包括DODMA。圖12舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在靜脈內(nèi)施用包含 DLinDMA的SNALP后48小時，在A/J小鼠中的遠(yuǎn)端、穩(wěn)定的Neuro2A-G腫瘤中螢光素酶表達(dá)的沉默。圖13舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在遞送包含DLinDMA和 包封抗-螢光素酶siRNA的SNALP制劑后，在Neuro2A-G細(xì)胞中螢光素 酶表達(dá)的沉默。圖14舉例說明這樣的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示在遞送包含DLinDMA和 包封抗-螢光素酶的siRNA的SNALP制劑后，在Neuro2A-G細(xì)胞中的螢 光素酶表達(dá)的沉默。在缺乏或存在氯喹的情況下進(jìn)行SNALP制劑的遞送。圖15舉例說明顯示細(xì)胞吸收SNALP的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述 I. 介紹
本發(fā)明提供新的陽離子脂質(zhì)，與常用的陽離子脂質(zhì)(諸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。當(dāng)結(jié)合到脂質(zhì)小泡(例如，脂質(zhì)體， SPLP和SNALP)中時，本文所述的陽離子脂質(zhì)賦予增加的融合性 (fUsogenicity)。II. 定義術(shù)語"脂質(zhì)"指一組有機(jī)化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且 特征是在水中不溶，但是在許多有機(jī)溶劑中是可溶的。通常將它們分成至 少三類(l)"簡單的脂質(zhì)"其包括脂肪和油以及蠟；(2)"化合物脂質(zhì)"其包 括磷脂和糖脂；(3)"衍生的脂質(zhì)"諸如類固醇。"脂質(zhì)小泡"指可用于傳遞化合物的任何脂質(zhì)組合物，其包括，但不限 于，脂質(zhì)體，其中水體積被兩親性脂雙層所包封；或其中脂質(zhì)包被包括大 分子組分的內(nèi)部，諸如包括干擾RNA序列的質(zhì)粒，伴隨減少的水性內(nèi)部； 或脂質(zhì)團(tuán)聚體或膠團(tuán)，其中被包封的成分包含在相對混亂的脂質(zhì)混合物 中。用于本文時，"包封的脂質(zhì)"可指提供具有充分包封、部分包封或兩者 的化合物的脂質(zhì)制劑。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述核酸充分包封在 脂質(zhì)制劑中(例如形成SPLP， pSPLP，或其它SNALP)。用于本文時，術(shù)語"SNALP"指穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)顆粒，包括SPLP。 SNALP代表包被減少的水性內(nèi)部的脂質(zhì)的小泡，所述內(nèi)部包括核酸(例如， ssDNA, dsDNA, ssRNA， microRNA(miRNA)，短發(fā)夾RNA(shRNA), ds脂A， siRNA或質(zhì)粒，包括自其中轉(zhuǎn)錄干擾RNA的質(zhì)粒)。用于本文時，術(shù)語 "SPLP"指包括被包封于脂質(zhì)小泡中的核酸(例如，質(zhì)粒)的核酸脂質(zhì)顆粒。 SNALPs和SPLPs典型地包含陽離子脂質(zhì)，非陽離子脂質(zhì)，和阻止所述顆粒 聚集的脂質(zhì)(例如，PEG-脂質(zhì)綴合物)。SNALPs禾卩SPLPs具有全身施用， 因?yàn)樗鼈冊陟o脈內(nèi)(i.v.)注射后顯示延長的循環(huán)壽命，在遠(yuǎn)端位點(diǎn)(例如，在 身體上與施用位點(diǎn)分隔的位點(diǎn)上)聚集并且可以介導(dǎo)被轉(zhuǎn)染的基因在這些 遠(yuǎn)端位點(diǎn)的表達(dá)。SPLPs包括"pSPLP"，其包括如在WO 00/03683中提及的 被包封的縮合劑-核酸復(fù)合物。術(shù)語"形成小泡的脂質(zhì)"傾向于包括任何具有疏水部分和極性頭部基 團(tuán)的兩親性脂質(zhì)并且其本身可以在水中自發(fā)形成雙層小泡，示例為大多數(shù)術(shù)語"采用小泡的脂質(zhì)"傾向于包括穩(wěn)定與脂雙層結(jié)合的任何兩親性 脂質(zhì)，以及其它的兩親性脂質(zhì)，其疏水部分與內(nèi)部，雙層膜的疏水區(qū)域接 觸，并且其極性頭部基團(tuán)部分朝向外部，膜的極性表面。采用小泡的脂質(zhì) 包括這樣的脂質(zhì)，其能夠獨(dú)立地適宜于采用非層狀的相，還能夠在存在雙層穩(wěn)定組分時，采取雙層結(jié)構(gòu)。典型的實(shí)例是DOPE (二油酰磷脂酰乙醇 胺)。雙層穩(wěn)定組分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的綴合的脂質(zhì)，聚 酰胺低聚物(例如，ATTA-脂質(zhì)衍生物)、肽、蛋白質(zhì)、去污劑、脂質(zhì)衍生 物、PEG-脂質(zhì)衍生物諸如與二烷氧基丙基偶聯(lián)的PEG、與二?；视团悸?lián) 的PEG、與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)的PEG，和與神經(jīng)酰胺綴合的PEG(見，美國 專利號5，885,613)。PEG可以直接與脂質(zhì)綴合或可以通過接頭部分與脂質(zhì)連 接。可以使用適合于將PEG偶聯(lián)于脂質(zhì)的任何接頭部分，包括，例如，包 含非酯的接頭部分和包含酯的接頭部分。用于本文時，術(shù)語"包含非酯的接頭部分"指不包含羧酸酯鍵(-OC(O)-) 的接頭部分。適合的包含非酯的接頭部分包括，但不限于，酰氨基 (-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲 (-NHC(O)NH-) ,二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(0)CCH2CH2C(0)-)， 琥珀酰胺(-NHC(0)CH2CH2C(0)NH-)，醚，二硫化物等，及其組合(諸如包 含氨基甲酸酯接頭部分和酰氨基接頭部分的接頭)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 將氨基甲酸酯接頭用于將PEG偶聯(lián)于脂質(zhì)。在其它的實(shí)施方案中，包含酯的接頭部分用于將PEG偶聯(lián)于脂質(zhì)。 適合的包含酯的接頭部分包括，例如碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基 (succinoyl)，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其組合。術(shù)語"兩親性脂質(zhì)"部分地指任何適合的材料，其中脂質(zhì)材料的疏水部 分朝向疏水相，而親水部分朝向水相。兩親性脂質(zhì)通常是脂質(zhì)小泡的主要 成分。親水性質(zhì)來自極性或帶電基團(tuán)諸如碳水化合物，磷酸鹽(酯)，羧基、 硫酸根合、氨基、巰基、硝基、羥基和其它類似基團(tuán)的存在。疏水性可以 通過包含非極性基團(tuán)來賦予，所述非極性基團(tuán)包括，但不限于，長鏈飽和 和不飽和脂族烴基團(tuán)和由一個或多個芳香族、脂環(huán)族或雜環(huán)基團(tuán)取代的這 樣的基團(tuán)。兩親性化合物的實(shí)例包括，但不限于，磷脂、氨脂質(zhì)和鞘脂類。 磷脂的代表性實(shí)例包括，但不限于，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、 溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰 磷脂酰膽堿或二亞油酰磷脂酰膽堿。缺乏磷的其它化合物，諸如鞘磷脂、 鞘糖脂家族、二?；视秃蚉-酰氧基酸也在被稱為兩親性脂質(zhì)的組中。另 外，上述的兩親性脂質(zhì)可與其它脂質(zhì)混和，所述脂質(zhì)包括甘油三酯和固醇。術(shù)語"中性脂質(zhì)"指在選定的pH以未帶電荷或中性兩性離子形式存在的許多脂質(zhì)種類中的任何一種。在生理pH下，這樣的脂質(zhì)包括，例如，二 ?；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及贰⑸窠?jīng)酰胺、神經(jīng)鞘磷脂、腦磷脂、 膽固醇、腦苷脂和二?；视汀Ｐg(shù)語"非陽離子脂質(zhì)"指如上所述的任何中性脂質(zhì)以及陰離子脂質(zhì)。術(shù)語"陰離子脂質(zhì)"指在生理pH下帶負(fù)電荷的任何脂質(zhì)。這些脂質(zhì)包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字帷-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰 乙醇胺，賴氨酰磷脂酰甘油、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它與中 性脂質(zhì)連接的陰離子修飾基團(tuán)。術(shù)語"陽離子脂質(zhì)"指在選定的pH，諸如生理pH下攜帶凈正電荷的許 多脂質(zhì)種類中的任何一種。這些脂質(zhì)包括，但不限于，1,2-二亞油基氧基 -N，N-二甲基氨基丙烷("DLinDMA"), 1，2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙 烷("DLenDMA")，雙十八烷基二甲銨("DODMA")， 二硬脂酰二甲銨 ("DSDMA"), N，N-二油基-N,N-氯化二甲銨("DODAC") ; N-(2,3-二油基氧基) 丙基)-N，N，N-氯化三甲銨("DOTMA") ; N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲銨 ("DDAB"); N-(2，3- 二油酰氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲銨("DOTAP"); 3-(N-(N，,N，-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；?膽固醇("DC-Chol")和N-(l,2二 肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨("DMRIE")。例如，在 低生理pH上具有陽性電荷的陽離子脂質(zhì)包括，但不限于:DODAP, DODMA, 和DMDMA。在某些情形中，陽離子脂質(zhì)包括可質(zhì)子化的叔胺頭部基團(tuán)、 C18烷基鏈，在頭部基團(tuán)和烷基鏈之間的醚鍵，和0-3個雙鍵。這些脂質(zhì) 包括，例如DSDMA,DLinDMA,DLenDMA，禾口DODMA。所述陽離子脂質(zhì) 可以包括醚鍵和pH可滴定的頭部基團(tuán)。這些脂質(zhì)包括，例如DODMA。術(shù)語"疏水脂質(zhì)"指具有非極性基團(tuán)的化合物，其包括，但不限于，長 鏈飽和和不飽和脂族烴基團(tuán)并且這些基團(tuán)任選地被一個或多個芳香族、脂 環(huán)族或雜環(huán)族基團(tuán)所取代。合適的實(shí)例包括，但不限于，二?；视汀⒍?垸基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨 基丙烷。術(shù)語"融合性的"指脂質(zhì)體，SNALP或其它藥物遞送系統(tǒng)與細(xì)胞膜融合 的能力。所述膜可以是質(zhì)膜或圍繞細(xì)胞器，例如內(nèi)體、核等的膜。術(shù)語"核酸"或"多核苷酸"指包含至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸的以單或雙鏈形式存在的聚合物。核酸包括包含已知核苷酸類似物或修 飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其是合成的，天然存在的，或非天然存在的， 其具有與參考核酸相似的結(jié)合特性，并且其以與參考核苷酸相似的方式進(jìn) 行代謝。這些類似物的實(shí)例包括，但不限于，硫代磷酸酯 (phosphorothioates)，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-0-甲基核 糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。除非具體限制，該術(shù)語涵蓋包含天然核苷酸 的已知類似物的核酸，其具有與參照核酸相似的結(jié)合特性并且以與天然存 在的核苷酸相似的方式進(jìn)行代謝。除非另外指出，具體的核酸序列還暗含 地涵蓋其保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子替換)，等位基因，直向同 源物，SNPs和互補(bǔ)序列以及明顯指出的序列。具體地，可通過產(chǎn)生序列來 獲得簡并密碼子替換，在所述序列中一個或多個選定(或所有)的密碼子的 第三個位置由混和的堿基和/或脫氧肌苷殘基所取代(Batzer " "/.， A^c/e/c y4c^i es. 19:5081 (1991); Ohtsuka"a/" J歷o/. C/zem. 260:2605-2608 (1985); 禾口 Cassol & a/. (1992); Rossolini " a/" Mo/. Ce〃.尸ra6^ 8:91-98 (1994))。 "核苷酸"包含糖脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，堿基，和磷酸基團(tuán)。核苷 酸通過磷酸基團(tuán)進(jìn)行連接在一起。核苷酸包括化學(xué)修飾的核苷酸，如在例 如WO 03/74654中所述。"堿基"包括嘌呤和嘧啶，其還包括天然化合物腺 嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然類似物，以及 嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于取代新的反應(yīng)基的修飾，所 述反應(yīng)基諸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧酸鹽(酯)和鹵代烷。DNA可 以以反義、質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA的部分、預(yù)壓縮的DNA、聚合酶鏈?zhǔn)椒?br> 應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物、載體(Pl, PAC， BAC， YAC，人工染色體)、表達(dá)盒、嵌合 序列、染色體DNA或這些基團(tuán)的衍生物的形式存在。術(shù)語核酸與基因、質(zhì) 粒、cDNA、 mRNA和干擾RNA分子(例如，合成的siRNA或表達(dá)自質(zhì)粒的 siRNA)交互使用。III陽離子脂質(zhì)本發(fā)明提供新的陽離子脂質(zhì)，與常用的陽離子脂質(zhì)(諸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具體地，本發(fā)明提供具有下列結(jié)構(gòu) 的式I的新的陽離子脂質(zhì)在上述式I中，R1和W獨(dú)立地進(jìn)行選擇并且是H或CrC3烷基。R3和 W獨(dú)立地進(jìn)行選擇并且是具有約10-約20個碳原子的垸基基團(tuán)，其中R3 和W至少其中之一包括至少兩個不飽和位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，R3和 R"都是相同的，即R3和W都是亞油基(C18)等。在另一個實(shí)施方案中， R3和R"是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亞油基(C18)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)是對稱的，即R3和R"都是相 同的。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R"都包含至少兩個不飽和位點(diǎn)。 在一些實(shí)施方案中，R3和W獨(dú)立地選自十二碳二烯基，十四碳二烯基， 十六碳二烯基，亞油基和二十碳二烯基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R4 都是亞油基。在一些實(shí)施方案中，R3和W包含至少三個不飽和位點(diǎn)并且 獨(dú)立地選自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亞麻基 和二十碳三烯基。本發(fā)明還提供具有下列結(jié)構(gòu)的式II的新的陽離子脂質(zhì)<formula>formula see original document page 16</formula>
在上述式II中，R1和W進(jìn)行獨(dú)立地選擇并且是H或d-C3垸基。R3 和W進(jìn)行獨(dú)立地選擇并且是具有約10-約20個碳原子的垸基基團(tuán)；R3和 R"至少一個包括至少兩個不飽和位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，R3和W都是 相同的，即R3和R"都是亞油基(C18)等。在另一個實(shí)施方案中，R3和 W是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亞油基(C18)。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)是對稱的，即RS和R"都是相同的。 在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R"都包含至少兩個不飽和位點(diǎn)。在一 些實(shí)施方案中，R3和W獨(dú)立地選自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六 碳二烯基，亞油基和二十碳二烯基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和W都是 亞油基。在一些實(shí)施方案中，R3和W包含至少三個不飽和位點(diǎn)并且獨(dú)立 地選自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亞麻基和二 十碳三烯基。IV包含陽離子脂質(zhì)的基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)顆粒(SPLPs或 SNALPs)和其它的基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，膠束，病毒體， 脂質(zhì)-核酸顆粒，核酸復(fù)合物及其混合物)，其包含本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)， 即式I，式II，或其組合的陽離子脂質(zhì)。本發(fā)明的脂質(zhì)-核酸顆粒典型地包 括核酸，式I或式II的陽離子脂質(zhì)，非陽離子脂質(zhì)和PEG-脂質(zhì)綴合物。 式I或式II的陽離子脂質(zhì)典型地包含存在于所述顆粒中的從約2%到約 60%，從約5%到約50%，從約10%到約45%，從約20%到約40%,或 約30%的總脂質(zhì)。所述非陽離子脂質(zhì)典型地包含存在于所述顆粒中的約 5%到約90%,從約10%到約85%，從約20%到約80%，從約 30%至U約70%，從約40%至U約60%或約48%的總脂質(zhì)。所述PEG-脂質(zhì)綴合物典型地包含存在于所述顆粒中的從約1%到約20%，從約 1.5%到約18%，從約4%到約15%,從約5%到約12%,或約2%的總脂 質(zhì)。本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)顆粒還可以包含膽固醇。如果存在，膽固醇典型地 包含存在于所述顆粒中的約10%到約60%，約12%到約58%,從約20% 到約55%，或約48%的總脂質(zhì)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易變得顯而易見
的是，例如，使用在本文所述的ERP測定，核酸-脂質(zhì)顆粒的成分的比例 可以變化。例如，對于全身遞送，陽離子脂質(zhì)可以包含存在于所述顆粒中的約5%到約15%的總脂質(zhì)，而對于局部或區(qū)域性遞送，所述陽離子脂 質(zhì)包含存在于所述顆粒中的約40%到約50%的總脂質(zhì)。本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)顆粒典型地具有約50 nm到約150nm，更典型地 約100nm到約130 nm，最典型地約110 nm到約115nm的平均直徑并且 是基本無毒的。此外，當(dāng)存在于本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)顆粒中時，核酸對于水 溶液中核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂質(zhì)顆粒及其制備的方法公開在美國 專利號5,753,613; 5,785,992; 5,705,385; 5,976,567; 5,981,501; 6,110,745; 6,320,017和WO 96/40964。A.陽離子脂質(zhì)可以將式I和II的陽離子脂質(zhì)單獨(dú)，或組合以一種或多種其它的陽離 子脂質(zhì)種類或非陽離子脂質(zhì)種類來用在本發(fā)明中。本文所述的式i和式n的陽離子脂質(zhì)典型地在選定的pH，諸如生理pH上攜帶凈正電荷。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含具有多個不飽和位點(diǎn)，例如 至少兩個或三個不飽和位點(diǎn)的垸基鏈的陽離子脂質(zhì)在形成具有增加的膜 流動性的脂質(zhì)-核酸顆粒中是特別有用的。已經(jīng)將也在本發(fā)明中是有用的許 多陽離子脂質(zhì)和相關(guān)類似物描述在同時待審的USSN 08/316,399;美國專 利號5,208,036， 5，264，618, 5,279,833和5,283,185，和WO 96/10390中。另外的適合的陽離子脂質(zhì)包括，例如雙十八烷基二甲銨("DODMA")， 二硬脂酰二甲銨("DSDMA")， N，N-二油基-N，N-二甲銨("DODAC"); N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N,N-氯化三甲銨("DOTMA") ; N，N -二硬脂酰 -N,N-溴化二甲銨("DDAB"); N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N,N，N-氯化三甲銨 ("DOTAP"); 3-(N-(N，，N，-二甲基氨基乙垸)-氨基甲?；?膽固醇("DC-Chor) 和N-(1，2 二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨 ("DMRIE")。將在本發(fā)明中也有用的許多這些脂質(zhì)和相關(guān)類似物，描述在 美國專利號5,208,036， 5，264，618， 5，279，833， 5,283,185， 5,753,613和 5，785，992中。
B.非陽離子脂質(zhì)用于本發(fā)明的非陽離子脂質(zhì)可以是能夠產(chǎn)生穩(wěn)定復(fù)合體的多種中性 不帶電荷的，兩性離子或陰離子脂質(zhì)中的任一種。它們優(yōu)選地是中性的， 盡管它們可以備選地是帶正電荷或帶負(fù)電荷的。用在本發(fā)明中的非陽離子 脂質(zhì)的實(shí)例包括磷脂-相關(guān)的物質(zhì)，諸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵 磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，腦磷脂， 心磷脂，磷脂酸，腦苷脂，二鯨蠟基磷酸酯，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)， 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)， 二油酰磷脂酰 甘油(DOPG)， 二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)， 二油酰-磷脂酰乙醇胺 (DOPE)，棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)，棕櫚酰油酰-磷脂酰乙醇胺 (POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-l-羧酸 酯(DOPE-mal)， 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)， 二棕櫚酰磷酸乙醇胺 (DMPE)， 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)， 16-0-單甲基PE， 16-0-二甲基 PE， 18-l-反式PE， l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。非陽離子脂質(zhì) 或固醇諸如膽固醇可以存在。另外的不含磷的脂質(zhì)是，例如，硬脂胺，十 二烷胺，十六垸胺，乙酰基棕櫚酸酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六垸基 酯，十四垸酸異丙酯，兩性丙烯酸酯聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基 -芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸酰胺，二(十八垸基)二甲基溴化銨等，二?；?磷脂酰膽堿，二?；字Ｒ掖及?，神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，腦磷脂，和腦苷 脂。其它的脂質(zhì)諸如溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺可以存在。非陽 離子脂質(zhì)還包括基于聚乙二醇的聚合物諸如PEG 2000， PEG 5000和與磷 脂或與神經(jīng)酰胺(被稱作PEG-Cer)綴合的聚乙二醇，如在同時待審的USSN 08/316,429中所描述的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，非陽離子脂質(zhì)是二?；字Ｄ憠A(例如，二硬 脂酰磷脂酰膽堿，二油酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二亞油酰磷 脂酰膽堿)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕櫚酰油 酰磷脂酰乙醇胺)，神經(jīng)酰胺或鞘磷脂。在這些脂質(zhì)中的酰基基團(tuán)優(yōu)選地是來自具有CKrC24碳鏈的脂肪酸的?；鶊F(tuán)。更優(yōu)選地是?；鶊F(tuán)是月桂酰，肉豆蔻酰，棕櫚酰，硬脂酰或油酰。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，非陽 離子脂質(zhì)將是膽固醇，1，2-M-二油酰磷脂酰乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。 C.雙層穩(wěn)定組分除了陽離子和非陽離子脂質(zhì)之外，本發(fā)明的SPLPs包含雙層穩(wěn)定組分(BSC)諸如ATTA-脂質(zhì)或PEG-脂質(zhì)，諸如偶聯(lián)于二垸氧基丙基的 PEG(PEG-DAA)，如在例如WO 05/026372中所述，偶聯(lián)于二?；视偷?PEG(PEG-DAG)，如在例如美國專利
發(fā)明者I·麥克拉克倫, J·海斯, L·R·帕爾默 申請人:普洛體維生物治療公司