專(zhuān)利名稱(chēng)：包含占優(yōu)勢(shì)的GlcNacMAN的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有特定N-連接的糖基化模式的糖蛋白的組合物及其制備方法。具體地，本發(fā)明涉及包含多個(gè)具有特定N-聚糖結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白糖蛋白的組合物，更具體地，涉及包含免疫球蛋白糖蛋白的組合物，其中在免疫球蛋白上具有一個(gè)或多個(gè)占優(yōu)勢(shì)的糖形結(jié)構(gòu)，其調(diào)節(jié)，如促進(jìn)特定效應(yīng)物功能。
背景技術(shù)：
糖蛋白介導(dǎo)人和其它哺乳動(dòng)物中的很多重要功能，包括催化作用、信號(hào)傳遞、細(xì)胞-細(xì)胞交通和分子識(shí)別和關(guān)聯(lián)。糖蛋白組成真核生物中的大多數(shù)非胞質(zhì)溶膠蛋白(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.2181-27)。為了治療目的開(kāi)發(fā)了很多糖蛋白，在過(guò)去20年中，天然存在的糖蛋白的重組形式成為了生物技術(shù)工業(yè)的大部分。用作治療劑的重組糖基化蛋白的實(shí)例包括紅細(xì)胞生成素(EPO)、治療性單克隆抗體(mAbs)、組織纖溶酶原激活物(tPA)、干擾素-β(IFN-β)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和人絨毛膜促性腺激素(hCH)(Cumming et al，1991，Glycobiology 1115-130)。重組生產(chǎn)的糖蛋白的糖基化模式的變化最近成為了科學(xué)領(lǐng)域的很多關(guān)注的話題，作為接近臨床的可能預(yù)防和治療而生產(chǎn)的重組蛋白。
抗體或免疫球蛋白(Ig)是在體液免疫應(yīng)答中起中心作用的糖蛋白?？梢詫⒖贵w看作是在體液和細(xì)胞防御機(jī)制中提供聯(lián)系的銜接分子。由抗體進(jìn)行的抗原特異性識(shí)別導(dǎo)致可能激活多個(gè)效應(yīng)物機(jī)制的免疫復(fù)合物的形成，導(dǎo)致復(fù)合物的除去和破壞。在免疫球蛋白的大類(lèi)中，可以從生化和功能上區(qū)分五類(lèi)抗體，即，IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，而更細(xì)微的差異限于可變區(qū)，其導(dǎo)致抗原結(jié)合的特異性。在這五類(lèi)Igs中，僅僅存在兩種類(lèi)型的輕鏈，它們稱(chēng)作lambda(λ)和kappa(κ)。在具有λ或κ鏈的抗體之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)功能差異，并且兩類(lèi)輕鏈的比例在各物種之間不同。存在5類(lèi)重鏈或同種型，這些決定了抗體分子的功能活性。免疫球蛋白的5個(gè)功能分類(lèi)是免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。每一同種型在免疫應(yīng)答中具有特定功能，它們的獨(dú)特功能特性是由重鏈的羧基末端部分賦予的，在此處它不與輕鏈締合。IgG是血漿中最充足的免疫球蛋白同種型(參見(jiàn)，例如，Immunobiology，Janeway et al，6thEdition，2004，GarlandPublishing，New York)。
免疫球蛋白G(IgG)分子包含F(xiàn)ab(片段抗原結(jié)合)結(jié)構(gòu)域和恒定和可變區(qū)，以及Fc(片段定型的)結(jié)構(gòu)域。每個(gè)重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域在連接N-聚糖與Ig分子的天冬酰胺殘基上，通常是在殘基Asn-297上含有N-連接的糖基化的單一位點(diǎn)(Kabat et al.，Sequences ofproteins of immunological interest，F(xiàn)ifth Ed.，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
出于三個(gè)主要原因，N-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)和功能方面的分析具有生物學(xué)意義(1)CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化在進(jìn)化過(guò)程中是保守的，表明寡糖的重要作用；(2)免疫球蛋白分子作為分析寡糖異質(zhì)性的模型系統(tǒng)；和(3)抗體包含兩個(gè)重鏈的二聚締合，其使得兩個(gè)寡糖單位直接彼此接觸，從而免疫球蛋白分子參與特定蛋白-碳水化合物和碳水化合物-碳水化合物相互作用。
已經(jīng)證明，Igs的不同糖基化模式與不同的生物性質(zhì)相關(guān)(Jefferisand Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65111-128；Wrightand Morrison，1997，Trends Biotechnol，1526-32)。但是，已知僅有少數(shù)特定糖形賦予需要的生物功能。例如，據(jù)報(bào)道，在N-連接的聚糖上的巖藻糖基化減少的免疫球蛋白組分與人FcγRIII的結(jié)合增強(qiáng)，因此增強(qiáng)了抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)(Shields et al，2002，J.Biol Chem，27726733-2674O；Shinkawa et al，2003，J.Biol.Chem.2783466-3473)。并且，據(jù)報(bào)道，CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的巖藻糖基化的G2(Gal2GlcNAc2-Man3GlcNAc2)IgG使補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)活性增加的程度高于異源性抗體的組合物增加的程度(Raju，2004，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2004/0136986)。也已經(jīng)提示，抗腫瘤的最優(yōu)抗體將是優(yōu)先結(jié)合以激活Fc受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)并且最少結(jié)合抑制性的FcγRIIb受體的抗體(Clynes et al，2000，Nature，6443-446)。因此，在Ig糖蛋白上富集特定糖形的能力是高度需要的。
概言之，糖蛋白上的糖基化結(jié)構(gòu)(寡糖)將依賴(lài)于表達(dá)宿主和培養(yǎng)條件而改變。在非人宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的治療性蛋白很可能含有非人糖基化，其可能在人體中引發(fā)免疫應(yīng)答-如酵母中的高甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185440-470)；植物中的α(1，3)-巖藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al，1999，Glycobiology，9365-372)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Noguchi etal.，1995.J.Biochem.1175-62)和小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck et al.，1993，Immun.Today，14477-479)。此外，糖基化可能隨著細(xì)胞培養(yǎng)條件而改變，這可能使得一些免疫球蛋白組合物成為免疫原性，這取決于它們的特定半乳糖模式(Patel et al.，1992.Biochem J.285839-845)。由非人哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易與人類(lèi)糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)更密切相關(guān)。因此，大多數(shù)商業(yè)化的免疫球蛋白是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。但是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為蛋白生產(chǎn)的宿主細(xì)胞具有一些重要的缺點(diǎn)。除了昂貴，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的過(guò)程產(chǎn)生了異質(zhì)性的糖形群體，具有低的體積測(cè)定滴度，并且需要不斷進(jìn)行的病毒污染和大量時(shí)間來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。
已知不同的糖形可以顯著影響治療特性，包括藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、受體相互作用和組織特異性靶定(Graddis et al.，2002，Curr PharmBiotechnol.3285-297)。具體地，對(duì)于抗體，寡糖結(jié)構(gòu)會(huì)影響與蛋白酶抗性相關(guān)的性質(zhì)、由FcRn受體介導(dǎo)的抗體的血清半衰期、與補(bǔ)體復(fù)合物C1(其誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC))的結(jié)合、以及與FcγR受體(其負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)途徑、吞噬作用和抗體反饋)的結(jié)合(Nose and Wigzell，1983；Leatherbarrow and Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walkeret al，1989；Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.ScL USA，894285-4289)。
由于不同的糖形與不同的生物性質(zhì)相關(guān)，富集一種或多種特定糖形的能力可以用于闡釋特定糖形和特定生物功能之間的關(guān)系。在將需要的生物功能與特定糖形模式進(jìn)行關(guān)聯(lián)后，可以產(chǎn)生對(duì)有利的糖形結(jié)構(gòu)進(jìn)行了富集的糖蛋白組合物。因此，非常需要生產(chǎn)對(duì)特定糖形進(jìn)行了富集的糖蛋白組合物的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多個(gè)N-聚糖的50摩爾百分比以上基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。更優(yōu)選地，所述多個(gè)N-聚糖的75摩爾百分比以上基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。最優(yōu)選地，所述多個(gè)N-聚糖的90摩爾百分比以上基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)以比所述多個(gè)N-聚糖中其次最占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)多約5摩爾百分比-約50摩爾百分比的水平存在。
本發(fā)明也提供了通過(guò)富集免疫球蛋白上的特定糖形(如GlcNAcMan5GlcNAc2)增加與FcγRIIIa和FcγRIIIb受體結(jié)合和減少與FcγRIIb受體結(jié)合的方法。一種優(yōu)選的實(shí)施方案提供了制備包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物的方法，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成，所述方法包括培養(yǎng)經(jīng)過(guò)工程化或經(jīng)過(guò)選擇以表達(dá)所述免疫球蛋白或其片段的宿主細(xì)胞的步驟。另一種優(yōu)選的實(shí)施方案提供了制備包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物的方法，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成，所述方法包括培養(yǎng)經(jīng)過(guò)工程化或經(jīng)過(guò)選擇以表達(dá)所述免疫球蛋白或其片段的低等真核宿主細(xì)胞的步驟。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)工程化或經(jīng)過(guò)選擇以表達(dá)所述免疫球蛋白或其片段，從而產(chǎn)生包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，低等真核宿主細(xì)胞包含編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)工程化或經(jīng)過(guò)選擇以表達(dá)所述免疫球蛋白或其片段，從而產(chǎn)生包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出與FcγRIIb受體的結(jié)合親和力減少。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GicNAc2組成，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出與FcγRIIIa和FcγRIIIb受體的結(jié)合親和力增加。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)增加。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含基本不含巖藻糖的免疫球蛋白。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含缺乏巖藻糖的免疫球蛋白。本發(fā)明的組合物也包括藥物組合物和可藥用的載體。本發(fā)明的組合物也包括免疫球蛋白的藥物組合物，所述免疫球蛋白進(jìn)行了純化，并且裝入診斷試劑盒中。
因此，本發(fā)明提供了制備具有預(yù)定的糖基化結(jié)構(gòu)的糖蛋白，特別是具有基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖的免疫球蛋白或抗體分子的組合物的材料和方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.具有GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的IgG的示意圖。
圖2.在YAS385-1中表達(dá)(如實(shí)施例2所述)并且在蛋白A柱(第1道)和苯基瓊脂糖凝膠柱(第2道)上從培養(yǎng)基純化(如實(shí)施例3所述)的JC-IgG的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠(2.5μg蛋白/泳道)。
圖3.在YAS385-1中表達(dá)(如實(shí)施例2所述)并且在蛋白A柱(第1道)和苯基瓊脂糖凝膠柱(第2道)上從培養(yǎng)基純化(如實(shí)施例3所述)的DX-IgG的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠(2.5μg蛋白/泳道)。
圖4A.在YAS385-1中表達(dá)的JC-IgG的MALDI-TOF譜，用β-半乳糖苷酶處理，表明主要是GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。B.在YAS385-1中表達(dá)的DX-IgG的MALDI-TOF譜，用β-半乳糖苷酶處理，表明主要是GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。
圖5A.FcγRIIIb與JC-IgG和Rtuximab的ELISA結(jié)合測(cè)定。B.FcγRIIIb與DX-IgG和Rituximab的ELISA結(jié)合測(cè)定。(GM5＝GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)。
圖6.FcγRIIIa-158F與JC-IgG和Rituximab的ELISA結(jié)合測(cè)定。(GM5＝GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)。
圖7A.FcγRIIb與JC-IgG和Rituximab的ELISA結(jié)合測(cè)定。圖7B.FcγRIIb與DX-IgG和Rituximab的ELISA結(jié)合測(cè)定(GM5＝GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO1編碼DX-IgG1輕鏈的鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO2編碼DX-IgG1重鏈的鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO3編碼IgG1輕鏈的人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO4編碼IgG1重鏈的人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO5-19編碼用于通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成Dx-IgG1的鼠輕鏈可變區(qū)的15個(gè)重疊的寡核苷酸。
SEQ ID NO20-23編碼用于連接DX-IgG1鼠輕鏈可變區(qū)與人輕鏈恒定區(qū)的4個(gè)寡核苷酸引物。
SEQ ID NO24-40編碼用于通過(guò)PCR合成DX-IgG1的鼠重鏈可變區(qū)的17個(gè)重疊的寡核苷酸。
SEQ ID NO41-44編碼用于連接DX-IgG1鼠重鏈可變區(qū)與人重鏈恒定區(qū)的4個(gè)寡核苷酸引物。
SEQ ID NO45編碼的核苷酸序列編碼具有N-末端EcoRI位點(diǎn)的Kar2(Bip)信號(hào)序列。
SEQ ID NO46-49編碼用于連接Kar2信號(hào)序列與DX-IgG1的輕鏈和重鏈的4個(gè)寡核苷酸引物。
SEQ ID NO50編碼相應(yīng)于JC-IgG1輕鏈的鼠IgG1可變區(qū)的核苷酸序列(GenBank#AF013576)。
SEQ ID NO51編碼相應(yīng)于JC-IgG1重鏈的鼠IgG1可變區(qū)的核苷酸序列(GenBank#AF013577)。
SEQ ID NO52-63編碼用于PCR合成JC-IgG1的鼠輕鏈可變區(qū)的12個(gè)重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO64-75編碼用于PCR合成JC-IgG1的鼠重鏈Fab片段的12個(gè)重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO76-87編碼用于PCR合成JC-IgG1的鼠重鏈Fc片段的12個(gè)重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO88編碼相應(yīng)于Fc片段的3’末端的3′Kpnl引物。
SEQ ID NO89編碼人血清白蛋白(HSA)的核苷酸序列。
SEQ ID NO90編碼用于本發(fā)明的凝血酶裂解的核苷酸序列。
發(fā)明詳述除非本文另有定義，本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。而且，除非上下文有其它規(guī)定，單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法進(jìn)行。通常，與本文記載相關(guān)使用的命名，以及本文記載的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)及雜交技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的而且普遍使用的。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常按照本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的以及如貫穿本說(shuō)明書(shū)中所引用和討論的各種一般性的以及更為具體的參考文獻(xiàn)中所記載的常規(guī)方法進(jìn)行。參見(jiàn)例如Sambrook et al.Molecular CloningA LaboratoryManual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992，以及2002增刊)；Harlowand Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor andDrickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ；Handbook of BiochemistrySeetion A Proteins，VolI，CRC Press(1976)；Handbook of BiochemistrySection A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6thEdition，2004，Garland Publishing，New York)。
本文所提及的所有出版物、專(zhuān)利和其它參考文獻(xiàn)均被引入作為參考。
除非另有說(shuō)明，下列術(shù)語(yǔ)應(yīng)被理解成具有以下含義如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“N-聚糖”、“聚糖”和“糖形”可以互換使用，是指N-連接的寡糖，例如，通過(guò)與蛋白中的天冬酰胺殘基的酰胺氮連接的N-乙酰葡糖胺殘基而連接的寡糖。糖蛋白上占優(yōu)勢(shì)的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(如N-乙酰-神經(jīng)氨酸(NANA))。糖基團(tuán)加工在ER腔共翻譯地發(fā)生，且在高爾基體中繼續(xù)而成為N-連接的糖蛋白。
N-聚糖含有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”表示甘露糖；“Glc”表示葡萄糖；而“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)。N-聚糖的差別在于包含添加至MaB3GlcNAc2(“Man3”)核心結(jié)構(gòu)的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、巖藻糖和唾液酸)的分支(觸角)數(shù)目不同，所述核心結(jié)構(gòu)也稱(chēng)作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。N-聚糖可根據(jù)其分支的組分進(jìn)行分類(lèi)(例如，高甘露糖、復(fù)合或雜合)?！案吒事短恰毙蚇-聚糖含有五個(gè)或更多個(gè)甘露糖殘基?！皬?fù)合”型N-聚糖通常含有至少一個(gè)與1，3甘露糖臂附著的GlcNAc和至少一個(gè)與“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂附著的GlcNAc。復(fù)合N-聚糖還可含有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)殘基，所述殘基任選地被唾液酸或衍生物(如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神經(jīng)氨酸而“Ac”是指乙酰基)修飾。復(fù)合N-聚糖還可含有包含“二等分(bisecting)”GlcNAc和核心巖藻糖(“Fuc”)的鏈內(nèi)取代。復(fù)合N-聚糖還可含有在“三甘露糖核心”上多個(gè)觸角，其通常被稱(chēng)為“多觸角性聚糖”?！半s合”N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端至少有一個(gè)GlcNAc，且在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上有零個(gè)或多個(gè)甘露糖。多種聚糖也可以稱(chēng)作“糖形”。
本文所使用的縮寫(xiě)具有本領(lǐng)域通用的用法，參見(jiàn)例如，上述糖的縮寫(xiě)。其它通用的縮寫(xiě)法包括“PNG酶(PNGase)”，或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”，其表示肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。
“分離的”或“基本上純的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合聚合物)是指基本與其它細(xì)胞成分分離的核酸或多核苷酸，其它細(xì)胞成分是在天然宿主細(xì)胞中與天然多核苷酸天然伴隨的那些成分，例如與所述核酸天然結(jié)合的核糖體、聚合酶和基因組序列。該術(shù)語(yǔ)包括如下核酸或多核苷酸，所述核酸或多核苷酸(1)已從其天然存在的環(huán)境中取出，(2)與多核苷酸的全部或部分不結(jié)合，在自然界中從該多核苷酸發(fā)現(xiàn)“分離的多核苷酸”，(3)可操作地連接于其天然不相連接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“基本上純的”還用于是指重組或克隆的DNA分離物、化學(xué)合成的多核苷酸類(lèi)似物或異源系統(tǒng)生物合成的多核苷酸類(lèi)似物。
然而，“分離的”不一定要求如此所述的核酸或多核苷酸本身從其自然環(huán)境中物理地取出。例如，如果異源序列置于內(nèi)源核酸序列的附近，使得該內(nèi)源核酸序列的表達(dá)改變，則生物體基因組中的該內(nèi)源核酸序列在此認(rèn)為是“分離的”。在這里，異源序列為不天然接近該內(nèi)源核酸序列的序列，而不管該異源序列本身是否是內(nèi)源的(源于相同的宿主細(xì)胞或其子代)或外源的(源于不同的宿主細(xì)胞或其子代)。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子序列可用于代替(例如，通過(guò)同源重組)宿主細(xì)胞基因組中天然的基因啟動(dòng)子，使得該基因具有改變的表達(dá)模式。該基因目前將成為“分離的”，因?yàn)槠渑c天然位于其側(cè)翼的至少一些序列分離開(kāi)。
如果核酸包含基因組中相應(yīng)核酸并不天然存在的任何修飾，則其也認(rèn)為是“分離的”。例如，如果內(nèi)源的編碼序列包含人工，例如通過(guò)人為干預(yù)引入的插入、缺失或點(diǎn)突變，則其認(rèn)為是“分離的”?！胺蛛x的核酸”還包括在異源部位整合入宿主細(xì)胞染色體的核酸以及作為附加體存在的核酸構(gòu)建體。此外，“分離的核酸”可基本上無(wú)其他的細(xì)胞材料，或當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上無(wú)培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上無(wú)化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。
如此處所用的，參照核酸序列的“簡(jiǎn)并變體”包括可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼翻譯而提供與翻譯自參照核酸序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并寡核苷酸”或“簡(jiǎn)并引物”用于表示能與靶核酸序列雜交的寡核苷酸，其不一定在序列上相同但在一個(gè)或多個(gè)特定的片段內(nèi)相互是同源的。
在核酸序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)“序列同一性的百分比”或“同一的”指兩個(gè)序列中的殘基當(dāng)用于最大對(duì)應(yīng)比對(duì)時(shí)是相同的。序列同一性比較的長(zhǎng)度可超過(guò)至少約九個(gè)核苷酸，通常至少約20個(gè)核苷酸，更通常至少約24個(gè)核苷酸，典型地至少約28個(gè)核苷酸，更典型地至少約32個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選至少約36或更多核苷酸的范圍。本領(lǐng)域有許多已知可用于測(cè)量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，多核苷酸序列可利用FASTA、Gap或Bestfit比較，其為Wisconsin PackageVersion 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。FASTA提供查詢(xún)和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)以及序列同一性百分比。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(在此通過(guò)引用整體引入)。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可利用FASTA以缺省參數(shù)(字長(zhǎng)為6以及計(jì)分矩陣的NOPAM因數(shù))或利用Gap以GCG Version 6.1提供的缺省參數(shù)確定，在此引入作為參考?；蛘?，序列可利用計(jì)算機(jī)程序，BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul 等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))比較。
如上所述，當(dāng)指核酸或其片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)“顯著的同源性”或“顯著的相似性”表明，當(dāng)與另一個(gè)核酸(或其互補(bǔ)鏈)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔Ф罴驯葘?duì)時(shí)，如通過(guò)任何熟知的序列同一性算法測(cè)量的，如FASTA、BLAST或Gap，存在核苷酸堿基的至少約50％、更優(yōu)選核苷酸堿基的60％、通常至少約70％、更通常至少約80％、優(yōu)選至少約90％以及更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性。
或者，當(dāng)核酸或其片段在嚴(yán)格雜交條件下雜交與另一核酸、另一核酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，存在顯著的同源性或相似性。核酸雜交實(shí)驗(yàn)上下文中的“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格洗滌條件”取決于許多不同的物理參數(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，核酸雜交將受以下條件如鹽濃度、溫度、溶劑、雜交種類(lèi)的堿基組成、互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度以及雜交核酸之間錯(cuò)配核苷酸堿基的數(shù)目的影響。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何變化這些參數(shù)以實(shí)現(xiàn)特定的雜交嚴(yán)格度。
通常，“嚴(yán)格雜交”在特定的條件設(shè)置下，在比具體DNA雜交物的熱解鏈溫度(Tm)低約25℃時(shí)進(jìn)行。“嚴(yán)格洗滌”在特定的條件設(shè)置下，在比具體DNA雜交物Tm低約5℃的溫度進(jìn)行。Tm為50％的靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。參見(jiàn)Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，page 9.51，在此引入作為參考。對(duì)于此處的目的，液相雜交的“嚴(yán)格條件”定義為在6X SSC(其中20X SSC包含3.0M NaCl和0.3M檸檬酸鈉)，1％SDS中，在65℃ 8-12小時(shí)的水相雜交(即無(wú)甲酰胺)，隨后為0.2XSSC，0.1％SDS中65℃20分鐘兩次洗滌。技術(shù)工作者將理解取決于許多因數(shù)包括雜交序列的長(zhǎng)度和同一性百分比，在65℃將存在不同速率的雜交。
術(shù)語(yǔ)“突變的”當(dāng)應(yīng)用于核酸序列時(shí)指相比參照核酸序列，可插入、缺失或改變核酸序列中的核苷酸。在一個(gè)位點(diǎn)可產(chǎn)生單個(gè)改變(點(diǎn)突變)或在單個(gè)位點(diǎn)可插入、缺失或改變多個(gè)核苷酸。此外，可在核酸序列內(nèi)的任何數(shù)目的位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)改變。核酸序列可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法突變，包括但不限于誘變技術(shù)如“易錯(cuò)PCR”(用于在其中DNA聚合酶的復(fù)制保真度較低，使得順著PCR產(chǎn)物的全長(zhǎng)獲得高比率的點(diǎn)突變的條件下進(jìn)行PCR的方法；參見(jiàn)例如.，Leung等，Technique，111-15(1989)和Caldwell and Joyce，PCR MethodsApplic.228-33(1992))；以及“定位于寡核苷酸的誘變”(能在任何克隆的目的DNA片段中產(chǎn)生位點(diǎn)特異性突變的方法；參見(jiàn)例如，Reidhaar-Olson and Sauer，Science 24153-57(1988))。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“載體”用來(lái)指能轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。載體的一種類(lèi)型為“質(zhì)?！保噶硗獾腄NA片段可以連接進(jìn)入其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。其他的載體包括粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)。載體的另一種類(lèi)型為病毒載體，其中另外的DNA片段可連接進(jìn)入該病毒基因組(下文更詳細(xì)地論述)。某些載體能在它所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有在宿主細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的載體)。其他的載體可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此隨著宿主基因組一起重復(fù)。此外，某些優(yōu)選的載體能指導(dǎo)與之可操作連接的基因的表達(dá)。所述載體此處稱(chēng)為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)單地稱(chēng)為“表達(dá)載體”)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“目的序列”或“目的基因”指核酸序列，一般編碼通常不在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此處公開(kāi)的方法允許一個(gè)或多個(gè)目的序列或目的基因穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組中。目的序列的非-限制性例子包括編碼具有酶活性的一種或多種多肽的序列，例如影響N-聚糖在宿主中合成的酶如甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、以及巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記序列”或“標(biāo)記基因”是指能夠表達(dá)允許對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)序列的存在或不存在進(jìn)行陽(yáng)性或陰性選擇的活性的核酸序列。例如，巴斯德畢赤氏酵母URA5基因是一種標(biāo)記基因，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)含有該基因的細(xì)胞在不存在尿嘧啶的條件下生長(zhǎng)的能力進(jìn)行選擇。也可以通過(guò)含有該基因的細(xì)胞不能在5-FOA存在下生長(zhǎng)而選擇其存在。標(biāo)記序列或基因不一定需要同時(shí)表現(xiàn)陽(yáng)性和陰性選擇性。來(lái)自巴斯德畢赤氏酵母的標(biāo)記序列或基因的非限定性實(shí)例包括ADE1，ARG4，HIS4和URA3。對(duì)于抗生素抗性標(biāo)記基因，常采用卡那霉素、新霉素、慶大霉素(或G418)、巴龍霉素和潮霉素抗性基因，以便允許在這些抗生素存在下生長(zhǎng)。
“可操作連接的”表達(dá)調(diào)控序列指其中表達(dá)調(diào)控序列與目的基因相是相鄰的，以控制目的基因的連接，以及以反式或在一定的距離內(nèi)作用而控制目的基因的表達(dá)調(diào)控序列。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)調(diào)控序列”指影響與之可操作連接的編碼序列的表達(dá)所必需的多核苷酸序列。表達(dá)調(diào)控序列為控制核酸序列轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件以及翻譯的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)如剪接和聚腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn))；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及當(dāng)需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。所述調(diào)控序列的性質(zhì)因宿主生物體而不同；原核生物中，所述調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”用來(lái)包括，至少其存在是用于表達(dá)必不可少的所有組分，并且還可以包括其存在是有利的另外的組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”(“表達(dá)宿主細(xì)胞”、“表達(dá)宿主系統(tǒng)”、“表達(dá)系統(tǒng)”或簡(jiǎn)單地稱(chēng)“宿主細(xì)胞”)用來(lái)指其中已導(dǎo)入重組載體的細(xì)胞。應(yīng)該理解的是所述術(shù)語(yǔ)不僅用來(lái)指特定的主題細(xì)胞而且指所述細(xì)胞的子代。因?yàn)橛捎谕蛔兓蛘攮h(huán)境影響而造成某些修飾可能在繼代中存在，實(shí)際上所述子代可能不同于親本細(xì)胞，但仍然包括在如此處所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞可以是分離的細(xì)胞或培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞系或可以是存在于活組織或生物體中的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“真核”是指具核的細(xì)胞或生物，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和低等真核細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“低等真核細(xì)胞”包括酵母、真菌、領(lǐng)鞭毛蟲(chóng)(collar-flagellates)、微孢子蟲(chóng)、alveolates(例如，甲藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生動(dòng)物)、紅藻門(mén)(rhodophyta)(例如，紅藻)、植物(例如，綠藻、植物細(xì)胞、蘚類(lèi))以及其它原生生物。酵母和真菌包括，但不限于畢赤氏酵母屬物種，如巴斯德畢赤氏酵母、Pichiafinlandica、喜海藻糖畢赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichiakoclamae、膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、柳畢赤氏酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏畢赤氏酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤氏酵母(Pichia stiptis)和甲醇畢赤氏酵母；糖酵母屬物種，如啤酒糖酵母；多形漢遜氏酵母、克魯維氏酵母屬物種(Kluyveromyces sp.)，如乳克魯維氏酵母；白色假絲酵母(Candida albicans)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、鐮孢屬物種(Fusarium sp.)，如禾赤鐮孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙鏈孢霉。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“肽”指短的多肽，例如通常小于約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)并且更通常小于約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)的多肽。如此處所用的術(shù)語(yǔ)包括模擬結(jié)構(gòu)并且因此具有生物學(xué)功能的類(lèi)似物和模擬物。
術(shù)語(yǔ)“多肽”包括天然-存在的和非-天然存在的蛋白質(zhì)，以及其片段、突變體、衍生物和類(lèi)似物。多肽可以是單體的或多聚體的。此外，多肽可包括許多不同的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)具有一種或多種不同的活性。
術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白質(zhì)”或“分離的多肽”為根據(jù)其來(lái)源或衍生來(lái)源的蛋白質(zhì)或多肽，其(1)與在天然狀態(tài)下伴隨其的天然締合的組分不相締合，(2)以自然界未發(fā)現(xiàn)的純度存在，其中可根據(jù)其他細(xì)胞材料的存在判定純度(例如，無(wú)來(lái)自相同種的其他蛋白質(zhì))(3)通過(guò)來(lái)自不同種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)自然界不存在(例如，其為自然界中發(fā)現(xiàn)的多肽的片段或其包括自然界中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸類(lèi)似物或衍生物或不是標(biāo)準(zhǔn)肽鍵的連接)。因此，化學(xué)合成的或在不同于多肽天然來(lái)源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然締合組分相“分離的”。利用本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，還可通過(guò)分離使多肽或蛋白質(zhì)基本上無(wú)天然締合組分。如由此定義的，“分離的”不一定要求如此描述的該蛋白質(zhì)、多肽、肽或寡肽已從其天然環(huán)境中物理取出。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“多肽片段”指具有缺失，例如相比全長(zhǎng)多肽具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽片段為其中該片段的氨基酸序列與天然存在序列的相應(yīng)位點(diǎn)相同的連續(xù)序列。片段通常至少5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選至少12、14、16或18個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)選至少25、30、35、40或45個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少50或60個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且甚至更優(yōu)選至少70個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
“修飾的衍生物”指多肽或其片段，其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本上同源但其包括例如，體內(nèi)或體外的化學(xué)和生化修飾或其摻入天然多肽中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，所述修飾包括例如，乙?；?、羧基化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、標(biāo)記，例如用放射性核素標(biāo)記，以及各種酶促修飾。用于標(biāo)記多肽的各種方法以及可用于所述目的的取代基或標(biāo)記物為本領(lǐng)域所熟知，并且包括放射性同位素如125I、32P、35S和3H、結(jié)合被標(biāo)記抗配體的配體(例如，抗體)、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、酶以及可用作被標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對(duì)成員的抗配體。標(biāo)記物的選擇取決于所需要的靈敏度、與引物結(jié)合的容易度、穩(wěn)定性要求和可得到的設(shè)備。用于標(biāo)記多肽的方法為本領(lǐng)域所熟知。參見(jiàn)，例如，Ausubel等.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992和2002的增刊)(在此引入作為參考)。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指包括偶聯(lián)至異種氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白由于其可被構(gòu)建而包含來(lái)自?xún)煞N或更多不同的蛋白質(zhì)的兩種或更多所需的功能元件而是有用的。融合蛋白包括來(lái)自目的多肽的至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選至少20或30個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少40、50或60個(gè)氨基酸，而更優(yōu)選至少75、100或125個(gè)氨基酸。包括本發(fā)明蛋白質(zhì)整體的融合蛋白具有特定的功用。包括在本發(fā)明融合蛋白內(nèi)的異種多肽為至少6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，常常至少8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，并且有用地至少15、20和25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。包括更大多肽如免疫球蛋白Fc片段，或者免疫球蛋白Fab片段，或甚至整個(gè)蛋白，如綠色熒光蛋白(“GFP”)生色團(tuán)的蛋白或全長(zhǎng)免疫球蛋白的融合體具有特定功用。融合蛋白可通過(guò)將編碼多肽或其片段的核酸序列與編碼不同蛋白質(zhì)或肽的核酸序列構(gòu)建在讀框內(nèi)并且隨后表達(dá)該融合蛋白而重組產(chǎn)生。或者，融合蛋白可通過(guò)將多肽或其片段交聯(lián)至另一種蛋白質(zhì)而以化學(xué)方法產(chǎn)生。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”、“免疫球蛋白”、“Ig”和“Ig分子”可以互換使用。每個(gè)抗體分子具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使其能夠與其特異性抗原結(jié)合，但如此處描述，所有抗體/免疫球蛋白具有相同的總體結(jié)構(gòu)。已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單位包括亞基的四聚體。每個(gè)四聚體具有相同的兩對(duì)多肽鏈，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括約100-110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)識(shí)別抗原。每條鏈的羧基端部分確定恒定區(qū)，其主要負(fù)責(zé)效應(yīng)物功能。輕鏈分類(lèi)為κ或λ。重鏈分類(lèi)為γ、μ、α、δ或ε，并且分別限定抗體的同種型為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。輕鏈和重鏈細(xì)分為可變區(qū)和恒定區(qū)(通常參見(jiàn)FundamentalImmunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(在此引入作為參考)。每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了在雙功能或雙特異性抗體外，兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。所述鏈均表現(xiàn)出由三個(gè)高變區(qū)，也稱(chēng)作互補(bǔ)決定區(qū)或CDRs連接的相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)(FR)的相同總體結(jié)構(gòu)。來(lái)自每一對(duì)的兩條鏈的CDRs是通過(guò)構(gòu)架區(qū)排列的，使得能夠與特異性表位結(jié)合。該術(shù)語(yǔ)包括天然存在的形式，以及片段和衍生物。該術(shù)語(yǔ)的范圍還包括各類(lèi)Igs，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。IgGs的亞型也包括在該術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。以最寬的含義使用該術(shù)語(yǔ)，并且包括單個(gè)的單克隆抗體(包括激動(dòng)劑和拮抗劑抗體)和結(jié)合于多個(gè)表位或抗原的抗體組合物。該術(shù)語(yǔ)特別地包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們包括或經(jīng)過(guò)修飾而包括重鏈免疫球蛋白恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的至少一部分，所述恒定區(qū)包含CH2結(jié)構(gòu)域的N-連接的糖基化位點(diǎn)或其變體。該術(shù)語(yǔ)包括含有Fc區(qū)的分子，如免疫粘附素(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2004/0136986)、融合體和抗體樣分子?；蛘撸@些術(shù)語(yǔ)可以稱(chēng)作至少具有至少含有N-連接的糖基化位點(diǎn)的Fab區(qū)的抗體片段。
術(shù)語(yǔ)“Fc”片段是指含有CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的抗體的“片段定型的”C端區(qū)(圖1)。術(shù)語(yǔ)“Fab”是指含有VH、CH1、VL和CL結(jié)構(gòu)域的抗體的“片段抗原結(jié)合”區(qū)(圖1)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”(mAb)是指獲自基本同質(zhì)的抗體群的抗體，即，構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的，只是可能小量存在天然突變。單克隆抗體是高度特異的，針對(duì)單個(gè)抗原性位點(diǎn)。此外，與典型地包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每個(gè)mAb針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了特異性，單克隆抗體的有利之處在于可以通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)合成它們，不受到其它免疫球蛋白的污染。術(shù)語(yǔ)“單克隆”表明的抗體特征是獲自基本同質(zhì)的抗體群，并且不應(yīng)該解釋為需要通過(guò)任何特殊方法生產(chǎn)抗體。例如，可以通過(guò)首先由Kohler et al，(1975)Nature，256495描述的雜交瘤法或可以通過(guò)重組DNA法(參見(jiàn)例如Cabilly等的美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567)制備用于本發(fā)明的單克隆抗體。
此處的單克隆抗體包括雜合和重組抗體，它們是通過(guò)以下方法制備的將抗體的可變(包括高變)區(qū)與恒定區(qū)(如“人源化”抗體)，或輕鏈與重鏈，或來(lái)自一個(gè)物種的鏈與來(lái)自另一個(gè)物種的鏈剪接在一起，或與異源蛋白融合，而不論來(lái)源的物種或免疫球蛋白類(lèi)或亞類(lèi)名稱(chēng)是什么(參見(jiàn)Cabilly等的美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567，Mage andLamoyi，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。此處的單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于第一物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與來(lái)源于不同物種或?qū)儆诓煌贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體以及所述抗體的片段中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們含有或經(jīng)過(guò)修飾而含有至少一個(gè)CH2。非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)，其含有來(lái)源于人免疫球蛋白的序列?？贵w的Fv片段是抗體的保留了完整分子的結(jié)合特征和特異性的最小單位。Fv片段是抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)的非共價(jià)締合的異二聚體。F(ab)′2片段是含有由二硫橋連接的Fab片段的兩個(gè)臂的片段。
人源化抗體的最常見(jiàn)形式是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的具有需要的特異性、親和力和容量的殘基替代。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含既不存在于受體抗體，也不存在于輸入的CDR或構(gòu)架序列中的殘基。進(jìn)行了這些修飾，以進(jìn)一步調(diào)整抗體性能，并使其最大化。概言之，人源化抗體將基本包含至少一個(gè)，一般是兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中所有或基本所有的CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或基本所有的CDR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的CDR區(qū)。人源化抗體優(yōu)選也將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型是人免疫球蛋白的該部分。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones et al，1986，Nature 321522-524；Reichmann et al，1988，Nature 332323-327，和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。
在術(shù)語(yǔ)抗體或免疫球蛋白范圍內(nèi)的“片段”包括通過(guò)多種蛋白酶消化產(chǎn)生的那些，通過(guò)化學(xué)裂解和/或化學(xué)解離產(chǎn)生的那些，和重組產(chǎn)生的那些，只要片段保持能夠特異性結(jié)合于靶分子。這些片段包括Fc、Fab、Fab′、Fv、F(ab′)2和單鏈Fv(scFv)片段。
本發(fā)明的抗體的感興趣的靶包括生長(zhǎng)因子受體(如FGFR，PDGFR，EGFR，NGFR和VEGF)及其配體。其它靶是G蛋白受體，并且包括K物質(zhì)受體、血管緊張素受體、α-和β-腎上腺素能受體、5-羥色胺受體和PAF受體。參見(jiàn)，例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56625-649(1987)。其它靶包括離子通道(如鈣、鈉、鉀通道)、毒草堿受體、乙酰膽堿受體、GABA受體、谷氨酸受體和多巴胺受體(參見(jiàn)Harpold，U.S.5,401,629和U.S.5,436,128)。其它靶是粘附蛋白如整聯(lián)蛋白、選擇蛋白和免疫球蛋白超家族成員(參見(jiàn)Springer，Nature346425-433(1990)。Osborn，Cell 623(1990)；Hynes，Cell 6911(1992))。其它靶是細(xì)胞因子，如白介素IL-1-IL-13、腫瘤壞死因子α和β、干擾素α、β和γ、腫瘤生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)和粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。參見(jiàn)HumanCytokinesHandbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，Blackwell Scientific，Boston，MA 1991)。其它靶是激素、酶和細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信使，如腺苷酸環(huán)化酶、鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶和磷脂酶C。感興趣的其它靶是白細(xì)胞抗原，如CD20和CD33。藥物也可以是感興趣的靶。靶分子可以是人、哺乳動(dòng)物或細(xì)菌分子。其它靶是抗原，如來(lái)自微生物病原體(病毒和細(xì)菌)的蛋白、糖蛋白和碳水化合物，以及腫瘤。其它靶描述于U.S.4,366,241。
此處討論的免疫Fc受體可以包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcRn(新生受體)。術(shù)語(yǔ)FcγRI可以指任何FcγRI亞型，除非指出相反的意思。術(shù)語(yǔ)FcγRII可以指任何FcγRII亞型，除非指出相反的意思。術(shù)語(yǔ)FcγRIII可以指任何FcγRIII亞型，除非指出相反的意思。
在該術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)的衍生物包括在序列上已被修飾，但仍然能特異性結(jié)合靶分子的抗體(或其片段)，包括種間嵌合的和人源化的抗體；抗體融合物；異聚抗體復(fù)合物和抗體融合物，如雙抗體(雙特異性抗體)、單鏈雙抗體和內(nèi)體(參見(jiàn)，例如.，Intracellular AntibodiesResearch and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-VerlagNew York，Inc.，1998)，在此引入其公開(kāi)內(nèi)容作為參考)。
術(shù)語(yǔ)“非-肽類(lèi)似物”指具有類(lèi)似于參照多肽性質(zhì)的化合物。非-肽化合物還可稱(chēng)為“肽模擬物”或“模擬肽”。參見(jiàn)，例如.，Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide LibrariesA Handbook，John Wiley(1997)；Bodanszky等.，Peptide Chemistry--A PracticalTextbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic PeptidesA Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans等.，J.Med.Chem.301229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8392-396(1985)；以及其中引用的參考文獻(xiàn)，在此引入作為參考。所述化合物常常借助于計(jì)算機(jī)分子建模開(kāi)發(fā)。結(jié)構(gòu)類(lèi)似于本發(fā)明有用的肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生同等的作用并且因此屬于本發(fā)明。
氨基酸取代可包括那些，其(1)降低對(duì)蛋白質(zhì)水解的敏感性，(2)降低對(duì)氧化作用的敏感性，(3)改變結(jié)合親和力而用于形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，(4)改變結(jié)合親和力或酶活性，以及(5)給予或改進(jìn)所述類(lèi)似物的其他物理化學(xué)的或功能性的性質(zhì)。
如此處所用的，二十種常規(guī)氨基酸及其縮寫(xiě)遵循常規(guī)用法。參見(jiàn)Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2nded.1991)，在此引入其作為參考。二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸以及其他的非常規(guī)氨基酸也可以為本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、ε-N，N，N-三甲基賴(lài)氨酸、ε-N乙酰賴(lài)氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、N-甲基精氨酸以及其他的類(lèi)似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。在此處所用的多肽注釋中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例，左手端對(duì)應(yīng)氨基端而右手端對(duì)應(yīng)羧基端。
如果編碼蛋白質(zhì)的核酸序列具有與編碼第二種蛋白質(zhì)的核酸序列類(lèi)似的序列，則該蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)具有“同源性”或與之“同源”。或者，如果兩種蛋白質(zhì)具有“類(lèi)似的”氨基酸序列，則一種蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)具有同源性。(因此，術(shù)語(yǔ)“同源蛋白質(zhì)”定義指兩種蛋白質(zhì)具有類(lèi)似的氨基酸序列。)在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，同源蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)具有至少65％的序列同源性，更優(yōu)選至少70％的序列同源性。甚至更優(yōu)選的為與野生型蛋白質(zhì)具有至少75％、80％、85％或90％序列同源性的同源蛋白質(zhì)。在又一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，同源蛋白質(zhì)具有至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。如此處所用的，兩個(gè)氨基酸序列區(qū)域之間的同源性(尤其關(guān)于預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)相似性)解釋為暗示功能的相似性。
當(dāng)“同源”用于指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，公認(rèn)的是不相同的殘基位點(diǎn)常常以保守的氨基酸取代而不同。“保守的氨基酸取代”為其中氨基酸殘基由具有類(lèi)似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)側(cè)鏈(R基團(tuán))的另一種氨基酸殘基取代的取代。通常，保守的氨基酸取代基本上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。如果兩個(gè)或更多氨基酸序列彼此通過(guò)保守取代而不同，可調(diào)高序列同一性的百分比或同源性程度以修正保守的取代性質(zhì)。用于進(jìn)行該調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見(jiàn)，例如.，Pearson，1994，Methods Mol.Biol.24307-31 and 25365-89(在此引入作為參考)。
下列六組每組包含彼此為保守取代的氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
多肽的序列同源性，也稱(chēng)為序列同一性百分比，通常利用序列分析軟件測(cè)量。參見(jiàn)，例如，Genetics Computer Group(GCG)的序列分析軟件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，910University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白質(zhì)分析軟件利用指定至各種取代、缺失和其他修飾，包括保守氨基酸取代的同源性測(cè)量而匹配相似的序列。例如，GCG包含如“Gap”和“Bestfit”的程序，其以缺省參數(shù)使用以確定緊密相關(guān)的多肽之間，如來(lái)自不同生物體種類(lèi)的同源多肽或野生型蛋白質(zhì)和其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參見(jiàn)，例如.，GCG Version 6.1。
當(dāng)將特定的多肽序列與包含來(lái)自不同生物體的大量序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比較時(shí)優(yōu)選的算法為計(jì)算機(jī)程序BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul 等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。
用于BLASTp的優(yōu)選的參數(shù)為期望值10(缺省)；過(guò)濾器seg(缺省)；開(kāi)放間隙的成本11(缺省)；延長(zhǎng)間隙的成本1(缺省)；最大對(duì)比100(缺省)；字長(zhǎng)11(缺省)；描述的編號(hào)100(缺省)；罰分矩陣BLOWSUM62。
比較同源性的多肽序列長(zhǎng)度通常為至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常至少約20個(gè)殘基，更通常至少約24個(gè)殘基，一般至少約28個(gè)殘基，并且優(yōu)選超過(guò)約35個(gè)殘基。當(dāng)搜索包含來(lái)自大量不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，優(yōu)選比較氨基酸序列。利用氨基酸序列搜索數(shù)據(jù)庫(kù)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的blastp以外的算法測(cè)量。例如，多肽序列可利用FASTA比較，GCG Version 6.1中的程序。FASTA提供查詢(xún)和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分比。Pearson，MethodsEnzymol.18363-98(1990)(在此引入其作為參考).例如，氨基酸序列之間的序列同一性百分比可利用如GCG Version 6.1提供的FASTA以缺省參數(shù)(字長(zhǎng)為2以及PAM250計(jì)分矩陣)確定，在此引入其作為參考。
“特異性結(jié)合”指兩種分子先于結(jié)合環(huán)境中其他的分子而相互結(jié)合的能力。一般，“特異性結(jié)合”與反應(yīng)中偶發(fā)的結(jié)合的區(qū)別是至少兩倍，更通常至少10倍，常常至少100倍。通常，如通過(guò)解離常數(shù)定量的，特異性結(jié)合反應(yīng)的親和力或親合力為約10-7M或更強(qiáng)(例如，約10-8M，10-9M或甚至更強(qiáng))。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“區(qū)域”指生物分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，區(qū)域定義為蛋白質(zhì)氨基酸序列的連續(xù)部分。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”指對(duì)生物分子已知或懷疑的功能有貢獻(xiàn)的生物分子的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域可以是與區(qū)域或其部分具有共同范圍；也可包括生物分子不同的、非-連續(xù)的區(qū)域。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸、核酸、脂類(lèi)等等，并且所述化合物可以為天然的或合成的。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“包括”或其變化形式如“包含”將理解為暗示包含所述的整數(shù)或整數(shù)組而不是排除任何其他的整數(shù)或整數(shù)組。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“基本由...組成”將理解為暗示包含所述的整數(shù)或整數(shù)組；而排除修飾或?qū)?shí)質(zhì)上影響或改變所述的整數(shù)的其它整數(shù)。對(duì)于N-聚糖物質(zhì)，術(shù)語(yǔ)“基本由所述的N-聚糖組成”將理解為包含該N-聚糖，而無(wú)論該N-聚糖在直接連接于糖蛋白的天冬酰胺殘基的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上是否巖藻糖基化。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“占優(yōu)勢(shì)”或變化形式，如“占優(yōu)勢(shì)的”，將理解為表示在用PNG酶處理糖蛋白并且通過(guò)質(zhì)譜法例如MALDI-TOFMS分析釋放的聚糖后具有總N-聚糖的最高摩爾百分比(％)的聚糖種類(lèi)。也就是說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“占優(yōu)勢(shì)”定義為各個(gè)實(shí)體，如特定糖形，以比任何其它實(shí)體高的摩爾百分比存在。例如，如果組合物由40摩爾百分比的種類(lèi)A、35摩爾百分比的種類(lèi)B和25摩爾百分比的種類(lèi)C組成，該組合物包含占優(yōu)勢(shì)的種類(lèi)A，種類(lèi)B是其次占優(yōu)勢(shì)的物質(zhì)。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“基本不含”特定糖殘基，如巖藻糖或半乳糖等，用于表示糖蛋白組合物基本不含包括所述殘基的N-聚糖。以純度形式表示，基本不含表示N-聚糖結(jié)構(gòu)含有所述糖殘基的量不超過(guò)10％，優(yōu)選低于5％，更優(yōu)選低于1％，最優(yōu)選低于0.5％，其中百分比是重量百分比或摩爾百分比。因此，本發(fā)明的糖蛋白組合物中的基本所有N-聚糖結(jié)構(gòu)都不含巖藻糖或半乳糖，或這兩者。
當(dāng)任何時(shí)候N-聚糖結(jié)構(gòu)上不存在可檢測(cè)量的特定糖殘基時(shí)，此處用到的糖蛋白組合物“缺乏”所述糖殘基，如巖藻糖或半乳糖。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，糖蛋白組合物是由上文定義的低等真核生物，包括酵母(如畢赤氏酵母屬物種；啤酒糖酵母屬物種；克魯維氏酵母屬物種；曲霉屬物種)生產(chǎn)的，并且將“缺乏巖藻糖”，因?yàn)檫@些生物的細(xì)胞不具有產(chǎn)生巖藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)所需的酶。因此，術(shù)語(yǔ)“基本不含巖藻糖”包括術(shù)語(yǔ)“缺乏巖藻糖”。但是，即使組合物在一個(gè)時(shí)間含有巖藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)或含有上文所述有限的、但可檢測(cè)量的巖藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)，組合物也可以是“基本不含巖藻糖”。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合活性增加”可以與“結(jié)合親和力增加”互換使用，表示IgG分子與受體或其它指出的分子的結(jié)合增加。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合活性減少”可以與“結(jié)合親和力減少”互換使用，表示IgG分子與受體或其它指出的分子的結(jié)合減少。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“吞噬作用”定義為免疫復(fù)合物的清除。吞噬作用是免疫細(xì)胞，包括但不限于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的免疫學(xué)活性。
抗體和抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用和多種應(yīng)答，包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)、免疫復(fù)合物的清除(吞噬作用)、B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生和IgG血清半衰期在以下文獻(xiàn)中分別定義Daeron et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234；Ward and Ghetie，1995，TherapeuticImmunol.277-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13339-345；Heyman，2003，Immunol.Lett.88157-161；和Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9121-125。
除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的相同含義。以下描述了示例性方法和材料，盡管與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施本發(fā)明并且它們對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。本文所述的所有出版物和其它參考文件均全文引入作為參考。如有沖突，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。材料、方法和實(shí)施例僅為例舉說(shuō)明而并非意在限制。
重組Ig-GlcNAcMan5GlcNAc2分子本發(fā)明提供了包含糖基化Igs群體的組合物，所述Igs具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-連接的糖形。本發(fā)明也提供了具有占優(yōu)勢(shì)的、介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能，如受體結(jié)合的GlcNAcMan5GlcNAc2N-連接的糖形的Igs和Ig組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的Ig和FcγRIII受體之間的相互作用提供了直接結(jié)合活性的增加。并且，優(yōu)選地，本發(fā)明的Ig和FcγRIIb受體之間的相互作用提供了直接結(jié)合活性的減少(或缺乏)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的Ig或Ig組合物表現(xiàn)出結(jié)合活性增加，這是由糖形結(jié)構(gòu)的富集/占優(yōu)勢(shì)而賦予的。本發(fā)明的突出特征是它提供了具有占優(yōu)勢(shì)的、介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能的特定糖形的Igs和Ig組合物，所述效應(yīng)物功能例如ADCC活性增加或B細(xì)胞產(chǎn)生抗體增加。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的Ig或Ig組合物表現(xiàn)出ADCC活性增加或B細(xì)胞產(chǎn)生抗體增加，這是通過(guò)一種糖形的富集/占優(yōu)勢(shì)而賦予的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，產(chǎn)生具有占優(yōu)勢(shì)的糖形的Ig組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它避免了產(chǎn)生具有不利糖形的Igs和/或產(chǎn)生可能誘導(dǎo)不利作用和/或稀釋更有效的Ig糖形濃度的Igs。因此，考慮包含具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的Igs的藥物組合物將具有有益的特征，包括但不限于減少與FcγRIIb的結(jié)合，和增加與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合，因此在更低的劑量將是有效的，因此具有更高的效力/效能。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的Ig分子在Ig分子中的介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能的Fc區(qū)上的重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn-297上包含至少一種GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，GlcNAcMan5GlcNAc2結(jié)構(gòu)位于二聚化Ig的每個(gè)CH2區(qū)的每個(gè)Asn-297上(圖1)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含Igs的組合物，所述Igs占優(yōu)勢(shì)地由基本上由Asn-297上的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)組成的N-聚糖糖基化(圖1)?；蛘?，可以將一個(gè)或多個(gè)存在于Ig分子上的碳水化合物部分缺失和/或添加到分子上，由此添加或減少I(mǎi)g上的糖基化位點(diǎn)數(shù)。此外，Ig分子的CH2區(qū)域內(nèi)的N-連接的糖基化位點(diǎn)的位置可以通過(guò)在分子內(nèi)的不同位置導(dǎo)入天冬酰胺(Asn)或N-糖基化位點(diǎn)而改變。盡管Asn-297是通常存在于鼠和人IgG分子中的N-糖基化位點(diǎn)(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991)，但該位點(diǎn)不是可以預(yù)見(jiàn)的唯一位點(diǎn)，該位點(diǎn)也不一定是行使功能所必須保留的。采用公知的誘變方法，技術(shù)人員可以改變編碼本發(fā)明的Ig的DNA分子，使得Asn-297上的N-糖基化位點(diǎn)缺失，并且可以進(jìn)一步改變DNA分子，使得在Ig分子內(nèi)的其它位置可以建立一個(gè)或多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選的是在Ig分子的CH2區(qū)域內(nèi)建立N-糖基化位點(diǎn)。但是，在30％的血清抗體中描述了Ig的Fab區(qū)的糖基化-通常在Asn-75(Rademacher et al，1986，Biochem.Soc.Symp.，51131-148)。Ig分子的Fab區(qū)內(nèi)的糖基化是一個(gè)額外位點(diǎn)，可以與Fc區(qū)內(nèi)的N-糖基化組合在一起或是單獨(dú)的。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多至少約5摩爾百分比的水平存在。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多至少約10摩爾-約25摩爾百分比的水平存在。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多至少約25摩爾-約50摩爾百分比的水平存在。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多約50摩爾百分比以上的水平存在。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多約75摩爾百分比以上的水平存在。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的重組Ig組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)以比重組Ig組合物中其次占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)多約90摩爾百分比以上的水平存在。具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖(55.8％)的JC-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析示于圖4A。具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖(60％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析示于圖4B。
Ig-GlcNAcMan5GlcNAc2與FcγRIII受體的結(jié)合增加Ig與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合的效應(yīng)物功能，如激活A(yù)DCC，是由Ig分子的Fc區(qū)介導(dǎo)的。不同功能是由該區(qū)域中的不同結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。因此，本發(fā)明提供了Ig分子和組合物，其中Ig分子上的Fc區(qū)中具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖，它能夠行使效應(yīng)物功能。在一種實(shí)施方案中，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Fc區(qū)賦予了與FcγRIIIa(圖6)和FcγRIIIb(圖5)受體結(jié)合的增加。在另一種實(shí)施方案中，F(xiàn)c具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。技術(shù)人員容易理解，包含F(xiàn)c區(qū)的分子，如免疫粘附素(Chamowand Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.1452-60；Ashkenazi andChamow，1997，Curr Opin.Immunol 9195-200)、Fc融合蛋白和抗體樣分子也包含在本發(fā)明中。
可以測(cè)定Ig分子與Fc受體的結(jié)合活性(親和力)。FcγRIII與IgG的結(jié)合測(cè)定的一個(gè)實(shí)例描述于實(shí)施例6。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，該測(cè)定可以容易地適于與任何免疫球蛋白分子的測(cè)定聯(lián)合使用。
如圖5A所示，與Rituximab相比，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(根據(jù)本發(fā)明制備的一種Ig)與FcγRIIIb的結(jié)合活性增加了10倍，如圖6所示，與FcγRIIIa的結(jié)合活性增加了10倍以上。如圖5B所示，與Rituximab相比，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(根據(jù)本發(fā)明制備的另一種Ig)與FcγRIIIb的結(jié)合活性增加了約100倍。
最引人注意的是，F(xiàn)cγRIIIa基因二態(tài)性產(chǎn)生了兩種同種型FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall′Ozzo et al，2004，Cancer Res.644664-4669)。對(duì)于FcγRIIIa-158V純合的基因型與對(duì)Rituximab的較高臨床反應(yīng)相關(guān)(Cartron et aL.，2002，Blood，99754-758)。但是，大多數(shù)人群只攜帶一個(gè)FcγRIIIa-158F等位基因，使得Rituximab對(duì)于大多數(shù)人群通過(guò)FcγRIIIa結(jié)合誘導(dǎo)ADCC來(lái)說(shuō)效率是較低的。但是，當(dāng)Rituximab樣抗CD20抗體在缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該抗體對(duì)于通過(guò)FcγRIIIa-158F和FcγRIIIa-158V增強(qiáng)ADCC是同樣有效的(Niwa et al.，2004，Clin.CaneRes.106248-6255)。本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案的抗體在不在N-聚糖上添加巖藻糖的宿主細(xì)胞中表達(dá)(如巴斯德畢赤氏酵母，即一種缺乏巖藻糖的酵母宿主；參見(jiàn)實(shí)施例1和2)。因此，考慮本發(fā)明的缺乏巖藻糖、并且與FcγRIIIa-158F的結(jié)合增強(qiáng)的抗體可能對(duì)于治療很多表現(xiàn)出對(duì)Rituximab的反應(yīng)減少的患者是特別有用的。
Ig-GlcNAcMan5GlcNAc2與FcγRIIb受體的結(jié)合減少I(mǎi)g與FcγRIIb結(jié)合的效應(yīng)物功能，如B細(xì)胞產(chǎn)生抗體增加和ADCC活性增加，是由Ig分子的Fc區(qū)介導(dǎo)的。不同功能是由該區(qū)域中的不同結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。因此，本發(fā)明提供了Ig分子和組合物，其中Ig分子上的Fc區(qū)中具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖，它能夠行使效應(yīng)物功能。在一種實(shí)施方案中，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Ig的Fc區(qū)賦予了與FcγRIIb受體的結(jié)合減少。技術(shù)人員容易理解，包含F(xiàn)c區(qū)的分子，如免疫粘附素(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.1452-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr Opin.Immunol 9195-200)、Fc融合蛋白和抗體樣分子也包含在本發(fā)明中。
可以測(cè)定Ig分子與Fc受體的結(jié)合活性(親和力)。FcγRIIb與IgG1的結(jié)合測(cè)定的一個(gè)實(shí)例描述于實(shí)施例6。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，該測(cè)定可以容易地適于與任何免疫球蛋白分子的測(cè)定聯(lián)合使用。
如圖7A所示，與Rituximab相比，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(本發(fā)明的一種Ig)與FcγRIIb的結(jié)合活性減少了大約8倍。如圖7B所示，與Rituximab相比，具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(本發(fā)明的另一種Ig)與FcγRIIb的結(jié)合活性減少了約2-5倍。
抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性增加在另一種實(shí)施方案中，F(xiàn)cγRIIIa或FcγRIIIb與具有GlcNAcMan5GlcNAc2作為占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的Ig分子或組合物可以賦予FcγRIII介導(dǎo)的ADCC的增加。已經(jīng)充分證明，F(xiàn)cγRIII(CD 16)受體負(fù)責(zé)ADCC活性(Daeron et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234)。在另一種實(shí)施方案中，具有GlcNAcMan5GlcNAc2作為占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的Ig分子或組合物與FcγRIIb的結(jié)合減少，賦予了ADCC的增加(Clynes et al.，2000，supra)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的Ig分子或組合物表現(xiàn)出ADCC活性增加，這是通過(guò)占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2的存在賦予的。
測(cè)量B細(xì)胞消耗的測(cè)定的一個(gè)實(shí)例和熒光釋放ADCC測(cè)定公開(kāi)于實(shí)施例7。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這些公開(kāi)的測(cè)定可以容易地適于與任何Ig分子的測(cè)定聯(lián)合使用。此外，動(dòng)物模型中的體內(nèi)ADCC測(cè)定可以適合于任何特異性IgG，參見(jiàn)Borchmann et al，2003，Blood，1023737-3742，Niwa et aL.，2004，Cancer Researeh，642127-2133和實(shí)施例7。
B細(xì)胞產(chǎn)生抗體增加已經(jīng)證明了抗體通過(guò)調(diào)節(jié)性FcγR途徑抗腫瘤(Clynes et al，2000，Nature，6443-446)。具體地，已知當(dāng)FcγRIIb與含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)的受體如B細(xì)胞受體(BCR)、FcγRI、FcγRIII和FcεRI共交聯(lián)時(shí)，它抑制ITAM介導(dǎo)的信號(hào)(Vivierand Daeron，1997，Immunol.Today，18286-291)。例如，F(xiàn)cgRII特異性抗體的添加阻斷Fc與FcgRIIB的結(jié)合，導(dǎo)致B細(xì)胞增殖增加(Wagle et al，1999，J of Immunol 1622732-2740)。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的Ig分子可以介導(dǎo)FcγRIIb受體結(jié)合的減少，導(dǎo)致B細(xì)胞的激活，其隨后催化漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11331-360)。測(cè)量B細(xì)胞產(chǎn)生抗體IgG1的測(cè)定的一個(gè)實(shí)例描述于實(shí)施例6。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，該測(cè)定可以容易地適于與任何免疫球蛋白分子的測(cè)定聯(lián)合使用。
其它免疫學(xué)活性已經(jīng)表明中性粒細(xì)胞上效應(yīng)細(xì)胞分子的表面表達(dá)改變，增加了對(duì)細(xì)菌感染的易感性(Ohsaka et al，1997，Br.J.Haematol.98108-113)。進(jìn)一步證明了IgG與FcγRIIIa效應(yīng)細(xì)胞受體的結(jié)合調(diào)節(jié)了腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)(Blom.Et al，2004，Arthritis Rheum.，481002-1014)。此外，F(xiàn)cγR誘導(dǎo)的TNF-α也增加中性粒細(xì)胞結(jié)合和吞噬IgG包被的紅細(xì)胞的能力(Capsoni et al，1991，J.Clin.Lab Immunol.34115-124)。因此，認(rèn)為本發(fā)明的表現(xiàn)出與FcγRIII的結(jié)合增加的Ig分子和組合物可以賦予TNF-α表達(dá)的增加。
已經(jīng)證明FcγRIII受體活性的增加溶酶體β-葡糖苷酸酶和其它溶酶體酶的分泌(Kavai et al，1982，Adv.Exp Med.Biol.141575-582；Ward和Ghetie，1995，Therapeutic Immunol，277-94)。此外，免疫受體被它們的配體占據(jù)的一個(gè)重要步驟是它們的內(nèi)化和送遞到溶酶體(Bonnerot et al，1998，EMBO J.，174906-4916)。因此，認(rèn)為本發(fā)明的表現(xiàn)出與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合增加的Ig分子或組合物可以賦予溶酶體酶分泌的增加。
FcγRIIIb僅僅存在于中性粒細(xì)胞上，它在免疫復(fù)合物的組裝中起主要作用，并且它的聚集激活吞噬作用、脫顆粒和呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致被調(diào)理的病原體的破壞。中性粒細(xì)胞的激活導(dǎo)致相應(yīng)于受體兩個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的受體的蛋白水解裂解的可溶形式的分泌。可溶FcγRIIIb通過(guò)FcγR依賴(lài)性效應(yīng)物功能的競(jìng)爭(zhēng)性抑制并通過(guò)與補(bǔ)體受體CR3的結(jié)合施加調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生(Sautes-Fridman et al，2003，ASHI Quarterly，148-151)。
因此，本發(fā)明提供了包含基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖的免疫球蛋白分子；并且提供了包含免疫球蛋白和多個(gè)與其連接的N-聚糖的組合物，其中所述多個(gè)N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。在任一種實(shí)施方案中，如本文中所示，所述GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖在免疫球蛋白上的優(yōu)勢(shì)優(yōu)選賦予需要的治療效應(yīng)物活性，與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合改進(jìn)，以及與FcγRIIb的結(jié)合減少。
免疫球蛋白亞類(lèi)已經(jīng)證明IgG亞類(lèi)具有對(duì)Fc受體的不同結(jié)合親和力(Huizinga etal，1989，J.of Immunol，1422359-2364)。每一種IgG亞類(lèi)可以提供本發(fā)明不同方面的特定優(yōu)點(diǎn)。因此，一方面，本發(fā)明提供了包括GlcNAcMan5GlcNAc2作為與IgG1分子連接的占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的IgG1組合物。另一方面，本發(fā)明包括GlcNAcMan5GlcNAc2作為與IgG2分子連接的占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的IgG2組合物。另一方面，本發(fā)明包括GlcNAcMan5GlcNAc2作為與IgG3分子連接的占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的IgG3組合物。另一方面，本發(fā)明包括GlcNAcMan5GlcNAc2作為與IgG4分子連接的占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的IgG4組合物。
或者，本發(fā)明可以應(yīng)用于所有5類(lèi)主要的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。本發(fā)明的優(yōu)選免疫球蛋白是人IgG，優(yōu)選是亞類(lèi)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之一。更優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫球蛋白是IgG1分子。
制備介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能和活性的重組免疫球蛋白分子一方面，本發(fā)明提供了制備具有N-聚糖的重組Ig分子的方法，所述N-聚糖基本由CH2結(jié)構(gòu)域的Asn-297上的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)組成，其中所述Ig分子介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能和活性，類(lèi)似地，提供了免疫球蛋白組合物，其中與免疫球蛋白連接的占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖是GlcNAcMan5GlcNAc2。在一種實(shí)施方案中，用重疊寡核苷酸合成Ig的重鏈和輕鏈，并且分別克隆到表達(dá)載體中(實(shí)施例1)，以便在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在主要催化GlcNAcMan5GlcNAc2添加的宿主株中表達(dá)重組Ig重鏈和輕鏈。在一種實(shí)施方案中，該糖形結(jié)構(gòu)更具體稱(chēng)作[(GlcNAcβ1，2-Manα1，3)(Manα1，3 Manα1，6 Manα，6)Manβ1，4-GlcNAcβ1，4-GlcNAc]，在Ig上的Fc區(qū)的氨基酸Asn-297的氮和GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖上的N-乙酰-β-D-葡糖胺的羥基之間形成鍵。在另一種實(shí)施方案中，可以在Ig分子內(nèi)的不同位點(diǎn)(不是Asn-297)，或與Fab區(qū)中的N-糖基化位點(diǎn)組合添加該占優(yōu)勢(shì)的聚糖。
在低等真核生物中制備具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2的Ig本發(fā)明的一方面提供了重組的低等真核宿主細(xì)胞，其可以用于制備占優(yōu)勢(shì)地具有GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的免疫球蛋白或抗體分子，與天然以低產(chǎn)率產(chǎn)生所述糖形的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白的組合物相比，GlcNAcMan5GlcNAc2是有利的。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是糖蛋白的組合物是用容易再現(xiàn)的預(yù)定的糖基化模式提供的。評(píng)估了所述組合物的特性，并且優(yōu)化得到需要的特性，而不利作用可以被一起最小化或避免。
本發(fā)明也提供了制備重組宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞被工程化或經(jīng)過(guò)選擇，以表達(dá)一種或多種核酸，用于生產(chǎn)包含基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖的Ig分子和具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的Ig組合物。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，用重組宿主細(xì)胞，優(yōu)選是重組的低等真核宿主細(xì)胞制備所述Ig分子和具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖的組合物。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括可以從重組宿主細(xì)胞或通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的糖蛋白。
可以用編碼需要的Ig區(qū)的載體和用編碼此處描述的一種或多種糖基化相關(guān)酶的載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主細(xì)胞，然后選擇用于具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的重組Ig分子或組合物的表達(dá)。本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可以是真核或原核宿主細(xì)胞，如動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌細(xì)胞等，其可以被工程化或經(jīng)過(guò)選擇，以制備具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的Ig組合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞是低等真核宿主細(xì)胞，按照本領(lǐng)域的描述對(duì)其進(jìn)行了遺傳工程化(WO 02/00879，WO 03/056914，WO04/074498，WO 04/074499，Choi et al，2003，PNAS，1005022-5027；Hamilton et al，2003，Nature，3011244-1246和Bobrowicz et al，2004，Glycobiology，14757-766)。具體地，WO 02/00879公開(kāi)了具有GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白，WO 04/074499公開(kāi)了具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白(并且具體公開(kāi)了免疫球蛋白)。
在一種實(shí)施方案中，編碼IgG1的載體，例如含有JC-IgG1的AOX1/pPICzA載體(實(shí)施例1)被導(dǎo)入巴斯德畢赤氏酵母YAS385-1株中。該YAS385-1株類(lèi)似于除去了K3報(bào)道蛋白(Hamilton et al，2003，Science，3011244-1246)，并且按照描述破壞了PNO1和MNN4b基因(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/020808)，并且按照描述導(dǎo)入了β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I基因(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/108088)的YSH44株。ΔpnolΔmnn4b雙破壞導(dǎo)致甘露糖基-磷酸化的去除。通過(guò)使酵母株在5-氟乳清酸(5-FOA)上生長(zhǎng)(Guthrie and Fink，1991，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Vol.169，Academic Press，San Diego)而除去甘露糖酶II基因，所述基因是按照對(duì)YSH44的描述導(dǎo)入的(Hamilton et al.，2003)，其側(cè)翼是URA5基因。甘露糖酶II基因的除去維持了五甘露糖核心結(jié)構(gòu)，其末端α-1，3和α-1，6甘露糖連接于α-1，6甘露糖臂和α-1，3甘露糖上的β-1，2GlcNAc，并且末端β-1，4半乳糖連接于β-1，2GlcNAc。然后用在AMR2基因座上插入U(xiǎn)RA3基因的URA3敲除質(zhì)粒(Guthrie and Fink，1991，supra)破壞AMR2基因，由此除去β-甘露糖甲基化(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/118008)。該YAS385-1株表達(dá)具有占優(yōu)勢(shì)的GalGlcNAcMan5GlcNAc2和GlcNAcMan5GlcNAc2的糖蛋白，得到具有占優(yōu)勢(shì)的GalGlcNAcMan5GlcNAc2和GlcNAcMan5GlcNAc2的JC-IgG。用β-半乳糖苷酶處理該具有占優(yōu)勢(shì)的GalGlcNAcMan5GlcNAc2和GlcNAcMan5GlcNAc2的JC-IgG(實(shí)施例3)，得到具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(圖4A)。
在另一種實(shí)施方案中，也將在含有DX-IgG的AOX1/pPICZA中編碼IgG1的載體(實(shí)施例1)導(dǎo)入巴斯德畢赤氏酵母YAS385-1株(上文)，純化，然后用β-半乳糖苷酶處理(實(shí)施例3)，得到具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(圖4B)。
或者，可以用本領(lǐng)域公知的一些方法表達(dá)本發(fā)明的抗體(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
低等真核生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)和穩(wěn)定的基因整合已經(jīng)描述過(guò)用諸如URA3，URA5，HIS4，SUC2，G418，BLA或SH BLA的選擇標(biāo)記在低等真核宿主株(巴斯德畢赤氏酵母)如中導(dǎo)入異源基因和證實(shí)其整合的方法。當(dāng)在低等真核生物中產(chǎn)生表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，所述方法適于制備本發(fā)明的Ig。此外，描述了允許重復(fù)使用URA3標(biāo)記物除去不需要的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。Alani et al，1987，Genetics，116541-545和美國(guó)專(zhuān)利No.6,051,419描述了基于破壞巴斯德畢赤氏酵母中的URA3基因的選擇系統(tǒng)。優(yōu)選地，用PpURA3或PpURA5-blaster盒破壞URA3、URA5或尿嘧啶生物合成途徑中的任何基因，允許基于尿嘧啶的營(yíng)養(yǎng)缺陷和對(duì)5-氟乳清酸(5FOA)的抗性進(jìn)行陽(yáng)性和陰性選擇(Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet，197345-346)。因此，技術(shù)人員可以理解，所示系統(tǒng)使得能夠通過(guò)選擇和負(fù)選擇而插入多個(gè)異源基因。
進(jìn)一步的酶促修飾進(jìn)一步的酶促缺失可能對(duì)于分離可能賦予人類(lèi)中的異常免疫原性活性的、不具有半乳糖基磷酸化或β-甘露糖基化的Ig是有益或必要的。如所述的，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/020808公開(kāi)了去除甘露糖基磷酸化的方法，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/118008公開(kāi)了去除β-甘露糖基化的方法。
在其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)中制備具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的Ig本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，選擇表達(dá)宿主系統(tǒng)(生物)用于異源蛋白表達(dá)，所述宿主系統(tǒng)可能需要或不需要經(jīng)過(guò)工程化以表達(dá)具有占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)的Ig。此處提供的實(shí)例是進(jìn)行Ig表達(dá)的一種方法的實(shí)例，所述Ig在Asn-297或另一N-糖基化位點(diǎn)或這兩者具有特定的聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地修改本發(fā)明的這些細(xì)節(jié)和實(shí)例，使其適用于任何蛋白表達(dá)宿主系統(tǒng)(生物)。
可以采用其它蛋白表達(dá)宿主系統(tǒng)，包括動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌細(xì)胞等來(lái)制備本發(fā)明的Ig分子和組合物。所述蛋白表達(dá)宿主系統(tǒng)可以經(jīng)過(guò)工程化，或經(jīng)過(guò)選擇，以表達(dá)占優(yōu)勢(shì)的糖形或可以天然產(chǎn)生具有占優(yōu)勢(shì)的聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。產(chǎn)生具有占優(yōu)勢(shì)的糖形的工程化的蛋白表達(dá)宿主系統(tǒng)的實(shí)例包括基因敲除/突變(Shields et al，2002，JBC，27726733-26740)；基因工程(Umafia et al，1999，Nature Biotech.，17176-180)或這兩者的組合?；蛘?，某些細(xì)胞天然表達(dá)占優(yōu)勢(shì)的糖形-例如，雞、人和牛(Raju et al，2000，Glycobiology，10477-486)。因此，通過(guò)選擇很多表達(dá)宿主系統(tǒng)中的至少一個(gè)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得本發(fā)明的具有占優(yōu)勢(shì)的一種特定聚糖結(jié)構(gòu)的Ig糖蛋白或組合物的表達(dá)。本領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)的用于制備糖蛋白的其它表達(dá)宿主系統(tǒng)包括CHO細(xì)胞Raiu WO9922764A1和Presta WO03/035835A1；雜交瘤細(xì)胞Trebak et al，1999，J.Immunol.Methods，23059-70；昆蟲(chóng)細(xì)胞Hsu et al，1997，JBC，2729062-970，和植物細(xì)胞Gerngrosset al，WO 04/074499A2。
IgG的純化純化和分離抗體的方法是公知的，并且在本領(lǐng)域中有描述。參見(jiàn)，例如，Kohler & Milstein，(1975)Nature 256495；Brodear et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；.Goding，MonoclonalAutibodiesPrinciples and Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；和Jakobovits et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551-255以及Jakobovits et al，(1993)Nature 362255-258。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以從用McCafferty et al.(1990)Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)建立的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體或抗體片段，用感興趣的抗原選擇合適的抗體或抗體片段。
可以根據(jù)實(shí)施例3中概括的方法純化根據(jù)本發(fā)明的方法制備的重組Ig分子。圖2顯示了從YAS385-1純化的JC-IgG的SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠。圖3顯示了從YAS385-1純化的DX-IgG的SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠。在另一種實(shí)施方案中，純化的Ig抗體具有GlcNAcMan5GlcNAc2作為占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一些質(zhì)譜法確定聚糖分析和在Ig分子上的分布，所述質(zhì)譜法包括但不限于HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOF MS。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)實(shí)施例5公開(kāi)的MALDI-TOF MS分析確定聚糖分布。圖4A顯示了從YAS385-1純化，并且用β-半乳糖苷酶處理的JC-IgG的MALDI-TOF譜(實(shí)施例3)。該MALDI-TOF顯示總N-聚糖的大約55.8摩爾％是GlcNAcMan5GlcNAc2。圖4B顯示從YAS385-1純化，并且用β-半乳糖苷酶處理的DX-IgG的MALDI-TOF譜。該MALDI-TOF顯示總N-聚糖的大約60摩爾％是GlcNAcMan5GlcNAc2。
藥物組合物可以將本發(fā)明的抗體摻入藥物組合物，所示組合物包含作為活性治療劑的抗體和多種其它可藥用的成分。參見(jiàn)Remington′sPharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。優(yōu)選的形式取決于施用途徑和治療用途。根據(jù)需要的制劑，組合物也可以包括可藥用的、無(wú)毒載體或稀釋劑，其定義為通常用于配制用于動(dòng)物或人類(lèi)施用的藥物組合物的載體。選擇稀釋劑，以便不影響組合物的生物活性。所述稀釋劑的實(shí)例是蒸餾水、生理磷酸緩沖液、林格氏液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，藥物組合物或制劑也可以包括其它載體、佐劑或無(wú)毒、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。
用于腸胃外施用的藥物組合物是無(wú)菌的、基本等滲的、無(wú)致熱源的，并且是根據(jù)FDA或相似機(jī)構(gòu)的GMP制備的?？梢栽谏砜山邮艿南♂寗┖退帉W(xué)載體中施用可注射劑量的物質(zhì)的溶液或懸浮液，所述載體可以是無(wú)菌液體，如水、油、鹽水、甘油或乙醇。此外，組合物中可以存在輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它成分是石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些，例如花生油、大豆油和礦物油。概言之，諸如丙二醇或聚乙二醇的多元醇是優(yōu)選的液體載體，特別是用于可注射溶液。可以以?xún)?chǔ)存注射或植入制劑的形式施用抗體，它們是以允許活性成分持續(xù)釋放的方式配制的。典型地，制備可注射的組合物，作為液體溶液或懸浮液；也可以制備固體形式，其適用于在注射前溶于或懸浮于液體載體。也可以將制劑乳化，或包被在脂質(zhì)體或微粒如聚交酯、聚乙醇酸交酯或用于增強(qiáng)佐劑效果的共聚物中，如上文的討論(參見(jiàn)Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-1191997)。
診斷產(chǎn)品也可以將本發(fā)明的抗體摻入多種診斷試劑盒和其它診斷產(chǎn)品，如陣列。提供的抗體通常預(yù)先結(jié)合于固相，如微量滴定板的孔。試劑盒通常含有用于檢測(cè)抗體結(jié)合的試劑和用于提供使用試劑盒的指導(dǎo)的標(biāo)簽。免疫測(cè)量或夾心測(cè)定是診斷試劑盒的優(yōu)選形式(參見(jiàn)US4,376,110，4,486,530，5,914,241和5,965,375)?？贵w陣列描述于例如US 5,922,615，US 5,458,852，US 6,01 9,944和US 6,143,576。
治療用途本發(fā)明提供了糖蛋白組合物，其包含在糖蛋白上占優(yōu)勢(shì)的特定糖形。本發(fā)明的一個(gè)特征是當(dāng)給包括人的哺乳動(dòng)物施用時(shí)，在優(yōu)選實(shí)施方案中，與具有相似一級(jí)結(jié)構(gòu)的其它糖蛋白組合物相比，包含新的糖蛋白組合物的藥物組合物有利地表現(xiàn)出優(yōu)越的體內(nèi)特性。因此，本發(fā)明的新組合物可以用于目前采用糖蛋白藥劑的場(chǎng)合，并且可以有利地提供改進(jìn)的特性和在產(chǎn)品各批次中的增加的統(tǒng)一性。本發(fā)明的制劑可以摻入溶液、單位劑型，如用于口服的片劑和膠囊中，以及摻入懸浮液、油膏等，這取決于特定的藥物或藥劑及其目標(biāo)領(lǐng)域。
在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了新的組合物，用于糖蛋白藥學(xué)試劑、藥物或藥劑，其中糖蛋白包括免疫球蛋白分子和包含糖蛋白劑的占優(yōu)勢(shì)的特定糖形的組合物。根據(jù)本發(fā)明的特定方面，提供了包含免疫球蛋白糖蛋白的組合物，該糖蛋白具有本文描述的占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的N-連接的寡糖。在優(yōu)選方面，糖蛋白是抗體，特別可以是單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備本發(fā)明的組合物的方法和工具。
本發(fā)明進(jìn)一步包括包含本發(fā)明的糖形制劑的藥物組合物。該組合物優(yōu)選是無(wú)菌的。當(dāng)組合物是水溶液時(shí)，糖蛋白優(yōu)選是可溶的。當(dāng)組合物是凍干的粉末時(shí)，粉末優(yōu)選可以在合適的溶劑中重配。
在其它方面，本發(fā)明包括用于治療疾病狀態(tài)的方法，包括給有需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效劑量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供在制品或試劑盒中的糖形制劑，其可以用于治療疾病或病癥的目的。
本發(fā)明的具有占優(yōu)勢(shì)的GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Ig分子具有很多治療用途，用于以下適應(yīng)癥，如癌癥、炎性疾病、感染、免疫疾病、自身免疫疾病，包括特發(fā)性血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自身免疫性溶血性貧血。
以下是參考Ig糖蛋白組合物的制備而說(shuō)明本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為是限制性的包含該實(shí)施例的目的僅在于舉例說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，該公開(kāi)內(nèi)容的許多修改和延伸都是可能的。所述修改和延伸被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
實(shí)施例1克隆DX-IgG1以在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)DX-IgG1(一種抗CD20的IgG1)的輕鏈(L)和重鏈(H)由小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成。輕鏈在SEQ ID NO1中公開(kāi)，重鏈在SEQ ID NO2中公開(kāi)。重鏈和輕鏈序列用購(gòu)自Integrated DNATechnologies(IDT)的重疊寡核苷酸合成。對(duì)于輕鏈可變區(qū)，購(gòu)買(mǎi)了15個(gè)重疊寡核苷酸(SEQ ID NO5-19)，在PCR反應(yīng)中用Extaq(Takada)退火，產(chǎn)生具有5’MlyI位點(diǎn)的輕鏈可變區(qū)片段。該輕鏈可變片段然后用5’MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO20)，3’可變/5’恒定引物L(fēng)fusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO21)，3’恒定區(qū)引物L(fēng)fusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO22)和3’CD20L/lp(SEQ ID NO23)通過(guò)重疊PCR與輕鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO3)(Gene Art，Toronto，Cabada)連接。最終的MlyI-輕鏈片段(其包括5’AG堿基對(duì))然后被插入到pCR2.1 topo載體(Invitrogen)中得到pDX343。對(duì)于重鏈，相應(yīng)于小鼠重鏈可變區(qū)的17個(gè)重疊寡核苷酸(SEQ ID NO24-40)購(gòu)自IDT，用Extaq退火。該重鏈可變片段然后用5’MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO41)，5’可變/恒定引物HchainASTKGPS/up(SEQ ID NO42)，3’可變/恒定引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO43)和3’恒定區(qū)引物HFckpn1/lp(SEQ ID NO44)通過(guò)重疊PCR與重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO4)(Gene Art)連接。最終的MlyI-重鏈片段(其包括5’AG堿基對(duì))然后被插入到pCR2.1 topo載體(Invitrogen)中得到pDX360。全長(zhǎng)輕鏈和全長(zhǎng)重鏈被從各自的topo載體中分離為MlyI和NotI片段。這些輕鏈和重鏈片段然后用4個(gè)重疊寡核苷酸——P.BiPss/UP1-EcoRI，P.BiPss/LP1，P.BiPss/LP2和P.BiP/LP2(分別為SEQ ID NO46-49)連接到Kar2(Bip)信號(hào)序列(SEQ ID NO45)上，然后連接到pPICZA的MlyI-NotI位點(diǎn)中，得到攜帶有Kar2-輕鏈的pDX344和攜帶有Kar2-重鏈的pDX468。pDX344的BglII-BamHI片段然后被亞克隆到含有用于染色體整合的AOX2啟動(dòng)子基因的pBK85中，得到pDX458。攜帶有重鏈的pDX468的BglII-BamHI片段然后被亞克隆到pDX458中，得到含有在AOX1啟動(dòng)子控制下的CD20的重鏈和輕鏈的pDX478。然后該質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化前用SpeI線性化，以整合到AOX2基因座，用Zeocin抗性選擇轉(zhuǎn)化體。(參見(jiàn)實(shí)施例2)。克隆JC-IgG1以在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)JC-IgG1的輕鏈(L)和重鏈(H)由小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成。小鼠可變輕鏈在SEQ ID NO50(GenBank#AF013576)中公開(kāi)，小鼠可變重鏈在SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)中公開(kāi)。重鏈和輕鏈序列用購(gòu)自Integrated DNA Technologies(IDT)的重疊寡核苷酸合成。對(duì)于輕鏈，購(gòu)買(mǎi)了12個(gè)重疊寡核苷酸(SEQ ID NO52-63)，在PCR反應(yīng)中用Extaq(Takada)退火，產(chǎn)生具有5’EcoRI位點(diǎn)和3’KpnI位點(diǎn)的660個(gè)堿基對(duì)的輕鏈。該輕鏈然后被亞克隆到pPICZA載體(Invitrogen)中，作為EcoRI-Kpn1片段。對(duì)于重鏈，購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)于Fab片段的12個(gè)重疊寡核苷酸(SEQ ID No64-75)，用Extaq退火，產(chǎn)生660個(gè)堿基對(duì)的Fab片段。Fc片段用12個(gè)重疊寡核苷酸(SEQ ID NO76-87)合成，其在類(lèi)似的重疊PCR反應(yīng)中退火。重鏈的Fab和Fc片段然后用相應(yīng)于重鏈Fab片段的5’末端的5’EcoRI引物(SEQ ID NO64)和相應(yīng)于Fc片段的3’末端的3’KpnI引物(SEQ ID NO88)，用pFU Turbo聚合酶(Stratagene)退火，產(chǎn)生1330個(gè)堿基對(duì)的重鏈。使用引物中編碼的5’EcoRI和3’KpnI位點(diǎn)，重鏈被克隆到pPICZa載體中。AOX2啟動(dòng)子序列，其起整合基因座的作用，被亞克隆到最終的pPICZa載體中。接下來(lái)，含有AOX1啟動(dòng)子的BglII-BstBI片段和含有來(lái)自人肝臟cDNA文庫(kù)的HAS序列(SEQ ID NO89)的BstBI-BamHI片段，凝血酶位點(diǎn)(SEQ ID NO90)和JC輕鏈均被亞克隆到該AOX2/pPICZa載體的BamHI位點(diǎn)處。然后另一個(gè)含有AOX1啟動(dòng)子的BglII-BstBI片段和含有HAS序列的BstBI-BamHI片段，凝血酶位點(diǎn)和JC重鏈被亞克隆到相同的pPICZa載體的BamHI位點(diǎn)處。最后的載體包括AOX2整合基因座，HAS標(biāo)記的JC輕鏈和HAS標(biāo)記的JC重鏈，得到pJC140。該表達(dá)盒被整合到巴斯德畢赤氏酵母菌株的AOX2基因座，轉(zhuǎn)化體用Zeocin抗性選擇。(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
Rituximab/Rituxan是購(gòu)自于Biogen-IDEC/Genentech，SanFrancisco，CA的抗CD20小鼠/人嵌合IgG1PCR擴(kuò)增Eppendorf Mastercycler被用于所有PCR反應(yīng)中。PCR反應(yīng)包含模板DNA，125μM dNTP，0.2μM每種正向和反向引物，Ex Taq聚合酶緩沖液(Takara Bio Inc.)，和Ex Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶緩沖液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。DNA片段的擴(kuò)增采用30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是97℃15秒，55℃15秒和72℃90秒，起始去飽和步驟是97℃2分鐘，最后的延伸步驟是72℃7分鐘。
PCR樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳被分離，DNA條帶用Qiagen的GelExtraction試劑盒提取并純化。所有DNA純化物用10mM Tris，pH8.0洗脫，除了最后的PCR(所有三種片段的重疊)，其用去離子水洗脫。
實(shí)施例2IgG載體向巴斯德畢赤氏酵母菌株YAS385-1中的轉(zhuǎn)化通過(guò)加入乙酸鈉至終濃度為0.3M而制備載體DNA。然后百分之百冰冷的乙醇被加入到DNA樣品中至終濃度為70％。DNA通過(guò)離心(12000g×10分鐘)而沉淀，并用70％冰冷的乙醇洗滌。DNA被干燥并重懸于50μl 10mM Tris，pH8.0中。通過(guò)將較少的培養(yǎng)物在BMGY(緩沖的最少的甘油100mM磷酸鉀，pH6.0；1.34％酵母氮基；4×5-10％生物素；1％甘油)中擴(kuò)增至O.D.為約2-6而制備要轉(zhuǎn)化的YAS385-1酵母培養(yǎng)物(Choi et al，2003；Hamilton et al，2003)。然后酵母細(xì)胞在1M山梨醇中洗滌3次，重懸于約1-2ml 1M的山梨醇，從而被制成電感受態(tài)。DNA(1-2μg)與100μl感受態(tài)酵母混合并在冰上溫育10分鐘。然后酵母細(xì)胞用BTX Electrocell Manipulator 600進(jìn)行電穿孔，參數(shù)是1.5kV，129ohms，和25μF。一毫升的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖，1M山梨醇)被加入到電穿孔的細(xì)胞中。隨后轉(zhuǎn)化的酵母被接種到含有zeocin的選擇性瓊脂平板上。
用于在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生IgG1的培養(yǎng)條件用pDX478或pJC140轉(zhuǎn)化的YAS385-1的單菌落被接種到50mlFalcon Centrifuge管中的10ml BMGY培養(yǎng)基(由1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34％酵母氮基；4×5-10％生物素；1％甘油組成)中。該培養(yǎng)物在24℃/170-190rpm搖動(dòng)培養(yǎng)48小時(shí)直到培養(yǎng)物飽和。然后100ml的BMGY被加入到500ml的帶擋板的燒瓶(baffled flask)中。然后種子培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到含有100mlBMGY培養(yǎng)基的帶擋板的燒瓶中。該培養(yǎng)物在24℃/170-190rpm搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。將燒瓶?jī)?nèi)物質(zhì)輕輕移入兩個(gè)50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm離心10分鐘。細(xì)胞沉淀用20ml不含甘油的BMGY洗滌一次，然后用20ml的BMMY(用1％MeOH替換1％甘油的BMGY)輕輕重懸。該重懸的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至250ml帶擋板的燒瓶中。該培養(yǎng)物在24℃/170-190rpm搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。然后燒瓶?jī)?nèi)物質(zhì)被輕輕移入兩個(gè)50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm離心10分鐘。在蛋白質(zhì)分離之前，培養(yǎng)物上清液用ELISA分析，確定近似抗體滴度(參見(jiàn)實(shí)施例3)。
培養(yǎng)物上清液中抗體的定量分析通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)進(jìn)行高結(jié)合力微量滴定板(Costar)用10ml PBS，pH7.4中的24μg山羊抗人Fab(Biocarta，Inc，San Diego，CA)包被，4℃溫育過(guò)夜。除去緩沖液，加入封閉緩沖液(PBS中的3％BSA)，然后室溫溫育1個(gè)小時(shí)。除去封閉緩沖液，將板用PBS洗滌3次。最后一次洗滌之后，加入遞增體積的抗體培養(yǎng)物上清液(0.4，0.8，1.5，3.2，6.25，12.5，25和50μl)，室溫溫育1小時(shí)。然后將板用PBS+0.05％Tween20洗滌。最后一次洗滌之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室溫溫育1小時(shí)。然后板用PBS-Tween20洗滌4次。板用TMB底物試劑盒進(jìn)行分析，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(PierceBiotechnology)操作。
實(shí)施例3IgG1的純化單克隆抗體用Streamline蛋白A柱從培養(yǎng)物上清液中捕獲?？贵w在Tris-Glycine pH3.5中洗脫，用1M Tris pH8.0中和。進(jìn)一步的純化用疏水相互作用層析(HIC)進(jìn)行。HIC柱的特定類(lèi)型取決于抗體。對(duì)于JC-IgG和DX-IgG，使用苯基瓊脂糖凝膠柱(也可以使用辛基瓊脂糖凝膠)，使用20mM Tris(7.0)，1M(NH4)2SO4緩沖液，用1M到6M(NH4)2SO4線性梯度緩沖液洗脫。苯基瓊脂糖凝膠柱的抗體級(jí)分被合并并交換到50mM NaOAc/Tris pH5.2緩沖液中，通過(guò)陽(yáng)離子交換(SP Sepharose Fast Flow)柱進(jìn)行最后的純化?？贵w用50mM Tris，1M NaCl(pH 7.0)進(jìn)行線性梯度洗脫。
用β-半乳糖苷酶處理Ig-GlcNAcMan5GlcNAc25mg純化的IgG(JC-IgG或DX-IgG)被緩沖交換到50mM NH4AcpH5.0中。在硅化管中，0.03Uβ-1，4-半乳糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)被加入到50mM NH4Ac pH5.0中的純化的IgG中，在37℃溫育16-24小時(shí)。該樣品被蒸發(fā)干燥，重懸于水中，用MALDI-TOF分析。然后用前述的苯基瓊脂糖凝膠純化將抗體從β-1，4-半乳糖苷酶中純化出來(lái)。
實(shí)施例4純化IgG1的檢測(cè)純化的JC-IgG或DX-IgG與適當(dāng)體積的加樣緩沖液混合，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其中使用預(yù)制凝膠，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(NuPAGE雙Tris電泳系統(tǒng)；InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif.)操作。凝膠蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)染料(Bio-Rad，Hercules，CA)染色。參見(jiàn)圖2和3。
抗體濃度蛋白質(zhì)層析級(jí)分的濃度用Bradford測(cè)定(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)確定，去其中使用白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)(Pierce，Rockford，IL)。
實(shí)施例5IgG1碳水化合物分析基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)。天冬酰胺連接的寡糖的MALDI-TOF分析N-連接的聚糖通過(guò)修改的Papac et al.，Glycobiology 8，445-454(1998)的方法從JC-IgG和DX-IgG釋放出來(lái)?？贵w樣品被還原并被羧甲基化，封閉膜，孔用水洗滌三次。IgG蛋白通過(guò)加入30μl含有1mU N-聚糖酶(EMDBiosciences，La Jolla，CA)的10mM NH4HCO3(pH8.3)被去糖基化。37℃溫育16小時(shí)后，含有聚糖的溶液通過(guò)離心被取出并被蒸發(fā)干燥。每個(gè)孔的干燥的聚糖溶解于15μl水中，0.5μl點(diǎn)樣在不銹鋼樣品板上，與0.5μl S-DHB基質(zhì)(9mg/ml二羥基苯甲酸/1mg/ml 5-甲氧基-水楊酸以1∶1在水/乙腈/0.1％三氟乙酸中)混合，干燥。通過(guò)用脈沖氮激光器(337nm)以4-ns的脈沖時(shí)間照射產(chǎn)生離子。該儀器在延遲提取模式(delayed extraction mode)以125-ns的延遲操作，加速電壓為20kV。柵極電壓為93.00％，指示線電壓(guide wire voltage)為0.1％，內(nèi)壓力是＜5×10-7torr(1torr＝133Pa)，低質(zhì)量門(mén)控(lowmass gate)是875Da。譜是從100-200個(gè)激光脈沖產(chǎn)生，用500-MHz的數(shù)字轉(zhuǎn)換器獲得。(Man)5(GlcNAc)2寡糖被用作外部分子量標(biāo)準(zhǔn)。所有譜用正離子模式的儀器產(chǎn)生。
實(shí)施例6抗原結(jié)合ELISA測(cè)定高結(jié)合微量滴定板(Costar)用PBS，pH7.4中的10μg抗原包被，4℃溫育過(guò)夜。除去緩沖液，加入封閉緩沖液(PBS中3％BSA)，然后室溫溫育1個(gè)小時(shí)。除去封閉緩沖液，將板用PBS洗滌3次。最后一次洗滌之后，加入遞增量的從0.2ng到100ng的純化抗體，室溫溫育1小時(shí)。然后將板用PBS+0.05％Tween20洗滌。最后一次洗滌之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室溫溫育1小時(shí)。然后用PBS-Tween20洗滌板4次。板用TMB底物試劑盒進(jìn)行分析，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(Pierce Biotechnology)操作。
Fc受體結(jié)合測(cè)定FcγRIIb，F(xiàn)cγRIIIa和FcγRIIIb的Fc受體結(jié)合測(cè)定根據(jù)以前描述的實(shí)驗(yàn)方法(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，2766591-6604)進(jìn)行。對(duì)于FcγRIII結(jié)合PBS，pH 7.4中的1μg/ml的FcγRIIIb(圖5)和FcγRIIb(圖7)融合蛋白或者0.8μg/ml的FcγRIIIa-LF(圖6)融合蛋白被包被到ELISA板(Nalge-Nunc，Naperville，IL)上，4℃48h。板用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)在25℃封閉1h。JC-IgG或DX-IgG二聚復(fù)合物通過(guò)將JC-IgG或DX-IgG和HRP-偶聯(lián)的F(Ab’)2抗-F(Ab’)2以2∶1的摩爾量在25℃混合1h制備于含有1％BSA的PBS中。然后將二聚復(fù)合物以1∶2在1％的BSA/PBS中系列稀釋?zhuān)?5℃包被到板上1小時(shí)。所使用的底物是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Vector Laboratories)。根據(jù)制造商(VectorLaboratories)的說(shuō)明書(shū)讀取450nm的吸光度。
B細(xì)胞中抗體反饋的ELISPOT測(cè)定該測(cè)定如Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.4610-15所述的方法實(shí)施。BSA(牛血清白蛋白)首先與IgG抗體偶聯(lián)得到BSA-IgG復(fù)合物。分泌BSA-特異的IgG的B細(xì)胞的數(shù)量用ELISPOT測(cè)定確定。從注射的小鼠中除去脾，用0.5％正常小鼠血清在DMEM(Gibco，New York)中制備細(xì)胞懸液。一百毫升的細(xì)胞懸液被應(yīng)用于BSA-包被的微量滴定板(參見(jiàn)上述的ELISA實(shí)驗(yàn)方法)上，在37℃，5％CO2溫育3.5h。板被洗滌并在4℃ o.n.與50μl在PBS-Tween中以1/100稀釋的堿性磷酸酶結(jié)合的綿羊抗小鼠IgG溫育。斑點(diǎn)在室溫下在50μl的5溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(Sigma-Aldrich)中顯影1小時(shí)，在立體顯微鏡下計(jì)數(shù)。
實(shí)施例7對(duì)于用血液基質(zhì)研究(blood matrix study)(例如B-細(xì)胞消耗)測(cè)定的ADCC，如Vugmeyster and Howell，2004，Int.Immunopharm.41117-1124中所述。不含血漿和紅細(xì)胞(RBC)的全血在染色緩沖液(含有1％BSA和0.1％疊氮化鈉的Hank平衡鹽溶液))，得到染色緩沖液中的白細(xì)胞懸液。然后全血樣品在1000g旋轉(zhuǎn)5分鐘。上清液(血漿)被丟棄，沉淀用氯化銨裂解(ACL)試劑處理，洗滌，重懸于等量的染色緩沖液中。對(duì)于B-細(xì)胞消耗測(cè)定10μl 100μg/ml的抗體溶液或染色緩沖液被加入到90μlSB基質(zhì)中，37℃溫育1小時(shí)。樣品立刻用抗-CD19-FITC和抗-CD45-PE在25℃染色30分鐘。然后樣品被固定于1％甲醛中，一式三份。B-細(xì)胞消耗的定量分析通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。B-細(xì)胞消耗的流式細(xì)胞分析裝備有自動(dòng)FACS加樣器和Cell Quest軟件的FACS Calibur(BD Biosciences)儀器被用于所有樣品的獲得和分析。Cytometer QC和設(shè)置包括運(yùn)行CaliBrite珠和Sphero Tech彩虹珠(BD Biosciences)以確認(rèn)儀器的功能性和探測(cè)器的線性。同種型和補(bǔ)償控制對(duì)每個(gè)檢測(cè)都被運(yùn)行以確認(rèn)儀器的設(shè)置?？偭馨图?xì)胞的B細(xì)胞的百分比由下述門(mén)控策略獲得。淋巴細(xì)胞群體在前向散射/側(cè)向散射散射圖上被標(biāo)記以定義區(qū)域1(T1)。用R1中的事件，顯示CD19和CD45標(biāo)記的熒光強(qiáng)度點(diǎn)圖。熒光標(biāo)記的同種型控制被用于確定CD19和CD45陽(yáng)性各自的截止點(diǎn)。％B用CellQuest測(cè)定為具有CD19-陽(yáng)性，CD45-陽(yáng)性表型的R1區(qū)域中的細(xì)胞的級(jí)分。每個(gè)處理組的樣品都是一式三份。B細(xì)胞消耗百分比用以下公式計(jì)算平均值[100*(1-用對(duì)照抗體處理的％B/平均值[用SB處理的％B])。熒光染料釋放ADCC測(cè)定PBMC分離來(lái)自健康個(gè)體或者血液捐贈(zèng)者(10-20)的外周靜脈血被收集到肝素化的真空管(Becton Dickinson Vacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中。植入2只小鼠需要大約5ml的血。外周血單核細(xì)胞(PBMC)用OptiPrep根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)離心分離。PBMC用由RPMI 1640，2mML-谷胺酰胺，100IU/ml青霉素，100g/ml鏈霉素(Gibco/BRL)組成并補(bǔ)充了20％胎牛血清的完全培養(yǎng)基(CM)洗滌一次，然后以1×106/mlCM的濃度重懸，并轉(zhuǎn)移至250ml的培養(yǎng)瓶(Falcon，NJ，USA)中以使單核細(xì)胞消耗。在37℃和5％CO2溫育1小時(shí)以后，非貼壁細(xì)胞被除去，用培養(yǎng)基洗滌一次，外周血淋巴細(xì)胞(PBL)被調(diào)整至濃度為2.5×107/mlCM。熒光塞料-釋放ADCC。ADCC檢測(cè)的前提是與CD20或CD40抗原呈遞靶細(xì)胞(分別是Raji細(xì)胞系或BCL1-3B3細(xì)胞)結(jié)合的抗體刺激靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞上的Fcγ受體結(jié)合。這依次促使呈遞CD20或CD40抗原的靶細(xì)胞裂解，釋放可以被定量檢測(cè)的內(nèi)部熒光染料。用Alamar-blue熒光代替靶細(xì)胞的51Cr標(biāo)記。50μl的CD20呈遞Raji細(xì)胞懸液(1x104細(xì)胞)與50μl量的抗-DX-IgG或抗-JC-IgGmAb(各種濃度)混合，50μl量的PBMC效應(yīng)細(xì)胞如上所述(效應(yīng)物與靶細(xì)胞比率可以是100∶1，50∶1，25∶1和12.5∶1)在96孔組織培養(yǎng)板中分離，在37℃，5％CO2溫育4小時(shí)以便于Raji或BCL1-3B3細(xì)胞的裂解。加入5μl的Alamar藍(lán)，繼續(xù)再溫育5小時(shí)，使得染料被吸收并代謝為熒光狀態(tài)。將板在振蕩器上冷卻到室溫，在熒光計(jì)上讀取熒光值，在530nm激發(fā)，在590nm發(fā)射。相對(duì)熒光單位(RFU)相對(duì)于抗mAb濃度繪制，用對(duì)照抗體——例如Rituximab從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。用嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(Niwa et al.，2004，Cancer Research，642127-2133)測(cè)定體內(nèi)ADCC。體內(nèi)ADCC活性可以用移植了來(lái)自包括雜合(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和純合(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV和FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型的健康供體的人外周血單核細(xì)胞(PMBC)的小鼠模型檢測(cè)。用該模型系統(tǒng)，檢測(cè)了具有占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖的Ig與Rituximab或任何其它對(duì)照抗體相比增強(qiáng)的ADCC活性。體內(nèi)ADCC測(cè)定的詳細(xì)的和充分的實(shí)驗(yàn)方法可以在Niwa et al.，2004，supra中找到。
序列表SEQIDN001(小鼠/人嵌合IgGl輕鏈)caaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgtctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctcttcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcctctccaaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtgttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctcttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctactactactgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccaaattggagattaagagaactgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO02(小鼠/人嵌合IgGl重鏈)caagtccagttgcaacagcctggtgccgagttggtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggttacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaggtagaggtttggagtggttggtgccatctacccaggtaacggtgacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactctaccgctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttgacttctgaagattctgctgtttactactgtgctagatccacctactacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactgtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaaSEQ ID NO03(人IgGl的輕鏈恒定區(qū))agaactgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO04(人IgGl的重鏈恒定區(qū))tctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaatgttcatactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggaggtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaa
SEQ ID NO05(CD20LF1)aggagtcgtattcaaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgSEQ ID NO06(CD20LF2)tctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctctSEQ ID NO07(CD20LF3)tcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttccSEQ ID NO08(CD20LF4)tctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtSEQ ID NO09(CD20LF5)gttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctSEQ ID NO10(CD20LF6)cttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttactacSEQ ID NO11(CD20LF7)tgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccSEQ ID NO12(CD20LF8)aaattggagattaagagaactgttgctgctccatccSEQ ID NO13(CD20LR1)caacagttctcttaatctccaatttggtaccaccaccgaaagttgSEQ ID NO14(CD20LR2)gtgggttagaagtccattgctgacagtagtaagtagcagcgtcctSEQ ID NO15(CD20LR3)cggcttcaactctggagatggtaagagagtaggaggtaccggaacSEQ ID NO16(CD20LR4)agaaccagagaatctaactggaacaccggaagccaagttggaagSEQ ID NO17(CD20LR5)tagcgtagatccatggctttggagaggaacctggcttttgctggaSEQ ID NO18(CD20LR6)ccagtgaatgtaagagacagaggaagaggctctacaagtcatggSEQ ID NO19(CD20LR7)tgaccttctctccaggggaagcagacaaaatagctggggattgagSEQ ID NO20(CD20L/up)aggagtcgtattcaaatcgtcSEQ ID NO21(LfusionRTVAAPS/up)
agaactgttgctgctccatccSEQ ID NO22(LfusionRTVAAPS/lp)ggatggagcagcaacagttcSEQ ID NO23(CD20L/lp)ctggtaccttaacactctcctctgttgaagSEQ ID NO24(CD20HFl)aggagtcgtattcaagtccagttgcaacagcctggtgccgagttgSEQ ID NO25(CD20HF2)gtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgta aggcttctggtSEQ ID NO26(CD20HF3)tacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaSEQ ID NO27(CD20HF4)ggtagaggtttggagtggattggtgccatctacccaggtaacggtSEQ ID NO28(CD20HF5)gacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccSEQ ID NO29(CD20HF6)gctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttgSEQ ID NO30(CD20HF7)acttctgaagactctgctgtttactactgtgctagatccacctacSEQ ID NO31(CD20HF8)tacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactSEQ ID NO32(CD20HF9)gtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccSEQ ID NO33(CD20HR1)tagtagaagcagcggaaacggtgacagtggtaccagcaccccaaaSEQ ID NO34(CD20HR2)cgttgaagtaccagtctccaccgtagtaggtggatctagcacagSEQ ID NO35(CD20HR3)agtaaacagcagagtcttcagaagtcaaggaagacaattgcatgtSEQ ID NO36(CD20HR4)aggcggtggaagaggacttatcagcggtaagagtagcctttccctSEQ ID NO37(CD20HR5)tgaatttttggttgtaagaagtgtcaccgttacctgggtagatgg
SEQ ID NO38(CD20HR6)caccaatccactccaaacctctacctggagtttgcttgacccagtSEQ ID NO39(CD20HR7)gcatgttgtaggaggtgaaagtgtaaccagaagccttacaggacaSEQ ID NO40(CD20HR8)tcttaacagaagcacctggcttgaccaactcggcaccaggctgttSEQ ID NO41(CD20H/up)AggagtcgtattcaagtccagSEQ ID NO42(HchainASTKGPs/up)gcttctactaagggaccatccSEQ ID NO43(HchainASTKGPs/lp)ggatggtcccttagtagaagcSEQ ID NO44(HFckpnl/lp)ctggtattacttacctggggacaaagacSEQ ID NO45(具有EcoRI的Kar2信號(hào)序列)gaattcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccatttgctaaacctgttagagctSEQ ID NO46(P.BiPss/UPl-EcoRI)aattcgaaacgatgctgtctttgaagccatcttggcttactttggctgctttgatgtacgctatgcttttSEQ ID NO47(P.BiPss/LP1)ccaaagtaagccaagatggcttcaaagacagcatcgtttcgSEQ ID NO48(P.BiPss/UP2)ggttgttgttccatttgctaagccagttagagctSEQ ID NO49(P.BiPss/LP2)agctctaactggcttagcaaatggaacaacaaccaaaagcatagcgtacatcaaagcagSEQ ID NO50(GenBank#AF013576)gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagatcctctcaatctttggaaaactctaacggtaacactttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagattttctggtgttccagatagattttctggttctggttctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttactcatgttccatacacttttggtggtggtactactttggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtactgcttctgttgtttgtcttcttaacaacttctacccaagagaagctaaggttcagtggaa ggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaacaagattctaaggattctacttactctttgtcttctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcttctccagttactaagtcctttaacagaggtgaatgttag
SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgttactggttactctattactactaactacaactggaactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacaccccatctttgaagaacagagtttctattactagagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgctagattggattactggggtcaaggtacttctgttactgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtactgctgctttgggttgtttggttaaggattactttccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaatcttctggtttgtactctttgtcttctgttgttactgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgataagagagttgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagttttcttgttcccaccaaaaccaaaggatacccttatgatttctagaactcctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgagtggtgttgaagttcataatgctaagacaaagccaagagaagaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaatacaagtgtaaggtctccaacaaagctcttccagctccaattgagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactgactaagaaccaagtctctctgacttgtctggttaaaggtttctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctggattctgatggttccttcttcctttactctaagcttactgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactcagaagtctctttccctgtctccaggtaaataaSEQ ID NO52 mh285L-1cggaattc-gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagSEQ ID NO53 mh285L-2agaaccagttcaagaaagtgttaccgttagagttttccaaagattgagaggatctacaagaaatagaagcttcatSEQ ID NO54 mh285L-3actttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagatttSEQ ID NO55 mh285L-4caaagtgaaatcagtaccagaaccagaaccagaaaatctatctggaacaccagaaaatctgttagaaactctgtaSEQ ID NOS6 mh285L-5tctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttacSEQ ID NO57 mh285L～6caacagttctcttaatttccaaagtagtaccaccaccaaaagtgtatggaacatgagtaacttgcaaacagaagtaaSEQ ID NO58 mh285L-7tggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtaSEQ ID NO59 mh285L-8tgaaccttagcttctcttgggtagaagttgttaagaagacaaacaacagaagcagtaccagacttcaattgttcat
SEQ ID NO60 mh285L-9cccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaaSEQ ID NO61 mh285L-10ccttagacaaagtcaaagtagaagacaaagagtaagtagaatccttagaatcttgttcagtaacagattcttgagaSEQ ID NO62 mh285L-11ctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcSEQ ID NO63 mh285L-12ggggtaccctaacattcacctctgttaaaggacttagtaactggagaagacaaaccttgatgagtaacSEQ ID NO64 mh285H-1cggaattc-gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgSEQ ID NO65 mh285H-2ggaaattgtctaatccagttccagttgtagttagtagtaatagagtaaccagtaacagaacaagtcaaagacaaagSEQ ID NO66 mh285H-3aactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacSEQ ID NO67 mh285H-4attggttcatagaagtatctctagtaatagaaactctgttcttcaaagatggggtgtattcagaagtaccatcgtaSEQ ID NO68 mh285H-5gagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgcSEQ ID NO69 mh285H-6agtagaagcagaagaaacagtaacagaagtaccttgaccccagtaatccaatctagcacagtagtaagtagcagtaSEQ ID NO70 mh285H-7ctgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtaSEQ ID NO71 mh285H-8gaaacagtaactggttctggaaagtaatccttaaccaaacaacccaaagcagcagtccaccagaagtagactta
SEQ ID NO72 mh285H-9tccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaaSEQ ID NO73 mh285H-10ccaaagaagaagatggaacagtaacaacagaagacaaagagtacaaaccagaagattgcaaaacagctggaaaagtSEQ ID NO74 mh285H-11ctgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgaSEQ ID NO75 mh285H-12tgtatgagttttatcacaagattttggttcaactctcttatcaaccttagtgttagatggSEQ ID NO76 Fc-15’gctgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacagttgtccaccatgtccagctcctgaacttcttgggtggaccatcagtttt3’SEQ ID NO77 Fc-25’atgtgacttcaggagttctagaaatcataagggtatcctttggttttggtgggaacaagaaaactgatggtccacccaga3’SEQ ID NO78 Fc-35’ctagaacccctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgat3’SEQ ID NO79 Fc-45’taagtagagttgtattgttcttctcttggctttgtcttagcattatgaacttcaacaccatcaacgtaccagttgaactt3’SEQ ID NO80 Fc-55’agaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaataca3’SEQ ID NO81 Fc-65’agctttggaaatggttttctcaattggagctggaagagctttgttggagaccttacacttgtattccttaccattcagcc3’SEQ ID NO82 Fc-75’gagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactgac3’SEQ ID NO83 Fc-85’cagcaatatcagatggatagaaacctttaaccagacaagtcagagagacttggttcttagtcagttcatctctggatggt3’
SEQ IDNO84 Fc-95’tctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctg3’SEQ ID NO85 Fc-105’tgccatctggacttatcaacagtaagcttagagtaaaggaagaaggaaccatcagaatccagaacaggaggagtagtctt3’SEQIDNO86 Fc-115’tgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactc3’SEQ ID NO87 Fc-125’ttatttacctggagacagggaaagagacttctgagtgtaatggttatgcaaag3’SEQ ID NO88 Fc/LP55’ggggtaccttatttacctggagacagggaaagagacttct3’SEQ ID NO89(人血清白蛋白，HSA)atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaatagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagSEQ ID NO90(凝血酶位點(diǎn))ctcgagcccggcggcggcggcggccgcctggttcctcgtggcttcggtacc
權(quán)利要求
1.包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中50摩爾百分比以上的所述多個(gè)N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中75摩爾百分比以上的所述多個(gè)N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中90摩爾百分比以上的所述多個(gè)N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖以比所述多個(gè)N-聚糖中其次最占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)多約5摩爾百分比-約50摩爾百分比的水平存在。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出與FcγRIIb受體的結(jié)合親和力減少。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出與FcγRIII受體的結(jié)合親和力增加。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述FcγRIII受體是FcγRIIIa受體。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述FcγRIII受體是FcγRIIIb受體。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白表現(xiàn)出抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)活性增加。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白基本不含巖藻糖。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白缺乏巖藻糖。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白與選自下組的抗原結(jié)合生長(zhǎng)因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細(xì)胞抗原、CD20、CD33、細(xì)胞因子、TNF-α和TNF-β。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自下組的Fc區(qū)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)。
15.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的組合物，和藥學(xué)可接受載體。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白基本不含巖藻糖。
17.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白缺乏巖藻糖。
18.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白包括與選自下組的抗原結(jié)合的抗體生長(zhǎng)因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細(xì)胞抗原、CD20、CD33、細(xì)胞因子、TNF-α和TNF-β。
19.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自下組的Fc區(qū)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)。
20.含有權(quán)利要求1的組合物的試劑盒。
21.含有編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主細(xì)胞，所述真核宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)工程化或經(jīng)過(guò)選擇以表達(dá)所述免疫球蛋白或其片段，由此產(chǎn)生包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是低等真核宿主細(xì)胞。
23.在真核宿主中生產(chǎn)包含多個(gè)免疫球蛋白的組合物的方法，每個(gè)免疫球蛋白包含至少一個(gè)與其連接的N-聚糖，其中所述組合物由此包含多個(gè)N-聚糖，所述N-聚糖中占優(yōu)勢(shì)的N-聚糖基本由GlcNAcMan5GlcNAc2組成。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述宿主細(xì)胞是低等真核宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及在免疫球蛋白糖蛋白上具有賦予其特定效應(yīng)物功能的占優(yōu)勢(shì)的N－聚糖結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白糖蛋白組合物。此外，本發(fā)明涉及含有具有特定的富集的N－聚糖結(jié)構(gòu)的抗體的藥物組合物，其中所述N－聚糖結(jié)構(gòu)是GlcNAcMan
文檔編號(hào)C12N15/10GK101001876SQ200580024782
公開(kāi)日2007年7月18日 申請(qǐng)日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者T·U·格恩格羅斯, H·李, S·維爾德特 申請(qǐng)人:格利科菲公司